Artykuł metodologiczny

Wykorzystanie pierwotniaka Paramecium caudatum jako nośnika infekcji przenoszonych przez żywność u larw danio pręgowanego

30.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58949

⸱

7 stycznia 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1McGovern Medical School, Department of Microbiology and Molecular Genetics, University of Texas Health Science Center at Houston

W tym artykule

Podsumowanie

Danio rerio) stają się powszechnie używanym modelem zwierzęcym kręgowców do kolonizacji i patogenezy mikrobiologicznej. Protokół ten opisuje zastosowanie pierwotniaka Paramecium caudatum jako nośnika infekcji przenoszonych przez żywność u larw danio pręgowanego. P. caudatum łatwo internalizuje bakterie i jest wchłaniany przez larwy danio pręgowanego poprzez naturalne zachowania żerowania.

Streszczenie

Ze względu na swoją przezroczystość, wykonalność genetyczną i łatwość utrzymania, danio pręgowany (Danio rerio) stał się powszechnie używanym modelem kręgowców w chorobach zakaźnych. Larwy danio pręgowanego naturalnie polują na jednokomórkowego pierwotniaka Paramecium caudatum. Protokół ten opisuje zastosowanie P. caudatum jako nośnika infekcji przenoszonych przez żywność u larw danio pręgowanego. P. caudatum internalizuje szeroką gamę bakterii, a komórki bakteryjne pozostają żywe przez kilka godzin. Danio pręgowany następnie poluje na P. caudatum, ładunek bakteryjny jest uwalniany w jelicie przednim po trawieniu nośnika pantofelka, a bakterie kolonizują przewód pokarmowy. Protokół zawiera szczegółowy opis utrzymania pantofelka, obciążenia bakteriami, określenia degradacji i dawki bakteryjnej, a także zakażenia danio pręgowanego przez karmienie pantofelkiem. Zaletą stosowania tej metody infekcji przenoszonych przez żywność jest to, że ściśle naśladuje ona sposób infekcji obserwowany w chorobach ludzkich, prowadzi do bardziej solidnej kolonizacji w porównaniu z protokołami zanurzenia i umożliwia badanie szerokiej gamy patogenów. Zakażenie przenoszone przez żywność w modelu danio pręgowanego można wykorzystać do badania ekspresji genów bakteryjnych w organizmie gospodarza, interakcji gospodarz-patogen oraz cech chorobotwórczości, w tym obciążenia bakteryjnego, lokalizacji, rozprzestrzeniania się i zachorowalności.

Wprowadzenie

Danio pręgowany ma morfologicznie i funkcjonalnie zachowane cechy wspólne ze ssakami, w tym linie granulocytów (np. neutrofile), komórki monocyty/makrofagopodobne, receptory Toll-podobne, cytokiny prozapalne i peptydy przeciwdrobnoustrojowe1. Przewód pokarmowy u danio pręgowanego jest w pełni rozwinięty po 6 dniach od zapłodnienia (dpf) i wykazuje zachowanie morfologiczne i funkcjonalne w przewodzie pokarmowym ssaków, takie jak zachowana regulacja transkrypcji w komórkach nabłonka jelitowego2. To sprawia, że danio pręgowany jest doskonałym modelem kolonizacji i patogenezy jelit. W modelu danio pręgowanego badano szeroki zakres drobnoustrojów jelitowych, w tym enterokrwotoczne Escherichia coli3, Vibrio cholerae4,5, Salmonella enterica6, mikrobiota danio pręgowanego7,8 oraz rola probiotyków w odporności jelitowej9. Niewątpliwą zaletą modelu danio pręgowanego jest to, że jest on kolonizowany przez wiele drobnoustrojów bez zaburzania endogennej mikrobioty, co pozwala na badanie zachowania drobnoustrojów w kontekście mieszanych populacji drobnoustrojów3,6. Obecnie większość modeli kolonizacji i chorób przewodu pokarmowego opiera się na podawaniu drobnoustrojów przez zanurzenie w kąpieli, gdzie danio pręgowany jest inkubowany w zawiesinie bakteryjnej przez określony czas10. Utrudnia to jednak określenie dokładnej dawki podawanych bakterii i prowadzi do ograniczonej kolonizacji niektórymi drobnoustrojami, szczególnie bakteriami niepatogennymi. Alternatywnie, zawiesina bakteryjna jest podawana rybom przez zgłębnik doustny11, ale jest to technicznie trudne i ograniczone do starszych larw i dorosłych ryb.

Ten protokół opisuje użycie jednokomórkowego pierwotniaka Paramecium caudatum jako nośnika do dostarczania mikrobów do przewodu pokarmowego larw danio pręgowanego. Pantofelki są łatwe i tanie w utrzymaniu i są w stanie żywić się szeroką gamą drobnoustrojów, w tym glonami, grzybami i bakteriami, które internalizują przez rzęskowy rowek ustny12,13,14. Po internalizacji bakterie są przetrzymywane w wakuolach, które ostatecznie zakwaszają się, a zawartość ulega degradacji w ciągu kilku godzin15. Larwy danio pręgowanego chwytają pantofelki jako naturalną zdobycz wkrótce po wykluciu, około 3–4 dpf w zależności od temperatury16, i chwytają je z dużą wydajnością. Proces chwytania zdobyczy trwa średnio 1,2 s od wykrycia do schwytania17, a schwytane pantofelki są szybko trawione w jelicie pręgowanym, tak że zinternalizowane żywe bakterie są uwalniane do przewodu pokarmowego3. W rezultacie pantofelek może być stosowany jako szybka i łatwa metoda dostarczania wysokiej i stałej dawki bakterii do przewodu pokarmowego danio pręgowanego. Dostarczone bakterie mogą być albo przekształcone w ekspresję białka fluorescencyjnego, takiego jak mCherry, jak opisano tutaj, lub, w przypadku bakterii genetycznie nieuleczalnych, mogą być wstępnie wybarwione barwnikiem fluorescencyjnym, aby umożliwić wizualizację w przewodzie pokarmowym.

Ten protokół opisuje dostarczanie drogą pokarmową enteropatogennych E. coli (enterokrwotocznych E. coli [EHEC] i przylegających inwazyjnych E. coli [AIEC]) oraz Salmonella enterica ssp. Typhimurium. Zarówno chorobotwórcze E. coli, jak i S. typhimurium są przenoszone drogą fekalno-oralną18,19 i mogą zostać nabyte przez skażoną żywność, taką jak mięso, warzywa i nabiał. Wykorzystując P. caudatum jako nośnik, E. coli i S. typhimurium z powodzeniem kolonizują larwy danio pręgowanego w ciągu 30–60 minut od jednoczesnej inkubacji z nośnikiem pantofelka. Osiągnięte obciążenie bakteryjne jest wystarczająco silne, aby uwidocznić kolonizację i określić obciążenie poprzez posiewanie homogenatów tkankowych.

Protokół

Opisana tutaj opieka, hodowla i eksperymenty nad danio pręgowanym są zgodne z Przewodnikiem opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych i zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Dobrostanu Zwierząt Centrum Nauk o Zdrowiu Uniwersytetu w Teksasie, numer protokołu AWC-16-0127.

1. Wzrost i utrzymanie pantofelka

  1. Pozyskiwanie żywych kultur pantofelków ze źródeł takich jak Międzynarodowe Centrum Zasobów Danio Pręgowanego (ZIRC).
  2. Z żywej hodowli dodać 1 ml kultury pantofelków, 1 ml kultury E. coli MG1655 (gęstość optyczna OD600 1,0–2,0) zawieszonej w 1x E3 (0,29 g/L NaCl, 13 mg/L KCl, 44 mg/L CaCl2, 81 mg/L MgSO4, 0,48 g/L HEPES, pH 7,0, sterylne), i 8 ml 1x E3 do 10 ml kolby do hodowli tkankowej. Lekko zamieszać, a następnie przechowywać w temperaturze 22 °C.
  3. Aby utrzymać posiew, co dwa tygodnie należy przenieść 1 ml kultury pantofelka do kolby do hodowli tkankowej o pojemności 10 ml z 9 ml świeżej pożywki 1x E3 zawierającej 108 CFU/ml E. coli MG1655 zawieszonej w 1x E3.

2. Określenie dawki bakteryjnej podawanej danio pręgowanemu

  1. Określ okres półtrwania bakterii w Pantofelku
    nuta: Okres półtrwania bakterii w pantofelku określa się przez posiew żywotnych E. coli odzyskanych z pantofelka, jak opisano poniżej.
    1. Po 2 godzinnej inkubacji bakterii (OD600 z 1,0) z pantofelkiem w temperaturze 22 °C, połączyć pantofelek i kokulturę bakteryjną w stożkowej probówce o pojemności 50 ml, przemyć pantofelek 1x E3 i policzyć liczbę pantofelków na mililitr (jak opisano poniżej w krokach 3.2.7 i 3.2.8).
    2. Po zliczeniu liczby pantofelków należy co godzinę (przez 6 godzin po ekspozycji) usunąć 50 μl współkultury pantofelka i bakterii i dodać każdą próbkę do świeżej probówki o pojemności 1,5 ml.
    3. Umieścić 950 μl 1% niejonowego środka powierzchniowo czynnego (patrz tabela materiałów) w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) do każdej z probówek o pojemności 1,5 ml i wirować przez 1 minutę w celu lizy pantofelka. Wykonać rozcieńczenia 1:10 każdej próbki, używając sterylnego PBS jako rozcieńczalnika (tj. 100 μl w 900 μL).
    4. Umieścić 100 μl każdego rozcieńczenia na selektywnych płytkach (pożywka LB tet: 1 g/l tryptonu, 0,5 g/l ekstraktu drożdżowego, 1 g/l NaCl, 30 μg/ml tetracykliny) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 16 godzin. Następnego dnia policz i zapisz liczbę kolonii bakteryjnych na płytce (jednostki tworzące kolonie, CFU), licząc tylko izolowane i odrębne pojedyncze kolonie. Zidentyfikuj płytkę z rozcieńczeniem, które daje 30–300 jtk.
    5. Określić zastosowany współczynnik rozcieńczenia. Na przykład, jeśli 1 μl kultury bakteryjnej zmiesza się z 99 ml sterylnego PBS, jest to rozcieńczenie 1:100 (0,01). Liczba ta będzie liczbą jtk w rozcieńczeniu. Wykonaj poniższe obliczenia dla każdego punktu czasowego, aby określić CFU w oryginalnej próbce:
      figure-protocol-1
    6. Oblicz i narysuj na wykresie liczbę żywotnych E. coli/pantofelków odpowiadającą godzinom po ekspozycji, korzystając ze stężenia pantofelka obliczonego w kroku 3.3.1 i określ okres półtrwania w pantofelku (Rysunek 1).
    7. Korzystając z liczby CFU obliczonej dla każdego punktu czasowego, oblicz i wykreśl liczbę żywotnych E. coli na pantofelek na osi y w funkcji godzin po inkubacji na osi x, używając stężenia pantofelka obliczonego w kroku 3.3.1. Określ okres półtrwania w pantofelku.
  2. Określ dawkowanie bakterii na podstawie okresu półtrwania bakterii i szybkości żerowania.
    nuta: Aby określić dawkę bakteryjną, należy wziąć pod uwagę okres półtrwania bakterii wewnątrz pantofelka oraz tempo żerowania danio pręgowanego na pantofelku (patrz krok 3.4).
    1. Użyj następującego wzoru, aby określić rozkład bakteryjny w pantofelku:
      (1) figure-protocol-2
      Gdzie N0 jest początkową ilością bakterii na pantofelek po 2 godzinach inkubacji, Nt jest pozostałą ilością po czasie t, τ jest czasem, po którym liczba żywych bakterii zmniejszyła się o połowę, a k jest stałą rozpadu.
    2. Na podstawie eksperymentu degradacji wyznacz stałą rozpadu k za pomocą okresu półtrwania bakterii (tj. czasu, po którym ilość żywotnych bakterii/pantofelka zmniejszyła się o połowę).
      (2) figure-protocol-3
      Do określenia okresu półtrwania należy użyć terminu figure-protocol-4 i
      (3) figure-protocol-5 lub
      (4) figure-protocol-6
      nuta: Na podstawie Rysunek 1, okres półtrwania E. coli w pantofelkach wynosi około 2,3 godziny. Tak więc, stosując wzór (4), szybkość rozpadu, k, dla E. coli wynosi:
      (5) figure-protocol-7
    3. Określ szybkość rozpadu (k) z eksperymentu półtrwania, aby znaleźć dawkę żywotnych bakterii (Nt) pobieranych przez larwy danio pręgowanego po czasie żerowania (t), gdzie (P) jest szybkością żerowania lub liczbą pantofelków zjadanych przez jedną rybę na godzinę:
      (6) figure-protocol-8 lub
      (7) figure-protocol-9
      nuta: Na Rysunek 1, początkowa ilość bakterii na pantofelek (N0) po 2 godzinach inkubacji (t) wynosi 790 CFU. Dla filmu 1 i Rysunek 2, wskaźnik żerowania (P) wynosi 1539.
    4. Korzystając z tych wartości w celu podstawienia do równania (7), oblicz dawkę bakterii spożywaną przez danio pręgowanego po 2-godzinnej inkubacji jako:
      (8) figure-protocol-10

3. Zakażenie pokarmowe danio pręgowanego

  1. Inkubuj bakterie za pomocą pantofelka.
    1. Przygotuj wspólną hodowlę pantofelka i E. coli MG1655 w noc poprzedzającą zakażenie. Połącz 8 ml pożywki E3, 1 ml trwającej kultury pantofelka i 1 ml kultury E. coli MG1655 (OD600 = 1,0) zawieszone w 1x E3 w kolbach do hodowli tkankowych T25. Inkubować kolby w temperaturze pokojowej (RT) przez noc. Dla każdego warunku leczenia należy przygotować dwie kolby z pantofelkiem.
    2. Zaszczepić bakteryjną pożywkę wzrostową (LB: 1 g/l tryptonu, 0,5 g/l ekstraktu drożdżowego, 1 g/l NaCl) zakaźnym szczepem bakterii, wybierając pojedynczą kolonię bakteryjną z płytki za pomocą sterylnej pętli inokulacyjnej. Inkubować płynną kulturę w temperaturze 37 °C i pozostawić na noc do wytrząsania z prędkością 110 obrotów na minutę (rpm).
      nuta: Podczas pracy z czynnikami zakaźnymi należy nosić środki ochrony indywidualnej (fartuch laboratoryjny i rękawice), a podczas pracy z czynnikami zakaźnymi należy stosować urządzenia o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2.
    3. Następnego dnia zmierz OD600 w nocnej hodowli. Obliczyć objętość kultury wymaganą do osiągnięcia OD600 równego 1 po ponownym zawieszeniu w 11 ml pożywki.
    4. Zebrać objętość bakterii z kroku 3.1.2 poprzez odwirowanie przy 6 000 x g przez 5 minut, po jednej objętości na każdą kolbę pantofelków. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad bakteryjny w 1 ml pożywki E3.
    5. Opcjonalnie należy wstępnie wybarwić bakterie barwnikiem fluorescencyjnym.
      1. Dodać 1 μl barwnika bakteryjnego FM 4-64FX (5 mg/ml roztworu podstawowego). Przykryj probówkę folią w celu ochrony przed fotobieleniem i inkubuj obracającą się od końca do końca w temperaturze przekątnej przez 15 minut.
      2. Usuń nadmiar barwnika, przemywając 1x E3: Bakterie granulowane przez wirowanie w temperaturze 6,000 x g przez 1,5 min, a następnie ponownie zawieś granulat w 1 ml pożywki E3. Powtórz krok prania dwa razy.
      3. Zebrać barwione bakterie przez odwirowanie przy 6 000 x g przez 5 minut. Wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad bakteryjny w 1 ml pożywki E3.
    6. Dodać 1 ml zawiesiny bakteryjnej do każdej z dwóch kolb świeżej pantofelka. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 godz.
      nuta: W przypadku pracy z barwionymi bakteriami inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.
  2. Umyj kokulturę bakterii/pantofelków.
    1. Połączyć zawartość obu kolb z kokulturą pantofelków i bakterii w stożkową probówkę o pojemności 50 ml. Odwirować próbki o masie 300 x g w temperaturze 15 °C przez 10 minut. Upewnij się, że wirówka jest wstępnie schłodzona przed tym krokiem.
    2. Usunąć około 10 ml supernatantu E3 za pomocą pipety serologicznej i dodać około 10 ml świeżego 1x E3 do probówki stożkowej.
      nuta: Podczas wszystkich etapów mycia ważne jest, aby bardzo szybko usuwać supernatant, ponieważ pantofelek zacznie wypływać z osadu. Wirować i usuwać supernatant z jednej probówki na raz, aby zapewnić wystarczająco szybką obsługę na tym etapie i uniknąć utraty pantofelka w supernatantze.
    3. Wirować próbki przez odwirowanie w temperaturze 300 x g w temperaturze 15 °C przez 5 minut. Usunąć około 10 ml supernatantu E3 za pomocą pipety serologicznej i dodać około 10 ml świeżego 1x E3 do stożkowej probówki. Powtórz ten krok dwukrotnie.
    4. Odwirować próbki przy 300 x g w temperaturze 15 °C przez 5 minut. Usunąć około 10 ml supernatantu E3, uważając, aby nie uszkodzić osadu.
    5. Zawiesić osad w pozostałych 10 ml pożywki E3 i przenieść 500 μl zawiesiny do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Osadzać 500 μl pantofelka, odwirowując przy 300 x g przez 5 minut, aby policzyć liczbę pantofelków.
    6. Usunąć 400 μl supernatantu E3 z próbki o objętości 500 μl. Dodać 20 μl 36,5% roztworu formaldehydu do pozostałych 100 μl pantofelka i delikatnie zawiesić, a następnie inkubować przez 5 minut w temperaturze 22 °C.
      nuta: Ten krok zabija pantofelka, aby umożliwić liczenie.
    7. Zmierz rzeczywistą całkowitą objętość za pomocą pipety i zapisz. Rozcieńczyć zawiesinę pantofelka w stosunku 1:1 v/v 0,4% roztworem błękitu trypanowego.
    8. Użyj licznika komórek lub hemocytometru, aby policzyć liczbę martwych pantofelków/ml.
      nuta: Ze względu na wcześniejszy etap fiksacji, większość pantofelków będzie w tym momencie martwa, ale liczba ta odzwierciedla liczbę żywych pantofelków w eksperymencie z jednoczesną inkubacją. Autorzy nie znaleźli znaczącej śmierci pantofelka z powodu koinkubacji bakterii, więc można to pominąć jako czynnik.
  3. Wspólna inkubacja larw pantofelka i danio pręgowanego.
    1. Obliczać stężenie pantofelka:
      figure-protocol-11
      figure-protocol-12
      nuta: W obliczeniach tych podaje się stężenie pantofelka w stożkowej probówce o pojemności 50 ml z kroku 3.2.5.
    2. Obliczyć objętość umytego pantofelka wymaganą dla stężenia 2 x 105 pantofelków/ml w końcowej objętości 3 ml E3,
      nuta: Stężenie pantofelka można regulować w oparciu o pożądaną dawkę bakterii, która podlega optymalizacji.
    3. Znieczulić danio pręgowanego poprzez dodanie trikainy do 100 mM Tris pH 8,0 do końcowego stężenia 100 mg/l. Przenieść 10 danio pręgowanego do każdej studzienki na 6-dołkowej płytce do całkowitej objętości 3 ml świeżego E3 zawierającego odpowiednie stężenie pantofelka (obliczone w kroku 3.3.2). Upewnij się, że larwy są przenoszone w minimalnej ilości płynu, aby upewnić się, że dobrze zregenerują się po znieczuleniu w biorcy.
    4. Inkubować w temperaturze 30 °C przez 2 godziny w inkubatorze dobowym w warunkach światła dziennego, aby zapewnić optymalne warunki oświetleniowe dla zdobyczy.
    5. Danio pręgowany należy umyć co najmniej 5 razy, przenosząc ryby do nowego dołka zawierającego 3 ml świeżego E3 zawierającego za każdym razem 100 mg/l trikainy.
      nuta: Nie próbuj pomijać tricainy na etapie prania. Przenoszenie ruchomych larw bez znieczulenia zwiększa ryzyko uszkodzenia i stresu zwierzęcia.
    6. Opcjonalnie przygotuj danio pręgowanego do obrazowania, umieszczając danio pręgowanego w 3 ml 1% niskotopliwej agarozy na czarnościennej 6-dołkowej płytce: Niskotopliwą agarozę przygotowuje się w 1xE3 i podgrzewa w kuchence mikrofalowej. Po stopieniu dodać trikainę do końcowego stężenia 160 mg/ml. Umieść rybę pod mikroskopem stereoskopowym, używając przyciętej żelowej końcówki ładującej, upewniając się, że głowa znajduje się po lewej stronie, a ogon po prawej (Rysunek 3). Odczekaj 5 minut, aż agaroza stwardnieje, a następnie nałóż osadzoną rybę na 1x E3 zawierającą 160 mg / ml tricainy do obrazowania.
  4. Określ tempo żerowania.
    nuta: Nie trzeba przeprowadzać osobnego eksperymentu, aby określić wskaźnik żerowania. Można to zrobić w kroku 3.3.4, jak opisano poniżej.
    1. W kroku 3.3.4 obejrzyj polującego danio pręgowanego na mikroskopie stereoskopowym i nagraj materiał wideo ze schwytania zdobyczy.
    2. Oceń materiał wideo. Chwytanie zdobyczy charakteryzuje się uderzaniem danio pręgowanego w kierunku zdobyczy. Policz każde uderzenie jako jedno zdarzenie schwytania ofiary, chociaż jest to tylko przybliżenie (patrz Dyskusja).
    3. Oblicz średnią liczbę przypadków schwytania zdobyczy na godzinę na podstawie wielu klipów wideo, z których każdy reprezentuje inną larwę danio pręgowanego (Rysunek 2).

Wyniki

Paramecium caudatum łatwo internalizuje szeroką gamę bakterii w wakuolach magazynujących. Gęstość bakterii wewnątrzkomórkowych zależy od gęstości bakterii i pantofelków w kokulturze, a także od użytych gatunków bakterii. Z biegiem czasu wakuole zakwaszają się i następuje degradacja bakteryjna. Szybkość degradacji musi być określona indywidualnie dla wszystkich stosowanych szczepów. W przypadku patogennej E. coli początkowa gęstość bakterii wynosi 790 bakterii/pantofelek, a bakterie ulegają degradacji z okresem półtrwania około 2,3 godziny (Rysunek 1).

figure-results-1
Rycina 1: Oznaczanie okresu półtrwania bakterii w pantofelku. (A) Po 2 godzinach wspólnej inkubacji z zakaźną E. coli, P. caudatum przemyto i przeniesiono na pożywkę bez bakterii. We wskazanych punktach czasowych liczbę żywotnych komórek E. coli oznaczono przez rozcieńczenie posiewu na selektywnym agarze . Wyniki są średnimi ± błąd standardowy średniej (SEM; n = 3). (B) Typowy obraz pantofelka przenoszącego zinternalizowane bakterie, z jasnym polem (Bi), bakteriami fluorescencyjnymi (Bii) i połączonymi kanałami (Biii). Podziałka = 20 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ponadto, badano tempo polowania danio pręgowanego, czyli tempo, w jakim danio pręgowany internalizuje pantofelek naładowany bakteriami podczas wspólnej inkubacji. Larwy danio pręgowanego zaczynają polować i chwytać żywą zdobycz od 5 dpf20, chociaż stwierdzono, że po wyhodowaniu w temperaturze 30 °C rozwój larw jest przyspieszony, a zwierzęta wykazują zachowania żerowania od 4 dpf. Żerowaniu towarzyszy charakterystyczne zachowanie uderzeniowe20 (Rysunek 2A), a określenie wskaźnika żerowania opiera się na założeniu, że każde uderzenie prowadzi do internalizacji jednego pantofelka, chociaż można to uznać tylko za przybliżenie (patrz Dyskusja). Opierając się na opisanych tutaj obserwacjach żerujących larw danio pręgowanego, szybkość wychwytu pantofelka wynosi około 1,539 na godzinę (Rysunek 2B).

figure-results-2
Rysunek 2: Określenie wskaźnika żerowania danio pręgowanego. (A) Nieruchome obrazy z filmu przedstawiającego polowanie, pokazujące larwy danio pręgowanego (5 dpf) polujące na pantofelki przenoszące fluorescencyjne bakterie. Czas w [sekundy]. Strzałka wskazuje główną oś ruchu podczas uderzania. (B) Kwantyfikacja wskaźnika żerowania (spożycie pantofelka na godzinę), na podstawie n = 10 filmów zrobionych w ciągu pełnych 2 godzin czasu ekspozycji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Po internalizacji pantofelka, danio pręgowany skutecznie rozkłada zdobycz w jelicie przednim, uwalniając zakaźne bakterie do układu pokarmowego. Jak opisano w niniejszym dokumencie, degradacja pantofelka przebiega szybko, a wolne bakterie można wykryć w przewodzie pokarmowym w ciągu 30 minut od żerowania. Wolne bakterie przemieszczają się następnie z jelita przedniego do jelita środkowego i tylnego, gdzie są wykrywane około 1–2 godziny po rozpoczęciu żerowania (Ryc. 3). Trwałość bakterii w jelicie zależy od gatunku i dawki, ale w przypadku E. coli i S. enterica waha się od kilku godzin do kilku dni. S. enterica lokalizuje się głównie w błonie śluzowej jelit, z pewną inwazją nabłonkową (ryc. 3D), prowadzącą do infiltracji neutrofili do nabłonka (ryc. 3C).

figure-results-3
Ryc. 3: Kolonizacja danio pręgowanego bakteriami. Danio pręgowany w dawce 5 dpf pozostawiono niezakażone (A) lub skolonizowano mCherry wykazującym ekspresję (B) E. coli lub (C) S. enterica. Eksperymenty z infekcją mogą być przeprowadzane na rybach typu dzikiego (A i B) lub liniach transgenicznych (np. linia Tg(MPO::EGFP)i114 eksprymująca neutrofile o zielonej fluorescencji pokazana w (C). Otwór doodbytniczy jest oznaczony strzałką. (D) Większe powiększenie odcinka jelita od larw osadzonych w całości zakażonych zakażeniem Salmonellą enterica. (Di) Niebieski = Hoechst oznaczający jądra, (Dii) Fioletowy = falloidyna oznaczająca F-aktynę, (Diii) Czerwony = Salmonella, (Div) łączy. Podziałka = 5 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Film 1: Materiał filmowy przedstawiający schwytanie ofiary. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Dyskusja

Opisany tutaj podstawowy protokół został zoptymalizowany pod kątem patogennych E. coli i został z powodzeniem zaadaptowany do innych gatunków bakterii, w tym Salmonella enterica i Vibrio cholerae. W przypadku niektórych gatunków, które nie kolonizują jelita danio pręgowanego po zanurzeniu w kąpieli, w tym niektórych szczepów Salmonella enterica i niektórych beztlenowców, do pomyślnego ustanowienia kolonizacji można zastosować infekcję przenoszoną przez żywność, jak opisano tutaj. W porównaniu z mikrozgłębkiem, który jest również stosowany do ustalania wysokiego obciążenia bakteryjnego w przewodzie pokarmowym larw, infekcja pokarmowa jest technicznie mniej trudna i wymaga mniej specjalistycznego sprzętu. Jednak parametry krytyczne powinny być zoptymalizowane pod kątem stosowanych gatunków i szczepów bakterii. Czynniki te obejmują gęstość bakterii i pantofelków na etapie kohodowli bakterii-pantofelka: Jeśli liczba bakterii w pantofelku jest niska, można to poprawić, zwiększając gęstość bakterii na etapie kohodowli. Niektóre gatunki bakterii mogą powodować uszkodzenie gospodarza pantofelka, co należy ocenić pod mikroskopem.

Innym ważnym czynnikiem w tym protokole jest chwytanie zdobyczy przez danio pręgowanego. Opisany tutaj wskaźnik żerowania opiera się na założeniu, że każde uderzenie w schwytaną zdobycz skutkuje połknięciem jednego pantofelka. W protokole zastosowano wysokie zagęszczenie pantofelków na rybę, aby zapewnić wysokie wskaźniki żerowania. Jednak chwytanie zdobyczy zależy od gęstości pantofelka w systemie, a w bardzo rozcieńczonych kulturach pantofelków tempo żerowania może wynosić nawet 13–15 pantofelków na godzinę21,22. Ograniczeniem jest to, że wskaźniki chwytania zdobyczy są również silnie zależne od warunków oświetleniowych, a w ciemności wskaźniki chwytania są o 80% niższe niż w warunkach oświetleniowych21 i należy to wziąć pod uwagę podczas przygotowywania eksperymentów. Jeśli czas ekspozycji na zdobycz musi zostać wydłużony w celu optymalizacji kolonizacji, należy wziąć pod uwagę wtórne narażenie na bakterie poprzez kał. W warunkach opisanych powyżej – 2 h ekspozycji na zdobycz – narażenie to jest znikome, ponieważ czas przejścia bakterii przez jelita wynosi ponad 1 godzinę, a stężenie bakterii w pojeździe jest znacznie wyższe niż w kale. Jeśli jednak czas ekspozycji na zdobycz znacznie się wydłuży, może to stać się istotnym czynnikiem.

W protokole tym należy uwzględnić odpowiednie kontrole, w tym kolonizację danio pręgowanego po karmieniu pantofelkiem zawierającym niepatogenną E. coli MG1655. Jeśli porównuje się wiele szczepów bakteryjnych pod kątem ich zdolności do kolonizacji gospodarza danio pręgowanego, ważne jest, aby sprawdzić, czy ich okres półtrwania w pantofelku jest porównywalny. Mutacje bakteryjne, w tym te naruszające integralność ściany komórkowej lub wykrywanie kwasów, mogą zagrozić stabilności bakterii w pantofelku. W takich przypadkach karmienie danio pręgowanego musi być dostosowane do różnic w dawkowaniu.

Opisany tutaj protokół może być wykorzystany do zbadania kolonizacji bakteryjnej i jej konsekwencji, w tym poprzez obrazowanie kolonizacji bakteryjnej danio pręgowanego, jak opisano powyżej, a także poprzez określenie CFU na danio pręgowanego z homogenatutkankowego 3 lub badanie zachorowalności i śmiertelności związanej z infekcją. Idealnie, do wizualizacji bakterii, należy użyć szczepów bakteryjnych wykazujących ekspresję białek fluorescencyjnych, takich jak mCherry lub białko czerwonej fluorescencji (RFP). Pozwoli to na wizualizację rosnących populacji bakterii. Jeśli szczep bakteryjny nie jest genetycznie podatny lub użycie ekspresji białka fluorescencyjnego jest wykluczone z innych powodów, bakterie mogą być barwione barwnikiem fluorescencyjnym, takim jak FM 4-64FX, przed wspólną hodowlą z pantofelkiem. Przy stosowaniu opisanego tutaj protokołu kohodowla z pantofelkiem nie zmniejsza jasności barwnika, a barwione bakterie są wyraźnie widoczne w jelicie danio pręgowanego. Jednak barwnik zostanie z czasem rozcieńczony, jeśli dojdzie do znacznego namnażania się bakterii w żywicielu danio pręgowanego. W obu przypadkach bakterie o czerwonej fluorescencji są lepsze od bakterii o zielonej fluorescencji, ponieważ autofluorescencja tkanek może być wyższa w kanale zielonym niż w czerwonym.

Stwierdzono, że protokół ten można dostosować do gatunków bakterii tlenowych i mikroaerofilnych. Być może uda się go przystosować do karmienia zarodników i gatunków grzybów, chociaż pozostaje to do przetestowania eksperymentalnego.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować członkom grupy Krachler za krytyczną lekturę i komentarze do manuskryptu. Praca ta została sfinansowana przez UT Systems STAR award, BBSRC i NIH (R01AI132354).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Paramecium caudatum, żyweCarolina131554nie przechowywać rosnących kultur poniżej temperatury pokojowej
0,4% Roztwór błękitu trypanowego SigmaT8154-20MLpłyn, sterylnie filtrowany, odpowiedni do hodowli komórkowych; przygotowany w 0,81% chlorku sodu i 0,06% fosforanie potasu, dizasadowy
dimetylosulfotlenek (DMSO)Sigma276855-100MLprzechowywać w komorze bezpieczeństwa rozpuszczalnika
Escherichia coli, MG1655ATCCATCC 700926można zastąpić dowolnym innym niepatogennym szczepem
E. coliFM 4-64FX bejcaThermo FisherF34653podwielokrotność i przechowywać zamrożony
FormaldehydSigmaF8775-4X25ML
LB BulionSigmaL3397-1KG
Fosforanowe buforowane tabletki soli fizjologicznejThermo Fisher18912014
TetracyklinaSigma87128-25Gtoksyczna, drażniąca
Trikaina (3-aminobenzoesan etylu metanosulfonian)SigmaE10521-10G
Triton X-100SigmaX100-100ML
Trypan Blue Solution, 0,4%Sigma93595-50ML
UltraPure Agaroza o niskiej temperaturze topnieniaThermo Fisher16520050
hemocytometr lub licznik komórekdowolny
mikroskop stereoskopowy
wirówka
stołowa mikrofalowy
koło
podgrzewany inkubator
urządzenia
zbiorniki
rotatorawibracyjnywodne hodowlane

Bibliografia

  1. Broz, P., Ohlson, M. B., Monack, D. M. Innate immune response to Salmonella Typhimurium, a model enteric pathogen. Gut Microbes. 3 (2), 62-70 (2012).
  2. Lickwar, C. R., et al. Genomic dissection of conserved transcriptional regulation in intestinal epithelial cells. PLoS Biology. 15 (8), e2002054(2017).
  3. Stones, D. H., et al. Zebrafish (Danio rerio) as a Vertebrate Model Host To Study Colonization, Pathogenesis, and Transmission of Foodborne Escherichia coli O157. mSphere. 2 (5), (2017).
  4. Mitchell, K. C., Breen, P., Britton, S., Neely, M. N., Withey, J. H. Quantifying Vibrio cholerae enterotoxicity in a zebrafish infection model. Applied and Environmental Microbiology. , 00783(2017).
  5. Logan, S. L., et al. The Vibrio cholerae type VI secretion system can modulate host intestinal mechanics to displace gut bacterial symbionts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (16), E3779-E3787 (2018).
  6. Howlader, D. R., et al. Zebrafish as a novel model for non-typhoidal Salmonella pathogenesis, transmission and vaccine efficacy. Vaccine. 34 (42), 5099-5106 (2016).
  7. Troll, J. V., et al. Microbiota promote secretory cell determination in the intestinal epithelium by modulating host Notch signaling. Development. 145 (4), (2018).
  8. Wiles, T. J., et al. Host Gut Motility Promotes Competitive Exclusion within a Model Intestinal Microbiota. PLoS Biology. 14 (7), e1002517(2016).
  9. Rendueles, O., et al. A new zebrafish model of oro-intestinal pathogen colonization reveals a key role for adhesion in protection by probiotic bacteria. PLoS Pathogens. 8 (7), e1002815(2012).
  10. Varas, M., et al. Salmonella Typhimurium induces cloacitis-like symptomsin zebrafish larvae. Microbial Pathogenesis. 107, 317-320 (2017).
  11. Runft, D. L., et al. Zebrafish as a natural host model for Vibrio cholerae colonization and transmission. Applied and Environmental Microbiology. 80 (5), 1710-1717 (2014).
  12. Meier, R., Wiessner, W. Infection of algae-free Paramecium bursaria with symbiotic Chlorella sp. Isolated from green paramecia: I. Effect of the incubation period. European Journal of Protistology. 24 (1), 69-74 (1988).
  13. Miura, T., Moriya, H., Iwai, S. Assessing phagotrophy in the mixotrophic ciliate Paramecium bursaria using GFP-expressing yeast cells. FEMS Microbiology Letters. 364 (12), (2017).
  14. Watanabe, K., et al. Ciliate Paramecium is a natural reservoir of Legionella pneumophila. Scientific Reports. 6, 24322(2016).
  15. Bragg, A. N., Hulpieu, H. A Method of Demonstrating Acidity of Food Vacuoles in Paramecium. Science. 61 (1580), 392(1925).
  16. Borla, M. A., Palecek, B., Budick, S., O'Malley, D. M. Prey capture by larval zebrafish: evidence for fine axial motor control. Brain, Behavior and Evolution. 60 (4), 207-229 (2002).
  17. Patterson, B. W., Abraham, A. O., MacIver, M. A., McLean, D. L. Visually guided gradation of prey capture movements in larval zebrafish. Journal of Experimental Biology. 216 (Pt 16), 3071-3083 (2013).
  18. Megraud, F. Transmission of Helicobacter pylori: faecal-oral versus oral-oral route. Alimentary Pharmacology & Therapeutics. 9 Suppl 2, 85-91 (1995).
  19. Spears, K. J., Roe, A. J., Gally, D. L. A comparison of enteropathogenic and enterohaemorrhagic Escherichia coli pathogenesis. FEMS Microbiology Letters. 255 (2), 187-202 (2006).
  20. Bianco, I. H., Kampff, A. R., Engert, F. Prey capture behavior evoked by simple visual stimuli in larval zebrafish. Frontiers in Systems Neuroscience. 5, 101(2011).
  21. Gahtan, E., Tanger, P., Baier, H. Visual prey capture in larval zebrafish is controlled by identified reticulospinal neurons downstream of the tectum. Journal of Neuroscience. 25 (40), 9294-9303 (2005).
  22. Westphal, R. E., O'Malley, D. M. Fusion of locomotor maneuvers, and improving sensory capabilities, give rise to the flexible homing strikes of juvenile zebrafish. Frontiers in Neural Circuits. 7, 108(2013).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

zakażenie przenoszone przez żywnośćkolonizacja bakteryjnautrzymywanie Parameciumobciążenie bakteryjnezakażanie zebrafishmikroskopia fluorescencyjnajednostki tworzące koloniepożywka E3
Wykorzystanie pierwotniaka Paramecium caudatum jako nośnika infekcji przenoszonych przez żywność u larw danio pręgowanego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.