Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Jednoczesna stymulacja elektryczna i mechaniczna w celu zwiększenia potencjału kardiomiogennego komórek

7.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58934

⸱

18 stycznia 2019

 ,  , 
1Insuficiencia Cardiaca y Regeneración Cardiaca (ICREC) Research Program, Health Science Research Institute Germans Trias i Pujol, 2Amsterdam Universitair Medisch Centrum (UMC), Vrije Universiteit Amsterdam, Pulmonology and Physiology, Amsterdam Cardiovascular Sciences, 3Electronic and Biomedical Instrumentation Group, Departament d'Enginyeria Electrònica, Universitat Politècnica de Catalunya, 4Cardiology Service, Germans Trias i Pujol University Hospital, 5Department of Medicine, Universitat Autònoma de Barcelona, 6Centro de Investigación Biomédica en Red (CIBER) Cardiovascular, Instituto de Salud Carlos III

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół treningu populacji komórek za pomocą bodźców elektrycznych i mechanicznych naśladujących fizjologię serca. Ta elektromechaniczna stymulacja zwiększa potencjał kardiomiogenny leczonych komórek i jest obiecującą strategią dla dalszej terapii komórkowej, modelowania choroby i badań przesiewowych leków.

Streszczenie

Choroby układu krążenia są główną przyczyną zgonów w krajach rozwiniętych. W związku z tym zapotrzebowanie na skuteczne terapie komórkami serca zmotywowało naukowców zajmujących się komórkami macierzystymi i bioinżynierią do opracowania in vitro wysokiej jakości ludzkiego mięśnia sercowego zarówno do badań podstawowych, jak i zastosowań klinicznych. Jednak niedojrzały fenotyp komórek serca jest ograniczeniem w uzyskiwaniu tkanek, które funkcjonalnie naśladują dorosły mięsień sercowy, który charakteryzuje się głównie sygnałami mechanicznymi i elektrycznymi. W związku z tym celem tego protokołu jest przygotowanie i dojrzewanie docelowej populacji komórek poprzez stymulację elektromechaniczną, rekapitulację parametrów fizjologicznych. Inżynieria tkankowa serca ewoluuje w kierunku bardziej biologicznych podejść, a zatem strategie oparte na bodźcach biofizycznych nabierają rozpędu. Opracowane w tym celu urządzenie jest unikalne i umożliwia indywidualną lub jednoczesną stymulację elektryczną i mechaniczną, starannie scharakteryzowaną i zwalidowaną. Ponadto, mimo że metodologia została zoptymalizowana pod kątem tego stymulatora i określonej populacji komórek, można ją łatwo dostosować do innych urządzeń i linii komórkowych. Uzyskane wyniki dostarczają dowodów na zwiększone zaangażowanie serca w populacji komórek po stymulacji elektromechanicznej. Komórki stymulowane elektromechanicznie wykazują zwiększoną ekspresję głównych markerów sercowych, w tym genów wczesnych, strukturalnych i regulujących wapń. To kondycjonowanie komórek może być przydatne w dalszej regeneracyjnej terapii komórkowej, modelowaniu chorób i wysokoprzepustowych badaniach przesiewowych leków.

Wprowadzenie

Funkcja serca opiera się na sprzężeniu pobudzenia elektrycznego i skurczu mechanicznego. W skrócie, połączenia międzykomórkowe kardiomiocytów umożliwiają propagację sygnałów elektrycznych, co prowadzi do niemal jednoczesnych skurczów serca, które pompują krew systemicznie oraz przez układ płucny. W związku z tym komórki serca podlegają zarówno siłom elektrycznym, jak i mechanicznym, które regulują ekspresję genów i funkcję komórkową. W związku z tym wiele zespołów badawczych podjęło próby opracowania platform hodowlanych naśladujących fizjologiczne środowisko serca, aby zrozumieć rolę stymulacji mechanicznej i elektrycznej w rozwoju, funkcji i dojrzewaniu serca. Stymulacje elektryczne i mechaniczne in vitro były stosowane oddzielnie w inżynierii tkankowej serca w celu zwiększenia właściwości funkcjonalnych, zwiększenia dojrzałości komórek lub poprawy sprzężenia międzykomórkowego i gospodarki wapniowej1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21. Niemniej jednak synchronizacja warunkowania elektromechanicznego pozostaje niewykorzystana ze względu na trudności w opracowaniu stymulatora i protokołu, a także konieczność optymalizacji22.

Wstępne prace traktowały stymulację elektromechaniczną jako połączenie stymulacji elektrycznej i perfuzji pożywki; jednak przepływ ten nie obejmuje odkształcenia opartego na naprężeniu, które jest typowe dla napełniania komór23,24,25. Później, bardziej fizjologiczne podejścia łączyły bodźce elektryczne z odkształceniem fizycznym lub rozciąganiem, aby naśladować skurcz izowolumetryczny26,27,28,29,30,31. Feng et al. opisali pierwszą demonstrację stymulacji elektromechanicznej w 2005 roku, raportując zwiększenie rozmiaru kardiomiocytów i poprawę ich właściwości skurczowych26. Wang et al. poddali mezenchymalne komórki macierzyste wstępnemu traktowaniu 5-azacytydyną i zastosowali jednoczesne kondycjonowanie elektryczne i mechaniczne, co poprawiło recelularyzację, żywotność komórek, różnicowanie w kierunku kardiomiocytów oraz przebudowę tkanki27. Od czasu tych publikacji więcej grup donosiło o stymulacji elektromechanicznej monowarstw komórkowych lub tkanek inżynieryjnych (np. Black28, Vunjak-Novakovic29,31 oraz nasza grupa30), przy czym pierwsze kondycjonowane komórki zostały przetestowane in vivo30. W skrócie, Morgan i Black przetestowali kilka kombinacji bodźców elektrycznych i mechanicznych, wykazując, że czas między stymulacjami był kluczowy, ponieważ opóźniona łączna stymulacja elektromechaniczna przyniosła najlepsze rezultaty28. Następnie Godier-Furnémont i współpracownicy zoptymalizowali protokół stymulacji elektromechanicznej dla inżynieryjnych konstruktów mięśnia sercowego z komórek serca noworodka szczura i osiągnęli, po raz pierwszy, dodatnią relację siła-częstotliwość29. Później nasza grupa zgłosiła, że komórki wstępnie kondycjonowane elektromechanicznie wykazywały zwiększoną ekspresję głównych markerów sercowych in vitro oraz szerokie korzystne efekty in vivo, takie jak poprawa funkcji serca lub zwiększenie gęstości naczyń w strefie brzeżnej zawału30. Najnowsza publikacja wykazała, że tkanki serca z kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych, poddane kondycjonowaniu elektromechanicznemu, osiągnęły poziom dojrzałości bliższy strukturze i funkcji serca dorosłego człowieka31. Dodatkowo, alternatywne trójwymiarowe platformy stymulacyjne obejmują rusztowania elektroaktywne, które dostarczają sygnałów elektrycznych, mechanicznych i topograficznych do przytwierdzonych komórek32. Ponadto odkształcenie mechaniczne (rozciąganie i kompresja monowarstwy komórkowej) można indukować za pomocą rozciągliwych elektrod naśladujących normalne warunki fizjologiczne, a także warunki ekstremalne33.

Zatem uzasadnieniem jest przypuszczenie, że bodźce elektromechaniczne in vitro oparte na warunkach fizjologicznych mogą zwiększyć potencjał kardiomiogenny komórki. Rzeczywiście, taka stymulacja mogłaby wspomóc dalszą integrację komórek terapeutycznych z mięśniem sercowym w scenariuszu klinicznym lub zwiększyć dojrzałość tkanki w zastosowaniach związanych z przesiewaniem leków.

Dodatkowo wyizolowaliśmy i scharakteryzowaliśmy populację ludzkich komórek progenitorowych pochodzących z tkanki tłuszczowej o pochodzeniu sercowym (cardiac ATDPCs)34. Komórki te znajdują się w tłuszczu epikardialnym. Wykazują one korzystne efekty histopatologiczne i funkcjonalne w leczeniu zawału mięśnia sercowego, a także zachowują potencjał różnicowania w kierunku kardiomiocytów i komórek śródbłonka.30,35. Postawiliśmy hipotezę, że korzyści te wzrosną po stymulacji biofizycznej.

W związku z tym opracowaliśmy urządzenie oraz schemat stymulacji dla badanej populacji komórek i zbadaliśmy ich efekty. Niniejszy protokół elektromechaniczny stanowi nową strategię indukowania aktywnego rozciągania komórek w sposób sterylny i nieinwazyjny w porównaniu z poprzednimi publikacjami36, w połączeniu ze stymulacją polem elektrycznym. Przedstawiona tutaj technika szczegółowo opisuje urządzenie i metodę stosowaną do stymulacji elektrycznej, mechanicznej oraz elektromechanicznej komórek.

Urządzenie to może zapewnić stymulację elektryczną i mechaniczną, niezależnie lub jednocześnie. Stymulacja jest przeprowadzana w sposób nieinwazyjny i aseptyczny przy użyciu nowej metody, która obejmuje wysterylizowane podłoże dla komórek, elektrody umieszczone wewnątrz standardowej płytki hodowlanej oraz platformę indukującą siły mechaniczne i elektryczne (Rysunek 1).

Platforma może pomieścić do sześciu płytek hodowlanych i składa się z kanapkowej struktury wykonanej z wycinanego laserowo polimetakrylanu metylu oraz elementów płytki drukowanej. Prototyp platformy opiera się na kombinacji monofazowego programowalnego stymulatora elektrycznego sterowanego komputerowo, płytki drukowanej zapewniającej stabilne połączenie elektrod oraz sześciu niklowanych magnesów neodymowych o wymiarach 10 mm x 10 mm x 5 mm, umieszczonych przy jednej stronie płytek hodowlanych. Znajduje się tam również aluminiowy pręt z sześcioma magnesami napędzającymi (ten sam model), umieszczony przed drugą stroną płytek hodowlanych i przesuwany za pomocą liniowego serwomotoru. Silnik jest sterowany przez kontroler silnika, obsługiwany przez port RS-232 za pomocą komercyjnego oprogramowania (patrz: Tabela materiałów). Za pośrednictwem interfejsu użytkownika i programowalnego stymulatora możliwe jest zaprogramowanie natężenia prądu, czasu trwania i częstotliwości impulsu, częstotliwości stymulacji mechanicznej, jej cyklu pracy, liczby impulsów, amplitudy impulsu (wychylenie magnesu) oraz nachylenia zbocza.

Układ elektrofizjologiczny z magnesami, elektrodami i złączami do stymulacji elektrycznej; przedstawiona analiza danych.
Rycina 1: Stymulator elektromechaniczny. (A) Konstrukcja z PDMS używana do kondycjonowania komórek. (B) Schemat konstrukcji z PDMS, zawierający elektrody i magnesy. (C) Szczegół widoku płytki drukowanej (platformy) wykorzystywanej do przeprowadzania kondycjonowania elektromechanicznego. Panel ten został zmodyfikowany na podstawie pracy Llucià-Valldeperas et al.30. (D) Zdjęcie platformy stymulacji elektromechanicznej oraz interfejsu użytkownika (komputera). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Zarówno stymulator, jak i metoda kondycjonowania elektromechanicznego zostały w pełni opisane w dwóch międzynarodowych patentach, WO-2013185818-A137 oraz WO-2017125159-A138.

Biokompatybilne konstrukcje silikonowe, zaprojektowane w celu zapewnienia wsparcia strukturalnego dla komórek, elektrod i magnesów, zostały opisane wcześniej10,21. W skrócie składają się one z polidimetylosiloksanu (PDMS), formowanego i utwardzanego w temperaturze pokojowej, o module Younga wynoszącym 1,3 MPa, co jest wartością zbliżoną do poziomów fizjologicznych. Konstrukcja zawiera zbiornik do hodowli komórkowej w obszarze elastycznym (10 mm x 10 mm x 2 mm), dwa wewnętrzne szczeliny poprzeczne do mocowania elektrod oraz dwa zatopione niklowane magnesy neodymowe o wymiarach 6 mm x 2 mm x 4 mm. Elektrody wykonano z platynowego drutu o średnicy 0,2 mm, owiniętego wokół rdzenia z politetrafluoroetylenu (PTFE) o wymiarach 2 mm x 3 mm x 12 mm (21 cm na elektrodę, około 23 zwoje) i rozmieszczono je po przeciwnych stronach obszaru elastycznego, aby wytworzyć pole elektryczne służące do indukcji stymulacji elektrycznej. Rozciąganie mechaniczne jest realizowane poprzez przyciąganie magnetyczne między magnesami zatopionymi w podłożu a magnesami zewnętrznymi umieszczonymi obok płytki hodowlanej oraz na ruchomym ramieniu aluminiowym. W ten sposób podłoże komórkowe może być rozciągane bez naruszania bariery sterylnej. Podejście to jest odpowiednie dla monowarstwy komórkowej, ale może zostać zaadaptowane również do konstrukcji trójwymiarowych.

Dodatkowo, w miejscu wysiewu komórek można odcisnąć regularny wzór, wykorzystując liniową siatkę dyfrakcyjną (1 250 rowków/mm). Bezpośrednia wizualizacja komórek hodowanych na konstrukcie z PDMS pod mikroskopem w świetle przechodzącym i fluorescencyjnym jest możliwa dzięki jego przezroczystości i grubości 0,5 mm. W niniejszym przypadku basen hodowlany z PDMS posiada pionowy wzór powierzchniowy, prostopadły do siły rozciągania, aby zorientować komórki prostopadle do pola elektrycznego, co minimalizuje gradient pola elektrycznego w obrębie komórki.

Rysunek 1 przedstawia szczegółowy opis konstrukcji i urządzenia wykorzystanego do stymulacji. Konstrukcja z PDMS oraz jej charakterystyka zostały zoptymalizowane pod kątem rozciągania komórek (Rysunek 1A,B). Stymulator został opracowany i zwalidowany w celu skutecznego zastosowania pożądanej stymulacji elektrycznej i mechanicznej komórek przytwierdzonych do konstrukcji z PDMS. Proces ten obejmuje zapewnienie dobrej łączności oraz łatwości obsługi przez użytkownika za pomocą interfejsu oprogramowania (Rysunek 1C,D).

Procedura stymulacji komórek przy użyciu tego specjalnie wykonanego urządzenia została opisana w sekcji protokołu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

To badanie wykorzystuje ludzkie kardiologiczne ATDPC z próbek pacjentów. Ich stosowanie zostało zatwierdzone przez lokalną komisję etyczną, a wszyscy pacjenci wyrazili świadomą zgodę. Protokół badania jest zgodny z zasadami określonymi w Deklaracji Helsińskiej.

1. Przygotowania

  1. Autoklawuj w autoklawie dwie pęsety, 12 platynowych elektrod PTFE do stymulacji elektrycznej i kilka ręczników papierowych w temperaturze 121 °C przez 20 minut.
  2. Wysterylizuj 12 niestandardowych konstrukcji PDMS (Rysunek 1A).
    1. Myć każdą konstrukcję 5 ml sterylnej, destylowanej wody z mieszaniem magnetycznym w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
    2. Myć 1x 5 ml 70% etanolu z mieszaniem magnetycznym w temperaturze pokojowej przez 5 min.
    3. Przemyć 5x 5 ml sterylnej, destylowanej wody z mieszaniem magnetycznym w temperaturze pokojowej przez 10 minut na pranie, w celu usunięcia pozostałości alkoholowych.
    4. Wysuszyć konstrukcje na sterylnych ręcznikach papierowych wewnątrz komory przepływowej przez noc.
    5. Przechowuj je w sterylnych probówkach wirówkowych o pojemności 50 ml do czasu użycia.

2. Sadzenie komórek (Dzień -1)

  1. Przed wysiewem komórek przenieś oczyszczone konstrukcje PDMS na sterylne płytki i wystaw je na działanie światła ultrafioletowego przez 5 minut, aby zapewnić całkowitą sterylizację.
  2. Przenieś każdy konstrukt na 35-milimetrową płytkę do hodowli komórkowej lub płytkę 6-dołkową w celu natychmiastowego wysiewu komórek.
  3. Trypsynizuj zlewającą się kolbę T75 z sercowymi ATDPC.
    1. Przemyć kolbę T75 5 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
    2. Dodać 1 ml 0,05% trypsyny-EDTA i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut w celu odłączenia komórek.
    3. Dodaj 5 ml kompletnej pożywki, aby dezaktywować trypsynę-EDTA.
    4. Zebrać wszystkie komórki do probówki o pojemności 15 ml i przemyć kolbę 2x 5 ml PBS, aby zebrać pozostałe komórki.
    5. Wirować przy 230 x g przez 5 minut w temperaturze 22 °C, usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 2 ml kompletnej pożywki w celu policzenia ich w komorze hemocytometru.
  4. Wysiewaj 200 μl sercowych ATDPC (2,5 x 105 komórek/ml) do puli komórkowej 12 konstruktów PDMS (Rysunek 1A,B), aby następnego dnia ~80% powierzchni wysiewu pokryło się komórkami, i inkubuj w temperaturze 37 °C i 5% CO2,
    nuta: Po 2–4 godzinach ogniwa należy przymocować. Inokulum komórkowe przygotowuje się w zależności od wielkości i wzrostu komórki. W przypadku mniejszych komórek należy zwiększyć gęstość wysiewu.
  5. Delikatnie dodaj 2 ml podgrzanej kompletnej pożywki (α-MEM uzupełnionej 10% płodowej surowicy bydlęcej, 1% L-glutaminy i 1% penicyliny-streptomycyny) na płytkę.
  6. Inkubować konstrukty w warunkach hodowli (zwykle 37 °C i 5% CO2 ) przez noc.

3. Konfiguracja stymulacji elektromechanicznej (Dzień 0)

  1. Przed rozpoczęciem procedury należy pobrać sześć konstruktów do stymulacji elektromechanicznej i sześć jako niestymulowane kontrole. Mając mniej niż sześć płytek na stymulację, użyj pustych konstruktów o tej samej objętości medium, aby zapewnić odpowiednią stymulację polem elektrycznym.
  2. Wyczyść jednostkę stymulacji 70% etanolem i umieść ją w komorze przepływowej.
  3. Przenieś sterylne elektrody i pęsetę do komory przepływowej.
  4. Usuń 90% pożywki z płytki hodowlanej, aby łatwo manipulować elektrodami i konstrukcjami. Po pierwsze, umieść konstrukty PDMS we właściwej pozycji, aby zapewnić przyciąganie magnetyczne (przemieszczenie PDMS w płytce hodowlanej w kierunku magnesu) zarówno między magnesami stałymi, jak i ruchomymi. Następnie podłącz przewód platynowy do złączy elektrod i części PTFE w wyznaczonym miejscu w konstrukcji PDMS.
  5. Dodaj 2,5 ml świeżej, wstępnie podgrzanej, kompletnej pożywki do każdego konstruktu.
    nuta: Utrzymuj sterylność przez cały zabieg i operuj na jednym konstrukcie na raz. Pozostałe konstrukty należy utrzymywać w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 do momentu użycia.
  6. Po umieszczeniu wszystkich konstrukcji PDMS i podłączeniu ich elektrycznie do platformy, należy wprowadzić platformę z powrotem do inkubatora w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  7. Podłącz źródło elektryczne i mechaniczne.
  8. Skonfiguruj program stymulacji. Określ reżimy stymulacji elektrycznej i mechanicznej za pomocą interfejsów użytkownika stymulatora elektrycznego i aplikacji, która steruje stymulacją mechaniczną. Ustaw synchronizację w następujący sposób.
    1. Włączyć stymulator elektryczny. Poczekaj, aż na wyświetlaczu pojawi się menu główne.
      1. Następnie wybierz opcję 2: Edytuj sekwencję + Enter.
      2. Edytuj menu sekwencji w następujący sposób.
        1. Użyj zakładki Tryb, aby wybrać napięcie lub prąd. Wybierz bieżącą, klikając + i naciśnij Enter.
        2. Na karcie Amplituda wybierz 1 (mA) za pomocą +/- i naciśnij Enter.
        3. W polu Period (T) (T) wybierz wartość 1000 (ms) z +/- i naciśnij Enter.
        4. Ustaw czas trwania impulsu (Tw) na 2 (ms) za pomocą +/- i naciśnij Enter.
        5. Na karcie Tryb wyzwalania wybierz opcję Zewnętrzne przez oprogramowanie i naciśnij Enter.
        6. Wróć do menu głównego wybierz opcję 4: Generuj sekwencję i naciśnij Enter.
          UWAGA: Stymulator elektryczny pozostaje w trybie czuwania, dopóki nie otrzyma polecenia wyzwalania z aplikacji stymulatora mechanicznego przez port szeregowy.
    2. Wykonaj następujące kroki w sekcji stymulacji mechanicznej panelu aplikacji sterującej (Rysunek 2C).
      1. Wpisz 1,000 (ms) w kontrolce tekstu Okres impulsu.
      2. Wpisz 500 (ms) w kontrolce tekstowej czasu włączenia (Tw), aby ustawić czas trwania impulsu mechanicznego.
      3. Wpisz 2,000 (AU) w kontrolce tekstu Wychylenie, aby uzyskać 10% wydłużenie konstrukcji. Jest to liczba kroków w silniku sterowania liniowego.
        UWAGA: Zastosowany tutaj protokół stymulacji składa się z monofazowych impulsów prostokątnych prądu przemiennego o długości 2 ms o napięciu 50 mV/cm przy 1 Hz i 10% rozciąganiu przez 7 dni. Czasy narastania i opadania impulsu mechanicznego są ustawione na 100 ms, aby z grubsza naśladować kształt impulsu ciśnienia w palenisku. Ponadto tryb powtarzania jest ustawiony na Ciągły i jest licznik wyświetlający liczbę impulsów.
  9. Zmieniaj media 2 razy w tygodniu (poniedziałki i czwartki po południu). Najpierw usuń stare nośniki; następnie dodaj ciepłe media po bokach wspornika PDMS, nigdy bezpośrednio na puli komórek.
    nuta: Jeśli komórki mają wysokie tempo wzrostu, podłoże należy wymieniać 3 razy w tygodniu (np. w poniedziałek, środę i piątek). Konieczne jest odłączenie i ponowne podłączenie wszystkich, ale nie ma potrzeby wyjmowania płytek hodowlanych i elektrod z ich miejsca.
  10. Próbki należy pobrać po przeprowadzeniu eksperymentu.

4. Pobieranie próbek na koniec eksperymentów (dzień 7)

  1. Do analiz RNA
    1. Myj konstrukcję 2x 3 ml 1x PBS przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    2. Dodać 3 ml 0,05% trypsyny-EDTA do każdej płytki (tyle, aby pokryć całą konstrukcję) i odczekać 5 minut w temperaturze 37 °C.
    3. Po odłączeniu komórek dodaj 2 ml kompletnej pożywki, aby dezaktywować trypsynę-EDTA.
    4. Zbierz wszystkie komórki do probówki o pojemności 15 ml i umyj konstrukt 2x 3 ml PBS, aby zebrać pozostałe komórki.
    5. Wirować przy 230 x g przez 5 minut w temperaturze 22 °C.
    6. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml PBS.
    7. Przenieść roztwór komórek do probówki o pojemności 1,5 ml i odwirować przy 230 x g przez 5 minut.
    8. Usunąć supernatant i przechowywać osad w temperaturze -80 °C w 700 μl odczynnika do lizy w celu dalszej izolacji RNA.
    9. Wyizoluj RNA za pomocą dostępnego w handlu zestawu, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.
    10. Odwrotna transkrypcja wyizolowanego RNA za pomocą zestawu i losowych heksamerów, zgodnie z protokołem producenta.
    11. W przypadku małych stężeń RNA należy wstępnie amplifikować, a następnie rozcieńczyć w stosunku 1:5 wodą wolną od RNaz przed przeprowadzeniem kolejnej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym (RT-PCR). Kontynuuj standardowy protokół RT-PCR w czasie rzeczywistym i sprawdź główne markery sercowe.
      UWAGA: Typowe markery sercowe obejmują wczesne i późne markery z różnych kategorii, takich jak sercowe czynniki transkrypcyjne (specyficzny dla miocytów czynnik wzmacniający 2A [MEF2A], białko wiążące GATA 4 [GATA-4]) i strukturalne (troponina sercowa I [cTnI], troponina sercowa T [cTnT], α-aktynina) i regulacja wapnia (Connexin43 [Cx43], retikulum sarko-/endoplazmatyczne Ca2+-ATPaza [SERCA2])30. W razie potrzeby można również przeprowadzić izolację białka. Jednoczesną izolację RNA i białka można przeprowadzić z tą samą próbką, przy użyciu dostępnych na rynku odczynników i zestawów (tabela materiałów), jeśli ilość próbki jest mniejsza.
  2. Do barwienia immunologicznego
    nuta: Jest to wykonywane bezpośrednio na komórkach przyłączonych do puli komórek konstruktu PDMS. Dlatego zalecamy umieszczanie za każdym razem filmu parafinowego o wymiarach 1 cm x 1 cm na wierzchu puli komórek, z dala od pokrywy płytki, aby zminimalizować parowanie roztworów inkubacyjnych.
    1. Myj konstrukcję 2x 3 ml PBS przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    2. Przymocuj komórki przymocowane do konstruktu za pomocą 2 ml 10% formaliny przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Myj komórki 3x 3 ml PBS przez 5 minut w temperaturze pokojowej. W przypadku długotrwałego przechowywania próbki należy pozostawić w PBS z 0,1% azydkiem sodu w temperaturze 4 °C.
    4. Przetworzyć komórki za pomocą 3 ml PBS + 0,5% detergentu (3x, każdorazowo 5–10 min, w temperaturze pokojowej).
    5. Inkubować komórki ze 100 μl PBS + 10% surowicy końskiej + 0,2% detergentu + 1% albuminy surowicy bydlęcej w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, aby zablokować niespecyficzne wiązanie przeciwciał.
    6. Inkubować komórki ze 100 μl PBS + 10% surowicy końskiej + 0,2% detergentu + 1% albuminy surowicy bydlęcej + przeciwciała pierwszorzędowego w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Na przykład pierwszorzędowe przeciwciała przeciwko Cx43 (1:100), sarkomerowi α-aktininie (1:100), GATA-4 (1:50), MEF2 (1:25) i SERCA2 (1:50).
    7. Umyć 3x 3 ml PBS w temperaturze pokojowej przez 5 min.
    8. Inkubować komórki ze 100 μl PBS + przeciwciała drugorzędowego w temperaturze pokojowej w ciemności przez 1 h.
      nuta: Zastosowano przeciwciała drugorzędowe sprzężone z różnymi fluoroforami i środkiem przeciwbarwiącym.
    9. Umyj je 3x 3 ml PBS w temperaturze pokojowej w ciemności przez 5 min.
    10. Inkubować komórki ze 100 μl barwienia jądrowego (0,1 μg/ml) w PBS w temperaturze pokojowej w ciemności przez 15 minut.
    11. Umyj je 3x 3 ml PBS w temperaturze pokojowej w ciemności przez 5 min.
    12. Próbki należy przechowywać w 3 ml PBS z 0,1% azydkiem sodu w temperaturze 4 °C do momentu nabrania.
      nuta: Akwizycja mikroskopowa jest możliwa w odwróconych mikroskopach fluorescencyjnych i konfokalnych z obiektywami o dużej odległości roboczej, ponieważ grubość konstrukcji wynosi około 0,5 mm.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rysunek 2 przedstawia ogólny schemat przyjęty dla stymulacji komórek. W skrócie, komórki wysiano na konstrukt z PDMS i poddano stymulacji elektromechanicznej, przy czym wymianę pożywki przeprowadzano dwa razy w tygodniu. Komórki niestymulowane posłużyły jako kontrola dla kondycjonowania elektromechanicznego. Dodatkowo wprowadzono do eksperymentu kolejną grupę kontrolną, w której wykorzystano podskórne ATDPCs jako kontrolę dla sercowych ATDPCs. Podskórne ATDPC...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Stymulacja elektromechaniczna wydaje się być bezpieczną alternatywą dla przygotowania komórek do nieprzyjaznego środowiska sercowego i zwiększenia ich zaangażowania sercowego. W tym przypadku protokół opisany dla komórek progenitorowych serca zwiększył ekspresję głównych markerów sercowych i stwierdzono, że jest korzystny dla ich następnej implantacji na mysim mięśniu sercowym30 po zawale serca. Ogólnie rzecz biorąc, elektromechanicznie stymulowane ATDPC serca zwiększały ekspresję genów związanych...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia, poza tym, że urządzenie i protokół stymulacji zostały wcześniej opatentowane (WO-2013185818-A1, WO-2017125159-A1).

Podziękowania

Autorzy pragną podziękować członkom Programu Badawczego ICREC (IGTP, Badalona) oraz Grupy Elektronicznego i Biomedycznego (UPC, Barcelona), szczególnie Prof. J. Rosell-Ferrerowi. Ponadto autorzy wyrażają uznanie dla czasopisma STEM CELLS Translational Medicine i AlphaMed Press za umożliwienie adaptacji wcześniej opublikowanych rycin (Llucià-Valldeperas, et al.30). Opracowanie tego prototypu i projekt protokołu były wspierane przez Ministerio de Educación y Ciencia (SAF 2008-05144), Ministerio de Economía y Competitividad (SAF 2014-59892), 7. program ramowy Komisji Europejskiej (RECATABI, NMP3-SL-2009-229239), Fundació La Marató de TV3 (080330, 201516, 201502) oraz Fundación para la Innovación y la Prospectiva en Salud en España (FIPSE; 06-00001396-15).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Stymulator
niklowane magnesy neodymoweSupermagneteQ-10-10-05-N
niklowane magnesy neodymoweSupermagneteQ-06-04-02-HN
polidimetylosiloksan (PDMS) SYLGAR 184 Zestaw elastomerów silikonowychDow Corning Corp184
krata dyfrakcyjna w kratki (1250 rowki/mm)Newport05RG150-1250-2
Sterownik silnikaFaulhaberMCLM-3006-S
LabviewNational Instruments
Cell culture
fosforanowa sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS)Gibco70013-065
0,05% trypsyna-EDTAGibco25300-120
35 mm naczynie do hodowli komórkowychBD Falcon45353001
płodowa surowica bydlęca (FBS)Gibco10270-106
L-Glutamina 200 mM, 100xGibco25030-024
Penicilina/Streptomicine, 10.000 U/mLGibco15140-122
Minimum niezbędne podłoże orzeł (alfa-MEM)SigmaM4526-24x500ML
Białko & Analizy RNA
proteazykoktajl SigmaP8340
QIAzol Odczynnik do lizyQiagen79306
AllPrep Zestaw RNA/BiałkowyQiagen50980404
Rneasy mini zestawQiagen74104
Uniwersalny zestaw sond iTaq One-StepBio-Rad Laboratories172-5140
Heksamery losoweQiagen79236
TaqMan PreAmp MasterMix 2xApplied Biosystems4391128
TaqMan Universal PCR MasterMixApplied Biosystems4324018
Immunostaining
10% formalinaSigmaHT-501128-4L
surowica końskaSigmaH1138
Triton X-100SigmaX100-500ML
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)SigmaA7906-100G
PARAFILMSigmaP6543
4',6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI)SigmaD9542
Phalloidin Alexa 568InvitrogenA12380
azydek soduSigmaS8032-100g
Hoechst 33342Sigma14533
Connexin-43 królicze przeciwciało pierwszorzędoweSigmaC6219 lot#061M4823
sarkomeryczne i alfa-aktynina mysie przeciwciało pierwszorzędoweSigmaA7811 lot#080M4864
GATA-4 kozie przeciwciało pierwotneR& DAF2606 VAZ0515101
Pierwszorzędowe przeciwciało królika MEF2Santa Cruzsc-313 lot#E0611
SERCA2 kozie przeciwciało pierwotneSanta Cruzsc-8095 lot#D2709
Cy3 przeciwciało drugorzędoweJackson ImmunoResearch711-165-152
Przeciwciało wtórne Cy3Jackson ImmunoResearch715-165-151
Cy3 wtórne przeciwciałoJackson ImmunoResearch712-165-150
Przeciwciało drugorzędowe Cy2Jackson ImmunoResearch715-225-150
Przeciwciało drugorzędowe Cy2Jackson ImmunoResearch711-225-152
Przeciwciało drugorzędowe Cy2Jackson ImmunoResearch705-225-147
inhibitor

Bibliografia

  1. McDonough, P. M., Glembotski, C. C. Induction of atrial natriuretic factor and myosin light chain-2 gene expression in cultured ventricular myocytes by electrical stimulation of contraction. Journal of Biological Chemistry. 267, 11665-11668 (1992).
  2. Tandon, N., et al. Electrical stimulation systems for cardiac tissue engineering. Nature Protocols. 4, 155-173 (2009).
  3. Serena, E., et al. Electrical stimulation of human embryonic stem cells: cardiac differentiation and the generation of reactive oxygen species. Experimental Cell Research. 315, 3611-3619 (2009).
  4. Tandon, N., et al. Optimization of electrical stimulation parameters for cardiac tissue engineering. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 5, 115-125 (2011).
  5. Zhang, X., Wang, Q., Gablaski, B., Lucchesi, P., Zhao, Y. A microdevice for studying intercellular electromechanical transduction in adult cardiac myocytes. Lab on a Chip. 13, 3090-3097 (2013).
  6. Chan, Y. C., et al. Electrical stimulation promotes maturation of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells. Journal of Cardiovascular Translational Research. 6, 989-999 (2013).
  7. Pietronave, S., et al. Monophasic and biphasic electrical stimulation induces a precardiac differentiation in progenitor cells isolated from human heart. Stem Cells and Development. 23, 888-898 (2014).
  8. Pavesi, A., et al. Electrical conditioning of adipose-derived stem cells in a multi-chamber culture platform. Biotechnology and Bioengineering. 111, 1452-1463 (2014).
  9. Baumgartner, S., et al. Electrophysiological and morphological maturation of murine fetal cardiomyocytes during electrical stimulation in vitro. Journal of Cardiovascular Pharmacology and Therapeutics. 20, 104-112 (2015).
  10. Llucià-Valldeperas, A., et al. Electrical stimulation of cardiac adipose tissue-derived progenitor cells modulates cell phenotype and genetic machinery. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 9 (11), 76-83 (2015).
  11. Llucià-Valldeperas, A., et al. Physiological conditioning by electric field stimulation promotes cardiomyogenic gene expression in human cardiomyocyte progenitor cells. Stem Cell Research and Therapy. 5, 93(2014).
  12. Radisic, M., et al. Functional assembly of engineered myocardium by electrical stimulation of cardiac myocytes cultured on scaffolds. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (52), 18129-18134 (2004).
  13. Fink, C., et al. Chronic stretch of engineered heart tissue induces hypertrophy and functional improvement. FASEB Journal. 14, 669-679 (2000).
  14. Zimmermann, W. H., et al. Engineered heart tissue grafts improve systolic and diastolic function in infarcted rat hearts. Nature Medicine. 12 (4), 452-458 (2006).
  15. Birla, R. K., Huang, Y. C., Dennis, R. G. Development of a novel bioreactor for the mechanical loading of tissue-engineered heart muscle. Tissue Engineering. 13, 2239-2248 (2007).
  16. Salameh, A., et al. Cyclic mechanical stretch induces cardiomyocyte orientation and polarization of the gap junction protein connexin43. Circulation Research. 106, 1592-1602 (2010).
  17. Galie, P. A., Stegemann, J. P. Simultaneous application of interstitial flow and cyclic mechanical strain to a three-dimensional cell-seeded hydrogel. Tissue Engineering Part C: Methods. 17 (5), 527-536 (2011).
  18. Leychenko, A., Konorev, E., Jijiwa, M., Matter, M. L. Stretch-induced hypertrophy activates NFkB-mediated VEGF secretion in adult cardiomyocytes. PLoS One. 6, 29055(2011).
  19. Tulloch, N. L., et al. Growth of engineered human myocardium with mechanical loading and vascular coculture. Circulation Research. 109, 47-59 (2011).
  20. Mihic, A., et al. The effect of cyclic stretch on maturation and 3D tissue formation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Biomaterials. 35, 2798-2808 (2014).
  21. Llucià-Valldeperas, A., et al. Unravelling the effects of mechanical physiological conditioning on cardiac adipose tissue-derived progenitor cells in vitro and in silico. Scientific Reports. 8, 499(2018).
  22. Stoppel, W. L., Kaplan, D. L., Black, L. D. Electrical and mechanical stimulation of cardiac cells and tissue constructs. Advanced Drug Delivery Reviews. 96, 135-155 (2016).
  23. Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nature Methods. 10, 781-787 (2013).
  24. Barash, Y., et al. Electric field stimulation integrated into perfusion bioreactor for cardiac tissue engineering. Tissue Engineering Part C: Methods. 16, 1417-1426 (2010).
  25. Maidhof, R., et al. Biomimetic perfusion and electrical stimulation applied in concert improved the assembly of engineered cardiac tissue. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 6, 12-23 (2012).
  26. Feng, Z., et al. An electro-tensile bioreactor for 3-D culturing of cardiomyocytes. A bioreactor system that simulates the myocardium's electrical and mechanical response in vivo. IEEE Engineering in Medicine and Biology Magazine. 24 (4), 73-79 (2005).
  27. Wang, B., et al. Myocardial scaffold-based cardiac tissue engineering: application of coordinated mechanical and electrical stimulations. Langmuir. 29 (35), 11109-11117 (2013).
  28. Morgan, K. Y., Black, L. D. Mimicking isovolumic contraction with combined electromechanical stimulation improves the development of engineered cardiac constructs. Tissue Engineering Part A. 20 (11-12), 1654-1667 (2014).
  29. Godier-Furnémont, A. F., et al. Physiologic force-frequency response in engineered heart muscle by electromechanical stimulation. Biomaterials. 60, 82-91 (2015).
  30. Llucià-Valldeperas, A., et al. Electromechanical Conditioning of Adult Progenitor Cells Improves Recovery of Cardiac Function After Myocardial Infarction. Stem Cell Translational Medicine. 6 (3), 970-981 (2017).
  31. Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
  32. Gelmi, A., et al. Direct Mechanical Stimulation of Stem Cells: A Beating Electromechanically Active Scaffold for Cardiac Tissue Engineering. Advanced Healthcare Materials. 5 (12), 1471-1480 (2016).
  33. Poulin, A., et al. An ultra-fast mechanically active cell culture substrate. Scientific Reports. 8 (1), 9895(2018).
  34. Bayes-Genis, A., et al. Human progenitor cells derived from cardiac adipose tissue ameliorate myocardial infarction in rodents. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 49 (5), 771-780 (2010).
  35. Bagó, J. R., et al. Bioluminescence imaging of cardiomyogenic and vascular differentiation of cardiac and subcutaneous adipose tissue-derived progenitor cells in fibrin patches in a myocardium infarct model. International Journal of Cardiology. 169, 288-295 (2013).
  36. Zimmermann, W. H., et al. Tissue engineering of a differentiated cardiac muscle construct. Circulation Research. 90 (2), 223-230 (2002).
  37. Methods and devices for mechanical and electrical stimulation of stem cell monolayer and 3d cultures for tissue engineering applications. Spanish patent. , Barcelano, Spain. WO/2013/185818 (2013).
  38. Method for Conditioning Stem Cells. Spanish patent. , Barceleno, Spain. WO/2017/125159 (2017).
  39. Roura, S., Gálvez-Montón, C., Bayes-Genis, A. Myocardial healing using cardiac fat. Expert Review of Cardiovascular Therapy. 16 (4), 305-311 (2018).
  40. Zhang, Y. M., Hartzell, C., Narlow, M., Dudley, S. C. Stem cell-derived cardiomyocytes demonstrate arrhythmic potential. Circulation. 106 (10), 1294-1299 (2002).
  41. Liu, J., Fu, J. D., Siu, C. W., Li, R. A. Functional sarcoplasmic reticulum for calcium handling of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes: insights for driven maturation. Stem Cells. 25 (12), 3038-3044 (2007).
  42. Wipff, P. J., et al. The covalent attachment of adhesion molecules to silicone membranes for cell stretching applications. Biomaterials. 30 (9), 1781-1789 (2009).
  43. Kim, C. iPSC technology--Powerful hand for disease modeling and therapeutic screen. Biochemistry and Molecular Biology Reports. 48 (5), 256-265 (2015).
  44. Ronaldson-Bouchard, K., Vunjak-Novakovic, G. Organs-on-a-Chip: A Fast Track for Engineered Human Tissues in Drug Development. Cell Stem Cell. 22 (3), 310-324 (2018).
  45. Bruyneel, A. A., McKeithan, W. L., Feyen, D. A., Mercola, M. Will iPSC-cardiomyocytes revolutionize the discovery of drugs for heart disease. Current Opinion inPharmacology. 42, 55-61 (2018).
  46. Farley, A., Johnstone, C., Hendry, C., McLafferty, E. Nervous system: part 1. Nursing Standard. 28 (31), 46-51 (2014).
  47. Brotto, M., Bonewald, L. Bone and muscle: Interactions beyond mechanical. Bone. 80, 109-114 (2015).
  48. Park, S. J., et al. Neurogenesis Is Induced by Electrical Stimulation of Human Mesenchymal Stem Cells Co-Cultured With Mature Neuronal Cells. Macromolecular Bioscience. 15 (11), 1586-1594 (2015).
  49. Vianney, J. M., Miller, D. A., Spitsbergen, J. M. Effects of acetylcholine and electrical stimulation on glial cell line-derived neurotrophic factor production in skeletal muscle cells. Brain Research. 1588, 47-54 (2014).
  50. Shima, A., Morimoto, Y., Sweeney, H. L., Takeuchi, S. Three-dimensional contractile muscle tissue consisting of human skeletal myocyte cell line. Experimental Cell Research. 370 (1), 168-173 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Stymulacja elektromechanicznasercowe ATDPCkonstrukty PDMSstymulacja elektrycznawysiew komórekPCR w czasie rzeczywistymekspresja GATA-4rozmieszczenie koneksyny 43
Jednoczesna stymulacja elektryczna i mechaniczna w celu zwiększenia potencjału kardiomiogennego komórek
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.