Artykuł metodologiczny

Jednoczesna stymulacja elektryczna i mechaniczna w celu zwiększenia potencjału kardiomiogennego komórek

DOI:

10.3791/58934

⸱

18 stycznia 2019

 ,  , 
1Insuficiencia Cardiaca y Regeneración Cardiaca (ICREC) Research Program, Health Science Research Institute Germans Trias i Pujol, 2Amsterdam Universitair Medisch Centrum (UMC), Vrije Universiteit Amsterdam, Pulmonology and Physiology, Amsterdam Cardiovascular Sciences, 3Electronic and Biomedical Instrumentation Group, Departament d'Enginyeria Electrònica, Universitat Politècnica de Catalunya, 4Cardiology Service, Germans Trias i Pujol University Hospital, 5Department of Medicine, Universitat Autònoma de Barcelona, 6Centro de Investigación Biomédica en Red (CIBER) Cardiovascular, Instituto de Salud Carlos III

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół treningu populacji komórek za pomocą bodźców elektrycznych i mechanicznych naśladujących fizjologię serca. Ta elektromechaniczna stymulacja zwiększa potencjał kardiomiogenny leczonych komórek i jest obiecującą strategią dla dalszej terapii komórkowej, modelowania choroby i badań przesiewowych leków.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Choroby układu krążenia są główną przyczyną zgonów w krajach rozwiniętych. W związku z tym zapotrzebowanie na skuteczne terapie komórkami serca zmotywowało naukowców zajmujących się komórkami macierzystymi i bioinżynierią do opracowania in vitro wysokiej jakości ludzkiego mięśnia sercowego zarówno do badań podstawowych, jak i zastosowań klinicznych. Jednak niedojrzały fenotyp komórek serca jest ograniczeniem w uzyskiwaniu tkanek, które funkcjonalnie naśladują dorosły mięsień sercowy, który charakteryzuje się głównie sygnałami mechanicznymi i elektrycznymi. W związku z tym celem tego protokołu jest przygotowanie i dojrzewanie docelowej populacji komórek poprzez stymulację elektromechaniczną, rekapitulację parametrów fizjologicznych. Inżynieria tkankowa serca ewoluuje w kierunku bardziej biologicznych podejść, a zatem strategie oparte na bodźcach biofizycznych nabierają rozpędu. Opracowane w tym celu urządzenie jest unikalne i umożliwia indywidualną lub jednoczesną stymulację elektryczną i mechaniczną, starannie scharakteryzowaną i zwalidowaną. Ponadto, mimo że metodologia została zoptymalizowana pod kątem tego stymulatora i określonej populacji komórek, można ją łatwo dostosować do innych urządzeń i linii komórkowych. Uzyskane wyniki dostarczają dowodów na zwiększone zaangażowanie serca w populacji komórek po stymulacji elektromechanicznej. Komórki stymulowane elektromechanicznie wykazują zwiększoną ekspresję głównych markerów sercowych, w tym genów wczesnych, strukturalnych i regulujących wapń. To kondycjonowanie komórek może być przydatne w dalszej regeneracyjnej terapii komórkowej, modelowaniu chorób i wysokoprzepustowych badaniach przesiewowych leków.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Funkcja serca opiera się na sprzężeniu pobudzenia elektrycznego i skurczu mechanicznego. Krótko mówiąc, połączenia międzykomórkowe kardiomiocytów umożliwiają propagację sygnału elektrycznego w celu wytworzenia prawie synchronicznych skurczów serca, które pompują krew ogólnoustrojowo i przez układ płucny. Komórki serca podlegają zatem zarówno siłom elektrycznym, jak i mechanicznym, które regulują ekspresję genów i funkcję komórkową. W związku z tym wiele grup próbowało opracować platformy hodowlane, które naśladują środowisko fizjologiczne serca, aby zrozumieć rolę stymulacji mechanicznej i elektrycznej w rozwoju, funkcji i dojrzewaniu serca. Stymulacje elektryczne i mechaniczne in vitro są szeroko stosowane w inżynierii tkanek serca w celu poprawy właściwości funkcjonalnych, przyspieszenia dojrzewania komórek lub poprawy sprzężenia komórka-komórka i obsługi wapnia1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18, 19,20,21. Niemniej jednak, synchroniczne warunkowanie elektromechaniczne pozostaje niewykorzystane ze względu na wyzwanie związane z opracowaniem stymulatora i protokołu, a także ze względu na obowiązkową optymalizację22.

Wstępne prace dotyczyły stymulacji elektromechanicznej jako kombinacji stymulacji elektrycznej i perfuzji mediów; jednak przepływ nie obejmuje deformacji opartej na odkształceniu, typowej dla wypełniania komór23,24,25. Później, bardziej fizjologiczne podejścia łączyły bodźce elektryczne z fizyczną deformacją lub rozciąganiem, aby naśladować skurcz izowolumetryczny26,27,28,29,30,31. Feng i in. opisali pierwszą demonstrację stymulacji elektromechanicznej w 2005 roku, donosząc o zwiększonym rozmiarze kardiomiocytów i właściwościach skurczowych26. Wang i wsp. wstępnie potraktowani mezenchymalne komórki macierzyste 5-azacytydyną i zastosowali jednoczesne kondycjonowanie elektryczne i mechaniczne, poprawiając recelularyzację, żywotność komórek, różnicowanie serca i przebudowę tkanek27. Od czasu tych publikacji więcej grup donosiło o elektromechanicznej stymulacji monowarstw komórkowych lub tkanek inżynieryjnych (np. Black28, Vunjak-Novakovic29,31, a nasza grupa30) z pierwszymi kondycjonowanymi komórkami testowanymi in vivo30. Krótko mówiąc, Morgan i Black przetestowali kilka kombinacji bodźców elektrycznych i mechanicznych, donosząc, że czas między stymulacjami był kluczowy, ponieważ opóźniona połączona stymulacja elektromechaniczna dawała najlepsze wyniki28. Następnie Godier-Furnémont i jego współpracownicy zoptymalizowali protokół stymulacji elektromechanicznej dla zmodyfikowanych konstrukcji mięśnia sercowego z komórek serca noworodków szczurów i po raz pierwszy uzyskali dodatnią zależność między siłą a częstotliwością29. Następnie nasza grupa poinformowała, że elektromechanicznie kondycjonowane komórki zwiększyły ekspresję głównych markerów serca in vitro i szerokie korzystne efekty in vivo, takie jak poprawa funkcji serca lub zwiększona gęstość naczyń w regionie granicznym zawału30. Najnowsza publikacja wykazała, że tkanki serca z kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych poddanych kondycjonowaniu elektromechanicznemu osiągnęły poziom dojrzewania bliższy strukturze i funkcji dorosłego ludzkiego serca31. Dodatkowo, alternatywne trójwymiarowe platformy stymulacji składają się z elektroaktywnych rusztowań, które dostarczają elektryczne, mechaniczne i topograficzne wskazówki do podłączonych komórek32. Co więcej, deformacja mechaniczna (rozciąganie i ściskanie monowarstwy ogniwa) może być również indukowana za pomocą rozciągliwych elektrod naśladujących normalne warunki fizjologiczne, a także warunki ekstremalne33.

Dlatego uzasadnieniem jest, że bodźce elektromechaniczne in vitro oparte na warunkach fizjologicznych mogą zwiększyć kardiomiogenny potencjał komórki. Stymulacja ta może przyczynić się do dalszej integracji komórek terapeutycznych z mięśniem sercowym w scenariuszu klinicznym lub przyspieszyć dojrzewanie tkanek do zastosowań w badaniach przesiewowych leków.

Ponadto, wyizolowaliśmy i scharakteryzowaliśmy populację komórek progenitorowych pochodzenia sercowego pochodzących z ludzkiej tkanki tłuszczowej (ATDPC serca)34. Komórki te znajdują się w tłuszczu nasierdziowym. Komórki te wykazują korzystne działanie histopatologiczne i czynnościowe w leczeniu zawału mięśnia sercowego, a także utrzymują potencjał różnicowania serca i śródbłonka. 30,35. Postawiliśmy hipotezę, że korzyści te wzrosną po stymulacji biofizycznej.

W związku z tym opracowaliśmy urządzenie i reżim stymulacji dla interesującej nas populacji komórek i zbadaliśmy efekty. Ten elektromechaniczny protokół jest nową strategią indukowania aktywnego rozciągania komórek w sterylny i nieinwazyjny sposób w porównaniu z poprzednimi publikacjami36, w połączeniu ze stymulacją polem elektrycznym. Opisana tutaj technika szczegółowo wyjaśnia urządzenie i metodę używaną do elektrycznej, mechanicznej i elektromechanicznej stymulacji komórek.

To urządzenie może dostarczać zarówno elektryczną, jak i mechaniczną stymulację, niezależnie lub równocześnie. Stymulacja jest wykonywana za pomocą nieinwazyjnego i aseptycznego nowatorskiego podejścia, które obejmuje wstępnie wysterylizowane podparcie komórek, elektrody umieszczone wewnątrz standardowej płytki hodowlanej oraz platformę, która indukuje siły mechaniczne i elektryczne (ryc. 1).

Platforma może pomieścić do sześciu płytek hodowlanych i składa się z warstwowej struktury z wycinanego laserowo poli(metakrylanu metylu) i elementów płytki drukowanej. Prototyp platformy opiera się na połączeniu monofazowego, programowalnego, sterowanego komputerowo stymulatora elektrycznego, płytki drukowanej do solidnego połączenia elektrod oraz sześciu niklowanych, neodymowych magnesów o wymiarach 10 mm x 10 mm x 5 mm, umieszczonych po jednej stronie płytek hodowlanych. Jest też aluminiowy pręt z sześcioma magnesami napędowymi (ten sam model) umieszczony przed drugą stroną płytek hodowlanych i poruszany za pomocą serwomotoru liniowego. Silnik jest napędzany przez sterownik silnika, obsługiwany przez port RS-232 przez komercyjne oprogramowanie (patrz tabela materiałów). Za pomocą interfejsu użytkownika i programowalnego stymulatora można zaprogramować natężenie elektryczne, czas trwania i częstotliwość impulsu, częstotliwość stymulacji mechanicznej, jej cykl pracy, liczbę impulsów, amplitudę impulsu (wychylenie magnesu) oraz nachylenie.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Stymulator elektromechaniczny. (A) Konstrukt PDMS używany do kondycjonowania komórek. (B) Rysunek konstrukcji PDMS, w tym elektrod i magnesów. (C) Szczegóły dotyczące płytki obwodu drukowanego (platformy) użytej do przeprowadzenia kondycjonowania elektromechanicznego. Ten panel został zmodyfikowany z Llucià-Valldeperas et al.30. (D) Zdjęcie platformy stymulacji elektromechanicznej i interfejsu użytkownika (komputera). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Zarówno stymulator, jak i metoda kondycjonowania elektromechanicznego są w pełni opisane w dwóch międzynarodowych patentach, WO-2013185818-A137 i WO-2017125159-A138.

Biokompatybilne silikonowe konstrukcje zaprojektowane w celu zapewnienia strukturalnego wsparcia dla komórek, elektrod i magnesów zostały opisane wcześniej10,21. Krótko mówiąc, składają się z polidimetylosiloksanu (PDMS), formowanego i utwardzanego w temperaturze pokojowej, o module Younga wynoszącym 1,3 MPa, zbliżonym do poziomu fizjologicznego. Konstrukcja zawiera pulę kultur komórkowych w elastycznym obszarze (10 mm x 10 mm x 2 mm), dwie wewnętrzne poprzeczne szczeliny do przechowywania elektrod oraz dwa wbudowane niklowane magnesy neodymowe o wymiarach 6 mm x 2 mm x 4 mm. Elektrody są zbudowane z drutu platynowego o średnicy 0,2 mm skręconego wokół pręta rdzeniowego z politetrafluoroetylenu (PTFE) o wymiarach 2 mm x 3 mm x 12 mm (21 cm na elektrodę, około 23 zwoje) i umieszczone po przeciwnych stronach elastycznego obszaru, aby wytworzyć pole elektryczne do indukowania stymulacji elektrycznej. Rozciąganie mechaniczne uzyskuje się poprzez przyciąganie magnetyczne między magnesami osadzonymi w podporze a magnesami zewnętrznymi umieszczonymi obok płytki hodowlanej i na ruchomym ramieniu aluminiowym. W ten sposób można przedłużyć podparcie komórki bez naruszania bariery sterylnej. Podejście to jest odpowiednie dla monowarstwy komórek, ale można je również dostosować do konstrukcji trójwymiarowych.

Dodatkowo, regularny wzór mógłby zostać nadrukowany w miejscu, w którym komórki są zasiane, za pomocą liniowej siatki dyfrakcyjnej (1,250 rowków/mm). Bezpośrednia wizualizacja komórek hodowanych na konstrukcie PDMS pod mikroskopem jasnym i fluorescencyjnym jest możliwa ze względu na jego przezroczystość i grubość 0,5 mm. W obecnym przypadku pula hodowlana PDMS ma pionowy wzór powierzchni, prostopadły do siły rozciągającej, aby ustawić komórki prostopadle do pola elektrycznego, co minimalizuje gradient pola elektrycznego w komórce.

Rysunek 1 pokazuje szczegółowy opis konstrukcji i urządzenia użytego do stymulacji. Konstrukcja i charakterystyka PDMS są zoptymalizowane pod kątem rozciągania komórek (Rysunek 1A,B). Stymulator został opracowany i zatwierdzony pod kątem skutecznego zastosowania pożądanej stymulacji elektrycznej i mechanicznej do komórek przyłączonych do konstruktu PDMS. Proces ten obejmuje zapewnienie dobrej łączności i łatwości obsługi przez użytkownika za pośrednictwem interfejsu oprogramowania (rysunek 1C,D).

Procedura stymulacji komórek za pomocą tego specjalnie wykonanego urządzenia jest opisana w sekcji protokołu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie wykorzystuje ludzkie kardiologiczne ATDPC z próbek pacjentów. Ich stosowanie zostało zatwierdzone przez lokalną komisję etyczną, a wszyscy pacjenci wyrazili świadomą zgodę. Protokół badania jest zgodny z zasadami określonymi w Deklaracji Helsińskiej.

1. Przygotowania

  1. Autoklawuj w autoklawie dwie pęsety, 12 platynowych elektrod PTFE do stymulacji elektrycznej i kilka ręczników papierowych w temperaturze 121 °C przez 20 minut.
  2. Wysterylizuj 12 niestandardowych konstrukcji PDMS (Rysunek 1A).
    1. Myć każdą konstrukcję 5 ml sterylnej, destylowanej wody z mieszaniem magnetycznym w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
    2. Myć 1x 5 ml 70% etanolu z mieszaniem magnetycznym w temperaturze pokojowej przez 5 min.
    3. Przemyć 5x 5 ml sterylnej, destylowanej wody z mieszaniem magnetycznym w temperaturze pokojowej przez 10 minut na pranie, w celu usunięcia pozostałości alkoholowych.
    4. Wysuszyć konstrukcje na sterylnych ręcznikach papierowych wewnątrz komory przepływowej przez noc.
    5. Przechowuj je w sterylnych probówkach wirówkowych o pojemności 50 ml do czasu użycia.

2. Sadzenie komórek (Dzień -1)

  1. Przed wysiewem komórek przenieś oczyszczone konstrukcje PDMS na sterylne płytki i wystaw je na działanie światła ultrafioletowego przez 5 minut, aby zapewnić całkowitą sterylizację.
  2. Przenieś każdy konstrukt na 35-milimetrową płytkę do hodowli komórkowej lub płytkę 6-dołkową w celu natychmiastowego wysiewu komórek.
  3. Trypsynizuj zlewającą się kolbę T75 z sercowymi ATDPC.
    1. Przemyć kolbę T75 5 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
    2. Dodać 1 ml 0,05% trypsyny-EDTA i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut w celu odłączenia komórek.
    3. Dodaj 5 ml kompletnej pożywki, aby dezaktywować trypsynę-EDTA.
    4. Zebrać wszystkie komórki do probówki o pojemności 15 ml i przemyć kolbę 2x 5 ml PBS, aby zebrać pozostałe komórki.
    5. Wirować przy 230 x g przez 5 minut w temperaturze 22 °C, usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 2 ml kompletnej pożywki w celu policzenia ich w komorze hemocytometru.
  4. Wysiewaj 200 μl sercowych ATDPC (2,5 x 105 komórek/ml) do puli komórkowej 12 konstruktów PDMS (Rysunek 1A,B), aby następnego dnia ~80% powierzchni wysiewu pokryło się komórkami, i inkubuj w temperaturze 37 °C i 5% CO2,
    nuta: Po 2–4 godzinach ogniwa należy przymocować. Inokulum komórkowe przygotowuje się w zależności od wielkości i wzrostu komórki. W przypadku mniejszych komórek należy zwiększyć gęstość wysiewu.
  5. Delikatnie dodaj 2 ml podgrzanej kompletnej pożywki (α-MEM uzupełnionej 10% płodowej surowicy bydlęcej, 1% L-glutaminy i 1% penicyliny-streptomycyny) na płytkę.
  6. Inkubować konstrukty w warunkach hodowli (zwykle 37 °C i 5% CO2 ) przez noc.

3. Konfiguracja stymulacji elektromechanicznej (Dzień 0)

  1. Przed rozpoczęciem procedury należy pobrać sześć konstruktów do stymulacji elektromechanicznej i sześć jako niestymulowane kontrole. Mając mniej niż sześć płytek na stymulację, użyj pustych konstruktów o tej samej objętości medium, aby zapewnić odpowiednią stymulację polem elektrycznym.
  2. Wyczyść jednostkę stymulacji 70% etanolem i umieść ją w komorze przepływowej.
  3. Przenieś sterylne elektrody i pęsetę do komory przepływowej.
  4. Usuń 90% pożywki z płytki hodowlanej, aby łatwo manipulować elektrodami i konstrukcjami. Po pierwsze, umieść konstrukty PDMS we właściwej pozycji, aby zapewnić przyciąganie magnetyczne (przemieszczenie PDMS w płytce hodowlanej w kierunku magnesu) zarówno między magnesami stałymi, jak i ruchomymi. Następnie podłącz przewód platynowy do złączy elektrod i części PTFE w wyznaczonym miejscu w konstrukcji PDMS.
  5. Dodaj 2,5 ml świeżej, wstępnie podgrzanej, kompletnej pożywki do każdego konstruktu.
    nuta: Utrzymuj sterylność przez cały zabieg i operuj na jednym konstrukcie na raz. Pozostałe konstrukty należy utrzymywać w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 do momentu użycia.
  6. Po umieszczeniu wszystkich konstrukcji PDMS i podłączeniu ich elektrycznie do platformy, należy wprowadzić platformę z powrotem do inkubatora w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  7. Podłącz źródło elektryczne i mechaniczne.
  8. Skonfiguruj program stymulacji. Określ reżimy stymulacji elektrycznej i mechanicznej za pomocą interfejsów użytkownika stymulatora elektrycznego i aplikacji, która steruje stymulacją mechaniczną. Ustaw synchronizację w następujący sposób.
    1. Włączyć stymulator elektryczny. Poczekaj, aż na wyświetlaczu pojawi się menu główne.
      1. Następnie wybierz opcję 2: Edytuj sekwencję + Enter.
      2. Edytuj menu sekwencji w następujący sposób.
        1. Użyj zakładki Tryb, aby wybrać napięcie lub prąd. Wybierz bieżącą, klikając + i naciśnij Enter.
        2. Na karcie Amplituda wybierz 1 (mA) za pomocą +/- i naciśnij Enter.
        3. W polu Period (T) (T) wybierz wartość 1000 (ms) z +/- i naciśnij Enter.
        4. Ustaw czas trwania impulsu (Tw) na 2 (ms) za pomocą +/- i naciśnij Enter.
        5. Na karcie Tryb wyzwalania wybierz opcję Zewnętrzne przez oprogramowanie i naciśnij Enter.
        6. Wróć do menu głównego wybierz opcję 4: Generuj sekwencję i naciśnij Enter.
          UWAGA: Stymulator elektryczny pozostaje w trybie czuwania, dopóki nie otrzyma polecenia wyzwalania z aplikacji stymulatora mechanicznego przez port szeregowy.
    2. Wykonaj następujące kroki w sekcji stymulacji mechanicznej panelu aplikacji sterującej (Rysunek 2C).
      1. Wpisz 1,000 (ms) w kontrolce tekstu Okres impulsu.
      2. Wpisz 500 (ms) w kontrolce tekstowej czasu włączenia (Tw), aby ustawić czas trwania impulsu mechanicznego.
      3. Wpisz 2,000 (AU) w kontrolce tekstu Wychylenie, aby uzyskać 10% wydłużenie konstrukcji. Jest to liczba kroków w silniku sterowania liniowego.
        UWAGA: Zastosowany tutaj protokół stymulacji składa się z monofazowych impulsów prostokątnych prądu przemiennego o długości 2 ms o napięciu 50 mV/cm przy 1 Hz i 10% rozciąganiu przez 7 dni. Czasy narastania i opadania impulsu mechanicznego są ustawione na 100 ms, aby z grubsza naśladować kształt impulsu ciśnienia w palenisku. Ponadto tryb powtarzania jest ustawiony na Ciągły i jest licznik wyświetlający liczbę impulsów.
  9. Zmieniaj media 2 razy w tygodniu (poniedziałki i czwartki po południu). Najpierw usuń stare nośniki; następnie dodaj ciepłe media po bokach wspornika PDMS, nigdy bezpośrednio na puli komórek.
    nuta: Jeśli komórki mają wysokie tempo wzrostu, podłoże należy wymieniać 3 razy w tygodniu (np. w poniedziałek, środę i piątek). Konieczne jest odłączenie i ponowne podłączenie wszystkich, ale nie ma potrzeby wyjmowania płytek hodowlanych i elektrod z ich miejsca.
  10. Próbki należy pobrać po przeprowadzeniu eksperymentu.

4. Pobieranie próbek na koniec eksperymentów (dzień 7)

  1. Do analiz RNA
    1. Myj konstrukcję 2x 3 ml 1x PBS przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    2. Dodać 3 ml 0,05% trypsyny-EDTA do każdej płytki (tyle, aby pokryć całą konstrukcję) i odczekać 5 minut w temperaturze 37 °C.
    3. Po odłączeniu komórek dodaj 2 ml kompletnej pożywki, aby dezaktywować trypsynę-EDTA.
    4. Zbierz wszystkie komórki do probówki o pojemności 15 ml i umyj konstrukt 2x 3 ml PBS, aby zebrać pozostałe komórki.
    5. Wirować przy 230 x g przez 5 minut w temperaturze 22 °C.
    6. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml PBS.
    7. Przenieść roztwór komórek do probówki o pojemności 1,5 ml i odwirować przy 230 x g przez 5 minut.
    8. Usunąć supernatant i przechowywać osad w temperaturze -80 °C w 700 μl odczynnika do lizy w celu dalszej izolacji RNA.
    9. Wyizoluj RNA za pomocą dostępnego w handlu zestawu, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.
    10. Odwrotna transkrypcja wyizolowanego RNA za pomocą zestawu i losowych heksamerów, zgodnie z protokołem producenta.
    11. W przypadku małych stężeń RNA należy wstępnie amplifikować, a następnie rozcieńczyć w stosunku 1:5 wodą wolną od RNaz przed przeprowadzeniem kolejnej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym (RT-PCR). Kontynuuj standardowy protokół RT-PCR w czasie rzeczywistym i sprawdź główne markery sercowe.
      UWAGA: Typowe markery sercowe obejmują wczesne i późne markery z różnych kategorii, takich jak sercowe czynniki transkrypcyjne (specyficzny dla miocytów czynnik wzmacniający 2A [MEF2A], białko wiążące GATA 4 [GATA-4]) i strukturalne (troponina sercowa I [cTnI], troponina sercowa T [cTnT], α-aktynina) i regulacja wapnia (Connexin43 [Cx43], retikulum sarko-/endoplazmatyczne Ca2+-ATPaza [SERCA2])30. W razie potrzeby można również przeprowadzić izolację białka. Jednoczesną izolację RNA i białka można przeprowadzić z tą samą próbką, przy użyciu dostępnych na rynku odczynników i zestawów (tabela materiałów), jeśli ilość próbki jest mniejsza.
  2. Do barwienia immunologicznego
    nuta: Jest to wykonywane bezpośrednio na komórkach przyłączonych do puli komórek konstruktu PDMS. Dlatego zalecamy umieszczanie za każdym razem filmu parafinowego o wymiarach 1 cm x 1 cm na wierzchu puli komórek, z dala od pokrywy płytki, aby zminimalizować parowanie roztworów inkubacyjnych.
    1. Myj konstrukcję 2x 3 ml PBS przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    2. Przymocuj komórki przymocowane do konstruktu za pomocą 2 ml 10% formaliny przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Myj komórki 3x 3 ml PBS przez 5 minut w temperaturze pokojowej. W przypadku długotrwałego przechowywania próbki należy pozostawić w PBS z 0,1% azydkiem sodu w temperaturze 4 °C.
    4. Przetworzyć komórki za pomocą 3 ml PBS + 0,5% detergentu (3x, każdorazowo 5–10 min, w temperaturze pokojowej).
    5. Inkubować komórki ze 100 μl PBS + 10% surowicy końskiej + 0,2% detergentu + 1% albuminy surowicy bydlęcej w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, aby zablokować niespecyficzne wiązanie przeciwciał.
    6. Inkubować komórki ze 100 μl PBS + 10% surowicy końskiej + 0,2% detergentu + 1% albuminy surowicy bydlęcej + przeciwciała pierwszorzędowego w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Na przykład pierwszorzędowe przeciwciała przeciwko Cx43 (1:100), sarkomerowi α-aktininie (1:100), GATA-4 (1:50), MEF2 (1:25) i SERCA2 (1:50).
    7. Umyć 3x 3 ml PBS w temperaturze pokojowej przez 5 min.
    8. Inkubować komórki ze 100 μl PBS + przeciwciała drugorzędowego w temperaturze pokojowej w ciemności przez 1 h.
      nuta: Zastosowano przeciwciała drugorzędowe sprzężone z różnymi fluoroforami i środkiem przeciwbarwiącym.
    9. Umyj je 3x 3 ml PBS w temperaturze pokojowej w ciemności przez 5 min.
    10. Inkubować komórki ze 100 μl barwienia jądrowego (0,1 μg/ml) w PBS w temperaturze pokojowej w ciemności przez 15 minut.
    11. Umyj je 3x 3 ml PBS w temperaturze pokojowej w ciemności przez 5 min.
    12. Próbki należy przechowywać w 3 ml PBS z 0,1% azydkiem sodu w temperaturze 4 °C do momentu nabrania.
      nuta: Akwizycja mikroskopowa jest możliwa w odwróconych mikroskopach fluorescencyjnych i konfokalnych z obiektywami o dużej odległości roboczej, ponieważ grubość konstrukcji wynosi około 0,5 mm.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 2 przedstawia ogólny schemat stosowany do stymulacji komórek. Krótko mówiąc, komórki wysiewano na konstrukcie PDMS i poddawano stymulacji elektromechanicznej, z wymianą pożywki wykonywaną dwa razy w tygodniu. Niestymulowane komórki wykorzystano jako kontrolę kondycjonowania elektromechanicznego. Dodatkowo dodaliśmy dodatkową kontrolę do eksperymentu, a podskórne ATDPC zostały użyte jako kontrola dla ATDPC serca. Podskórne ATDPC są otrzymywane z podskó...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stymulacja elektromechaniczna wydaje się być bezpieczną alternatywą dla przygotowania komórek do nieprzyjaznego środowiska sercowego i zwiększenia ich zaangażowania sercowego. W tym przypadku protokół opisany dla komórek progenitorowych serca zwiększył ekspresję głównych markerów sercowych i stwierdzono, że jest korzystny dla ich następnej implantacji na mysim mięśniu sercowym30 po zawale serca. Ogólnie rzecz biorąc, elektromechanicznie stymulowane ATDPC serca zwiększały ekspresję genów związanych...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia, poza tym, że urządzenie i protokół stymulacji zostały wcześniej opatentowane (WO-2013185818-A1, WO-2017125159-A1).

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy pragną podziękować członkom Programu Badawczego ICREC (IGTP, Badalona) oraz Grupy Elektronicznego i Biomedycznego (UPC, Barcelona), szczególnie Prof. J. Rosell-Ferrerowi. Ponadto autorzy wyrażają uznanie dla czasopisma STEM CELLS Translational Medicine i AlphaMed Press za umożliwienie adaptacji wcześniej opublikowanych rycin (Llucià-Valldeperas, et al.30). Opracowanie tego prototypu i projekt protokołu były wspierane przez Ministerio de Educación y Ciencia (SAF 2008-05144), Ministerio de Economía y Competitividad (SAF 2014-59892), 7. program ramowy Komisji Europejskiej (RECATABI, NMP3-SL-2009-229239), Fundació La Marató de TV3 (080330, 201516, 201502) oraz Fundación para la Innovación y la Prospectiva en Salud en España (FIPSE; 06-00001396-15).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Stymulator
niklowane magnesy neodymoweSupermagneteQ-10-10-05-N
niklowane magnesy neodymoweSupermagneteQ-06-04-02-HN
polidimetylosiloksan (PDMS) SYLGAR 184 Zestaw elastomerów silikonowychDow Corning Corp184
krata dyfrakcyjna w kratki (1250 rowki/mm)Newport05RG150-1250-2
Sterownik silnikaFaulhaberMCLM-3006-S
LabviewNational Instruments
Cell culture
fosforanowa sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS)Gibco70013-065
0,05% trypsyna-EDTAGibco25300-120
35 mm naczynie do hodowli komórkowychBD Falcon45353001
płodowa surowica bydlęca (FBS)Gibco10270-106
L-Glutamina 200 mM, 100xGibco25030-024
Penicilina/Streptomicine, 10.000 U/mLGibco15140-122
Minimum niezbędne podłoże orzeł (alfa-MEM)SigmaM4526-24x500ML
Białko & Analizy RNA
proteazykoktajl SigmaP8340
QIAzol Odczynnik do lizyQiagen79306
AllPrep Zestaw RNA/BiałkowyQiagen50980404
Rneasy mini zestawQiagen74104
Uniwersalny zestaw sond iTaq One-StepBio-Rad Laboratories172-5140
Heksamery losoweQiagen79236
TaqMan PreAmp MasterMix 2xApplied Biosystems4391128
TaqMan Universal PCR MasterMixApplied Biosystems4324018
Immunostaining
10% formalinaSigmaHT-501128-4L
surowica końskaSigmaH1138
Triton X-100SigmaX100-500ML
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)SigmaA7906-100G
PARAFILMSigmaP6543
4',6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI)SigmaD9542
Phalloidin Alexa 568InvitrogenA12380
azydek soduSigmaS8032-100g
Hoechst 33342Sigma14533
Connexin-43 królicze przeciwciało pierwszorzędoweSigmaC6219 lot#061M4823
sarkomeryczne i alfa-aktynina mysie przeciwciało pierwszorzędoweSigmaA7811 lot#080M4864
GATA-4 kozie przeciwciało pierwotneR& DAF2606 VAZ0515101
Pierwszorzędowe przeciwciało królika MEF2Santa Cruzsc-313 lot#E0611
SERCA2 kozie przeciwciało pierwotneSanta Cruzsc-8095 lot#D2709
Cy3 przeciwciało drugorzędoweJackson ImmunoResearch711-165-152
Przeciwciało wtórne Cy3Jackson ImmunoResearch715-165-151
Cy3 wtórne przeciwciałoJackson ImmunoResearch712-165-150
Przeciwciało drugorzędowe Cy2Jackson ImmunoResearch715-225-150
Przeciwciało drugorzędowe Cy2Jackson ImmunoResearch711-225-152
Przeciwciało drugorzędowe Cy2Jackson ImmunoResearch705-225-147
inhibitor

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. McDonough, P. M., Glembotski, C. C. Induction of atrial natriuretic factor and myosin light chain-2 gene expression in cultured ventricular myocytes by electrical stimulation of contraction. Journal of Biological Chemistry. 267, 11665-11668 (1992).
  2. Tandon, N., et al. Electrical stimulation systems for cardiac tissue engineering. Nature Protocols. 4, 155-173 (2009).
  3. Serena, E., et al. Electrical stimulation of human embryonic stem cells: cardiac differentiation and the generation of reactive oxygen species. Experimental Cell Research. 315, 3611-3619 (2009).
  4. Tandon, N., et al. Optimization of electrical stimulation parameters for cardiac tissue engineering. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 5, 115-125 (2011).
  5. Zhang, X., Wang, Q., Gablaski, B., Lucchesi, P., Zhao, Y. A microdevice for studying intercellular electromechanical transduction in adult cardiac myocytes. Lab on a Chip. 13, 3090-3097 (2013).
  6. Chan, Y. C., et al. Electrical stimulation promotes maturation of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells. Journal of Cardiovascular Translational Research. 6, 989-999 (2013).
  7. Pietronave, S., et al. Monophasic and biphasic electrical stimulation induces a precardiac differentiation in progenitor cells isolated from human heart. Stem Cells and Development. 23, 888-898 (2014).
  8. Pavesi, A., et al. Electrical conditioning of adipose-derived stem cells in a multi-chamber culture platform. Biotechnology and Bioengineering. 111, 1452-1463 (2014).
  9. Baumgartner, S., et al. Electrophysiological and morphological maturation of murine fetal cardiomyocytes during electrical stimulation in vitro. Journal of Cardiovascular Pharmacology and Therapeutics. 20, 104-112 (2015).
  10. Llucià-Valldeperas, A., et al. Electrical stimulation of cardiac adipose tissue-derived progenitor cells modulates cell phenotype and genetic machinery. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 9 (11), 76-83 (2015).
  11. Llucià-Valldeperas, A., et al. Physiological conditioning by electric field stimulation promotes cardiomyogenic gene expression in human cardiomyocyte progenitor cells. Stem Cell Research and Therapy. 5, 93(2014).
  12. Radisic, M., et al. Functional assembly of engineered myocardium by electrical stimulation of cardiac myocytes cultured on scaffolds. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (52), 18129-18134 (2004).
  13. Fink, C., et al. Chronic stretch of engineered heart tissue induces hypertrophy and functional improvement. FASEB Journal. 14, 669-679 (2000).
  14. Zimmermann, W. H., et al. Engineered heart tissue grafts improve systolic and diastolic function in infarcted rat hearts. Nature Medicine. 12 (4), 452-458 (2006).
  15. Birla, R. K., Huang, Y. C., Dennis, R. G. Development of a novel bioreactor for the mechanical loading of tissue-engineered heart muscle. Tissue Engineering. 13, 2239-2248 (2007).
  16. Salameh, A., et al. Cyclic mechanical stretch induces cardiomyocyte orientation and polarization of the gap junction protein connexin43. Circulation Research. 106, 1592-1602 (2010).
  17. Galie, P. A., Stegemann, J. P. Simultaneous application of interstitial flow and cyclic mechanical strain to a three-dimensional cell-seeded hydrogel. Tissue Engineering Part C: Methods. 17 (5), 527-536 (2011).
  18. Leychenko, A., Konorev, E., Jijiwa, M., Matter, M. L. Stretch-induced hypertrophy activates NFkB-mediated VEGF secretion in adult cardiomyocytes. PLoS One. 6, 29055(2011).
  19. Tulloch, N. L., et al. Growth of engineered human myocardium with mechanical loading and vascular coculture. Circulation Research. 109, 47-59 (2011).
  20. Mihic, A., et al. The effect of cyclic stretch on maturation and 3D tissue formation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Biomaterials. 35, 2798-2808 (2014).
  21. Llucià-Valldeperas, A., et al. Unravelling the effects of mechanical physiological conditioning on cardiac adipose tissue-derived progenitor cells in vitro and in silico. Scientific Reports. 8, 499(2018).
  22. Stoppel, W. L., Kaplan, D. L., Black, L. D. Electrical and mechanical stimulation of cardiac cells and tissue constructs. Advanced Drug Delivery Reviews. 96, 135-155 (2016).
  23. Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nature Methods. 10, 781-787 (2013).
  24. Barash, Y., et al. Electric field stimulation integrated into perfusion bioreactor for cardiac tissue engineering. Tissue Engineering Part C: Methods. 16, 1417-1426 (2010).
  25. Maidhof, R., et al. Biomimetic perfusion and electrical stimulation applied in concert improved the assembly of engineered cardiac tissue. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 6, 12-23 (2012).
  26. Feng, Z., et al. An electro-tensile bioreactor for 3-D culturing of cardiomyocytes. A bioreactor system that simulates the myocardium's electrical and mechanical response in vivo. IEEE Engineering in Medicine and Biology Magazine. 24 (4), 73-79 (2005).
  27. Wang, B., et al. Myocardial scaffold-based cardiac tissue engineering: application of coordinated mechanical and electrical stimulations. Langmuir. 29 (35), 11109-11117 (2013).
  28. Morgan, K. Y., Black, L. D. Mimicking isovolumic contraction with combined electromechanical stimulation improves the development of engineered cardiac constructs. Tissue Engineering Part A. 20 (11-12), 1654-1667 (2014).
  29. Godier-Furnémont, A. F., et al. Physiologic force-frequency response in engineered heart muscle by electromechanical stimulation. Biomaterials. 60, 82-91 (2015).
  30. Llucià-Valldeperas, A., et al. Electromechanical Conditioning of Adult Progenitor Cells Improves Recovery of Cardiac Function After Myocardial Infarction. Stem Cell Translational Medicine. 6 (3), 970-981 (2017).
  31. Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
  32. Gelmi, A., et al. Direct Mechanical Stimulation of Stem Cells: A Beating Electromechanically Active Scaffold for Cardiac Tissue Engineering. Advanced Healthcare Materials. 5 (12), 1471-1480 (2016).
  33. Poulin, A., et al. An ultra-fast mechanically active cell culture substrate. Scientific Reports. 8 (1), 9895(2018).
  34. Bayes-Genis, A., et al. Human progenitor cells derived from cardiac adipose tissue ameliorate myocardial infarction in rodents. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 49 (5), 771-780 (2010).
  35. Bagó, J. R., et al. Bioluminescence imaging of cardiomyogenic and vascular differentiation of cardiac and subcutaneous adipose tissue-derived progenitor cells in fibrin patches in a myocardium infarct model. International Journal of Cardiology. 169, 288-295 (2013).
  36. Zimmermann, W. H., et al. Tissue engineering of a differentiated cardiac muscle construct. Circulation Research. 90 (2), 223-230 (2002).
  37. Methods and devices for mechanical and electrical stimulation of stem cell monolayer and 3d cultures for tissue engineering applications. Spanish patent. , Barcelano, Spain. WO/2013/185818 (2013).
  38. Method for Conditioning Stem Cells. Spanish patent. , Barceleno, Spain. WO/2017/125159 (2017).
  39. Roura, S., Gálvez-Montón, C., Bayes-Genis, A. Myocardial healing using cardiac fat. Expert Review of Cardiovascular Therapy. 16 (4), 305-311 (2018).
  40. Zhang, Y. M., Hartzell, C., Narlow, M., Dudley, S. C. Stem cell-derived cardiomyocytes demonstrate arrhythmic potential. Circulation. 106 (10), 1294-1299 (2002).
  41. Liu, J., Fu, J. D., Siu, C. W., Li, R. A. Functional sarcoplasmic reticulum for calcium handling of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes: insights for driven maturation. Stem Cells. 25 (12), 3038-3044 (2007).
  42. Wipff, P. J., et al. The covalent attachment of adhesion molecules to silicone membranes for cell stretching applications. Biomaterials. 30 (9), 1781-1789 (2009).
  43. Kim, C. iPSC technology--Powerful hand for disease modeling and therapeutic screen. Biochemistry and Molecular Biology Reports. 48 (5), 256-265 (2015).
  44. Ronaldson-Bouchard, K., Vunjak-Novakovic, G. Organs-on-a-Chip: A Fast Track for Engineered Human Tissues in Drug Development. Cell Stem Cell. 22 (3), 310-324 (2018).
  45. Bruyneel, A. A., McKeithan, W. L., Feyen, D. A., Mercola, M. Will iPSC-cardiomyocytes revolutionize the discovery of drugs for heart disease. Current Opinion inPharmacology. 42, 55-61 (2018).
  46. Farley, A., Johnstone, C., Hendry, C., McLafferty, E. Nervous system: part 1. Nursing Standard. 28 (31), 46-51 (2014).
  47. Brotto, M., Bonewald, L. Bone and muscle: Interactions beyond mechanical. Bone. 80, 109-114 (2015).
  48. Park, S. J., et al. Neurogenesis Is Induced by Electrical Stimulation of Human Mesenchymal Stem Cells Co-Cultured With Mature Neuronal Cells. Macromolecular Bioscience. 15 (11), 1586-1594 (2015).
  49. Vianney, J. M., Miller, D. A., Spitsbergen, J. M. Effects of acetylcholine and electrical stimulation on glial cell line-derived neurotrophic factor production in skeletal muscle cells. Brain Research. 1588, 47-54 (2014).
  50. Shima, A., Morimoto, Y., Sweeney, H. L., Takeuchi, S. Three-dimensional contractile muscle tissue consisting of human skeletal myocyte cell line. Experimental Cell Research. 370 (1), 168-173 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Stymulacja elektromechanicznasercowe ATDPCkonstrukty PDMSstymulacja elektrycznawysiew kom rekPCR w czasie rzeczywistymekspresja GATA 4rozmieszczenie koneksyny 43

Powiązane artykuły