Method Article

Kwantyfikacja niejednorodnego rozmieszczenia białka synaptycznego w mózgu myszy za pomocą immunofluorescencji

DOI:

10.3791/58940

⸱

January 29th, 2019

 ,  , 
1Institute of Anatomy and Embryology, University Medical Center Göttingen

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy ilościowe podejście do określania rozkładu białka synaptycznego względem białka markerowego za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego, mikroskopii konfokalnej i analizy komputerowej.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecność, brak lub poziom określonych białek synaptycznych może poważnie wpłynąć na transmisję synaptyczną. Oprócz wyjaśnienia funkcji białka, ważne jest również określenie jego rozmieszczenia. W tym miejscu opisujemy protokół wykorzystujący immunofluorescencję, mikroskopię konfokalną i analizę komputerową w celu określenia dystrybucji białka synaptycznego Mover (zwanego również TPRGL lub SVAP30). Porównujemy rozkład Movera z rozkładem białka pęcherzyków synaptycznych synaptofizyny, określając w ten sposób rozkład Movera w sposób ilościowy w stosunku do obfitości pęcherzyków synaptycznych. Warto zauważyć, że metoda ta może potencjalnie zostać wdrożona, aby umożliwić porównanie dystrybucji białek przy użyciu różnych przeciwciał lub mikroskopów lub w różnych badaniach. Nasza metoda pozwala obejść nieodłączną zmienność barwień immunofluorescencyjnych, uzyskując stosunek, a nie bezwzględny poziom fluorescencji. Dodatkowo, opisana przez nas metoda umożliwia badaczowi analizę rozkładu białka na różnych poziomach: od całych wycinków mózgu do regionów mózgu do różnych podregionów w jednym obszarze mózgu, takich jak różne warstwy hipokampa lub kory czuciowej. Mover jest białkiem specyficznym dla kręgowców, które jest związane z pęcherzykami synaptycznymi. Dzięki tej metodzie pokazujemy, że Mover jest niejednorodnie rozmieszczony w obszarach mózgu, z wysokimi poziomami w brzusznej części pallidum, jądrach przegrody i ciele migdałowatym, a także w pojedynczych obszarach mózgu, takich jak różne warstwy hipokampa.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komunikacja między neuronami odbywa się w wyspecjalizowanych miejscach kontaktu zwanych synapsami. Synapsy zawierają niezliczoną ilość różnych białek, które koordynują transmisję synaptyczną. Niektóre z tych białek wykazują niejednorodną dystrybucję w całym układzie nerwowym i nie są obecne we wszystkich synapse1. Jednym z przykładów takiego białka jest Munc13, które bierze udział w procesie pobudzania pęcherzyków synaptycznych. Istnieją różne izoformy Munc13, które są niejednorodnie rozmieszczone w mózgu2, a obecność lub brak określonych izoform może wpływać na krótkoterminową plastyczność synaptyczną i dynamikę pęcherzyków synaptycznych3,4,5. Dlatego tak ważne jest, aby móc zidentyfikować obecność różnych białek synaptycznych w różnych obszarach mózgu.

Metody wyboru do oznaczania ilościowego białek synaptycznych - jak dotąd - to spektrometria mas i Western blot, a nie immunohistochemia6,7,8,9. W niektórych przypadkach stosuje się kilka metod, które wzajemnie się uzupełniają, aby ocenić zarówno ilość, jak i lokalizację określonych białek (np. Wilhelm i wsp.10). Metoda, którą tutaj opisujemy, pozwala na lokalizację i kwantyfikację interesujących białek bez potrzeby stosowania jakiejkolwiek metody biochemicznej, po prostu wykorzystując barwienie immunofluorescencyjne. Kolejną zaletą jest to, że kwantyfikacja może być przeprowadzona na obszarach znacznie mniejszych, a zatem bardziej szczegółowych, niż te uzyskane innymi metodami. Należy jednak wziąć pod uwagę, że do oceny dystrybucji białka będącego przedmiotem zainteresowania potrzebne jest wiarygodne białko referencyjne.

Barwienie fluorescencyjne za pomocą immunohistochemii pozwala nam rutynowo identyfikować lokalizację białek w różnych obszarach mózgu, jak również w różnych przedziałach neuronalnych. Aby zidentyfikować różne przedziały, stosuje się specjalne znaczniki. Zazwyczaj przeciwciała przeciwko synapsynie i synaptofizynie11 mogą być używane do oznaczania pęcherzyków synaptycznych, podczas gdy przeciwciała przeciwko fagotowi oznaczają strefę aktywną zakończenia presynaptycznego12. Transportery pęcherzykowe, takie jak pęcherzykowe transportery glutaminianu (vGluT) lub pęcherzykowy transporter GABA (vGAT), są używane do oznaczania odpowiednio zakończeń presynaptycznych excitatory13 i hamujących14. Po stronie postsynaptycznej przeciwciała przeciwko białku Homera mogą być stosowane do oznaczania zakończeń postsynaptycznych, a przeciwciała przeciwko białku gęstości postsynaptycznej 95 (PSD95)15,16,17 lub gephyrin18,19,20 może oznaczać odpowiednio pobudzające lub hamujące zakończenia postsynaptyczne. Stosując przeciwciała przeciwko białku będącemu przedmiotem zainteresowania i markery, takie jak te opisane powyżej, można określić lokalizację takiego białka. Wiele dotychczasowych badań zrobiło to w sposób jakościowy21. Jednak, aby wiarygodnie określić zróżnicowany rozkład określonego białka synaptycznego, należy nie tylko określić jego obecność lub brak, ale także jego względne stężenie. Niejednorodność rozmiarów i gęstości synaps sprawia, że ważne jest ustalenie stosunku między markerem synaptycznym a białkiem będącym przedmiotem zainteresowania. W przeciwnym razie regiony bogate w synapsy, takie jak niepiramidalne warstwy hipokampa i warstwa molekularna móżdżku, będą wykazywać dużą gęstość białek synaptycznych, tylko ze względu na większą gęstość synaps, ale nie ze względu na silną obecność tego białka w każdej synapsie (np. Wallrafen i Dresbach1). Z drugiej strony, białka w somie neuronalnej (np. TGN3822) zwykle wykazują silną obecność w warstwie komórek piramidowych hipokampa lub warstwie komórek ziarnistych hipokampa lub móżdżku ze względu na wysoką koncentrację ciał komórek neuronalnych w tych obszarach. Dlatego ten niejednorodny rozkład struktur, w tym przypadku synaps, może prowadzić do fałszywego oszacowania rozmieszczenia samego białka będącego przedmiotem zainteresowania. Ponadto istnieje wewnętrzna zmienność intensywności barwienia w próbkach w barwieniach immunohistochemicznych. Opisany tutaj protokół uwzględnia to i unika takich uprzedzeń, a także innych zastrzeżeń wynikających z metod immunohistochemicznych.

W naszym ostatnim badaniu użyliśmy tej metody do opisania różnicowego wyrażenia Mover (zwanego również TPRGL23 lub SVAP3024) w 16 różnych obszarach mózgu1. Mover jest białkiem synaptycznym specyficznym dla kręgowców, które można znaleźć w połączeniu z pęcherzykami synaptycznymi i wpływa na uwalnianie neuroprzekaźników25,26,27. Powiązaliśmy ekspresję Mover z obfitością pęcherzyków synaptycznych, poprzez barwienie synaptofizyny jako markera referencyjnego pęcherzyków synaptycznych. Stwierdziliśmy wysoki poziom Mover, szczególnie w jądrach przegrody, brzusznej części palidum i ciele migdałowatym. W obrębie hipokampa znaleźliśmy niejednorodny rozkład Mover, z wysokimi poziomami w warstwach związanych z obliczeniami wewnątrz hipokampa i niskimi poziomami w warstwach wejściowych i wyjściowych.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół nie obejmuje eksperymentów na żywych zwierzętach. Eksperymenty polegające na eutanazji zwierząt w celu pobrania próbek mózgu zostały zatwierdzone przez lokalne organy ochrony zwierząt (Tierschutzkommission der Universitätsmedizin Göttingen) pod numerem zatwierdzenia T 10/30.

UWAGA: Do tego protokołu użyto 3 dorosłych samców myszy C57BL/6.

1. Przygotowanie próbki

  1. Przygotować utrwalacz i 0,1 M bufor fosforanowy (PB; patrz Tabela 1).
  2. Unieruchom zwierzę przez perfuzję przezsercową, jak opisano w Gage i wsp.28. Najpierw przepłukać krew 0,9% roztworem NaCl, a następnie przelać 30 ml 4% paraformaldehydu (PFA).
  3. Otwórz czaszkę nożyczkami i ostrożnie odizoluj mózg za pomocą łyżki o krawędziach, aby uniknąć uszkodzenia tkanki.
  4. Napełnij 50 ml probówki reakcyjnej utrwalaczem i umieść mózg w 4% PFA w temperaturze 4 °C przez noc.
  5. Usunąć utrwalacz i umyć mózg w 50 ml 0,1 M PB na wytrząsarce przez 30 minut.
  6. Po umyciu inkubować mózg w probówce reakcyjnej o pojemności 50 ml w 30% sacharozie w 0,1 M PB przez 48 godzin lub do momentu, gdy mózg zanurzy się w probówce w temperaturze 4 °C w celu krioprotekcji.
  7. Przytnij kriochroniony mózg ostrym ostrzem, umieść go w krioformie i zanurz w związku o optymalnej temperaturze cięcia (OCT). Unikaj bąbelków. Zorientuj mózg i zamroź kriomold w zamrażarce o temperaturze -80 °C.
  8. Zamontuj zamrożoną tkankę do cięcia. Wyrównać tkankę z temperaturą kriomikrotomu przez co najmniej 15 minut przed cięciem.
  9. Podziel mózg na plastry koronalne o grubości 25 μm. Ostrożnie dotykaj OCT szklanym haczykiem, nie dotykając tkanki mózgowej. Zebrać 3 sąsiadujące ze sobą plastry na dołku na płytce 24-dołkowej i przechowywać je w 0,1 M PB w temperaturze 4 °C do momentu zabarwienia.
    UWAGA: W tym miejscu protokół może zostać wstrzymany na okres do dwóch tygodni. Dłuższy czas przechowywania może wpływać na jakość tkanki, a tym samym wpływać na wynik eksperymentu.

2. Immunofluorescencja

  1. Przygotować roztwory zawierające bufor blokujący, bufor przeciwciał, bufor płuczący 1 i bufor płuczący 2 (patrz Tabela 1).
  2. Opłucz plastry raz PB, aby usunąć nadmiar OCT.
    1. Usuń roztwór plastikową pipetą bez zasysania plasterków mózgu. Dodać 250 μl świeżego PB za pomocą pipety 1000 μL.
      UWAGA: Plastry nie powinny wysychać, więc dobrze usuń i dodaj płyny.
  3. Usunąć PB za pomocą plastikowej pipety i dodać 250 μl buforu blokującego do studzienki za pomocą pipety 1000 μl. Inkubować przez 3 godziny w temperaturze pokojowej (RT) na wytrząsarce.
  4. W czasie inkubacji rozcieńczyć pierwszorzędowe przeciwciała w buforze przeciwciał w probówce reakcyjnej. Użyć 250 μl buforu przeciwciał na studzienkę i dodać odpowiednią ilość przeciwciała (patrz Tabela 2), pipetując je bezpośrednio do roztworu za pomocą pipety o pojemności 2 μl. Wymieszaj roztwór, delikatnie pipetując kilka razy w górę i w dół. Wkrótce potem przemieszaj wir, aby zapewnić prawidłowe wymieszanie.
    UWAGA: Aby określić fluorescencję tła, barwienie należy również wykonywać bez dodawania przeciwciała pierwszorzędowego. W tym celu należy inkubować plasterek w roztworze przeciwciał bez przeciwciał pierwszorzędowych zgodnie z protokołem.
  5. Po czasie inkubacji usunąć bufor blokujący za pomocą plastikowej pipety i dodać 250 μl roztworu przeciwciała zawierającego przeciwciała pierwszorzędowe do studzienki. Inkubować plastry z przeciwciałem pierwszorzędowym przez noc w temperaturze 4 °C na shakerze.
  6. Następnego dnia umyj plastry buforem myjącym 1 3x przez 10 min w temperaturze RT na shakerze.
    1. Usunąć pożywkę plastikową pipetą i dodać 300 μl buforu myjącego 1 do dołka. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Powtórz 3 razy.
  7. Podczas etapów przemywania rozcieńczyć przeciwciała drugorzędowe sprzężone z fluoroforem w buforze przeciwciał w probówce reakcyjnej. Użyć 250 μl buforu przeciwciał na studzienkę i dodać odpowiednią ilość przeciwciała (patrz Tabela 2), pipetując je bezpośrednio do roztworu za pomocą pipety o pojemności 2 μl. Wymieszaj roztwór, delikatnie pipetując kilka razy w górę i w dół. Wkrótce potem przemieszaj wir, aby zapewnić prawidłowe wymieszanie.
    UWAGA: Ponieważ przeciwciała są wrażliwe na światło, wszystkie czynności od tego momentu muszą być wykonywane w ciemności.
  8. Po zakończeniu płukania należy usunąć bufor płuczący plastikową pipetą i dodać 250 μl roztworu przeciwciał zawierających przeciwciała drugorzędowe do studzienki drobnoustrojowej. Inkubować plastry z przeciwciałami drugorzędowymi przez 90 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
  9. Plastry myć buforem myjącym 2 3x przez 10 min w temperaturze RT.
  10. Podczas etapów płukania rozcieńczyć 4′,6-diamidyn-2-fenyloindol (DAPI) w 0,1 M PB w stężeniu 1:2000.
  11. Usunąć bufor płuczący 2 plastikową pipetą i dodać 250 μl roztworu DAPI do studzienki. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce.
  12. Usunąć roztwór DAPI plastikową pipetą i dodać 500 μl 0,1 M PB na studzienkę za pomocą pipety 1000 μl.
  13. Zamontuj plastry na szkiełkach mikroskopowych.
    1. Umieść szkiełko mikroskopowe pod stereoskopem. Za pomocą cienkiego pędzelka nałóż na szkiełko trzy oddzielne krople po 0,1 mln PB. Umieść jedną plasterkę na kroplę na szkiełku mikroskopowym.
    2. Użyj cienkiego pędzelka, aby spłaszczyć i zorientować plastry na szkiełku mikroskopowym.
    3. Gdy wszystkie plastry zostaną prawidłowo ułożone, usuń nadmiar PB chusteczką i dokładnie wysusz szkiełko.
      UWAGA: Unikaj całkowitego suszenia plastrów mózgu.
    4. Dodać 80 μl podłoża do zatapiania na szkiełku. Ostrożnie opuść szkiełko nakrywkowe na szkiełko, osadzając w ten sposób plastry mózgu.
    5. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia w dygestoria na 1-2 godziny (przykryj je, aby uniknąć ekspozycji na światło) i przechowuj je w pojemniku na szkiełka mikroskopowe w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.

3. Obrazowanie

  1. Po całkowitym utwardzeniu podłoża zatapiającego umieścić szkiełko mikroskopowe pod mikroskopem konfokalnym.
    UWAGA: Mikroskopia epifluorescencyjna w połączeniu z oprogramowaniem do dekonwolucji powinna dać podobną jakość obrazu.
  2. Dostosuj ustawienia lasera, zwiększając lub zmniejszając intensywność lasera dla każdego kanału, tak aby kilka pikseli było prześwietlonych i zapewniało maksymalny rozkład wartości szarości.
  3. Zdobądź wirtualne tkanki całego wycinka mózgu dla różnych kanałów.
    1. W oprogramowaniu do obrazowania (patrz Spis materiałów) wybierz opcję Płytki i ręcznie wyznacz wycinek mózgu za pomocą ustawień regionu kafelków.
    2. Rozmieść punkty podparcia w całym regionie kafelka i dostosuj fokus dla różnych punktów podparcia, naciskając przycisk Sprawdź regiony/pozycje kafelków....
    3. Dostosuj ustawienia w trybie akwizycji zgodnie z żądaną rozdzielczością i rozmiarem pliku wynikowego obrazu, a następnie rozpocznij skanowanie.
  4. Po zakończeniu skanowania użyj funkcji Stitching, aby przetworzyć wirtualną tkankę. Wyeksportuj plik jako .tif za pomocą funkcji Eksport obrazu.

4. Analiza komputerowa

  1. Załaduj wszystkie pojedyncze kanały dla jednego obrazu do FIJI29, klikając Plik| Otwarty.
  2. Za pomocą narzędzia do zaznaczania odręcznego nakreśl jedną półkulę w kanale DAPI. Utwórz maskę zaznaczenia, klikając Edytuj| Wybór| Utwórz maskę.
  3. Określ średnią intensywność fluorescencji dla pojedynczych kanałów (Mover i synaptofizyna), klikając Analizuj| Środek.
    UWAGA: Upewnij się, że wybrałeś różne kanały, aby określić średnie wartości intensywności fluorescencji dla każdego kanału.
  4. Skopiuj średnią intensywność fluorescencji dla pojedynczych kanałów do arkusza kalkulacyjnego.
  5. Określ średnią intensywność fluorescencji dla pojedynczych kanałów w obszarze zainteresowania, wyznaczając obszar również za pomocą narzędzia do zaznaczania odręcznego. Użyj atlasu mózgu myszy jako odniesienia.
  6. Powtórz kroki 4.1-4.5 dla wszystkich półkul i wszystkich obszarów zainteresowania.
    UWAGA: Określ wartości dla każdej półkuli osobno, aby później porównać wartości w obszarze zainteresowania z obszarem na półkuli (patrz krok 5.2).

5. Obsługa danych

  1. W przypadku, gdy fluorescencja tła jest wysoka (patrz Dyskusja), może być konieczne odjęcie tła. W tym celu należy określić średnią intensywność fluorescencji dla wycinka przetworzonego bez pierwszorzędowego przeciwciała przeciwko białku referencyjnemu (tutaj: synaptofizynie) i odjąć tę wartość od wszystkich wartości uzyskanych dla obszarów mózgu i półkul.
  2. Po ustaleniu średnich intensywności fluorescencji dla pojedynczych kanałów dla każdej półkuli i każdego obszaru zainteresowania (patrz Tabela 3), należy obliczyć stosunek Mover do synaptofizyny, dzieląc wartość Mover przez wartość dla synaptofizyny (żółty w Tabeli 3). Wykonaj tę czynność dla każdej półkuli i każdego obszaru zainteresowania osobno.
  3. Podziel stosunek uzyskany dla jednego obszaru zainteresowania przez współczynnik uzyskany dla odpowiedniej półkuli (kolor pomarańczowy w tabeli 3), aby określić stosunek obszaru zainteresowania do półkuli.
  4. Aby określić względną liczebność Mover, należy przeliczyć stosunek uzyskany w 5.2 na procent, określając jego odchylenie od 1 (kolor czerwony w tabeli 3). Współczynnik 1,25 dałby zatem względną liczebność Ruchu o 25% powyżej średniej, a współczynnik 0,75 dałby względną liczebność Ruchu o 25% poniżej średniej.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Reprezentatywne wzorce barwienia różnych markerów można zobaczyć w Rysunek 1. Wzór różni się w zależności od rozmieszczenia białka. Przykłady pięciu poziomów rostro-ogonowych przedstawiono w kolumnach (A)-(E). Reprezentatywne barwienie DAPI pokazano w pierwszym rzędzie: DAPI przylega do DNA komórki, a zatem jądra są barwione. Powoduje to powstanie wzorca punktowego. Regiony o dużej gęstości komórek są jaśniejsze niż regiony o...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiona tutaj metoda ma na celu ilościowe określenie rozmieszczenia białka będącego przedmiotem zainteresowania w stosunku do obfitości białka markerowego o znanym rozmieszczeniu. Barwienie immunofluorescencyjne może wykazywać dużą zmienność intensywności barwienia między różnymi plastrami. Opisane tutaj podejście do kwantyfikacji pozwala obejść ten problem poprzez określenie stosunku białka będącego przedmiotem zainteresowania do średniej na całej półkuli. W związku z tym różne intensywności barwienia na różnych p...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Irmgard Weiss za doskonałą pomoc techniczną. Autorzy dziękują za wsparcie Hermesa Pofantisa i Andoniyi Petkovej. Autorzy dziękują również Europejskiemu Instytutowi Neuronauki za korzystanie z LSM800 i pomoc techniczną, zwłaszcza ze strony dr Nilsa Halbsguta. Praca ta została sfinansowana przez Uniwersyteckie Centrum Medyczne w Getyndze. JSV dziękuje za wsparcie ze strony Centrum Mikroskopii Nanoskalowej i Fizjologii Molekularnej Mózgu (CNMPB).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Probówki reakcyjne 1,5 mlEppendorf30120094
50 ml Probówki reakcyjneGreiner Bio-One227261
multiwell 24 dołkiFisher Scientific                                                                                                                                                                                              Pipeta plastikowa 087721H
(jednorazowa)Pipeta Sarstedt861,176
1000 mlRainin 
Pipeta 2 mlEppendorf3123000012
Vortex Genius 3 Szkiełka mikroskopowe IKA3340001
MenzelFisher Scientific                                                                                                                                                                                  10144633CF
StereoskopLeica
LSM800ZeissMikroskop konfokalny
zamrażanie mikrotomuLeica
PBS (10X)Roche                                                                                                                                                                           
PFASigma                                                                                                                                                                                      P6148-1kg
NaClBioFroxx1394KG001
sacharozaneoFroxx1104KG001
Tissue TekSakura 4583PAŹ
Na2HPO4BioFroxx5155KG001
NaH2PO4Merck1,063,460,500
normalna surowica koziaMerck MilliporeS26-100ML
normalna surowica osłaMerckS30-100ML
Triton X-100Merck1,086,031,000
królicze systemy synaptyczne anty-MoverRRID: AB_10804285
świnka morska anty-SynaptophysinSynaptic SystemsRRID: AB_1210382
osła anty-królika AF647Jackson ImmunoResearchRRID: AB_2492288
koza anty-mysia AF488Jackson ImmunoResearchRRID: AB_2337438
Mowiol4-88Calbiochem                                                                                                                                                                                                   
Oprogramowanie ZEN2 niebieskie OprogramowanieZeissMicroscopy
FIJIImageJOprogramowanie
analityczne Microsoft ExcelMicrosoft
1701438211666789001475904

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wallrafen, R., Dresbach, T. The Presynaptic Protein Mover Is Differentially Expressed Across Brain Areas and Synapse Types. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 58(2018).
  2. Augustin, I., Betz, A., Herrmann, C., Jo, T., Brose, N. Differential expression of two novel Munc13 proteins in rat brain. Biochemical Journal. 337, 363-371 (1999).
  3. Rosenmund, C., et al. Differential Control of Vesicle Priming and Short-Term Plasticity by Munc13 Isoforms. Neuron. 33, 411-424 (2002).
  4. Breustedt, J., et al. Munc13-2 differentially affects hippocampal synaptic transmission and plasticity. Cerebral cortex. 20, 1109-1120 (2010).
  5. Chen, Z., Cooper, B., Kalla, S., Varoqueaux, F., Young, S. M. The Munc13 Proteins Differentially Regulate Readily Releasable Pool Dynamics and Calcium-Dependent Recovery at a Central Synapse. The Journal of Neuroscience. 33, 8336-8351 (2013).
  6. Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. A Defined Methodology for Reliable Quantification of Western Blot Data. Mol Biotechnol. , (2013).
  7. Charette, S. J., Lambert, H., Nadeau, P. J., Landry, J. Protein quantification by chemiluminescent Western blotting Elimination of the antibody factor by dilution series and calibration curve. Journal of Immunological Methods. 353, 148-150 (2010).
  8. Heidebrecht, F., Heidebrecht, A., Schulz, I., Behrens, S., Bader, A. Improved semiquantitative Western blot technique with increased quantification range. Journal of Immunological Methods. 345, 40-48 (2009).
  9. Toki, M. I., Cecchi, F., Hembrough, T., Syrigos, K. N., Rimm, D. L. Proof of the quantitative potential of immunofluorescence by mass spectrometry. Laboratory Investigation. 97, 329-334 (2017).
  10. Wilhelm, B. G., et al. Composition of isolated synaptic boutons reveals the amounts of vesicle trafficking proteins. Science. 344, 1023-1028 (2014).
  11. Navone, F., et al. Protein p38: An integral membrane protein specific for small vesicles of neurons and neuroendocrine cells. Journal of Cell Biology. 103, 2511-2527 (1986).
  12. Gundelfinger, E. D., Reissner, C., Garner, C. C. Role of Bassoon and Piccolo in Assembly and Molecular Organization of the Active Zone. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 7, (2016).
  13. Ziegler, D. R., Cullinan, W. E., Herman, J. P. Distribution of vesicular glutamate transporter mRNA in rat hypothalamus. Journal of Comparative Neurology. 448, 217-229 (2002).
  14. Chaudhry, F. A., et al. The vesicular GABA transporter, VGAT, localizes to synaptic vesicles in sets of glycinergic as well as GABAergic neurons. Journal of Neuroscience. 18, 9733-9750 (1998).
  15. Aoki, C., et al. Electron Microscopic Immunocytochemical SAP-97 at Postsynaptic, Presynaptic, and Nonsynaptic Sites of Adult and Neonatal Rat Visual Cortex. Synapse. 257, 239-257 (2001).
  16. Valtschanoff, J. G., et al. Expression of NR2 Receptor Subunit in Rat Somatic Sensory Cortex : Synaptic Distribution and Colocalization With NR1 and PSD-95. Journal of Comparative Neurology. 611, 599-611 (1999).
  17. Hunt, A., Schenker, L. J., Kennedy, B. PSD-95 Is Associated with the Postsynaptic Density and Not with the Presynaptic Membrane at Forebrain Synapses. Journal of Neuroscience. 76, 1380-1388 (1996).
  18. Luscher, B., Fuchs, T., Kilpatrick, C. L. GABA A Receptor Trafficking-Mediated Plasticity of Inhibitory Synapses. Neuron. 70, 385-409 (2011).
  19. Kirby, M. Understanding the molecular diversity of GABAergic synapses. 5, 1-12 (2011).
  20. Harris, K. M., Weinberg, R. J., Verrall, A. W. Ultrastructure of Synapses in the Mammalian Brain. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , 1-30 (2012).
  21. Heise, C., et al. Selective Localization of Shanks to VGLUT1-Positive Excitatory Synapses in the Mouse Hippocampus. Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, (2016).
  22. Peters, P. J., Yuan, L. C., Biology, C., Branch, M. Localization of TGN38 to the trans-Golgi network: involvement of a cytoplasmic tyrosine-containing sequence. Journal of Cell Biology. 120, 1123-1135 (1993).
  23. Antonini, D., et al. Tprg, a gene predominantly expressed in skin, is a direct target of the transcription factor p63. Journal of Investigative Dermatology. 128, 1676-1685 (2008).
  24. Burre, J., et al. Synaptic vesicle proteins under conditions of rest and activation: Analysis by 2-D difference gel electrophoresis. Electrophoresis. 27, 3488-3496 (2006).
  25. Kremer, T., et al. Mover is a novel vertebrate-specific presynaptic protein with differential distribution at subsets of CNS synapses. FEBS Letters. 581, 4727-4733 (2007).
  26. Ahmed, S., et al. Mover Is a Homomeric Phospho-Protein Present on Synaptic Vesicles. PLoS ONE. 8, (2013).
  27. Körber, C., et al. Modulation of Presynaptic Release Probability by the Vertebrate-Specific Protein Mover. Neuron. 87, 521-533 (2015).
  28. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. , 1-9 (2012).
  29. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, (2012).
  30. Schneider Gasser, E. M., et al. Immunofluorescence in brain sections: simultaneous detection of presynaptic and postsynaptic proteins in identified neurons. Nature Protocols. 1, 1887-1897 (2006).
  31. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , ACADEMIC PRESS. (2001).
  32. Sun, Y., Ip, P., Chakrabartty, A. Simple Elimination of Background Fluorescence in Formalin-Fixed Human Brain Tissue for Immunofluorescence Microscopy. Journal of Visualized Experiments. , 1-6 (2017).
  33. Poole, A. R., Dingle, J. T., Mallia, A. K. The localization of retinol-binding protein in rat liver by immunofluorescence microscopy. Journal of Cell Science. 394, 379-394 (1975).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Synaptic Protein DistributionImmunofluorescence ProtocolConfocal MicroscopyComputer Based AnalysisMover ProteinSynaptophysin ComparisonBrain Slice AnalysisFluorescence Intensity RatioHeterogeneous DistributionHippocampal Layers

Related Articles