Artykuł metodologiczny

System indukcyjny do grupowania aparatów szparkowych za pomocą zanurzenia w roztworze cukru w siewkach rzodkiewnika pospolitego (Arabidopsis thaliana)

DOI:

10.3791/58951

⸱

15 lutego 2019

 , 
1Department of Integrated Frontier Sciences, The University of Tokyo, 2International Research Organization for Advanced Science and Technology, Kumamoto University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem tego protokołu jest pokazanie, jak indukować skupione aparaty szparkowe w liścieniach siewek Arabidopsis thaliana poprzez zanurzenie roztworu pożywki zawierającej cukier oraz jak obserwować struktury wewnątrzkomórkowe, takie jak chloroplasty i mikrotubule w zgrupowanych komórkach ochronnych za pomocą konfokalnej mikroskopii laserowej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ruch aparatów szparkowych pośredniczy w wymianie gazowej roślin, która jest niezbędna do fotosyntezy i transpiracji. Otwieranie i zamykanie aparatów szparkowych odbywa się odpowiednio poprzez znaczny wzrost i spadek objętości komórek ochronnych. Ponieważ transport wahadłowy jonów i wody zachodzi między komórkami ochronnymi a większymi sąsiednimi komórkami naskórka podczas ruchu aparatów szparkowych, rozmieszczenie aparatów szparkowych roślin jest uważane za optymalne rozmieszczenie ruchów aparatów szparkowych. Eksperymentalne systemy do zakłócania rozmieszczenia aparatów szparkowych są przydatne do zbadania znaczenia wzoru odstępów. Zidentyfikowano kilka kluczowych genów związanych z rozmieszczeniem aparatów szparkowych, a skupione aparaty szparkowe mogą być eksperymentalnie indukowane poprzez zmianę tych genów. Alternatywnie, grupowane aparaty szparkowe mogą być również indukowane przez zabiegi egzogenne bez modyfikacji genetycznej. W tym artykule opisujemy prosty system indukcji skupionych aparatów szparkowych u siewek Arabidopsis thaliana poprzez zanurzenie roztworu pożywki zawierającej sacharozę. Nasza metoda jest łatwa i ma bezpośrednie zastosowanie do linii transgenicznych lub zmutowanych. Większe chloroplasty są przedstawiane jako biologiczna cecha charakterystyczna skupionych komórek ochronnych indukowanych sacharozą. Ponadto przedstawiono reprezentatywny konfokalny obraz mikroskopowy mikrotubul korowych jako przykład wewnątrzkomórkowej obserwacji skupionych komórek ochronnych. Promieniowa orientacja mikrotubul korowych jest utrzymywana w skupionych komórkach ochronnych, tak jak w rozmieszczonych komórkach ochronnych w warunkach kontrolnych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Roślinna stomia jest niezbędnym organem do wymiany gazowej dla fotosyntezy i transpiracji, a ruch aparatów szparkowych jest realizowany przez znaczące zmiany w komórkach ochronnych poprzez pobieranie i uwalnianie wody przez jony. Pod mikroskopem możemy zaobserwować rozłożony wzór rozmieszczenia aparatów szparkowych na powierzchni liści i łodyg. Uważa się, że ten rozłożony rozkład aparatów szparkowych wspomaga ruch aparatów szparkowych, który jest regulowany przez wymianę jonów i wody między komórkami ochronnymi a sąsiednimi komórkami naskórka1,2. Eksperymentalne systemy indukcyjne dla aparatów szparkowych w klastrach są przydatne do badania znaczenia rozmieszczenia aparatów szparkowych w odstępach

między nimi.

Doniesiono, że przestrzenne grupowanie aparatów szparkowych może być wywołane przez genetyczną modyfikację kluczowych genów do różnicowania komórek ochronnych3,4 lub leczenie związkiem chemicznym5. Stwierdziliśmy również, że leczenie zanurzeniowe roztworem pożywki uzupełnionym cukrami, w tym sacharozą, glukozą i fruktozą, powodowało grupowanie się aparatów szparkowych w liścieniach siewek Arabidopsis thaliana6. W naskórku liścienia traktowanym sacharozą zaobserwowano zmniejszoną kalozę w nowych ścianach komórkowych oddzielających merysteroidy i komórki naskórka, co sugeruje, że zanurzenie w roztworze sacharozy negatywnie wpływa na ścianę komórkową, co zapobiega wyciekowi i ektopowemu działaniu kluczowych produktów genowych dla różnicowania komórek ochronnych (np. czynników transkrypcyjnych) w kierunku sąsiednich komórek naskórka6. Podobny mechanizm został zasugerowany na podstawie badań nad mutantami gsl8/chor7,8. Nasz eksperymentalny system do powtarzalnej indukcji aparatów szparkowych w klastrach przy użyciu roztworu pożywki zawierającej sacharozę jest dość łatwy i tani. Może być również używany do badania struktur wewnątrzkomórkowych, takich jak organelle i cytoszkielet w zgrupowanych komórkach ochronnych, gdy jest stosowany do linii transgenicznych wyrażających markery fluorescencyjne, które oznaczają struktury wewnątrzkomórkowe9,10.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie 3% roztworu 1/2 Murashige-Skoog zawierającego sacharozę

  1. Do zlewki dodać 1,1 g pośrednich soli Murashige-Skoog i 15 g sacharozy.
  2. Dodaj 490 ml wody destylowanej i dobrze wymieszaj za pomocą mieszadła.
  3. Dostosuj pH do 5,8 za pomocą KOH.
  4. Rozcieńczyć do 500 ml wodą destylowaną i przenieść roztwór do średniej butelki.
  5. Wysterylizować roztwór w autoklawie (121 °C, 20 min). Jeśli roztwór ten nie zostanie natychmiast zużyty, może być przechowywany w temperaturze 4 °C po sterylizacji.

2. Indukcja zgrupowanych aparatów szparkowych przez zanurzenie w roztworze zawierającym sacharozę

  1. Wysterylizuj nasiona.
    1. Przygotuj roztwór sterylizacyjny, dodając 500 μl 5% aktywnego roztworu chloru NaClO i 1 μl 10% Triton X-100 do 500 μl sterylnej wody.
    2. Umieść ok. 50 transgenicznych nasion A. thaliana z markerem fluorescencyjnym, takim jak CT-GFP11 lub GFP-TUB612 w probówce o pojemności 1,5 ml.
    3. Dodaj 1 ml 70% roztworu etanolu i dobrze wymieszaj, odwracając pięć razy. Pozostaw na 1 min.
    4. Nasiona opadną na dno tuby. Na czystej ławce delikatnie usuń 70% etanol za pomocą mikropipety i dodaj 1 ml roztworu sterylizacyjnego. Dobrze wymieszaj, odwracając pięć razy i odstaw na 5 minut.
    5. Umyj nasiona. Kontynuując pracę w warunkach aseptycznych, na czystej ławce, delikatnie usuń roztwór za pomocą mikropipety i dodaj 1 ml sterylnej wody. Powtórz ten krok pięć razy.
  2. Dodaj 1,5 ml wysterylizowanego 3% roztworu 1/2 pożywki Murashige-Skoog zawierającego sacharozę do każdego dołka 24-dołkowej płytki na czystej ławce.
  3. Dodaj dwa wysterylizowane nasiona do każdej studzienki. Przyklej pokrywkę do płytki 24-dołkowej za pomocą dwóch warstw parafilmu.
  4. Przenieść 24-dołkową płytkę do komory wzrostowej ustawionej w temperaturze 23,5 °C w cyklu 12-godzinnym/12-godzinnym światło-ciemność przy użyciu 100 μmol m−2 s−1 białego światła i inkubować przez 14 dni.

3. Obserwacja mikroskopowa skupionych aparatów szparkowych

  1. Umieścić 30 μl 3% roztworu 1/2 pożywki Murashige-Skoog zawierającego sacharozę z dołka płytki 24-dołkowej na środku szkiełka podstawowego (rozmiar: 76 × 26 mm, grubość: 1,0-1,2 mm).
  2. Usuń liścienie z 14-dniowej sadzonki za pomocą nożyczek preparujących. Unieś liścienie stroną obserwacyjną skierowaną do góry na kropli roztworu.
  3. Przygotuj próbkę liścienia zgodnie z naszą poprzednią metodą13. Zasadniczo umieść 30 μl roztworu na środku szkła nakrywkowego (rozmiar: 18 × 18 mm, grubość: 0,12-0,17 mm). Odwróć szklankę nakrywkową do góry nogami i delikatnie połóż ją na liścieniu. Zetrzyj nadmiar buforu za pomocą niestrzępiącej się chusteczki.
  4. Umieść próbkę na stoliku konfokalnego mikroskopu laserowego i wybierz zgrupowane komórki ochronne do obserwacji przy użyciu oświetlenia jasnego pola.
  5. Uzyskaj obrazy konfokalne znakowanych fluorescencyjnie struktur wewnątrzkomórkowych zgodnie z instrukcjami producenta mikroskopu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj przedstawiono protokół prostej metody wywoływania grupowania aparatów szparkowych roztworem pożywki zawierającej sacharozę w siewkach A. thaliana. Skupione komórki ochronne hodowane w roztworze zawierającym sacharozę (Rysunek 1B) mają większe chloroplasty niż komórki ochronne hodowane w warunkach kontrolnych wolnych od sacharozy (Rysunek 1A). Powiększenie chloroplastów potwierdzono za pomocą CT-GFP

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiono protokoły indukcji skupionych aparatów szparkowych u siewek A. thaliana poprzez zanurzenie roztworu pożywki zawierającej sacharozę. Jak pokazano tutaj, metoda ta jest bardzo prosta i nie wymaga specjalistycznych umiejętności, ale może skutecznie wywołać skupione aparaty szparkowe. Ponad 45% komórek ochronnych jest zgrupowanych w 3% roztworze pożywki zawierającej sacharozę (średnie wartości z ponad 20 niezależnych obserwacji)6. Co więcej, ten eksperymentalny system może być b...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jesteśmy wdzięczni Prof. Seiichiro Hasezawie za jego życzliwe wsparcie naszej pracy. Prace te zostały wsparte grantami Japońskiego Towarzystwa Promocji Nauki (JSPS) KAKENHgrant o numerach 17K19380 i 18H05492, z The Sumitomo Foundation for a Grant for Basic Science Research Projects grant numer 160146 oraz The Canon Foundation dla T.H. Ten eksperymentalny system został opracowany dzięki wsparciu finansowemu JSPS KAKENHgrant nr 26891006 dla K. A. Dziękujemy mgr Robbie Lewisowi z Edanz Group (www.edanzediting.com/ac) za redakcję szkicu manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Płytka 24-dołkowaSumitomo BakeliteMS-0824R
Laser 488 nmFurukawa DenkoHPU-50101-PFS2
Laser 488 nmOlympusSapphire488-20/O
510 nm filtr długoprzepustowyOlympusBA510IF
524 - filtr pasmowo-przepustowy 546 nmSemrockFF01-535/22-25
530 nm krótkoprzepustowy filtrOlympusBA530RIF
561 nm laserCVI Melles Griot85-YCA-025-040
604 - 644 nm filtr pasmowo-przepustowySemrockFF01-624/40-25
Konfokalna głowica skanującaYokogawaCSU10
Konfokalna głowica skanującalaserowa OlympusFV300
Chłodzona kamera CCDFotometriaOprogramowanie do akwizycji obrazu CoolSNAP HQ2
Urządzenia molekularneMetaMorph wersja 7.8.2.0
Oprogramowanie do akwizycji obrazówOlympusFLUOVIEW v5.0
Olejek immersyjnyOlympusOlejek immersyjny Typ-Fne = 1,518 (23 stopnie)
Mikroskop odwróconyOlympusIX-70
Mikroskop odwróconyOlympusIX-71
Mieszanina soli roślinnej Murashige i SkoogFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation392-00591Murashige T i Skoog F (1962) Poprawiona pożywka do szybkiego wzrostu i testów biologicznych z kulturami tkanek tytoniu. Physiologia Plantarum 15(3), 473-497.
Soczewka obiektywu OlympusUPlanApo 100x / 1.35 NA Olej Irys 1.35NA = 1.35
Soczewka obiektywu OlympusUPlanAPO 40x / 0.85 NANA = 0.85
SacharozaFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation196-00015
laserowa

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Raschke, K., Fellows, M. P. Stomatal movement in Zea mays: shuttle of potassium and chloride between guard cells and subsidiary cells. Planta. 101 (4), 296-316 (1971).
  2. Higaki, T., Hashimoto-Sugimoto, M., Akita, K., Iba, K., Hasezawa, S. Dynamics and environmental responses of PATROL1 in Arabidopsis subsidiary cells. Plant and Cell Physiology. 55 (4), 773-780 (2013).
  3. Bergmann, D. C., Sack, F. D. Stomatal development. Annual Review of Plant Biology. 58, 163-181 (2007).
  4. Pillitteri, L. J., Torii, K. U. Mechanisms of stomatal development. Annual Review of Plant Biology. 63, 591-614 (2012).
  5. Sakai, Y., et al. The chemical compound bubblin induces stomatal mispatterning in Arabidopsis by disrupting the intrinsic polarity of stomatal lineage cells. Development. 144 (3), 499-506 (2017).
  6. Akita, K., Hasezawa, S., Higaki, T. Breaking of plant stomatal one-cell-spacing rule by sugar solution immersion. PLOS One. 8 (9), 72456(2013).
  7. Chen, X. Y., et al. The Arabidopsis callose synthase gene GSL8 is required for cytokinesis and cell patterning. Plant Physiology. 150 (1), 105-113 (2009).
  8. Guseman, J. M., et al. Dysregulation of cell-to-cell connectivity and stomatal patterning by loss-of-function mutation in Arabidopsis chorus (glucan synthase-like 8). Development. 137 (10), 1731-1741 (2010).
  9. Akita, K., Hasezawa, S., Higaki, T. Cortical microtubules and fusicoccin response in clustered stomatal guard cells induced by sucrose solution immersion. Plant Signaling and Behavior. 13 (4), 1454815(2018).
  10. Akita, K., Hasezawa, S. Sugar solution induces clustered lips. Cytologia. 79 (2), 125-126 (2014).
  11. Holzinger, A., Buchner, O., Lütz, C., Hanson, M. R. Temperature-sensitive formation of chloroplast protrusions and stromules in mesophyll cells of Arabidopsis thaliana. Protoplasma. 230 (1-2), 23-30 (2007).
  12. Abe, T., Hashimoto, T. Altered microtubule dynamics by expression of modified α-tubulin protein causes right-handed helical growth in transgenic Arabidopsis plants. The Plant Journal. 43 (2), 191-204 (2005).
  13. Higaki, T. Real-time imaging of plant cell surface dynamics with variable-angle epifluorescence microscopy. Journal of Visualized Experiments. (106), 53437(2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Obr bka sacharozobj to kom rek szparkowychpowi kszenie chloroplast wmikrotubule korymikroskopia konfokalnapo ywka Murashige Skooggrupowanie szparekinkubacja siewek

Powiązane artykuły