Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wykrywanie aktywności proteazy za pomocą fluorescencyjnej symografii peptydowej

13K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58938

⸱

20 stycznia 2019

 ,  , 
1Comprehensive Cancer Center, James Cancer Hospital and Solove Research Center, Ohio State University, 2Department of Biomedical Engineering, College of Engineering, Ohio State University

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół dla zmodyfikowanej techniki zymograficznej, w której peptydy fluorescencyjne są używane jako degradowalny substrat zamiast natywnych białek. Elektroforeza próbek biologicznych w fluorescencyjnych zymogramach peptydowych umożliwia wykrycie szerszego zakresu proteaz niż dotychczasowe techniki zymograficzne.

Streszczenie

Celem tej metody jest pomiar aktywności proteolitycznej złożonych próbek biologicznych. Próbki rozdziela się według masy cząsteczkowej za pomocą elektroforezy za pomocą żelu rozdzielczego osadzonego w degradowalnym podłożu. Metoda ta różni się od tradycyjnej zymografii żelowej tym, że wygaszony peptyd fluorogenny jest kowalencyjnie włączany do żelu rozdzielczego zamiast białek o pełnej długości, takich jak żelatyna lub kazeina. Zastosowanie peptydów fluorogennych umożliwia bezpośrednie wykrycie aktywności proteolitycznej bez dodatkowych etapów barwienia. Enzymy w próbkach biologicznych rozszczepiają wygaszony peptyd fluorogenny, powodując wzrost fluorescencji. Sygnał fluorescencyjny w żelach jest następnie obrazowany za pomocą standardowego skanera żelu fluorescencyjnego i określany ilościowo za pomocą densytometrii. Zastosowanie peptydów jako degradowalnego substratu znacznie rozszerza możliwe proteazy wykrywalne za pomocą technik zymograficznych.

Wprowadzenie

Żelowa zymografia to technika biologiczna używana do pomiaru aktywności proteolitycznej w próbkach biologicznych, takich jak płyny ustrojowe lub pożywki do hodowli komórkowych1,2,3. Próbki są rozdzielane według ich mas cząsteczkowych za pomocą elektroforezy przez żel poliakrylamidowy osadzony w degradowalnym podłożu. Typowe substraty ulegające degradacji obejmują żelatynę, kazeinę, kolagen i elastynę, które zostały wykorzystane do pomiaru aktywności metaloproteinaz macierzy (MMP) -1, -2, -3, -7, -8, -9 i -11, a także różnych katepsyn1,2,4,5,6,7,8. Po elektroforezie enzymy są renaturyzowane i mogą degradować białko w żelu. W tradycyjnej symografii żelowej żel jest barwiony barwnikiem białkowym, takim jak Coomassie Blue, a aktywność proteazy jest wykrywana jako utrata sygnału, tj. białe pasma (degradacja białka) na ciemnoniebieskim tle.

Tutaj opisujemy protokół alternatywnej metody żelowej zymografii, w której degradowalnym substratem jest krótki, fluorogenny peptyd kowalencyjnie włączony do żelu poliakrylamidowego (Rysunek 1). Zastąpienie syntetycznych peptydów jako degradowalnych substratów umożliwia wykrycie szerszego zakresu proteaz w porównaniu z tradycyjną zymografią żelową z natywnymi białkami9. Wiązanie kowalencyjne peptydu fluorogenicznego zapobiega dyfuzji i migracji peptydu podczas elektroforezy żelowej obserwowanej poprzednimi metodami9,10. Co więcej, zastosowanie substratu fluorogennego umożliwia bezpośrednie wykrycie aktywności proteazy bez dodatkowych etapów barwienia i odbarwiania. Ogólnym celem tej metody jest wykrycie aktywności proteazy w próbkach biologicznych poprzez kowalencyjne włączenie peptydów fluorogennych do żeli zymogramowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie warstwy żelu rozdzielczego

  1. Przygotować 10% roztwór żelu rozdzielczego poliakryloamidu zgodnie z tabelą 1. Dodać tetrametyloetylenodiaminę (TEMED) i nadsiarczan amonu (APS) bezpośrednio przed wlaniem żelu, ponieważ ich dodanie inicjuje reakcję polimeryzacji.
  2. Napełnij pustą kasetę z miniżelem o średnicy 1,5 mm do połowy (5 ml) roztworem żelu o rozdzielczości 10%.
  3. Dodaj cienką warstwę izopropanolu (~500 μL) na wierzch żelu poliakrylamidowego, aby uzyskać płaski żel i zapobiec powstawaniu pęcherzyków. Użyj pozostałego roztworu poliakrylamidu, aby śledzić postęp reakcji polimeryzacji. Gdy poliakrylamid w probówce całkowicie zastygnie, reakcja jest zakończona (~40 min).

2. Przygotowanie cząsteczki łącznika azydo-PEG3-maleimidu

  1. Podczas gdy pierwsza rozdzielcza warstwa żelu ulega polimeryzacji, wyjmij zestaw azido-PEG3-maleimid z magazynu w temperaturze -20 °C i pozwól składnikom osiągnąć temperaturę pokojową. W każdym zestawie znajdują się dwa elementy. Fiolka 1 zawiera ester maleimidu NHS, ciało stałe o barwie od białawej do szarej. Fiolka 2 zawiera azido-PEG3-aminę, lekko żółty olej.
    UWAGA: Autorzy sugerują użycie zestawu 25 mg azido-PEG3-maleimid, ponieważ może on być przechowywany tylko przez krótki czas (1-2 godziny) w temperaturze -20 °C po przygotowaniu, zanim zacznie ulegać degradacji. 25 mg wystarcza do wyprodukowania 10 żeli peptydowych. Żele należy zużyć w ciągu 3 tygodni od przygotowania.
  2. Rozpuść składniki fiolki 2 w zalecanej przez producenta objętości dimetylosulfotlenku (DMSO) i wiruj przez 30 sekund, aby upewnić się, że płyny zostały dobrze wymieszane.
  3. Przenieść zawartość fiolki 1 do czystej, suchej kolby okrągłodennej o pojemności 100 ml zawierającej mieszadło.
    UWAGA: Przed użyciem przepłukać kolbę acetonem i całkowicie wysuszyć, aby zapobiec zakłóceniu reakcji przez wilgoć.
  4. Natychmiast włożyć do otworu kolby gumowy korek do przegrody z membraną, którą można przekłuć strzykawką. Pracuj szybko, aby zapobiec przedostawaniu się wilgoci do kolby.
  5. Włóż dwie igły strzykawki o rozmiarze 18 do membrany i podłącz jedną z nich do zbiornika z gazem obojętnym (np. argonem). Pozostawić gaz obojętny do napełnienia kolby przez 3 minuty. Składniki fiolek 1 i 2 należy zmieszać w atmosferze gazu obojętnego, aby zapobiec powstawaniu niepożądanych produktów reakcji.
    UWAGA: Druga igła strzykawki ma za zadanie zapewnić odpowietrznik, umożliwiając w ten sposób przepływ powietrza atmosferycznego zawartego w kolbie z kolby podczas napełniania jej gazem obojętnym. Nie zapomnij dołączyć igły odpowietrzającej!
  6. Odciąć dopływ gazu obojętnego i odłączyć go od igły. Za pomocą strzykawki wstrzyknąć całą zawartość fiolki 2 do kolby.
  7. Wyjmij obie igły i strzykawkę i pozwól składnikom mieszać się przez 30 minut w temperaturze pokojowej, mieszając.
  8. Zdjąć gumowy korek do przegrody i przenieść zawartość do czystej probówki wirówkowej o pojemności 5 ml. Roztwór maleimidu azydo-PEG3 należy zużyć w ciągu 1 godziny w temperaturze pokojowej.

3. Przygotowanie warstwy żelu rozdzielczego peptydów

  1. Gdy pierwsza rozdzielcza warstwa żelu spolimeryzuje się, odlej warstwę izopropanolu. Opłucz górną część żelu, pipetując 1 ml wody dejonizowanej na wierzch żelu, a następnie odlej wodę.
  2. Pobrać funkcjonalizowany tiolem peptyd fluorescencyjny z magazynu w temperaturze -80 °C i pozostawić do rozmrożenia w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Peptyd funkcjonalizowany tiolem można przygotować zgodnie z wcześniejszym opisem11,12. Można również stosować dostępne w handlu peptydy, ale wymagają one dodania końcowej reszty cysteiny, aby umożliwić reakcję kliknięcia maleimid-tiol. Rozpuścić peptyd do stężenia podstawowego 10 mM i przechowywać go w temperaturze -80 °C w małych (30 μl) podwielokrotnościach w celu ograniczenia powtarzających się cykli zamrażania i rozmrażania.
  3. Przygotować 10% rozdzielczy roztwór żelu zawierający cząsteczkę łącznika azydo-PEG3-maleimidu i peptyd fluorescencyjny zgodnie z tabelą 1. Dodać TEMED i APS bezpośrednio przed nalewaniem żelu, ponieważ ich dodanie inicjuje reakcję polimeryzacji.
  4. Napełnij połowę pozostałej części kasety z żelem (3 ml) roztworem żelu rozpuszczającego peptydy.
    UWAGA: Wielowarstwowe podejście do żelu rozdzielczego zmniejsza ilość peptydu i łącznika niezbędnego dla każdego żelu. Rozmiar warstwy żelu rozdzielczego peptydów można dostosować, aby w razie potrzeby dostosować się do większego zakresu mas cząsteczkowych.
  5. Odpipetować cienką warstwę izopropanolu (~500 μl) do górnej części żelu poliakrylamidowego, aby uzyskać równy żel i zapobiec powstawaniu pęcherzyków. Użyj pozostałego roztworu poliakrylamidu, aby śledzić postęp reakcji polimeryzacji. Gdy poliakrylamid w probówce całkowicie zastygnie, reakcja jest zakończona (~40 min).
    UWAGA: Peptyd fluorescencyjny jest wrażliwy na światło. Żele należy przykryć folią aluminiową, aby zapobiec fotowybielaniu podczas przygotowywania żelu, elektroforezy, mycia i wywoływania.
  6. Odleć warstwę izopropanolu i spłukać górną część żelu rozpuszczającego peptydy wodą dejonizowaną, jak w kroku 3.1.
  7. W przypadku natychmiastowego użycia żeli należy przejść do kroku 4, w przeciwnym razie należy zanurzyć przygotowane żele w 100 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w temperaturze 4 °C w plastikowym pudełku, aby zapobiec wysychaniu żeli. Owiń pudełko folią aluminiową, aby zapobiec fotowybielaniu. Żele można przechowywać w PBS do 3 tygodni przed użyciem.

4. Przygotowanie żelu do układania

  1. Przygotować 5% roztwór żelu do układania w stosy zgodnie z tabelą 1. Dodać TEMED i APS bezpośrednio przed nalewaniem żelu, ponieważ ich dodanie inicjuje reakcję polimeryzacji.
  2. Napełnij pozostałą pustą część kasety z żelem (~2 ml) roztworem żelu do układania w stosy.
  3. Szybko włóż grzebień żelowy o średnicy 1,5 mm do warstwy żelu do układania w stosy, upewniając się, że pod studzienkami nie pozostały żadne pęcherzyki. Użyj pozostałego roztworu poliakrylamidu, aby śledzić postęp reakcji polimeryzacji. Gdy poliakrylamid w probówce całkowicie zastygnie, reakcja jest zakończona (~10 min).
  4. Delikatnie wyjmij grzebień i taśmę z tyłu kasety z żelem.

5. Przygotowanie próbek biologicznych do elektroforezy

  1. Przygotuj kondycjonowane pożywki komórkowe, lizaty komórkowe, homogenaty tkankowe i wzorce MMP zgodnie z opisem w innym miejscu w warunkach nieredukcyjnych2. Nie podgrzewaj próbek.
  2. Na przykład przygotuj kondycjonowane podłoże komórkowe w następujący sposób:
    1. Płytka 40 000 komórek/cm,2 komórki na 6-dołkowej płytce w 10% pożywce hodowlanej płodowej surowicy bydlęcej (FBS). Inkubować komórki w wilgotnej komorze (5% CO2 w temperaturze 37 °C) przez 24 godziny i pozwolić im osiągnąć 70-80% konfluencji.
      UWAGA: Jeśli komórki nie osiągną pożądanej konfluencji po 24 godzinach, pozwól im rosnąć w 10% pożywce hodowlanej FBS przez dodatkowe 24 godziny.
    2. Umyj komórki dwukrotnie PBS i dodaj 2 ml pożywki hodowlanej bez surowicy. Inkubować komórki w wilgotnej komorze (5% CO2 w temperaturze 37 °C) przez dodatkowe 24 godziny.
    3. Za pomocą pipety serologicznej zebrać kondycjonowane podłoże z każdej studzienki. Wirować pożywkę z prędkością 1200 obr./min przez 3 minuty, aby usunąć wszelkie resztki komórek. Pobrać supernatant i stężyć za pomocą odśrodkowego filtra odśrodkowego o pojemności 15 ml i masie cząsteczkowej 10 kDa. Odwirować jednostki filtrujące przy 4.000 x g przez 15 min w wirniku wahliwym lub 5.000 x g przez 15 min w wirniku o stałym kącie.
      UWAGA: Ten krok jest opcjonalny, ale może zwiększyć intensywność prążków proteolitycznych w żelach peptydowych zymografii.
    4. Przenieść skoncentrowany filtrat do świeżej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Porcjować i przechowywać próbki w temperaturze -80 °C przez maksymalnie trzy cykle zamrażania i rozmrażania.
  3. Określ ilościowo zawartość białka za pomocą standardowego testu ilościowego białka (np. BCA, test Bradforda itp.).

6. Elektroforeza próbek biologicznych w żelach peptydowych

  1. Próbki rozpuścić w konwencjonalnym buforze do próbek zymografii (62,5 mM Tris-HCl, pH 6,8, 25% glicerol, 4% SDS, 0,01% błękit bromofenolowy). W przypadku próbek komórek i tkanek zaleca się ~30 μg całkowitego białka na studzienkę i 50-100 ng białka w przypadku wzorców MMP.
  2. Dodaj 400 ml 1x Tris-Glycine SDS Running Buffer do aparatu żelowego. Załadować do 35 μl próbki na studzienkę. Badać próbki pod napięciem 120 V w temperaturze 4 °C przez 1,5 godziny lub do momentu, gdy wzorce masy cząsteczkowej wykażą, że interesujące proteazy znajdują się w warstwie żelu rozdzielającego peptydy (która ma widoczny pomarańczowy kolor).
    UWAGA: Większość MMP i ich wariantów mieści się w zakresie 35-100 kDa. Gdy wzorce masy cząsteczkowej wskazują, że masy te znajdują się w warstwie żelu rozdzielczego peptydów, elektroforezę można zatrzymać. Tę samą zasadę można zastosować do innych klas proteaz o znanych masach cząsteczkowych. Jeśli istnieje zainteresowanie wykrywaniem wielu proteaz w większym zakresie mas cząsteczkowych, należy zmniejszyć rozmiar warstwy żelu rozdzielczego i zwiększyć rozmiar warstwy żelu rozdzielczego peptydów.
  3. Po elektroforezie wyjąć żele z plastikowej kasety i myć żele trzy razy przez 10 minut każdy w temperaturze pokojowej pod delikatnym mieszaniem w buforze renaturyzacyjnym zawierającym 2,5% Triton X-100, 1 μM ZnCl2 i 5 mM CaCl2 w 50 mM Tris-HCl, pH 7,5.
  4. Przenieść żele do rozwijającego się roztworu buforowego zawierającego 1% Triton X-100, 1 μM ZnCl2 i 5 mM CaCl2 w 50 mM Tris-HCl, pH 7,5 przez 15 min. Zastąpić świeżym roztworem buforowym do wywoływania i inkubować żele w temperaturze 37 °C pod delikatnym mieszaniem przez 24 godziny, upewniając się, że żele są całkowicie zanurzone w roztworze.

7. Obrazowanie żeli peptydowych

  1. Po 24 godzinach zobrazuj żele za pomocą skanera/imagera z żelem fluorescencyjnym przy użyciu odpowiednich filtrów wzbudzenia i emisji. Na przykład żele peptydowe pokazane w reprezentatywnych wynikach są sprzężone z fluoresceiną i zostały zobrazowane przy użyciu filtra wzbudzającego o długości fali 488 nm i filtra emisyjnego o długości fali 521 nm. Stosowanie odpowiednich filtrów dla Twojego fluoroforu zmaksymalizuje wykrywanie aktywności proteolitycznej.
    UWAGA: Obrazy można również wykonywać za pomocą aparatu do obrazowania żelowego wyposażonego w transiluminator UV, często używanego do obrazowania żeli DNA barwionych bromkiem etydyny. Zobrazuj żele za pomocą ustawienia transiluminatora UV (365 nm) i filtra emisyjnego 590 nm.
  2. Przeprowadź densytometryczną ocenę natężeń pasma za pomocą ImageJ, jak opisano w innym miejscu13.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Stosując opisaną tutaj metodę, do żeli poliakrylamidowych włączono dwa fluorescencyjne peptydy degradowalne przez proteazy: GGPQG↓IWGQK(PEG)2C (w tekście i na rysunkach oznaczony skrótem QGIW) oraz GPLA↓CpMeOBzlWARK(PEG)2C (w tekście i na rysunkach oznaczony skrótem LACW). Symbol ↓ wskazuje miejsce rozszczepienia. QGIW jest sekwencją pochodzącą z kolagenu typu I, zaprojektowaną do wykrywania komórkowych kolagenaz14. LACW jest sekwen...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Obecne techniki zymograficzne polegają na wprowadzaniu natywnych substratów do żeli poliakrylamidowych w celu wykrycia proteolizy. Chociaż techniki te zyskały szerokie zastosowanie, nadal mają ograniczoną liczbę proteaz, które mogą wykryć. W tym miejscu opisano protokół, w którym fluorescencyjne, degradowalne przez proteazę peptydy są włączane do żelu rozdzielczego poliakrylamidu. Sprzężenie kowalencyjne za pomocą cząsteczki łącznika azydo-PEG3-maleimidu umożliwia separację i wykrywanie szerszej gamy proteaz niż jest to ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Finansowanie zapewnione przez The Ohio State University College of Engineering, Wydział Inżynierii Biomedycznej oraz Comprehensive Cancer Center - Arthur G. James Cancer Hospital i Richard J. Solove Research Institute.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Puste kasety na żel 1,5 mmThermoFisher ScientificNC2015
1,5 mm, 10-dołkowe puste grzebienie kasetowe żeloweThermoFisher ScientificNC3510
1x sól fizjologiczna buforowana fosforanamiFisher Scientific10-010-049
20% roztwór SDSAmbionAM9820
3x Bufor do próbek symografiiBio-Rad1610764
40% (w/v) Akrylamid/Bis (19:1)AmbionAM9022
6-dołkowe płytki do hodowli tkankowychThermoFisher Scientific087721B
Filtr odśrodkowy Amicon Ultra-2 (10 kDa MWCO)Sigma-AldrichUFC201024
Nadsiarczan amonuSigma-AldrichA3678
Zestaw azydo-PEG3-MaleimidKliknij Chemia NarzędziaAZ107
Chlorek wapniaThermoFisher ScientificBP510100
DimetylosulfotlenekFisher ScientificBP231
IzopropanolFisher ScientificA416P
Zestaw do oznaczania białek Micro BCAThermoFisher Scientific23235
N N N' N'-tetrametyloetylenodiamina (TEMED)Sigma-AldrichT9281
PowerPac Basic Power SupplyBio-Rad1645050
Precision Plus Protein Dual Color StandardBio-Rad161-0374
Igły podskórne PrecisionGlideFisher Scientific14-826
Kolba okrągłodenna (100 ml)Fisher Scientific50-873-144
gumowy do przegrodyFisher Scientific50-872-546
Sterylna strzykawka z końcówką ślizgową (1 ml)Fisher Scientific14-823-434
Triton X-100Sigma-AldrichX100
Trizma hydrochlroideSigma-AldrichT5941
Typhoon 9410 Obrazowanie molekularneGE Amersham8149-30-9410
ChlorekSigma-Aldrich
Korek 208086

Bibliografia

  1. Vandooren, J., Geurts, N., Martens, E., Vanden Steen, P. E., Opdenakker, G. Zymography methods for visualizing hydrolytic enzymes. Nature Methods. 10 (3), 211-220 (2013).
  2. Toth, M., Fridman, R. Assessment of Gelatinases (MMP-2 and MMP-9) by Gelatin Zymography. Methods in Molecular Medicine. 57, (2001).
  3. Heussen, C., Dowdle, E. B. Electrophoretic analysis of plasminogen activators in polyacrylamide gels containing sodium dodecyl sulfate and copolymerized substrates. Analytical Biochemistry. 102 (1), 196-202 (1980).
  4. Gogly, B., Groult, N., Hornebeck, W., Godeau, G., Pellat, B. Collagen zymography as a sensitive and specific technique for the determination of subpicogram levels of interstitial collagenase. Analytical Biochemistry. 255 (2), 211-216 (1998).
  5. Inanc, S., Keles, D., Oktay, G. An improved collagen zymography approach for evaluating the collagenases MMP-1, MMP-8, and MMP-13. BioTechniques. 63 (4), 174-180 (2017).
  6. Perera, H. K. I. Detection of Aspartic Proteinase Activities Using Gel Zymography. Zymography. , 43-52 (2017).
  7. van Beurden, P. A. M. S. noek-, Vonden Hoff, J. W. Zymographic techniques for the analysis of matrix metalloproteinases and their inhibitors. BioTechniques. 38 (1), 73-83 (2005).
  8. Oliver, G. W., Stetler-Stevenson, W. G., Kleiner, D. E., Zymography, Zymography, Casein Zymography, and Reverse Zymography: Activity Assays for Proteases and their Inhibitors. Proteolytic Enzymes. Springer Lab Manual. , Springer. Berlin, Heidelberg. 63-76 (1999).
  9. Deshmukh, A. A., Weist, J. L., Leight, J. L. Detection of proteolytic activity by covalent tethering of fluorogenic substrates in zymogram gels. BioTechniques. 64 (5), 203-210 (2018).
  10. Yasothornsrikul, S., Hook, V. Y. Detection of proteolytic activity by fluorescent zymogram in-gel assays. BioTechniques. 28 (6), 1172-1173 (2000).
  11. Leight, J. L., Alge, D. L., Maier, A. J., Anseth, K. S. Direct measurement of matrix metalloproteinase activity in 3D cellular microenvironments using a fluorogenic peptide substrate. Biomaterials. 34 (30), 7344-7352 (2013).
  12. Leight, J. L., Tokuda, E. Y., Jones, C. E., Lin, A. J., Anseth, K. S. Multifunctional bioscaffolds for 3D culture of melanoma cells reveal increased MMP activity and migration with BRAF kinase inhibition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (17), 5366-5371 (2015).
  13. Ren, Z., Chen, J., Khalil, R. A. Zymography as a Research Tool in the Study of Matrix Metalloproteinase Inhibitors. Methods in Molecular Biology. 1626, Clifton, N.J. 79-102 (2017).
  14. Nagase, H., Fields, G. B. Human matrix metalloproteinase specificity studies using collagen sequence-based synthetic peptide. Biopolymers. 40 (4), 399-416 (1996).
  15. Mucha, A., et al. Membrane Type-1 Matrix Metalloprotease and Stromelysin-3 Cleave More Efficiently Synthetic Substrates Containing Unusual Amino Acids in Their P1′ Positions. Journal of Biological Chemistry. 273 (5), 2763-2768 (1998).
  16. Thimon, V., Belghazi, M., Labas, V., Dacheux, J. -L., Gatti, J. -L. One- and two-dimensional SDS-PAGE zymography with quenched fluorogenic substrates provides identification of biological fluid proteases by direct mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 375 (2), 382-384 (2008).
  17. Sun, X., Salih, E., Oppenheim, F. G., Helmerhorst, E. J. Activity-based mass spectrometric characterization of proteases and inhibitors in human saliva. Proteomics. Clinical Applications. 3 (7), 810-820 (2009).
  18. Yu, W., Woessner, J. F. Heparin-Enhanced Zymographic Detection of Matrilysin and Collagenases. Analytical Biochemistry. 293 (1), 38-42 (2001).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Wykrywanie aktywności proteazżel rozdzielający peptydyporównanie zymografii żelatynowejfluorescencyjny skaner żeliinkubacja w buforze wywoływującymtraktowanie inhibitorem MMPprojektowanie substratów peptydowychanaliza degradacji biomateriałuweryfikacja metodą Western blot
Wykrywanie aktywności proteazy za pomocą fluorescencyjnej symografii peptydowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.