Artykuł metodologiczny

Identyfikacja mediatorów sygnalizacji receptora limfocytów T poprzez badania przesiewowe bibliotek inhibitorów chemicznych

9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58946

⸱

22 stycznia 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, 2Singapore Immunology Network, A*STAR, 3Curiox Biosystems, 4Department of Immunobiology, Rega Institute for Medical Research, Katholieke Universiteit (KU) Leuven

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł wykorzystuje test oparty na cytometrii przepływowej do badania bibliotek chemicznych inhibitorów w celu identyfikacji inhibitorów i ich celów, które wpływają na sygnalizację receptora limfocytów T. Opisane tutaj metody można również rozszerzyć o badania przesiewowe o wysokiej przepustowości.

Streszczenie

Szlak sygnałowy receptora limfocytów T (TCR) składa się z wielu mediatorów, które przekazują sygnały po aktywacji TCR. Zaproponowano i wdrożono różne strategie identyfikacji nowych mediatorów sygnalizacji TCR, co przyczyniłoby się do lepszego zrozumienia procesów zachodzących w komórkach T, w tym aktywacji i selekcji grasicy. Opisujemy test przesiewowy, który umożliwia identyfikację cząsteczek wpływających na sygnalizację TCR w oparciu o aktywację rozwijających się tymocytów. Silne sygnały TCR powodują, że rozwijające się tymocyty aktywują maszynerię apoptotyczną w procesie znanym jako selekcja negatywna. Dzięki zastosowaniu inhibitorów kinaz, te, których cele wpływają na sygnalizację TCR, są w stanie zastąpić proces selekcji negatywnej. Metoda opisana w tym artykule może być wykorzystana do identyfikacji inhibitorów kinaz kanonicznych o ustalonych rolach w szlakach sygnałowych TCR, a także inhibitorów nowych kinaz, które nie zostały jeszcze ustalone w szlakach sygnałowych TCR. Strategia badań przesiewowych może być zastosowana do badań przesiewowych o wyższej przepustowości w celu identyfikacji nowych celów lekowych w sygnalizacji TCR.

Wprowadzenie

Limfocyty T to linia limfocytów, które odgrywają kluczową rolę w utrzymaniu odporności adaptacyjnej. Wyrażają TCR, co umożliwia im rozpoznawanie ich ligandów, kompleksów składających się z cząsteczki głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC) ze związanym peptydem, które znajdują się na powierzchni komórek prezentujących antygen (APC). Wyzwolenie szlaku sygnałowego TCR poprzez interakcję TCR/MHC ma kluczowe znaczenie dla aktywacji i rozwoju limfocytów T1.

W rozwoju limfocytów T, hematopoetyczne komórki macierzyste (HSC) pochodzące ze szpiku kostnego migrują do grasicy, gdzie ulegają różnicowaniu i przechodzą przez etapy progresji linii limfocytów T2. Podwójnie dodatnie (DP) tymocyty, wyrażające zarówno koreceptory CD4, jak i CD8, angażują się z autopeptydem/MHC na APC. Tymocyty o umiarkowanym powinowactwie do ligandów autopeptydowych / MHC dojrzewają, aby stać się jednododatnimi (SP) tymocytami CD4 lub CD8, proces określany jako selekcja pozytywna. I odwrotnie, tymocyty, które otrzymują nadmierną stymulację TCR przez autopeptyd/MHC, ulegają apoptozie poprzez selekcję negatywną3,4. Ten proces indukowanej stymulacją, zależnej od kaspazy apoptozy może być naśladowany in vitro poprzez stymulację tymocytów, na przykład za pomocą kulek pokrytych przeciwciałem anty-CD3/285. Dojrzałe limfocyty T, które przechodzą proces selekcji, są aktywowane przez ligandy niebędące samopeptydami/MHC z APC na obrzeżach. Samopeptyd/MHC są nadal istotne dla obwodowych limfocytów T, w kontekście sygnalizacji tonicznej dla przeżycia i proliferacji homeostazy, różnicowania limfocytów T pomocniczych oraz wzmacniania odpowiedzi komórek T na nie-peptydowe/MHC poprzez koagonizm6,7,8,9. Wiązanie TCR o wysokim powinowactwie do liganda peptydu/MHC aktywuje kilka dalszych szlaków sygnałowych, które obejmują wiele cząsteczek sygnałowych tworzących złożoną sieć sygnalizacyjną TCR10. Szlaki sygnałowe TCR są badane od kilkudziesięciu lat, a mimo to odkrycie nowych mediatorów szlaku nie wykazuje oznak słabnięcia11,12. Modulacja szlaków sygnałowych TCR ma znaczenie kliniczne i może obejmować nasilanie odpowiedzi komórek T w zastosowaniach immunoterapeutycznych lub hamowanie odpowiedzi komórek T w celu kontroli autoimmunizacji13. Strategie modulacji odpowiedzi limfocytów T zależą głównie od zakłócenia aktywności kinazy lub fosfatazy14,15,16.

Opisujemy zastosowanie testu opartego na cytometrii przepływowej do badania przesiewowego małych związków chemicznych pod kątem ich zdolności do modulacji sygnalizacji TCR i aktywacji limfocytów T17. Test opiera się na zjawisku tymocytów aktywujących szlak apoptozy pod wpływem silnych sygnałów TCR. Test jest wystarczająco czuły, aby zidentyfikować zmiany w sile stymulacji; inkubacja tymocytów eksprymujących transgeniczny TCR z tetramerami peptydowymi/MHC o rosnącym powinowactwie skutkowała odpowiednim wzrostem aktywacji kaspazy - używanym jako miara odpowiedzi apoptotycznej5. Do badań przesiewowych wykorzystaliśmy bibliotekę inhibitorów kinaz i oceniliśmy ich zdolność do modulowania odpowiedzi tymocytów na silne sygnały TCR.

Opisano kilka strategii opartych na cytometrii przepływowej lub reporterach fluorescencyjnych dla wysokoprzepustowych badań przesiewowych asortymentu fenotypów aktywacji obwodowej w różnych podzbiorach limfocytów T. Strategie te obejmują wykorzystanie genetycznych reporterów fluorescencyjnych do oceny czasu i wielkości aktywacji komórek T18, wykorzystanie degranulacji jako odczytu aktywności cytotoksycznych komórek T19,20, oraz analiza fosforylacji różnych białek zaangażowanych w sygnalizację komórkową21.

Prezentowany tutaj test przesiewowy jest w stanie skutecznie zidentyfikować związki, które hamują kanoniczne cząsteczki szlaku sygnałowego TCR, a także potencjalne, nowe związki o hamującym wpływie na sygnalizację TCR. Na przykład zidentyfikowaliśmy inhibitory GSK3β i Hsp90 jako nowe związki wpływające na odpowiedzi limfocytów T17. Test jest w stanie odróżnić inhibitory, które zakłócają transdukcję sygnału, ze względu na zmniejszenie odpowiedzi apoptotycznej, od niezależnego od TCR wpływu inhibitorów na toksyczność komórkową. Oprócz indukcji apoptozy mierzymy również regulację w górę CD69 i regulację w dół TCR jako markery aktywacji. Ponieważ sieci sygnalizacyjne TCR są złożone, zastosowanie wielu odczytów może zwiększyć szanse na odkrycie cząsteczek o określonym wpływie na pojedynczy szlak. W tym miejscu wprowadzamy również zastosowanie protokołu niezależnego od wirowania jako wysokoprzepustowej alternatywy dla oryginalnego protokołu podczas barwienia komórek w ramach przygotowań do analizy cytometrii przepływowej. Test opisany w tym artykule wykorzystuje niewielką bibliotekę związków inhibitorów kinaz, ale zasadniczo można go wykorzystać do badań przesiewowych o wyższej przepustowości. Wybrana biblioteka może również zawierać różne inhibitory lub inne cząsteczki.

Protokół

W tym badaniu użyto 6- do 8-tygodniowych samców i samic myszy C57Bl/6. Myszy zostały wyhodowane w ośrodku dla zwierząt na Narodowym Uniwersytecie Singapuru (Singapur). Narodowy Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Singapuru zatwierdził wszystkie eksperymenty na zwierzętach.

1. Przygotowanie zawiesiny tymocytu

  1. Poddaj myszy eutanazji w komorze CO2 .
  2. Wykonaj kolejne kroki w kapturze do hodowli tkankowej, aby uniknąć zanieczyszczenia kultur komórkowych. Przymocuj tuszę myszy do deski rozwarstwiającej za pomocą szpilek i spryskaj mysz 70% etanolem.
  3. Za pomocą nożyczek wykonaj pionowe nacięcie po stronie brzusznej, zaczynając od brzucha w kierunku szczęki. Wykonaj dalsze nacięcia wzdłuż każdej z tylnych nóg. Rozciągnij skórę, aby odsłonić klatkę piersiową i przygwoźdź ją.
  4. Odetnij przeponę i obie strony klatki piersiowej od tylnego końca nożyczkami. Podnieś klatkę piersiową i przypnij ją, aby odsłonić grasicę. Oddziel tkanki łączne przyczepione do grasicy i wyekstrahuj grasicę za pomocą pary zakrzywionych kleszczy.
  5. Umieść grasicę w dołku na 6-dołkowej płytce zawierającej 5 ml kompletnej pożywki RPMI.
    UWAGA: Rozważ dodanie do pożywki 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) pozbawionej węgla drzewnego, aby poprawić żywotność tymocytów, jeśli spodziewany jest długi czas oczekiwania między sekcją a testem stymulacji.
  6. Delikatnie rozgnieć grasicę końcem strzykawki i przepuść komórki przez sitko o średnicy 70 μM. Alternatywnie, aby zebrać tymocyty w zdrowszym stanie, rozważ użycie dwóch par kleszczy do ściskania grasicy i zbierania tymocytów, które wypływają z nabłonka grasicy.
  7. Przejdź do zliczania komórek za pomocą hemocytometru lub dowolnego automatycznego przyrządu do liczenia komórek.

2. Miareczkowanie inhibitorów kinaz do stężeń nietoksycznych

UWAGA: Ta sekcja skupia się na przygotowaniu inhibitorów do użycia w ekranach aktywacji limfocytów T. Inhibitory stosowane w wysokich stężeniach mogą powodować śmierć komórki, co jest odczytem z ekranów aktywacji limfocytów T. Seria rozcieńczeń inhibitorów ma na celu określenie końcowego stężenia poszczególnych inhibitorów, które nie powinny indukować apoptozy niezależnie od stymulacji TCR. Biblioteka inhibitorów kinaz użytych w tym badaniu została zakupiona od zewnętrznego dostawcy. Wykaz inhibitorów znajduje się w Tabeli Materiałów.

  1. Przygotowanie płytek inhibitorów kinaz w niższych stężeniach
    1. Aby przygotować płytkę z inhibitorami w temperaturze 1 mM, dodaj 10 μl inhibitorów do 90 μl dimetylosulfotlenku (DMSO) dla wszystkich inhibitorów.
      UWAGA: Inhibitory z biblioteki małocząsteczkowej użytej w tym badaniu mają stężenie podstawowe 10 mM. Jeśli inhibitory występują w postaci granulek, należy postępować zgodnie z zalecanymi krokami rozpuszczania podanymi przez dostawców. Jeżeli inhibitory nie są dostarczane w dawce 10 mM, należy przygotować płytki z inhibitorami w alternatywnych odpowiednich stężeniach i przygotować oddzielne seryjne rozcieńczenia inhibitorów o odpowiednim współczynniku rozcieńczenia.
      UWAGA: W przypadku toksycznych inhibitorów należy postępować zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi bezpiecznego obchodzenia się i usuwania.
    2. Aby przygotować płytkę z inhibitorami w dawce 0,1 mM, należy dodać 10 μl inhibitorów z płytki inhibitorów 1 mM do 90 μl DMSO.
    3. Aby przygotować płytkę z inhibitorami w ilości 0,01 mM, dodaj 10 μl inhibitorów z płytki z 0,1 mM inhibitorów do 90 μL DMSO.
  2. Leczenie tymocytów inhibitorami kinaz
    1. Przygotować zawiesinę tymocytu zgodnie z punktem 1.
    2. Rozcieńczyć tymocyty w pełnym RPMI, aby uzyskać zawiesinę tymocytów 5 x 106 komórek/ml.
    3. Dodać 200 μl zawiesiny tymocytów do wszystkich studzienek na płytce 96-dołkowej, używając pipety wielokanałowej.
    4. Do każdego dołka dodać 2 μl inhibitorów z odpowiedniego dołka płytki zawierającej 1 mM inhibitory (końcowe stężenie inhibitorów wynosi 10 μM).
    5. Na tej samej płytce przygotować cztery studzienki z niepoddanymi działaniu substancji kontrolnych, cztery studzienki z kontrolami dodatnimi poddanymi działaniu deksametazonu o wielkości 5 μM i cztery studzienki z kontrolami ujemnymi poddanymi działaniu nośnika, dodając 2 μl DMSO.
    6. Inkubować tymocyty w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 17 - 20 godzin (lub przez noc).
  3. Oznaczanie odpowiednich stężeń poszczególnych inhibitorów
    1. Obracać płytkę z tymocytami w temperaturze 300 x g i temperaturze 4 °C przez 5 minut. Ponownie zawiesić komórki w 250 μl buforu do przemywania FACS.
    2. Przeprowadź analizę cytometryczną przepływową próbek i przeanalizuj wyniki za pomocą programu do analizy cytometrii przepływowej.
    3. Określ procent aktywnych komórek na podstawie bramkowania FSC-SSC. Strategia bramkowania jest pokazana w Rysunek 1B.
    4. Oblicz średnią procentu żywych komórek na podstawie kontroli traktowanych DMSO, które są znormalizowane na 100%. Ustaw dowolny przedział akceptowalnej śmierci komórki (np. 20%). Inhibitory, które spowodowały pewien odsetek żywych komórek poniżej tego okna (tj. poniżej 80% kontrolnych leczonych DMSO), należy ponownie przetestować w niższych stężeniach.
    5. W przypadku inhibitorów, które nie spełniły kryteriów żywotności w kroku 2.3.4, należy powtórzyć kroki z kroków 2.2.1 - 2.3.4, ale w kroku 2.2.4 należy użyć płytki z inhibitorami o wartości 0,1 mM zamiast płytki zawierającej inhibitory 1 mM. Końcowe stężenie stosowanych tu inhibitorów wynosi 1 μM.
    6. W przypadku inhibitorów, które nadal powodują wysoki poziom śmierci komórki przy 1 μM, należy przetestować inhibitory przy 0,1 μM. Powtórz kroki 2.2.1 - 2.3.4, ale użyj płytki z inhibitorami przy 0,01 mM w kroku 2.2.4. Końcowe stężenie zastosowanych tutaj inhibitorów wynosi 0,1 μM.
  4. Przygotowanie płytki wyjściowej inhibitorów kinaz
    1. W przypadku inhibitorów, które mają być stosowane w stężeniu 10 μM, dodaj 10 μl 10 mM inhibitorów do 10 μL DMSO.
    2. W przypadku inhibitorów, które mają być stosowane w stężeniu 1 μM, należy dodać 1 μl 10 mM inhibitorów do 19 μl DMSO.
    3. W przypadku inhibitorów, które mają być stosowane w stężeniu 0,1 μM, dodaj 1 μl inhibitorów 10 mM do 199 μl DMSO (Rysunek 1C).
      UWAGA: Przygotowana płytka podstawowa inhibitorów ma 500-krotność stężenia zamierzonego stężenia końcowego po dodaniu do zawiesin tymocytów. Płytka podstawowa inhibitorów może być przygotowana w paskach PCR lub na płytkach 96-dołkowych.
    4. Płytka podstawowa inhibitorów kinaz może być stosowana do tymocytów w celu przeprowadzenia badań przesiewowych w konwencjonalnym systemie zależnym od wirowania (sekcja 3; patrz Rysunek 1A, metody 1 i 2) lub w alternatywnym systemie niezależnym od wirowania (sekcja 4; patrz Rysunek 1A, metoda 3).

3. Badanie przesiewowe biblioteki inhibitorów kinaz (konwencjonalny test oparty na wirówce)

  1. Leczenie tymocytów inhibitorami kinaz
    1. Przygotować zawiesinę tymocytu zgodnie z punktem 1.
    2. Rozcieńczyć tymocyty w pełnym RPMI, aby uzyskać zawiesinę tymocytów 5 x 106 komórek/ml.
    3. Dodaj 200 μl tymocytów do każdego dołka 96-dołkowej płytki za pomocą pipety wielokanałowej. Połóż talerz na lodzie.
    4. Dodać 0,5 μl inhibitorów do płytki 96-dołkowej z odpowiednich studzienek podstawowej płytki inhibitora przygotowanej w sekcji 2.4.
    5. Przygotować osiem studzienek z niepoddanymi działaniu substancji kontrolnych. Przygotować cztery studzienki kontrolne poddane działaniu nośnika, dodając 0,5 μl DMSO. Przygotuj cztery studzienki kontrolne poddane działaniu deksametazonu o wielkości 5 μM (Rysunek 2).
  2. Stymulacja tymocytów za pomocą kulek anty-CD3/CD28
    1. Weź 1 ml kulek i umyj je 2 ml PBS. Oddziel koraliki za pomocą stojaka magnetycznego i odessaj roztwór. Ponownie zawiesić kulki w 5 ml pełnego RPMI.
      UWAGA: Stosunek koralików do komórek wynosi od 1 do 2,5. Dostosuj ilość kulek do pobrania, w zależności od liczby studzienek do stymulacji i liczby użytych tymocytów.
    2. Dodać 50 μl kulek do każdej próbki poddanej działaniu inhibitora, czterech próbek poddanych działaniu DMSO i czterech z ośmiu próbek niepoddanych działaniu inhibitora. Dodać 50 μl pełnego RPMI do pozostałych czterech nieoczyszczonych studzienek. Rysunek 2 pokazuje ogólny układ płyty.
    3. Wymieszaj zawartość studzienek za pomocą pipety wielokanałowej.
    4. Inkubować tymocyty w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 17 - 20 godzin (lub przez noc).
  3. Barwienie antygenów powierzchniowych
    1. Przygotować mieszaninę barwiącą przeciwciała zawierającą przeciwciała anty-TCRβ, anty-CD4, anty-CD8 i anty-CD69. Rozcieńczyć przeciwciała w buforze płuczącym FACS (PBS uzupełniony 0,5% albuminą surowicy bydlęcej [BSA]) w stosunku 1:200 (v/v).
      UWAGA: Rozważ optymalizację mian przeciwciał stosowanych do barwienia, zamiast stosowania stałych rozcieńczeń przeciwciał, aby zminimalizować różnice w barwieniu w różnych eksperymentach i poprawić stosunek sygnału do szumu.
    2. Wirować płytkę w temperaturze 300 x g i w temperaturze 4 °C przez 5 minut.
    3. Przesuń płytkę, aby wyrzucić roztwór.
    4. W tym momencie protokół może być zgodny z konwencjonalnym protokołem zależnym od wirówki (przejdź do kroku 3.3.5; zobacz Rysunek 1A, metoda 1) lub alternatywnym protokołem niezależnym od wirowania (przejdź do kroku 4.4.4; zobacz Rysunek 1A, metoda 2).
    5. Zawiesić komórki w 75 μl mieszaniny przeciwciał barwiących przygotowanej w kroku 3.3.1.
    6. Wymieszać próbki za pomocą pipety wielokanałowej i inkubować je na lodzie przez 30 minut.
  4. Utrwalanie komórek
    1. Przemyć studzienki 200 μl buforu płuczącego FACS i wirować płytkę w temperaturze 300 x g i temperaturze 4 °C przez 5 minut.
    2. Przesuń płytkę, aby wyrzucić roztwór.
    3. Dodaj bufor do utrwalania/permeabilizacji (w zestawie z zestawem do aktywnej apoptozy kaspazy-3; to samo z 10-krotnym buforem do trwałej ondulacji/płukania wspomnianym w kroku 3.5.1 i przeciwciałem anty-kaspazą-3 w kroku 3.5.2) w ilości 200 μl na studzienkę.
    4. Inkubować na lodzie przez 30 minut.
  5. Barwienie wewnątrzkomórkowe dla aktywnej kaspazy 3
    1. Przygotuj 1x bufor do trwałej ondulacji/mycia, rozcieńczając 5 ml 10x buforu do trwałej ondulacji/mycia w 45 ml ultraczystej wody.
    2. Przygotuj wewnątrzkomórkową aktywną plamę kaspazy, dodając 1,3 ml przeciwciała anty-kaspazy-3 do 6,5 ml 1x buforu do trwałej ondulacji. Stosunek przeciwciała do buforu do trwałej ondulacji/płukania wynosi 1:5.
    3. Obracać płytkę w temperaturze 300 x g i w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Trzepać płytką, aby wyrzucić roztwór. Umyj płytkę 200 μl 1x buforu do trwałej ondulacji.
    4. Powtórz krok 3.5.3.
    5. Obracać płytkę w temperaturze 300 x g i w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Trzepać płytką, aby wyrzucić roztwór. Dodać 75 μl wewnątrzkomórkowego barwnika kaspazowego przygotowanego w kroku 3.5.2 do wszystkich studzienek.
    6. Wymieszać próbki za pomocą pipety wielokanałowej i inkubować na lodzie przez 1 godzinę.
    7. Przemyć próbki 200 μl 1 buforu do trwałej ondulacji/płukania i obracać płytkę w temperaturze 300 x g i temperaturze 4 °C przez 5 minut.
    8. Przesuń płytkę, aby wyrzucić roztwór. Umyj płytkę 200 μl 1x buforu do trwałej ondulacji. Wirować płytkę w temperaturze 300 x g i w temperaturze 4 °C przez 5 minut.
    9. Przesunąć płytkę, aby wyrzucić roztwór i ponownie zawiesić próbki w 200 μl buforu płuczącego FACS.
    10. Przeprowadź analizę cytometryczną przepływową próbek i przeanalizuj wyniki za pomocą programu do analizy FACS.
    11. Korzystając z wykresu CD4 w porównaniu z CD8, zbierz populację tymocytów DP z dodatnią ekspresją zarówno CD4, jak i CD8 (Rysunek 2, dolna połowa). W bramce tymocytowej DP określ procent komórek z aktywowaną kaspazą-3, używając niestymulowanej próbki jako kontroli ujemnej i deksametazonu jako kontroli pozytywnej. Do analizy ekspresji CD69 w bramce tymocytowej DP należy użyć próbki niestymulowanej jako kontroli ujemnej, a próbki stymulowanej jako kontroli dodatniej.
      UWAGA: Podczas bramkowania na tymocytach DP należy sprawdzić, czy populacja tymocytów DP jest prawidłowo bramkowana dla poszczególnych próbek. Pobudzone komórki obniżają koreceptory powierzchniowe i może dojść do niezamierzonego wykluczenia zdarzeń, jeśli zostanie użyta ciasna bramka DP.

4. Badanie przesiewowe biblioteki inhibitorów kinaz (test niezależny od wirówki)

  1. Leczenie tymocytów inhibitorami kinaz
    1. Przygotować zawiesinę tymocytu zgodnie z punktem 1.
    2. Rozcieńczyć tymocyty w pełnym RPMI, aby uzyskać zawiesinę tymocytów o wymiarach 25 x 106 komórek/ml.
    3. Dodaj 40 μl tymocytów do każdego dołka płytki o małej objętości, używając pipety wielokanałowej. Połóż talerz na lodzie.
    4. Rozcieńczyć inhibitory z płytki podstawowej, DMSO i deksametazonu w pełnym RPMI w stosunku czterech części całkowitego RPMI do jednej części inhibitora/DMSO/deksametazonu (współczynnik rozcieńczenia 5).
      UWAGA: Ponieważ objętości użyte w tej płytce o małej objętości są 5 razy mniejsze niż w metodzie konwencjonalnej, inhibitory i odczynniki kontrolne są rozcieńczane pięciokrotnie przed dodaniem ich do tymocytów w płytce.
    5. Dodać 0,5 μl inhibitorów do płytki 96-dołkowej z odpowiednich dołków płytki inhibitorowej przygotowanych w kroku 4.1.4.
    6. Przygotować osiem studzienek z niepoddanymi działaniu substancji kontrolnych. Przygotować cztery studzienki kontrolnych poddanych działaniu nośnika, dodając 0,5 μl DMSO przygotowanego w kroku 4.1.4. Przygotować cztery studzienki kontrolne poddane działaniu deksametazonu o wielkości 5 μM, używając rozcieńczonego deksametazonu przygotowanego w kroku 4.1.4 (Rysunek 2).
  2. Stymulacja tymocytów za pomocą kulek anty-CD3/CD28
    1. Upewnij się, że koraliki są równomiernie zawieszone. Weź 1 ml kulek i umyj je 2 ml PBS. Oddziel koraliki za pomocą stojaka magnetycznego i odessaj roztwór. Ponownie zawiesić kulki w 1 ml pełnego RPMI.
      UWAGA: Stosunek koralików do komórek wynosi od 1 do 2,5. Dostosuj ilość koralików w zależności od liczby studzienek do stymulacji i liczby użytych tymocytów.
    2. Dodać 10 μl zawiesiny kulek do każdej próbki poddanej działaniu inhibitora, czterech próbek poddanych działaniu DMSO i czterech z ośmiu próbek niepoddanych działaniu inhibitora. Dodać 10 μl pełnego RPMI do pozostałych czterech nieoczyszczonych studzienek. Rysunek 2 pokazuje ogólny układ płyt.
      UWAGA: Ostateczna objętość studzienek wynosi 50 μl, co mieści się w maksymalnej pojemności studzienek. Ważne jest, aby zachować ostrożność i trzymać płytki w pozycji pionowej, aby uniknąć rozlania przez studzienkę.
    3. Aby wymieszać, wymieszać płytkę za pomocą wytrząsarki orbitalnej do mikropłytek. Alternatywnie wymieszaj zawartość studzienek za pomocą pipety wielokanałowej.
    4. Inkubować tymocyty w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 17 - 20 godzin (lub przez noc) z pokrywką zapobiegającą parowaniu.
  3. Ustawienie podkładki do płyt
    UWAGA: Instrukcja montażu podkładki do płyt jest dostarczana przez producenta. Kroki są pokrótce wymienione poniżej. Na każdy etap zalewania potrzeba około 150 ml roztworu.
    1. Zalać system mycia 70% etanolem zawierającym 1% Tween 20.
    2. Zalać system mycia wodą dejonizowaną zawierającą 1% Tween 20.
    3. Zalać system mycia buforem myjącym FACS.
  4. Barwienie antygenów powierzchniowych
    1. Przygotować mieszaninę barwiącą przeciwciała zawierającą przeciwciała anty-TCRβ, anty-CD4, anty-CD8 i anty-CD69. Rozcieńczyć przeciwciała w buforze płuczącym FACS w stosunku 1:100 (v/v).
    2. Umyj płytkę 9 razy, używając 55 μl buforu myjącego FACS na jedno mycie, przy użyciu automatycznego systemu mycia z przepływem laminarnym.
      UWAGA: Pod koniec płukania w każdej studzience będzie 25 μl resztkowej objętości.
    3. Zawiesić komórki w 25 μl mieszaniny przeciwciał barwiących przygotowanej w kroku 4.4.1.
    4. Jeżeli próbki są przenoszone z płytki 96-dołkowej (z kroku 3.3.4), ponownie zawiesić komórki w 50 μl mieszaniny przeciwciał przygotowanej w kroku 3.3.1 i przenieść próbki na płytkę o małej objętości. Ten krok odpowiada metodzie numer 2, jak pokazano na Rysunek 1A.
    5. Aby wymieszać, należy wymieszać płytkę za pomocą wytrząsarki orbitalnej do mikropłytek lub wymieszać próbki za pomocą pipety wielokanałowej i inkubować na lodzie przez 30 minut.
  5. Utrwalanie komórek
    1. Umyj płytkę 9 razy, używając 55 μl buforu myjącego FACS na mycie, przy użyciu automatycznego systemu mycia z przepływem laminarnym.
    2. Dodaj bufor do utrwalania/permeabilizacji (w zestawie z zestawem do aktywnej apoptozy kaspazy-3; to samo z 10-krotnym buforem do trwałej ondulacji/płukania wspomnianym w kroku 4.6.1 i przeciwciałem anty-kaspazą-3 w kroku 4.6.2) w ilości 50 μl na studzienkę.
    3. Inkubować na lodzie przez 30 minut.
  6. Barwienie wewnątrzkomórkowe dla aktywnej kaspazy 3
    1. Przygotuj 1x bufor do trwałej ondulacji/mycia, rozcieńczając 25 ml 10x buforu do trwałej ondulacji/mycia w 225 ml ultraczystej wody.
    2. Przygotuj wewnątrzkomórkowe aktywne barwienie kaspazy, dodając 1 ml przeciwciała anty-kaspazy-3 do 2 ml 1x buforu do trwałej ondulacji/płukania. Stosunek przeciwciała do buforu do trwałej ondulacji/płukania wynosi 1:2.
    3. Zalać system mycia 1x buforem do trwałej ondulacji/prania.
    4. Umyj płytkę 9x 1x buforem do trwałej ondulacji/mycia, w ilości 55 μl na każde mycie.
    5. Dodać 25 μl wewnątrzkomórkowego barwnika kaspazowego przygotowanego w kroku 4.6.2 do wszystkich studzienek.
    6. Aby wymieszać, należy wymieszać płytkę za pomocą wytrząsarki orbitalnej do mikropłytek lub wymieszać próbki za pomocą pipety wielokanałowej i inkubować na lodzie przez 1 godzinę.
    7. Umyj płytkę 9x 1x buforem do trwałej ondulacji/mycia, w ilości 55 μl na każde mycie.
    8. Dodać 25 μl buforu płuczącego FACS do wszystkich studzienek.
    9. Przenieść próbki do probówek do mikromiareczkowania po odpowiednim wymieszaniu za pomocą pipetowania.
    10. Dodać kolejne 50 μl buforu płuczącego FACS do pustych studzienek i powtórzyć krok 4.6.9.
    11. Powtórzyć czynności 4.6.9 i 4.6.10 2x aż do momentu, gdy do probówek do mikromiareczkowania zostanie zebranych 200 μl próbek.
      UWAGA: Celem procedur opisanych w krokach 4.6.10 i 4.6.11 jest zapewnienie maksymalnego odzysku komórek z płytki o małej objętości. Jeśli liczba komórek nie stanowi problemu, po kroku 4.6.10 po prostu uzupełnij probówki do mikromiareczkowania do 200 μl buforem płuczącym FACS.
    12. Przeprowadzić analizę cytometryczną przepływową próbek i przeanalizować wyniki za pomocą programu do analizy FACS, zgodnie z krokiem 3.5.11. Aktywacja kaspazy-3 i ekspresja CD69 są analizowane w bramce zawierającej tymocyty CD4 + CD8 + DP.

Wyniki

Podejście do testu przesiewowego przedstawiono podsumowująco na Rysunku 1A. Inhibitory kinazy poddano najpierw badaniu pod kątem ich utajnionych efektów na żywotność tymocytów. Jako kontrolę pozytywną dla apoptozy wykorzystano deksametazon jako czynnik proapoptotyczny. Bramkowanie dla populacji żywych komórek określono na podstawie nieleczonych kontroli negatywnych oraz kontroli pozytywnych traktowanych deksametazonem (Rysunek 1B). Inhibitory testowano najpierw w stężeniu 10 µM na tymocytach, a odsetek żywych komórek mierzono po 18 h inkubacji. Przyjęto 20-procentowy zakres śmierci komórkowej, tak aby związki indukujące utratę więcej niż 20% komórek w bramce komórek żywych w porównaniu z próbkami traktowanymi DMSO były testowane w niższych stężeniach (Rysunek 1B). Przedstawiono reprezentatywne wykresy FACS wybranych próbek traktowanych inhibitorami w celu zilustrowania testu żywotności. LY294002 (2-(4-morpholinyl)-8-phenyl-4H-1-benzopyran-4-one; CAS 154447-36-6), inhibitor PI3K22, nie zwiększył znacząco śmierci komórek przy 10 µM i inhibitor ten zastosowano w stężeniu 10 µM w kolejnych testach. CAY10626 (N-[2-(dimethylamino)ethyl]-N-methyl-4-[[[[4-[4-(4-morpholinyl)-7-(2,2,2-trifluoroethyl)-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-2-yl]phenyl]amino]carbonyl]amino]-benzamide; CAS 1202884-94-3), dualny inhibitor PI3Kα/mTOR23, indukował wysoki poziom śmierci komórkowej przy 10 µM i 1 µM, ale nie przy 0,1 µM, w związku z czym uznano 0,1 µM za odpowiednie stężenie do zastosowania w dalszych testach. Staurosporyna (2,3,10,11,12,13-hexahydro-10R-methoxy-9S-methyl-11R-methylamino-9S,13R-epoxy-1H,9H-diindolo[1,2,3-gh;3',2',1'-lm]pyrrolo[3,4-j][1,7]benzodiazonin-1-one; CAS 62996-74-1), pan-inhibitor białkowej kinazy C o udowodnionej zdolności do indukcji apoptozy24, wywołała znaczną śmierć komórek we wszystkich testowanych stężeniach, nawet przy 0,1 µM. Została ona wykorzystana w kolejnych badaniach w stężeniu 0,1 µM jako dodatkowa kontrola pozytywna.

Końcowe stężenia inhibitorów wybrano na podstawie najwyższych stężeń, przy których nie zwiększały one śmierci komórek o więcej niż 20% w porównaniu do próbek traktowanych DMSO. Po ustaleniu końcowych stężeń inhibitorów przygotowano płytkę zapasową, w której wszystkie inhibitory znajdowały się w stężeniu 500-krotnie wyższym niż stężenie stosowane w kontakcie z komórkami. Rysunek 1C przedstawia układ płytek na płycie zapasowej wraz z końcowymi stężeniami inhibitorów. W alternatywnym protokole inkubacji komórek bezpośrednio w płytkach o małej objętości dla testu płukania w przepływie laminarnym, zastosowanie małych objętości wymagało dalszego rozcieńczenia inhibitorów. Aby upewnić się, że zawartość DMSO w kulturach po dodaniu inhibitorów nie będzie zbyt wysoka dla komórek, inhibitory dodatkowo rozcieńczono w pełnym medium RPMI z czynnikiem rozcieńczenia 5, tak aby ich stężenie było 100-krotnie wyższe od stężenia docelowego podczas aplikacji do komórek.

Inhibitory, rozcieńczone do nietoksycznych stężeń, wykorzystano w analizie apoptozy indukowanej stymulacją TCR w tymocytach5,17. Stymulację przeprowadzono przy użyciu kulek anti-CD3/CD28 przez 18 h, a następnie komórki barwiono w celu oceny aktywacji kaspazy-3 w populacji podwójnie dodatnich (DP) tymocytów CD4+ i CD8+ (Rysunek 2). W próbkach stymulowanych anti-CD3/CD28 oraz w próbkach stymulowanych anti-CD3/28 i traktowanych DMSO (jako kontrolą) zaobserwowano wzrost aktywacji kaspazy-3 i ekspresji CD69, a także obniżenie poziomu TCR w porównaniu do próbek niestymulowanych. Próbki traktowane deksametazonem wykazały wzrost aktywacji kaspazy-3 niezależny od upregulacji CD69, co jest zgodne z oczekiwanym efektem indukowania apoptozy niezależnie od stymulacji TCR.

Rysunek 3A podsumowuje wyniki badania przesiewowego biblioteki dla wybranych inhibitorów. Zarówno aktywacja kaspazy-3, jak i CD69 mogą być wykorzystane do identyfikacji potencjalnych inhibitorów ze względu na supresję ekspresji. Zgodnie z oczekiwaniami, inhibitory kanonicznych mediatorów sygnalizacji TCR pojawiły się jako pozytywne wyniki w badaniach przesiewowych. Takie inhibitory, wykazujące różny stopień mocy hamowania, obejmowały inhibitory o szerokim spektrum działania, celujące w wiele kinaz, a także inhibitory bardziej specyficzne. Niektóre inhibitory były w stanie supresować zarówno aktywację kaspazy-3, jak i nadekspresję CD69 (Rysunek 3B, górny rząd, lewe panele). Jednym z takich inhibitorów jest bisindolylmaleimide II (3-(1H-Indol-3-yl)-4-[1-[2-(1-methyl-2-pyrrolidinyl)ethyl]-1H-indol-3-yl]-1H-pyrrole-2,5-dione; CAS 137592-45-1), który hamuje wszystkie izoformy kinazy białkowej C, a ponadto kinazę białkową A oraz PDK125,26,27. Innym inhibitorem w tej kategorii jest CAY10657 (3-[(aminocarbonyl)amino]-5-[4-(4-morpholinylmethyl)phenyl]-2-thiophenecarboxamide; CAS 494772-86-0), proponowany inhibitor IKK228.

Zidentyfikowano związki, które hamowały zwiększenie ekspresji CD69, ale nie upośledzały aktywacji kaspazy-3 (Rysunek 3B, górny rząd, panele po prawej). Wśród zidentyfikowanych inhibitorów znajdowały się CAY10626, inhibitor PI3Kα i mTOR23, oraz U-0126 (2,3-bis[amino[(2-aminophenyl)thio]methylene]-butanedinitrile; CAS 109511-58-2), inhibitor MEK29. Wyniki pokazują, że różne inhibitory celujące w różne kinazy z określonych gałęzi szlaku sygnalizacyjnego TCR, zwłaszcza te celujące w kinazy późnego etapu, mogą prowadzić do selektywnego upośledzenia zjawisk aktywacji limfocytów T.

Istniały również inhibitory, które nie hamowały jednocześnie zwiększenia ekspresji CD69 oraz aktywacji kaspazy-3 (Rycyna 3B, dolny rząd, lewe panele). Dwiema zidentyfikowanymi substancjami należącymi do tej kategorii są paklitaksel (βS-(benzoylamino)-αR-hydroxy-benzenepropanoic acid, (2aR,4S,4aS,6R,9S,11S,12S,12aR,12bS)-6,12b-bis(acetyloxy)-12-(benzoyloxy)-2a,3,4,4a,5,6,9,10,11,12,12a,12b-dodecahydro-4,11-dihydroxy-4a,8,13,13-tetramethyl-5-oxo-7,11-methano-1H-cyclodeca[3,4]benz[1,2-b]oxet-9-yl ester; CAS 33069-62-4), który zaburza dynamikę mikrotubul30, oraz nekrostatyna-5 (2-[[3,4,5,6,7,8-hexahydro-3-(4-methoxyphenyl)-4-oxo[1]benzothieno[2,3-d]pyrimidin-2-yl]thio]-acetonitrile; CAS 337349-54-9), będąca inhibitorem kinazy RIP131. W przypadkach, w których zwiększenie ekspresji CD69 i aktywacja kaspazy-3 nie zostały upośledzone, może to wynikać z faktu, że inhibitory te nie oddziaływały na odpowiednią kinazę w szlaku sygnałowym TCR.

Jak wspomniano wcześniej, w badaniach przesiewowych zastosowano staurosporynę w stężeniu, które nadal indukowało apoptozę w tymocytach. Zgodnie z oczekiwaniami, próbka traktowana staurosporyną wykazała wysoki poziom aktywacji kaspazy-3 (Rycyna 3B, dolny rząd, prawa kolumna). Niski poziom ekspresji CD69 można przypisać zapośrednicznemu przez staurosporynę hamowaniu PKC, ponieważ bisindolylmaleimid II, inny inhibitor pan-PKC, również tłumił ekspresję CD69. Alternatywnie, staurosporyna mogła wywołać apoptozę w komórkach, zanim były one w stanie zwiększyć ekspresję CD69.

W celu zwiększenia przepustowości i automatyzacji protokołu przygotowano procedury równoległe, które obejmowały zastosowanie zautomatyzowanego systemu mycia płytek poprzez przepływ laminarny. Przetestowano i porównano dwa oddzielne protokoły z wykorzystaniem tego zautomatyzowanego urządzenia do mycia płytek z konwencjonalną metodą hodowli komórek na płytkach 96-dołkowych i barwienia komórek w protokole zależnym od wirowania. Jedna metoda polegała na hodowli komórek na płytkach 96-dołkowych zgodnie ze standardową procedurą, a następnie przeniesieniu komórek na płytki kompatybilne z automatyczną myjką do płytek w celu przeprowadzenia etapów barwienia (Rycina 4, próbki DA-Washing). Druga metoda polegała na hodowli komórek bezpośrednio na płytkach kompatybilnych z myjką i kontynuowaniu protokołu barwienia na tej samej płytce (Rycina 4, próbki DA-Culture). Protokoły niezależne od wirowania nie wykazują wielu zauważalnych różnic w barwieniu aktywnej kaspazy-3, CD69 lub TCRβ w różnych testowanych próbkach w porównaniu do konwencjonalnego protokołu zależnego od wirowania (Rycina 4). Różnice w intensywności barwienia można przypisać zastosowaniu przeciwciał w nieco innych stężeniach podczas etapów barwienia.

Przesiewanie inhibitorów kinaz; dane z cytometrii przepływowej; schemat układu eksperymentalnego; analiza stężeń.
Rysunek 1: Żywotność tymocytów po traktowaniu inhibitorami. (A) Schemat głównych etapów testu przesiewowego. Zaproponowano trzy metody stymulacji i barwienia tymocytów wykorzystywanych w teście aktywacji, mianowicie (1) hodowlę tymocytów w standardowych płytkach 96-dołkowych, a następnie barwienie zgodnie z konwencjonalnym protokołem opartym na wirowaniu, (2) hodowlę tymocytów w standardowych płytkach 96-dołkowych, a następnie barwienie zgodnie z protokołem płukania niezależnym od wirowania oraz (3) hodowlę tymocytów w płytkach o małej objętości, a następnie barwienie w tych samych płytkach zgodnie z protokołem płukania niezależnym od wirowania. (B) Strategie bramkowania zastosowane w testach żywotności. Bramka dla żywych komórek została wyznaczona na podstawie wykresów rozproszenia przedniego (FSC) i bocznego (SSC), jak opisano wcześniej17. Inhibitory uznane za zbyt toksyczne w badanym stężeniu poddano dalszym testom żywotności przy stężeniach 10-krotnie niższych. Przedstawiono reprezentatywne próbki traktowane inhibitorami. Należy zwrócić uwagę na wspólną kontrolę (traktowaną DMSO [DMSO]) zastosowaną dla próbek 1 µM i 0,1 µM. (C) Układ płytek z rozcieńczonymi inhibitorami. Schematyczne przedstawienie płytek z inhibitorami rozcieńczonymi w DMSO do stężenia 500-krotnie większego niż zamierzone stężenie końcowe. Każdy dołek reprezentuje jeden unikalny inhibitor; szare dołki są puste. Przedstawione stężenia to stężenia końcowe po dodaniu do kultur komórkowych, mianowicie 10 µM (ciemnoczerwony), 1 µM (fuksja) i 0,1 µM (niebieski). Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Eksperyment na płytce ELISA; wyniki cytometrii przepływowej dla ekspresji CD4/CD8, CD69, ActCasp3, efekty inhibitorów.
Rycina 2: Układ płytki w teście aktywacji tymocytów. (Góra) Kolumny 1 i 12 są zarezerwowane dla kontroli, natomiast kolumny od 2 do 11 zawierają próbki traktowane inhibitorem (beżowe). Kontrola negatywna (niestymulowane [NS]; szare) zajmuje dołki od A1 do D1, a kontrola pozytywna śmierci komórek (traktowane deksametazonem [DEX]; fioletowe) zajmuje dołki od E1 do H1. Kolumny od 2 do 12 zawierają tymocyty stymulowane kuleczkami anti-CD3/CD28. Kontrola pozytywna aktywacji tymocytów (próbki stymulowane [α-CD3/CD28]; zielone) zajmuje dołki od A12 do D12, a kontrola nośnika (stymulowane i traktowane DMSO [α-CD3/CD28 + DMSO]; czerwone) zajmuje dołki od E12 do H12. (Dół) Wykresy cytometrii przepływowej dla barwień aktywnej kaspazy-3 (ActCasp3), CD69 oraz TCRβ tymocytów wyselekcjonowanych w bramce komórek podwójnie pozytywnych (DP). Przedstawiono reprezentatywne wykresy dla różnych kontroli. NS = niestymulowane; DEX = próbki traktowane deksametazonem; α-CD3/CD28 + DMSO = próbki stymulowane kuleczkami powlekanymi CD3/CD28 i traktowane DMSO; α-CD3/CD28 = próbki stymulowane kuleczkami powlekanymi CD3/CD28. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Diagramy analizy cytometrii przepływowej ekspresji markerów CD69 i ActCasp3 w komórkach poddanych działaniu inhibitorów.
Rycina 3: Przesiewowa analiza biblioteki inhibitorów pod kątem aktywacji tymocytów. (A) Podsumowanie danych z testu aktywacji. Są to wyniki reprezentatywnego eksperymentu przedstawiające znormalizowane wartości komórek z aktywną kaspazą-3 oraz ekspresją CD69 dla wybranych inhibitorów. Normalizacja została przeprowadzona poprzez porównanie procentu komórek w bramce dla kaspazy-3-dodatnich lub CD69-dodatnich do wartości kontroli traktowanej DMSO, która na wykresie została przyjęta jako wartość względna 0. (B) Wybrane wykresy FACS. Wykresy cytometrii przepływowej dla inhibitorów, które hamowały zarówno aktywację kaspazy-3, jak i zwiększenie ekspresji CD69 (lewa góra), hamowały wyłącznie zwiększenie ekspresji CD69 (prawa góra) lub nie wywarły wpływu na aktywację kaspazy-3 i ekspresję CD69 (lewa dół). Wykresy próbki traktowanej staurosporyną pokazano w celu zilustrowania efektów zastosowania inhibitora w stężeniach toksycznych (prawa dół). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza cytometrii przepływowej, TCRβ vs ActCasp3 oraz CD69, przedstawiająca wyniki apoptozy i aktywacji.
Rycina 4: Porównanie różnych protokołów analizy. Wykresy cytometrii przepływowej dla aktywności kaspazy-3 (ActCasp3), CD69 oraz TCRβ w barwieniu tymocytów DP po zastosowaniu trzech różnych protokołów analizy. Przebadano cztery różne warunki: kontrolę negatywną (niestymulowane [NS]), kontrolę pozytywną śmierci komórkowej (traktowane deksametazonem [DEX]), kontrolę nośnika (stymulowane i traktowane DMSO [α-CD3/CD28 + DMSO]) oraz próbkę traktowaną inhibitorem (stymulowane i traktowane PIK-75 [α-CD3/CD28 + PIK-75]). Conventional = hodowla tymocytów w standardowych płytkach 96-dołkowych i barwienie zgodnie z konwencjonalnym protokołem opartym na wirowaniu; DA-Washing = hodowla tymocytów w standardowych płytkach 96-dołkowych i barwienie przy użyciu protokołu płukania w przepływie laminarnym; DA-Culture = hodowla tymocytów w płytkach o małej objętości i barwienie w tych samych płytkach przy użyciu protokołu płukania w przepływie laminarnym.  Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

Dyskusja

Zaproponowana tutaj strategia badań przesiewowych ocenia zdolność małocząsteczkowych inhibitorów do tłumienia efektów apoptozy w tymocytach po stymulacji, oprócz bardziej konwencjonalnych markerów aktywacji komórek T-CD69 w górę i regulacji w dół TCR. Można również dołączyć dodatkowe markery, aby umożliwić analizę różnych podzbiorów tymocytów32. Interesującym aspektem obecnego testu jest fakt, że inhibitory, które utrudniają sygnalizację TCR, tłumią również indukcję apoptozy, co dodatkowo podkreśla różnicę niezależnych od TCR efektów, jakie inhibitory mogą mieć na indukowanie śmierci komórki. Co więcej, test oparty na cytometrii przepływowej pozwala na wykorzystanie wielu odczytów jako odrębnych markerów aktywacji, które mogą informować o wpływie inhibitorów na oddzielne poszczególne gałęzie sygnalizacji TCR. W przedstawionym przypadku były to inhibitory, które wykazywały zróżnicowane hamowanie aktywacji kaspazy-3 i regulacji w górę CD69. Ponieważ niektóre związki mogą wpływać na funkcje porządkowe, takie jak synteza białek lub transport pęcherzykowy, nie jest zaskakujące obserwowanie wpływu na regulację w górę markerów syntetyzowanych de novo (np. CD69), ale nie na modyfikacje potranslacyjne (np. proteolityczną aktywację kaspazy-3).

Ponieważ przedstawiony tutaj test mierzy apoptozę jako odczyt, konieczne jest, aby utajone działanie toksyczne inhibitorów nie przesłaniało wyników. Na przykład w badaniu przesiewowym nie rozcieńczyliśmy staurosporyny powyżej 1 nM, mimo że w tym stężeniu nadal była toksyczna dla komórek. Reprezentatywne wyniki są zgodne z tym, że staurosporyna jest inhibitorem kinazy promiskuitycznej i induktorem apoptozy33. Bez wystarczającego rozcieńczenia badanych związków do stężeń nietoksycznych możliwe jest przeoczenie potencjalnych trafień.

Opisana tutaj strategia badań przesiewowych byłaby trudna do zastosowania u ludzi ze względu na komplikacje związane z uzyskaniem wystarczającej liczby tymocytów do wysokoprzepustowych badań przesiewowych. Możliwe jest jednak uzyskanie próbek grasicy ludzkiej z biopsji serca dziecięcego34,35 lub z płodów36,37. Niemniej jednak, ponieważ szlaki sygnałowe TCR i sekwencje aminokwasowe białek sygnałowych są w dużej mierze konserwatywne między myszami a ludźmi, test tymocytów stanowi przydatną wstępną strategię przesiewową, a wszelkie wyniki uzyskane za pomocą tego testu przy użyciu mysich tymocytów można następnie zweryfikować w pierwotnych ludzkich limfocytach.

Jednym z ograniczeń konwencjonalnego protokołu zależnego od wirowania jest perspektywa utraty komórek, którą można przypisać wieloetapowemu charakterowi procesu, który obejmuje takie etapy, jak przenikanie komórek i wirowanie. Każdy etap wirowania i ponownego zawieszania nieuchronnie prowadzi do utraty komórek. Chociaż takie straty mogą nie być krytyczne w przypadku badań obejmujących ograniczoną liczbę próbek, mogą stwarzać problemy w przypadku stosowania w badaniach przesiewowych o wyższej przepustowości, w szczególności w miarę postępu formatu testu od 96 do 384 do 1536 dołków. Jednym ze sposobów obejścia tego problemu jest zastosowanie przepuszczalnych dla komórek fluorescencyjnych czujników kaspazy38 , które umożliwiają wykrywanie aktywacji kaspazy przy jednoczesnym unikaniu powikłań związanych z przenikaniem komórek i wielokrotnym płukaniem5. Alternatywnie, możliwe jest również zastosowanie metody mycia komórek przez przepływ laminarny niezależnej od wirowania w celu zminimalizowania utraty komórek. Dzięki zautomatyzowanej stacji mycia płytek w połączeniu z płytą bezścienną, komórki są myte przez przepływ laminarny bez użycia wirówki. Wykładnicze rozcieńczenie odczynników pozwala na dokładne i wydajne płukanie komórek w czasie krótszym niż 3 minuty, co odpowiada rozcieńczeniu dwóm rundom płukania odśrodkowego. Bez naprężeń zewnętrznych spowodowanych wirowaniem komórki są bardziej żywotne, a straty komórek są zminimalizowane.

Zbadaliśmy również możliwość wykorzystania zautomatyzowanej stacji mycia płytek po wyhodowaniu tymocytów w 96-dołkowych płytkach z dnem w kształcie litery U, a także hodowli komórek bezpośrednio na płytkach bezściennych kompatybilnych z automatyczną stacją mycia płytek. Hodowla komórek na płytkach bez ścianek umożliwiła wyeliminowanie wszystkich etapów wirowania i zminimalizowanie utraty komórek poprzez wyeliminowanie potrzeby przenoszenia próbki między płytkami. Ogólnie rzecz biorąc, te trzy różne protokoły są porównywalne zarówno pod względem skuteczności stymulacji, jak i barwienia. Zautomatyzowana stacja mycia zapewnia korzyści w postaci automatyzacji, szybkości i wydajności, co ułatwia analizę o większej przepustowości. Co więcej, dzięki zwiększonej automatyzacji etapy mycia mogą być przeprowadzane szybciej, a eksperymenty lub eksperymentatorzy są bardziej spójne. Stacja mycia ma jednak pewne wady: do zalewania pralki potrzebne są duże ilości myjących (150 ml na zmianę bufora, z czego 50 ml zużywa się do mycia); należy zachować szczególną ostrożność podczas obchodzenia się z płytą, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego studzienek z powodu ograniczonej przegrody między studzienkami płytki o małej objętości; bufor resztkowy 25 μl w studzienkach po przepłukaniu wymaga użycia odczynników przygotowanych o stężeniu wyższym niż 1x. Aby rozwiązać problem objętości resztkowej i ograniczonej pojemności płytki, można dodać akcesorium zwiększające objętość inkubacji z 70 μl do 150 μl, co ułatwia przyjęcie konwencjonalnych protokołów. Chociaż obecnie dostępne są zautomatyzowane systemy obsługi płyt, zajmują one znaczną powierzchnię w porównaniu z systemem mycia laminarnego, który jest małą jednostką o powierzchni ~1 stopy sześciennej (~0,028 m3). Co więcej, integracja wirowania z automatycznymi systemami obsługi płytek stanowi wyzwanie, ograniczając ich zastosowanie w myciu komórek. O ile nam wiadomo, obecnie nie ma dostępnych innych przyrządów do mycia komórek niezależnych od wirówek.

Przedstawiona tutaj strategia badań przesiewowych jest w stanie zidentyfikować małe cząsteczki i ich rzekome kinazy docelowe, które wpływają na sygnalizację TCR i aktywację komórek T. Wykorzystana tu biblioteka składa się głównie z małocząsteczkowych inhibitorów kinaz i była w stanie wygenerować szereg potencjalnie interesujących trafień. Protokół może być również z łatwością stosowany do bibliotek inhibitorów innych klas enzymów lub do innych typów małych cząsteczek, a także do bibliotek innych związków (np. różnych makrocząsteczek). Protokół może być również stosowany do badań przesiewowych innych typów komórek, takich jak obwodowe limfocyty T lub unieśmiertelnione komórki, w tym te wyrażające transgeniczne TCR lub przenoszące systemy reporterowe. Identyfikacja i charakterystyka nowych mediatorów sygnalizacji limfocytów T może poszerzyć naszą wiedzę na temat szlaku sygnałowego, a także pomóc w opracowaniu terapii celowanej w chorobach immunologicznych 13,14,15,16. Podsumowując, badanie to rozszerza zakres dostępnych opcji wykrywania mediatorów sygnalizacji limfocytów T za pomocą wysokoprzepustowych testów przesiewowych.

Oświadczenia

Autor Chyan Ying Ke jest pracownikiem firmy Curiox Biosystems, która produkuje podkładkę do komórek DA i płytki do komórek DA używane w tym artykule.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty z Narodowej Rady Badań Medycznych Ministerstwa Zdrowia Singapuru, NMRC CBRG15may017, oraz Ministerstwa Edukacji Singapuru, 2014-T2-1-136 (dla N.R.J.G.).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
RPMIHyCloneSH30027FS
FBSHyCloneSH3007103
L-glutaminaHyCloneSH3003401
Pirogronian soduHyCloneSH3023901
Penicylina/StreptomycynaHyCloneSV30010
b-merkaptoetanolSigma Aldrich516732 
10X PBSVivantisPB0344 – 1L
Biblioteka badań przesiewowych kinazy (96-Well)Cayman Chemical10505Dokładna zawartość biblioteki może się różnić
DMSOSigma AldrichD2650
DeksametazonSigma AldrichD4902 
Koraliki anty-CD3/CD28Thermo Fisher Scientific11452D
FITC Zestaw do apoptozy aktywnej kaspazy-3BD Pharmingen550480Zawiera bufor do utrwalania/przepuszczalności, bufor 10X Perm/Wash i przeciwciało anty-kaspazowe 3
Myjka DA-CellCURIOXHT1000
96-dołkowa płytka DA-CellCURIOX96-DC-CL-05
Przeciwciała
CD3eBioLegend100236
TCRbBD Biosciences553174
CD4BD Biosciences740007
CD8BD Biosciences563786
CD69eBioscience25-0699-42
inhibitory
TG003CaymanChemical-Zbiblioteki badań przesiewowych kinazy
PKC 412CaymanChemical-Zbiblioteki badań przesiewowych kinaz
DoramapimodCaymanChemical-Zbiblioteki badań przesiewowych kinazy
PaklitakselKajmanchemiczny-Zbiblioteki badań przesiewowych kinazy
ErlotinibKajman Chemiczny-z biblioteki badań przesiewowych kinazy
Nekrostyna-5Substancja chemiczna Kajmanów-Zbiblioteki badań przesiewowych kinaz
NVP-BEZ235Substancja chemiczna Kajmanów-Zbiblioteki badań przesiewowych kinazy
PhtalazynonpirazolKajman chemiczny-Zbiblioteki badań przesiewowych kinazy
AG-879Substancja chemiczna Kajmanów-Z Biblioteka badań przesiewowych kinazy
1-NA-PP1CaymanChemical-Zbiblioteki badań przesiewowych kinazy
Torin 1CaymanChemical-Zbiblioteki badań przesiewowych kinazy
Bisindolylmaleimid IIKajmanChemical-Zbiblioteki badań przesiewowych kinazy
BIBF 1120Kajmanychemiczne-Zbiblioteki badań przesiewowych kinazy
SMI-4aCaymanChemical-Fromthe Kinase Screening Library
bisindolylmaleimide XI (chlorowodorek)CaymanChemical-Fromthe Kinase Screening Library
CAY10657CaymanChemical-Fromthe Kinase Screening Library
AS-703026CaymanChemical-Fromthe Kinase Screening Library
Chlorek chelerytrynyCayman Chemical-Z Biblioteki Badań Przesiewowych Kinazy
TunikamycynaCaymanChemical-ZBiblioteki Badań Przesiewowych Kinaz
GSK 1059615CaymanChemical-ZBiblioteki Badań Przesiewowych Kinazy
RuxolitinibCaymanChemical-ZBiblioteki Badań Przesiewowych Kinazy
Nekrostyna-1Kajman Chemiczna-ZBiblioteki Badań Przesiewowych Kinazy
SB 505124Kajmany Chemiczne-z biblioteki badań przesiewowych kinazy
INK128Kajmany Chemiczne-z biblioteki badań przesiewowych kinaz
Kanertynib (chlorowodorek)Kajmany Chemiczne-z biblioteki badań przesiewowych kinaz
SB 431542Kajmany -z biblioteki badań przesiewowych kinazy
PD 173074Kajmany Chemiczny-z biblioteki badań przesiewowych kinaz
Kwas walproinowy (sól sodowa)Chemia Kajmana-Z biblioteki badań przesiewowych kinaz
PD 0325901Kajmany Chemiczna-z biblioteki badań przesiewowych kinazy
SB 203580Chemia Kajmanów-z biblioteki badań przesiewowych kinazy
VX-702Substancja chemiczna Kajmanów-z kinazy Biblioteka badań przesiewowych
EmodinCayman Chemical-z biblioteki badań przesiewowych kinazy
CHIR99021Cayman Chemical-z biblioteki badań przesiewowych kinaz
BIOCayman Chemical-z biblioteki badań przesiewowych kinazy
imatynib (mesylan)Chemical Cayman -z biblioteki badań przesiewowych kinazy
JabłczansunitynibuChemia Kajmanów-Zbiblioteki badań przesiewowych kinazy
GefitynibKajman Chemiczny-Zbiblioteki badań przesiewowych kinaz
PP2Kajman Chemiczny-Zbiblioteki badań przesiewowych kinazy
3-MetyladeninaKajman Chemiczna-Zbiblioteki badań przesiewowych kinazy
Bisindolylmaleimid IKajman Chemiczny-Zkinazy Biblioteka przesiewowa
Bisindolilomaleimid IVCayman Chemical-z biblioteki badań przesiewowych kinazy
Bisindolylmaleimid VCayman Chemical-z biblioteki badań przesiewowych kinaz
NSC 663284Cayman Chemical-z biblioteki badań przesiewowych kinazy
D 4476Kajmany chemiczne-z biblioteki badań przesiewowych kinazy
NU 7026CaymanChemical-Fromthe Kinase Screening Library
H-9 (chlorowodorek)CaymanChemical-Fromthe Kinase Screening Library
Indirubina-3'-monoximeCaymanChemical-Fromthe Kinase Screening
KN-62CaymanChemical-Fromthe Kinase Screening Library
KN-93Cayman Chemical- Z biblioteki badań przesiewowych kinaz
CGP 57380Kajmanchemiczny-Z biblioteki badań przesiewowych kinaz
Izo-OlomoucinaKajmanchemiczny-Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
S)-Glicyl-H-1152 (chlorowodorek)Substancja chemiczna Kajmanów-Zbiblioteki badań przesiewowych kinazy
Bisindolilomaleimid VIII (octan)Kajman Chemiczny-Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
ST638CaymanChemical-Zbiblioteki badań przesiewowych kinazy
SU 6656CaymanChemical-Zbiblioteki badań przesiewowych kinazy
LY364947CaymanChemical-Zbiblioteki badań przesiewowych kinazy
SB 203580 (chlorowodorek)CaymanChemical-Zbiblioteki
badań przesiewowych kinazyCAY10621CaymanChemical-Fromthe Kinase Screening Library
YM-201636CaymanChemical-Fromthe Kinase Screening Library
ZM 447439CaymanChemical-Fromthe Kinase Screening Library
AS-041164CaymanChemical-Fromthe Kinase Screening Library
NVP-AEW541 (chlorowodorek)Cayman Chemical- Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
PP242CaymanChemical-Fromthe Kinase Screening Library
ABT-869CaymanChemical-Fromthe Kinase Screening Library
CAY10622CaymanChemical-Fromthe Kinase Screening Library
17β-hydroxy WortmanninCaymanChemical-Fromthe Kinase Screening Library
CAY10626CaymanChemical-Fromthe Kinase Screening Library
SU 6668CaymanChemical-Fromthe Kinase Screening Library
CAY10572CaymanChemical-Fromthe Kinase Screening Library
N,N-DimethylsphingosineCaymanChemical-Fromthe Kinase Screening Library
LY294002Cayman Chemical-Z Biblioteki Badań Przesiewowych Kinazy
U-0126CaymanChemical-ZBiblioteki Badań Przesiewowych Kinazy
StaurosporineCaymanChemical-ZBiblioteki Badań Przesiewowych Kinazy
KN-92 (chlorowodorek)CaymanChemical-ZBiblioteki Badań Przesiewowych Kinazy
AS-605240 (sól potasowa)CaymanChemical-Zkinazy Biblioteka przesiewowa
O-1918CaymanChemical-Fromthe Kinase Screening Library
Y-27632 (chlorowodorek)CaymanChemical-Fromthe Kinase Screening Library
LeelamineCaymanChemical-Fromthe Kinase Screening Library
PD 98059CaymanChemical-Fromthe Kinase Screening Library
PD 169316CaymanChemical-Fromthe Kinase Screening Library
TGX-221CaymanChemical-Fromthe Kinase Screening Library
(S)-H-1152 (chlorowodorek)CaymanChemical-Fromthe Kinase Screening Library
AS-605240CaymanChemical-Fromthe Kinase Screening Library
D-erythro-Sphingozyna C-18Cayman Chemical- Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
OSU03012CaymanChemical-Zbiblioteki badań przesiewowych kinazy
JNJ-10198409CaymanChemical-Zbiblioteki badań przesiewowych kinazy
Leelamine (chlorowodorek)KajmanChemical-Zbiblioteki badań przesiewowych kinazy
Kwas arachidonowy LeelamideCaymanChemical-Zkinazy Biblioteka badań przesiewowych
Kwas laurynowy LeelamideCaymanChemical-Zbiblioteki badań przesiewowych kinazy
AS-252424CaymanChemical-Zbiblioteki badań przesiewowych kinazy
CAY10505CaymanChemical-Zbiblioteki badań przesiewowych kinazy
PI-103CaymanChemical-Zbiblioteki badań przesiewowych kinazy
PIK-75 ( chlorowodorek)Cayman Chemical-z biblioteki badań przesiewowych kinazy
Inhibitor kinazy sfingozynowej 2Cayman Chemical-z biblioteki badań przesiewowych kinazy
PiceatannolCayman Chemical-z biblioteki badań przesiewowych kinazy
SC-1Cayman Chemical-z biblioteki badań przesiewowych kinazy
(R) - RoscovitineCayman Chemical-Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
BAY-43-9006CaymanChemical-Zbiblioteki badań przesiewowych kinazy
CAY10561CaymanChemical-Zbiblioteki badań przesiewowych kinaz
AS-604850CaymanChemical-Zbiblioteki badań przesiewowych kinazy
PI3-kinaza α Inhibitor 2CaymanChemical-Zbiblioteki badań przesiewowych kinazy
ML-9CaymanChemical-Zbiblioteki badań przesiewowych kinazy
TriciribineCaymanChemical-Zbiblioteki badań przesiewowych kinazy
Analog erbstatynyCaymanChemical-Zbiblioteki badań przesiewowych kinazy
KenpaulloneCayman Chemical-Z Biblioteki Badań Przesiewowych Kinaz
OlomoucynaCaymanChemical-ZBiblioteki Badań Przesiewowych Kinazy
AG-494CaymanChemical-ZBiblioteki Badań Przesiewowych Kinaz
AG-825CaymanChemical-ZBiblioteki Badań Przesiewowych Kinaz
AG-1478CaymanChemical-ZBiblioteki Badań Przesiewowych Kinazy
SB 216763CaymanChemical-Fromthe Kinase Screening Library
SB 415286CaymanChemical-Fromthe Kinase Screening Library
AG-17CaymanChemical-Fromthe Kinase Screening Library
H-8 (chlorowodorek)CaymanChemical-Fromthe Kinase Screening Library
LFM-A13Cayman Chemical-FromLibrary-Fromthe Kinase Screening Library-From the Kinase Screening Library Biblioteka
SC-514CaymanChemical-Zbiblioteki badań przesiewowych kinazy
ApigeninCaymanChemical-Zbiblioteki badań przesiewowych kinaz
AG-18CaymanChemical-Zbiblioteki badań przesiewowych kinaz
CAY10554CaymanChemical-Zbiblioteki badań przesiewowych kinazy
DRBCayman Chemical-Z Biblioteki Badań Przesiewowych Kinaz
RG-13022CaymanChemical-ZBiblioteki Badań Przesiewowych Kinaz
RG-14620CaymanChemical-ZBiblioteki Badań Przesiewowych Kinaz
AG-490CaymanChemical-ZBiblioteki Badań Przesiewowych Kinazy
AG-82CaymanChemical-ZBiblioteki Badań Przesiewowych Kinazy
AG-99Cayman Chemiczny-z biblioteki badań przesiewowych kinazy
AG-213CaymanChemical-zbiblioteki badań przesiewowych kinazy
AG-183CaymanChemical-zbiblioteki badań przesiewowych kinazy
Lavendustin CCaymanChemical-Zbiblioteki badań przesiewowych kinazy
ZM 336372CaymanChemical-Zbiblioteki badań przesiewowych kinazy
5-IodotubercidinCaymanChemical-Fromthe Kinase Screening Library
SB 202190CaymanChemical-Fromthe Kinase Screening Library
CAY10571CaymanChemical-Fromthe Kinase
ScreeningLibrary-Fromthe Kinase Screening Library
SP 600125Cayman Chemical- Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
L-treo-sfingozyna C-18CaymanChemical-Zbiblioteki badań przesiewowych kinazy
H-89CaymanChemical-Zbiblioteki badań przesiewowych kinaz
HA-1077 (chlorowodorek)Kajmanchemiczny-Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
AG-370CaymanChemical-Zbiblioteki badań przesiewowych kinazy
WortmanninCaymanChemical-Fromthe Kinase Screening Library
AG-1296CaymanChemical-Fromthe Kinase Screening Library
KT 5823CaymanChemical-Fromthe Kinase Screening Library
Janex 1CaymanChemical-Fromthe Kinase Screening Library
CAY10574Cayman Chemical-Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
CAY10575Cayman Chemical-z biblioteki badań przesiewowych kinazy
CAY10576Cayman Chemical-z biblioteki badań przesiewowych kinazy
NH125Cayman Chemical-z biblioteki badań przesiewowych kinazy
TWS119Cayman Chemical-z biblioteki badań przesiewowych kinazy
NSC 210902CaymanChemical-Zbiblioteki badań przesiewowych kinazy
CAY10577CaymanChemical-Zbiblioteki badań przesiewowych kinazy
CAY10578CaymanChemical-Zbiblioteki badań przesiewowych kinazy
PD 184161CaymanChemical-Zbiblioteki badań przesiewowych kinazy
CCT018159CaymanChemical-Zbadania przesiewowego kinazy-Z badania przesiewowego kinazy Biblioteka
MyricetinCayman Chemical-z biblioteki badań przesiewowych kinazy
,,,,, Library ( the Kinase Screening

Bibliografia

  1. Gascoigne, N. R., Rybakin, V., Acuto, O., Brzostek, J. TCR Signal Strength and T Cell Development. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32, 327-348 (2016).
  2. Rothenberg, E. V., Moore, J. E., Yui, M. A. Launching the T-cell-lineage developmental programme. Nature Reviews Immunology. 8 (1), 9-21 (2008).
  3. Klein, L., Hinterberger, M., Wirnsberger, G., Kyewski, B. Antigen presentation in the thymus for positive selection and central tolerance induction. Nature Reviews Immunology. 9 (12), 833-844 (2009).
  4. Starr, T. K., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of T cells. Annual Review of Immunology. 21, 139-176 (2003).
  5. Rybakin, V., Gascoigne, N. R. Negative selection assay based on stimulation of T cell receptor transgenic thymocytes with peptide-MHC tetramers. PLoS One. 7 (8), e43191(2012).
  6. Krogsgaard, M., Juang, J., Davis, M. M. A role for "self" in T-cell activation. Seminars in Immunology. 19 (4), 236-244 (2007).
  7. Nakayama, T., Yamashita, M. The TCR-mediated signaling pathways that control the direction of helper T cell differentiation. Seminars in Immunology. 22 (5), 303-309 (2010).
  8. Hoerter, J. A., et al. Coreceptor affinity for MHC defines peptide specificity requirements for TCR interaction with coagonist peptide-MHC. The Journal of Experimental Medicine. 210 (9), 1807-1821 (2013).
  9. Zhao, X., et al. Nonstimulatory peptide-MHC enhances human T-cell antigen-specific responses by amplifying proximal TCR signaling. Nature Communications. 9 (1), 2716(2018).
  10. Fu, G., et al. Fine-tuning T cell receptor signaling to control T cell development. Trends in Immunology. 35 (7), 311-318 (2014).
  11. Wang, D., et al. Tespa1 is involved in late thymocyte development through the regulation of TCR-mediated signaling. Nature Immunology. 13 (6), 560-568 (2012).
  12. Fu, G., et al. Themis sets the signal threshold for positive and negative selection in T-cell development. Nature. 504 (7480), 441-445 (2013).
  13. Rosenblum, M. D., Gratz, I. K., Paw, J. S., Abbas, A. K. Treating human autoimmunity: current practice and future prospects. Science Translational Medicine. 4 (125), (2012).
  14. Hebeisen, M., et al. SHP-1 phosphatase activity counteracts increased T cell receptor affinity. The Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 1044-1056 (2013).
  15. Wang, R. E., et al. An immunosuppressive antibody-drug conjugate. Journal of the American Chemical Society. 137 (9), 3229-3232 (2015).
  16. Borroto, A., et al. First-in-class inhibitor of the T cell receptor for the treatment of autoimmune diseases. Science Translational Medicine. 8 (370), (2016).
  17. Chen, E. W., Brzostek, J., Gascoigne, N. R. J., Rybakin, V. Development of a screening strategy for new modulators of T cell receptor signaling and T cell activation. Scientific Reports. 8 (1), 10046(2018).
  18. Fouda, A., Tahsini, M., Khodayarian, F., Al-Nafisah, F., Rafei, M. A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules. Journal of Visualized Experiments. (121), e55199(2017).
  19. Zhao, Z., et al. A high-throughput phenotypic screen of cytotoxic T lymphocyte lytic granule exocytosis reveals candidate immunosuppressants. Journal of Biomolecular Screening. 20 (3), 359-371 (2015).
  20. Florian, A. E., et al. Flow cytometry enables a high-throughput homogeneous fluorescent antibody-binding assay for cytotoxic T cell lytic granule exocytosis. Journal of Biomolecular Screening. 18 (4), 420-429 (2013).
  21. Krutzik, P. O., Crane, J. M., Clutter, M. R., Nolan, G. P. High-content single-cell drug screening with phosphospecific flow cytometry. Nature Chemical Biology. 4 (2), 132-142 (2008).
  22. Vlahos, C. J., Matter, W. F., Hui, K. Y., Brown, R. F. A specific inhibitor of phosphatidylinositol 3-kinase, 2-(4-morpholinyl)-8-phenyl-4H-1-benzopyran-4-one (LY294002). The Journal of Biological Chemistry. 269 (7), 5241-5248 (1994).
  23. Chen, Z., et al. Synthesis and SAR of novel 4-morpholinopyrrolopyrimidine derivatives as potent phosphatidylinositol 3-kinase inhibitors. Journal of Medicinal Chemistry. 53 (8), 3169-3182 (2010).
  24. Ruegg, U. T., Burgess, G. M. Staurosporine, K-252 and UCN-01: potent but nonspecific inhibitors of protein kinases. Trends in Pharmacological Sciences. 10 (6), 218-220 (1989).
  25. Davis, P. D., et al. Inhibitors of protein kinase C. 1. 2,3-Bisarylmaleimides. Journal of Medicinal Chemistry. 35 (1), 177-184 (1992).
  26. Komander, D., et al. Interactions of LY333531 and other bisindolyl maleimide inhibitors with PDK1. Structure (London, England: 1993). 12 (2), 215-226 (2004).
  27. Gassel, M., et al. The protein kinase C inhibitor bisindolyl maleimide 2 binds with reversed orientations to different conformations of protein kinase A. The Journal of Biological Chemistry. 279 (22), 23679-23690 (2004).
  28. Faull, A., Johnstone, C., Morley, A., et al. Novel compounds. , (2003).
  29. Favata, M. F., et al. Identification of a novel inhibitor of mitogen-activated protein kinase kinase. The Journal of Biological Chemistry. 273 (29), 18623-18632 (1998).
  30. Woods, C. M., Zhu, J., McQueney, P. A., Bollag, D., Lazarides, E. Taxol-induced mitotic block triggers rapid onset of a p53-independent apoptotic pathway. Molecular Medicine (Cambridge, MA). 1 (5), 506-526 (1995).
  31. Teng, X., et al. Structure-activity relationship study of novel necroptosis inhibitors. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 15 (22), 5039-5044 (2005).
  32. Saini, M., et al. Regulation of Zap70 expression during thymocyte development enables temporal separation of CD4 and CD8 repertoire selection at different signaling thresholds. Science Signaling. 3 (114), ra23(2010).
  33. Chae, H. J., et al. Molecular mechanism of staurosporine-induced apoptosis in osteoblasts. Pharmacological Research. 42 (4), 373-381 (2000).
  34. Varas, A., et al. Analysis of the human neonatal thymus: evidence for a transient thymic involution. Journal of Immunology (Baltimore, MD:1950). 164 (12), 6260-6267 (2000).
  35. Verstichel, G., et al. The checkpoint for agonist selection precedes conventional selection in human thymus. Science Immunology. 2 (8), (2017).
  36. Yamaguchi, E., de Vries, J., Yssel, H. Differentiation of human single-positive fetal thymocytes in vitro into IL-4- and/or IFN-gamma-producing CD4+ and CD8+ T cells. International Immunology. 11 (4), 593-603 (1999).
  37. Farley, A. M., et al. Dynamics of thymus organogenesis and colonization in early human development. Development (Cambridge, UK). 140 (9), 2015-2026 (2013).
  38. Cali, J. J., et al. Bioluminescent assays for ADMET. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 4 (1), 103-120 (2008).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Sygnalizacja TCRaktywacja limfocyt w Tinhibitory kinazcytometria przep ywowahodowla tymocyt wtest kaspazy 3ekspresja CD69p ytka o ma ej obj to ciprzesiew apoptotycznydownregulacja TCR
Identyfikacja mediatorów sygnalizacji receptora limfocytów T poprzez badania przesiewowe bibliotek inhibitorów chemicznych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.