Nierdzewny protokół wysokiej jakości izolacji RNA z mikrowypreparowanych komórek Purkiniego w ludzkim pośmiertnym móżdżku

Podsumowanie

Ten protokół wykorzystuje metodę bez plam do wizualizacji i izolowania komórek Purkinjego w świeżo zamrożonej tkance z ludzkiego móżdżku pośmiertnego za pomocą mikrodysekcji laserowej. Celem tego protokołu jest wygenerowanie wystarczających ilości wysokiej jakości RNA do sekwencjonowania RNA.

Streszczenie

Mikrodysekcja laserowa (LCM) jest korzystnym narzędziem, które pozwala na pobieranie odpowiednich cytologicznie i/lub fenotypowo komórek lub regionów z heterogenicznych tkanek. Wychwycony produkt może być stosowany w różnych metodach molekularnych do izolacji białek, DNA lub RNA. Jednak zachowanie RNA z pośmiertnej ludzkiej tkanki mózgowej jest szczególnie trudne. Standardowe techniki wizualizacji LCM wymagają procedur barwienia histologicznego lub immunohistochemicznego, które mogą dalej degradować RNA. W związku z tym zaprojektowaliśmy nierdzewny protokół wizualizacji w LCM z zamierzonym celem zachowania integralności RNA w pośmiertnej tkance mózgowej człowieka. Komórka Purkiniego móżdżku jest dobrym kandydatem do wizualizacji ze stali nierdzewnej ze względu na swoją wielkość i charakterystyczne położenie. Kora móżdżku ma wyraźne warstwy, które różnią się gęstością komórek, co czyni je dobrym archetypem do identyfikacji pod mikroskopią w dużym powiększeniu. Komórki Purkiniego to duże neurony znajdujące się między warstwą komórek ziarnistych, która jest gęstą siecią komórkową małych neuronów, a warstwą molekularną, która jest rzadka w ciałach komórkowych. Ze względu na tę architekturę możliwe jest zastosowanie wizualizacji ze stali nierdzewnej. Inne narządy lub układy komórkowe, które naśladują ten fenotyp, również byłyby odpowiednie. Protokół ze stali nierdzewnej ma na celu utrwalenie świeżo zamrożonej tkanki za pomocą etanolu i usunięcie lipidów za pomocą ksylenu w celu poprawy wizualizacji morfologicznej pod mikroskopią świetlną o dużym powiększeniu. Protokół ten nie uwzględnia innych metod utrwalania i jest specjalnie opracowany dla świeżo mrożonych próbek tkanek pobranych przy użyciu systemu ultrafioletowego (UV)-LCM. W tym miejscu przedstawiamy pełny protokół sekcji i mocowania świeżo mrożonej pośmiertnej tkanki ludzkiego móżdżku oraz oczyszczania RNA z komórek Purkinjego wyizolowanych za pomocą UV-LCM, przy jednoczesnym zachowaniu jakości RNA do późniejszego sekwencjonowania RNA. W naszych rękach protokół ten zapewnia wyjątkowy poziom wizualizacji komórkowej bez potrzeby stosowania odczynników barwiących i daje RNA o wysokiej liczbie integralności RNA (≥8), zgodnie z potrzebami eksperymentów profilowania transkrypcji.

Wprowadzenie

Laserowa mikrodysekcja (LCM) jest cennym narzędziem badawczym, które pozwala na separację patologicznie istotnych komórek do późniejszej oceny molekularnej. Wykorzystanie analiz molekularnych w tych heterogenicznych próbkach tkanek oraz korelacja z danymi patologicznymi i klinicznymi jest niezbędnym krokiem w ocenie translacyjnego znaczenia badań biologicznych¹. Podczas analizy danych dotyczących ekspresji genów z RNA zdecydowanie zaleca się stosowanie zamrożonych skrawków tkanki, ponieważ pozwala to na uzyskanie doskonałej jakości RNA, a także maksymalizacji ilości². Powszechnie wiadomo, że wysoka jakość i ilość RNA są niezbędne do uzyskania istotnych danych z sekwencjonowania RNA³. Jednak w przypadku stosowania RNA ze świeżo mrożonej tkanki pośmiertnej do LCM, degradacja RNA jest poważnym wyzwaniem, ponieważ zachodzi natychmiast po śmierci, a jej zakres zależy od różnych czynników związanych z metodą pobierania tkanek^4,5. Ponadto degradacja RNA nasila się, gdy potrzebne są techniki barwienia w celu rozpoznania szczegółów histologicznych i identyfikacji komórki. Specjalistyczne techniki barwienia, takie jak hematoksylina i eozyna, barwienie Nissl, immunofluorescencja i immunohistochemia są pomocne w różnicowaniu komórek z otaczającego zrębu, ale wykazano, że degradują RNA i zmieniają profile ekspresji transkryptu⁶. Dlatego nasze laboratorium stworzyło nierdzewny protokół specjalnie zaprojektowany do zachowania RNA w pośmiertnym ludzkim móżdżku w celu sekwencjonowania RNA po izolacji LCM neuronów Purkinjego.

Podczas przetwarzania świeżo zamrożonej tkanki na LCM, metoda utrwalania może różnie wpływać zarówno na RNA, jak i na integralność tkanki. Utrwalanie formaliny jest standardem dla zachowania morfologicznego, ale powoduje sieciowanie, które może fragmentować RNA i zakłócać amplifikację RNA⁷. Utrwalanie etanolu jest lepszą alternatywą dla izolacji RNA, ponieważ jest to utrwalacz koagulacyjny, który nie indukuje sieciowania¹. Aby poprawić wizualizację morfologii tkanki, ksylen jest najlepszym wyborem, ponieważ usuwa lipidy z tkanki. Istnieją jednak znane ograniczenia związane z wykorzystaniem ksylenu w LCM, ponieważ tkanki mogą wyschnąć i stać się kruche, powodując fragmentację tkanek po wychwycie laserowym⁷. Ksylen jest również lotną toksyną i musi być odpowiednio traktowany w dygestorium. Niemniej jednak wykazano, że ksylen poprawia wizualizację tkanek, jednocześnie zachowując integralność RNA⁸. Dlatego nasz protokół koncentruje się na zastosowaniu 70% wiązania etanolu i odwadniania etanolu, a następnie inkubacji ksylenu w celu uzyskania jasności morfologicznej.

Ważne jest, aby zwrócić uwagę na różne typy systemów mikrodysekcji opartych na laserze, ponieważ wykazano, że różnią się one szybkością, precyzją i jakością RNA. Mikrodysekcja wychwytu laserem w podczerwieni (IR) i systemy mikrodysekcji mikrowiązki lasera ultrafioletowego (UV) były nowymi platformami LCM, które pojawiły się prawie równocześnie⁸. System IR-LCM wykorzystuje "system kontaktowy" wykorzystujący przezroczystą folię termoplastyczną umieszczoną bezpośrednio na wycinku tkanki, a komórki będące przedmiotem zainteresowania selektywnie przylegają do folii za pomocą skupionych impulsów z lasera IR. Alternatywnie, system UV-LCM jest "systemem bezkontaktowym", w którym skupiona wiązka laserowa odcina komórki lub obszary zainteresowania w tkance; W zależności od konfiguracji w dwóch obecnie dostępnych platformach komercyjnych, które wykorzystują konstrukcję mikroskopu odwróconego lub pionowego, tkanka jest pozyskiwana do urządzenia do pobierania za pomocą fali ciśnienia indukowanej laserem, która katapultuje ją przeciwko grawitacji lub tkanki jest zbierana odpowiednio przez grawitację. Do istotnych zalet systemu UV-LCM należy szybsza akwizycja komórek, wolne od zanieczyszczeń pobieranie z podejściem bezkontaktowym oraz bardziej precyzyjna preparacja dzięki znacznie mniejszej średnicy wiązki laserowej⁹. Protokół ten został specjalnie zaprojektowany dla systemu UV-LCM i nie został przetestowany w systemie IR-LCM. W obu konstrukcjach systemów UV-LCM, podczas akumulacji komórek w nasadce zbiorczej, użycie szkiełka nakrywkowego, które zwiększa przejrzystość komórkową podczas mikroskopii, nie jest odpowiednie, ponieważ komórki nie byłyby w stanie wejść do nasadki zbiorczej. Dlatego, aby poprawić wizualizację tkanek, przetestowaliśmy użycie nieprzezroczystych nakrętek zbiorczych, które są zaprojektowane tak, aby działały jako szkiełko nakrywkowe do wizualizacji mikroskopowej w systemach UV-LCM, w porównaniu z nasadkami zbiorczymi wypełnionymi płynem. Nasadki do zbierania płynów mogą być trudne, ponieważ ciecz ulega parowaniu i musi być często wymieniana podczas pracy przy mikroskopie. Czas staje się ważnym czynnikiem wpływającym na stabilność RNA, ponieważ przechwycona tkanka rozpuszcza się natychmiast⁷.

Nasze laboratorium bada pośmiertne zmiany neuropatologiczne w móżdżku u pacjentów z drżeniem samoistnym (ET) i pokrewnymi zaburzeniami neurodegeneracyjnymi móżdżku. Wykazaliśmy zmiany morfologiczne skoncentrowane na komórkach Purkinjego, które odróżniają przypadki ET od kontrolnych, w tym zmniejszoną liczbę komórek Purkinjego, zwiększoną regresję dendrytyczną i różnorodne zmiany aksonalne, co prowadzi nas do postulatu, że degeneracja komórek Purkinjego jest podstawową cechą biologiczną w patogenezie ET^10,11,12,13. Profilowanie transkrypcyjne jest stosowane w wielu chorobach neurologicznych w celu zbadania podstaw molekularnych leżących u podstaw zwyrodnieniowych zmian komórkowych. Jednak profile transkrypcyjne z heterogenicznych próbek, takich jak regiony tkanki mózgowej, mogą skutecznie maskować ekspresję transkryptów o niskiej liczebności i/lub zmniejszać wykrywanie zmian molekularnych, które występują tylko w niewielkiej populacji dotkniętych chorobą komórek, takich jak komórki Purkinjego w korze móżdżku. Na przykład komórki Purkiniego są znacznie przewyższane liczebnie przez obfite komórki ziarniste w korze móżdżku o około 1:3000; W związku z tym, aby skutecznie celować w ich transkryptom, wymagana jest specyficzna izolacja tych neuronów. Kora móżdżku jest wyznaczona przez wyraźne warstwy, które różnią się gęstością i wielkością komórek. Ta architektura komórkowa jest idealna do wizualizacji w świeżo zamrożonej próbce tkanki bez odczynników barwiących zawierających barwniki. Teoretycznie protokół ten może być również stosowany do innych typów tkanek, które mają podobną charakterystyczną organizację tkanek.

Ten protokół został zaprojektowany specjalnie do wizualizacji komórek Purkinjego w ludzkim pośmiertnym móżdżku. Istnieje wiele protokołów utrwalania, barwienia, wizualizacji i konserwacji RNA wielu typów tkanek dla celów zarówno IR, jak i UV-LCM. Rozważając eksperymentalny projekt UV-LCM, osoby powinny dostosować swój protokół tak, aby jak najlepiej odpowiadał potrzebom i wymaganiom materiałów początkowych i końcowych. W tym miejscu łączymy wiele aspektów różnych protokołów LCM, aby zapewnić ulepszoną metodę wizualizacji komórek Purkinjego w pośmiertnym ludzkim móżdżku bez potrzeby stosowania odczynników barwiących zawierających barwnik w celu przygotowania wysokiej jakości RNA do sekwencjonowania transkryptomu.

Protokół

Wszystkie próbki ludzkie wykorzystane w tym protokole zostały uzyskane za świadomą zgodą i zostały zatwierdzone przez Wewnętrzną Komisję Rewizyjną (IRB) na Uniwersytecie Columbia i Uniwersytecie Yale.

UWAGA: Całość tego protokołu powinna być zgodna ze ścisłymi wytycznymi dotyczącymi obchodzenia się z RNA, gdzie zawsze używa się dłoni w rękawiczce, wszystkie powierzchnie są czyszczone dekontaminatorem RNazy, a wszystkie materiały robocze są wolne od RNA/DNA/nukleazy.

1. Przetestuj integralność RNA tkanki przed rozpoczęciem LCM

UWAGA: Testowanie jakości RNA można przeprowadzić wieloma metodami. Upewnij się, że RNA z całego przekroju jest badany w celu uzyskania reprezentatywnego numeru integralności RNA (RIN) dla próbki.

1. Starannie wybrać próbki tkanek do włączenia, które mieszczą się w parametrze projektu eksperymentalnego. Jeśli tniesz na kriostacie, przejdź do kroku 1.2. Jeśli nie, odpowiednio przetrzyj tkankę i przejdź do kroku 1.11.
2. Zdobądź dwa pojemniki z suchym lodem. Rozmiar będzie zależał od liczby próbek.
   1. W pierwszym pojemniku z suchym lodem umieść pustą, oznaczoną probówkę o pojemności 2 ml kodem tkanki.
      UWAGA: Zamrożenie probówek zajmuje 10 minut. Probówki muszą zostać zamrożone przed umieszczeniem w nich tkanki; W przeciwnym razie tkanka stopi się na powierzchni rurki.
   2. W drugim pojemniku z suchym lodem umieść tkankę z zamrażarki o temperaturze -80 °C, która wymaga kontroli RNA.
3. Wyczyść kriostat. Zobacz krok 4.7, aby uzyskać szczegółową procedurę czyszczenia.
4. Usuń tkankę z suchego lodu i odetnij niewielką część tkanki za pomocą odkażonej żyletki odkażonej przez RNazę. Tkanka powinna mieć wymiary około 1 cm x 1 cm.
5. Umieścić kopiec o wysokości około 3 mm ze związkiem o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) na "uchwycie" kriostatu i pozostawić do częściowego zamrożenia. Następnie umieść tkankę na wierzchu OCT - nie wpychaj się do OCT, po prostu pozwól jej spocząć na wierzchu.
6. Gdy OCT stwardnieje, umieść uchwyt z zamontowaną tkanką w ramieniu tnącym kriostatu i ustaw przed ostrzem kriostatu.
7. Przycinaj na odcinkach 30 μm, aż tkanka będzie równa.
8. Wytnij 300 μm tkanki i umieść w zamrożonej probówce o pojemności 2 ml. Umieść probówkę z powrotem w suchym lodzie.
9. Wyjmij chusteczkę z "uchwytu" i umieść ją z powrotem w suchym lodzie, aż będzie gotowa do odłożenia.
10. Powtórz kroki 1.4–1.9 dla wszystkich tkanek.
11. Gdy wszystkie próbki są kompletne, wyekstrahuj RNA za pomocą dostarczonego zestawu do ekstrakcji RNA (Tabela materiałów #15). Szczegółowy protokół jest dostarczany z zestawem do ekstrakcji RNA. Postępuj zgodnie ze wszystkimi instrukcjami, w tym z opcjonalnym krokiem suszenia membrany probówki zbiorczej i opcjonalnym krokiem mineralizacji DNazy (Tabela materiałów #16).
12. Przetestuj integralność wyekstrahowanego RNA za pomocą bioanalizatora oceny jakości¹⁴.

2. Przygotuj się przed rozpoczęciem sekcji dla LCM

1. Wyczyść uchwyty szkiełek przed każdą rundą cięcia tkanek pod kątem LCM. Wykonaj procedurę czyszczenia dzień przed użyciem, aby umożliwić całkowite wyschnięcie przez noc.
   UWAGA: Uchwyty szkiełek służą do utrwalania wycinków tkanek w etanolu i oczyszczania w ksylenie.
   1. Procedura czyszczenia uchwytu szkiełka: Spłukać środkiem odkażającym RNazy, a następnie wodą uzdatnioną pirowęglanem dietylu (DEPC). Pozostaw do wyschnięcia na noc do góry nogami na powierzchni wolnej od RNA/DNA/nukleazy, unikając kurzu lub innych zanieczyszczeń unoszących się w powietrzu.
      ostrożność: DEPC jest wysoce toksyczny i powinien być traktowany i utylizowany zgodnie ze standardowym protokołem EH&S dotyczącym niebezpiecznych chemikaliów.
2. Wyczyść szczotki do cięcia za pomocą dekontaminatora RNazy i pozostaw do wyschnięcia na noc. Unikaj kurzu i innych zanieczyszczeń.
3. Umieść szkiełka membranowe w świetle UV na 30 minut w temperaturze pokojowej. Nie wystawiaj szkiełek na działanie promieniowania UV wcześniej niż 1–2 dni przed użyciem. Zwiększa to wiązanie tkanki ze szkiełkiem membranowym.
   UWAGA: Krok 2.3 można połączyć z Krokiem 4, który pozwala na zabieg UV w tym samym dniu, w którym następuje cięcie tkanek (patrz Krok 4.4).

3. Przygotuj roztwory utrwalające z wodą wolną od RNaz i wysokiej jakości etanolem

UWAGA: Wszystkie roztwory są przygotowywane na świeżo dla każdego eksperymentu. Upewnij się, że procedura czyszczenia uchwytu szkiełka od kroku 1.1 została zakończona. Wszystkie rozwiązania przygotowywane są w uchwytach na prowadnice.

1. Umieść 30 ml 100% etanolu w jednym uchwycie na szkiełka.
2. Rozcieńczyć etanol wodą wolną od RNaz/DNaz/nukleaz. Umieść 30 ml 95% etanolu w jednym szkiełku i połóż na lodzie.
3. Rozcieńczyć etanol wodą wolną od RNaz/DNaz/nukleaz. Umieść 30 ml 70% etanolu w jednym uchwycie na szkiełko i połóż na lodzie.
4. Umieść 30 ml 100% ksylenu w dwóch oddzielnych uchwytach na szkiełka i oznacz je jako #1 i #2.

4. Przygotowanie kriostatu do cięcia tkanek

1. Zaopatrz się w wiadro lodu na roztwory etanolu i pojemnik z suchym lodem na chusteczkę.
   ostrożność: Suchy lód jest bardzo zimny, dlatego należy używać rękawic ochronnych. Nie umieszczaj lodu i suchego lodu w tym samym pojemniku. Różne temperatury lodu i suchego lodu spowodują, że utworzą się one razem w nieokreślonej temperaturze.
2. Wyjmij chusteczkę z zamrażarki o temperaturze -80 °C i umieść ją na suchym lodzie w celu transportu do kriostatu.
3. Ustawienia kriostatu:
   1. Ustaw grubość przekroju na 14 μm.
   2. Ustaw grubość przycinania na 30 μm, aby zachować ilość tkanki.
   3. W przypadku kriostatów z temperaturą dwukomorową i temperaturą przechowywania próbek, należy ustawić temperaturę komory (CT) na -18 °C. W przypadku kriostatów z jednym ustawieniem należy ustawić temperaturę na -17 °C.
   4. W przypadku kriostatów z podwójną komorą i temperaturą przechowywania próbek, ustaw temperaturę obiektu (OT) na -16 °C.
      UWAGA: OT musi być cieplejszy niż CT, aby zapewnić równomierne cięcie. Jeśli tkanka nadal się rozdrabnia, OT można zwiększyć do -15 °C, a CT do -18 °C.
4. Umieść tkankę w kriostacie na co najmniej 20 minut, aby umożliwić osiągnięcie optymalnej temperatury.
   UWAGA: Jeśli tkanka nie ma optymalnej temperatury, rozpadnie się podczas cięcia. Nie umieszczaj tkanki w temperaturze -20 °C poprzedniej nocy, aby zachować integralność RNA i zapobiec tworzeniu się kryształków lodu. Pozwól tkance na tyle czasu, ile to konieczne, aby zrównoważyć się do optymalnej temperatury, aby ciąć płynnie. W tym przypadku może wystąpić fakultatywne zastosowanie inkubacji szkiełek w promieniowaniu UV (patrz krok 1.3).
5. Umieść "uchwyt" w kriostacie na co najmniej 20 minut, aby umożliwić mu zejście do temperatury kriostatu.
6. Umieść czyste szczotki w kriostacie na co najmniej 20 minut, aby pozwolić zejść do temperatury kriostatu.
7. Wyczyść kriostat
   1. Oczyść scenę mieszaniną 1:1 odkażacza RNazy i 70% etanolu rozcieńczoną wodą wolną od RNA/DNA/nukleazy, aby zapobiec zamarzaniu na scenie.
   2. Wyczyść nowe jednorazowe ostrze kriostatu za pomocą dekontaminatora RNazy i umieść w uchwycie ostrza na scenie. Odczekaj co najmniej 20 minut, aż ostrze kriostatu osiągnie temperaturę kriostatu.
   3. Wyczyść płytkę zapobiegającą przetaczaniu się za pomocą dekontaminatora RNazy i przymocuj do stolika. Odczekaj co najmniej 20 minut, aż płyta stabilizująca przechylenie osiągnie temperaturę kriostatu.
      UWAGA: Płyta zapobiegająca przechylaniu się nie jest wymagana do cięcia, ale jest wysoce zalecana. Jeśli płyta zapobiegająca staczaniu się nie jest dostępna, alternatywą jest oczyszczona szczotka. Jeśli płyta zabezpieczająca nie ma odpowiedniej temperatury, tkanka stopi się lub przyklei podczas cięcia.

5. Sekcja tkanki

1. Wytnij mały kawałek tkanki (~1 cm x 1 cm) do przekrojenia. Włóż pozostałą chusteczkę do zamrażarki z suchym lodem/-80 °C.
   UWAGA: Upewnij się, że sekcja tkanki składa się w ~95% z kory móżdżku, w której znajdują się komórki Purkinjego.
2. Umieść kopiec OCT o wysokości około 3 mm, aby przykryć "uchwyt". Zacznij od budowania warstw na wierzchu powolnym, okrężnym ruchem, aż powstanie mały kopiec.
3. Gdy OCT jest częściowo zamrożony, ale w środku nadal znajduje się trochę płynu, umieść tkankę na wierzchu OCT. Nie wpychaj tkanki głęboko do OCT. Pozwól chusteczce usiąść na wierzchu OCT, aż do całkowitego zamrożenia. Zajmie to 1–2 minuty.
4. Umieść "uchwyt" z zamrożonym OCT i tkanką w ramieniu tnącym kriostatu. Wyreguluj tkankę tak, aby była równo z ostrzem tnącym.
5. Pozostaw tkankę w ramieniu tnącym na 15–20 minut, aby dostosować się do nowej temperatury.
   UWAGA: W zależności od grubości tkanki potrzebny jest czas na aklimatyzację do temperatury. Pozwól chusteczce siedzieć tak długo, jak to konieczne, aby ciąć czysto. Dostosuj OT i CT, aby pomóc w aklimatyzacji do temperatury tkanek.
6. Powoli przesuwaj tkankę bliżej ostrza. Gdy tkanka dotrze do ostrza, rozpocznij proces przycinania. Grubość wykończenia należy ustawić na 30 μm.
7. Przytnij 2–3 razy, aż warstwy kory będą widoczne.
8. Umieść i wyrównaj płytkę zabezpieczającą tuż nad ostrzem kriostatu.
   UWAGA: Srebrna linia pojawi się ze światła w kriostacie na styku ostrza i płytki zapobiegającej przetaczaniu. Oznacza to, że płyta stabilizująca przechylanie się znajduje się bezpośrednio nad krawędzią ostrza.
9. Rozpocznij cięcie sekcji z prędkością 14 μm. Prawidłowo przycięte sekcje będą płasko pod płytą zabezpieczającą.
   UWAGA: Jeśli chusteczka jest zablokowana, upewnij się, że płytka zapobiegająca przetaczaniu się jest wystarczająco zimna. W razie potrzeby umieszczenie kawałka suchego lodu na zewnątrz (strona nie dotykająca sceny) szybko schłodzi płytę stabilizacyjną.
10. Wytnij 4–6 sekcji i wyrównaj je poziomo w poprzek stolika kriostatu.
11. Ustawiając szkiełko pod kątem, podnieś wszystkie kawałki tkanki za jednym razem.
    UWAGA: Za pomocą szczotek podnieś końce chusteczki, aby były łatwiej dostępne dla szkiełka po podniesieniu. Nie podnoś jednej sekcji na raz. Wystawienie na działanie powietrza o temperaturze pokojowej pogorszy integralność RNA.
    ostrożność: Nie pozwól, aby membrana dotykała stopnia kriostatu. Jeśli membrana dotknie stolika, zacznie odłączać się od szkiełka i spowoduje błędy podczas próby LCM.
12. Natychmiast przejdź do kroku 6. Nie zwlekaj z fiksacją.

6. Utrwalanie tkanki/wizualizacja bez plam

1. Natychmiast przejdź do protokołu utrwalania etanolu
2. Umieść szkiełko w uchwycie szkiełka z 70% etanolem na 2 minuty — na lodzie.
3. Umieść szkiełko w uchwycie szkiełka z 95% etanolem na 45 s — na lodzie.
4. Umieść szkiełko w uchwycie szkiełka ze 100% etanolem na 2 minuty — w temperaturze RT.
5. Zanurz szkiełko 3 razy w uchwycie szkiełka z ksylenem 1 — przy suchej temperaturze (RT).
6. Umieść szkiełko w uchwycie szkiełek z ksylenem 2 na 5 minut — w temperaturze RT.
7. Pozostawić do wyschnięcia w czystym miejscu przez co najmniej 30 minut. Optymalny jest dłuższy czas schnięcia, do 60 min.
   ostrożność: Szkiełka stojące do suszenia w dygestorium. Ksylen jest lotny. Ułożenie szkiełek na płasko spowoduje, że ksylen będzie gromadził się w sekcji tkankowej, co spowoduje, że tkanka będzie zbyt ciemna.

7. Opcjonalnie — Przechowywanie slajdów

1. Umieścić wysuszone szkiełka w pojedynczych probówkach o pojemności 50 ml (po jednym szkiełku na probówkę) i umieścić w zamrażarce w temperaturze -80 °C na okres do 7 dni.
   UWAGA: Szkiełka muszą być suche przed umieszczeniem w zamrażarce w temperaturze -80 °C. Nie używaj środka osuszającego wewnątrz tuby, ponieważ cząstki stałe osadzają się w tkance i membranie. Upewnij się, że nasadka rurki jest szczelna; Jeśli nie, podczas rozmrażania przed użyciem na szkiełku wystąpi kondensacja.
   ostrożność: Integralność RNA zmniejsza się po 7 dniach, podobnie jak jakość wizualizacji tkanek.

8. Rozmrażanie przechowywanych preparatów do użytku

1. Wyjąć probówkę za pomocą jednego szkiełka z zamrażarki w temperaturze -80 °C na 1 godzinę przed planowanym użyciem.
2. Nie otwieraj rurki od razu. Pozwól, aby rurka osiągnęła temperaturę pokojową. Kondensacja wystąpi tylko na zewnątrz rury.
3. Gdy rurka osiągnie temperaturę pokojową i cała kondensacja zniknie (około 30–40 min), zdejmij nasadkę i wystawij szkiełko na działanie powietrza o temperaturze pokojowej.
4. Pozwól szkiełku zaaklimatyzować się do temperatury pokojowej przez 15–20 minut. Pozostaw szkiełko wewnątrz rurki ze zdjętą nakrętką.
   UWAGA: Zjeżdżalnia jest teraz gotowa do LCM.

9. Laserowe wychwytywanie mikrodysekcji komórek Purkinjego:

UWAGA: Ta sekcja protokołu będzie omawiać tylko szczegóły związane z przechwytywaniem komórek Purkinjego do późniejszego sekwencjonowania RNA. W tej sekcji założono, że użytkownik jest zaznajomiony z mikroskopem laserowym UV i powiązanym oprogramowaniem.

1. Wyczyść stolik mikroskopu i ramię zbierające nakrętki za pomocą odkażacza RNazy.
2. Dłońmi w rękawiczkach umieść szkiełko podstawowe na mikroskopie, a nieprzezroczystą nasadkę o pojemności 500 μl w ramieniu do pobierania danych.
   UWAGA: Zawsze upewnij się, że technika RNA jest prawidłowa, czyszcząc obszar roboczy środkiem odkażającym RNaza i używając rąk w rękawiczkach podczas dotykania szkiełka lub nieprzezroczystej nasadki. Rękawice można zdjąć, gdy zamek i nasadka są na swoim miejscu i rozpocznie się przechwytywanie laserowe.
3. Przy małym powiększeniu wyrównaj nieprzezroczystą nasadkę na tkance móżdżku, upewniając się, że nasadka obejmuje cały obszar widoczny w okularze.
   UWAGA: Tylko okular mikroskopu pokaże, czy nieprzezroczysta nasadka jest wyśrodkowana. Aparat nie pokaże, jeśli nasadka jest wyśrodkowana nad tkanką. W zależności od konstrukcji lunety do przechwytywania laserowego, wizualizacja przez nieprzezroczystą nasadkę będzie albo tylko w okularze, albo wizualizowana zarówno w okularze, jak i w kamerze.
4. Wizualizuj warstwy móżdżku za pomocą soczewki obiektywu 5x - 10x i umieść kursor na sekcji, w której przecinają się warstwa molekularna i warstwa komórek ziarnistych (warstwa komórek Purkinjego).
5. Przejdź do 40X i wizualizuj komórki Purkinjego.
   UWAGA: Zobacz Rysunek 1 i Rysunek 2 to przykładowe wizualizacje.
6. Rozpocznij przechwytywanie komórek Purkinjego.
   nuta: Do przeprowadzenia sekwencjonowania RNA wymagane jest co najmniej 5 ng RNA. Około 1600–2000 komórek Purkinjego wytwarza wystarczającą ilość materiału RNA do sekwencjonowania. RNA będzie stabilne do 8 godzin pod mikroskopem. Przetestuj energię UV i ognisko UV przed pobraniem, aby upewnić się, że poziomy są prawidłowe. Z biegiem czasu tkanka będzie nadal wysychać, a energia UV i ognisko UV mogą być konieczne do zmiany.

10. Pobieranie RNA po LCM

1. Przygotuj bufor do lizy komórek (za każdym razem przygotuj świeży)
   1. Rozcieńczyć 2-merkaptoetanol w buforze do lizy w stosunku 1:100 (odpowiednio 10 μl: 1 ml). Bufor do lizy (RLT) znajduje się w Tabeli materiałów (#14 i #15).
2. Dodać 50 μl buforu do lizy komórek do nieprzezroczystej nasadki, nasadką skierowaną do góry. Ostrożnie zamknij rurkę nad nasadką.
3. Pozostaw rurkę do góry nogami na 1 minutę.
4. Wiruj probówkę przez 30 s i szybko odkręć bufor do lizy na dno probówki.
5. Ponownie otwórz probówkę i powtórz kroki 10.2–10.4.
6. Umieść probówkę zawierającą 100 μl buforu do lizy i RNA z zamrażarki o temperaturze -80 °C, aż wszystkie próbki będą gotowe i gotowe do ekstrakcji RNA (Tabela materiałów #14).

Wyniki

Ten protokół szczegółowo opisuje etapy przygotowania świeżo zamrożonej pośmiertnej ludzkiej tkanki mózgowej do UV-LCM. Podano dokładne specyfikacje i adnotacje dotyczące cięcia kriostatu, ponieważ cięcie świeżo zamrożonej tkanki mózgowej z dużą precyzją może być trudne. Najważniejszą kwestią, którą należy wziąć pod uwagę, jest to, że świeżo zamrożona tkanka jest bardzo zimna i wymaga znacznej ilości czasu, aby przyzwyczaić się do wyższej temperatury kriostatu. Tego kroku nie można przyspi...

Dyskusja

Przedstawiony tutaj protokół jest specjalnie zmodyfikowany, aby był nierdzewnym podejściem do wizualizacji morfologicznie odrębnych tkanek dla UV-LCM. Metoda ta ma na celu maksymalizację integralności RNA dla późniejszego bezpośredniego sekwencjonowania RNA, przy jednoczesnym zachowaniu zwiększonego poziomu wizualizacji tkanek. Zdolność do rozróżniania różnych typów komórek w celu wychwycenia, w celu stworzenia możliwie najczystszej populacji komórek, ma zasadnicze znaczenie dla zrozumienia różnych profili molekularnych ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
MembranSlide NF 1.0 PEN	Zeiss	415190-9081-000	Szkiełka membranowe do tkanek. Nie zalecamy korzystania ze szkiełek szklanych.
AdhesiveCap 500 Opaque	Zeiss	415190-9201-000	Nieprzezroczyste nasadki służą do poprawy wizualizacji tylko na odwróconych zakresach
RNase Away	Molecular BioProducts	7005-11	Odpowiednie są również inne produkty do odkażania RNazy. Służy do czyszczenia wszystkich powierzchni przed pracą.
200 Proof Ethanol	Decon Laboratories	2701	Jeśli używasz alternatywnego etanolu, zapewnij wysoką jakość. Niezbędny do utrwalenia tkanek.
Ksyleny (certyfikowany ACS)	Fisher Scientific	X5P-1GAL	Jeśli używasz alternatywnego ksylenu, zapewnij wysoką jakość. Niezbędne do wizualizacji tkanek.
UltraPure Woda destylowana	Invitrogen	10977-015	Inna woda wolna od RNA / DNA / nukleaz również odpowiednia. Stosowany tylko w rozcieńczaniu etanolu.
Slide-Fix Slide Jars	Evergreen	240-5440-G8K	Odpowiedni jest również każdy uchwyt na slajdy/słoik. Należy go wyczyścić przed użyciem. Służy do mocowania po przekroju.
Płyta stabilizatora, komplet 70 mm 100 μ m	Leica Biosystems	14041933980	zależy od rodzaju kriostatu i miejsca mocowania na stoliku. Wszystkie kriostaty mają różne wymagania.
Pirowęglan dietylu (DEPC)	Sigma Aldrich	D5758-50mL	DEPC od dowolnego dostawcy wystarczy. Postępuj zgodnie ze wskazówkami dotyczącymi uzdatniania wody.
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666A	Chusteczki Kimwipes można zamówić u dowolnego sprzedawcy i używać w dowolnym rozmiarze. Chusteczki Kimwipes są przeznaczone do czyszczenia mikroskopu i kriostatu.
Tissue-Plus O.C.T. Compound	Fisher Scientific	23-730-571	Dopuszczalna jest każda marka OCT. Żadna tkanka nie zostanie osadzona w OCT, łatwo jest przymocować tkankę do "chucka".
Edge-Rite Low-Profile Microtome Blades	Thermo Scientific	4280L	Typ ostrza zależy od typu kriostatu. Wszystkie kriostaty mają różne wymagania.
Leica Microsystems 3P  UCHWYTY KRIOSTATOWE 25 + 30 MM	Fisher Scientific	NC0558768	Typ uchwytu zależy od typu kriostatu. Wszystkie kriostaty mają różne wymagania. Każdy rozmiar jest odpowiedni.
RNeasy Micro Kit (50)	Qiagen	74004	Wymagany do ekstrakcji RNA po LCM. Bufor do lizy RLT niezbędny do zbierania wychwyconych komórek z nieprzezroczystej czapeczki.
RNeasy Mini Kit (50)	Qiagen	74104	Wymagany do ekstrakcji RNA preparatów do sekcji, które są wykonywane przed LCM w celu zbadania integralności RNA tkanek wyjściowych.
Zestaw DNazy bez RNaz	Qiagen	79254	Dnaza usunie dowolne DNA, aby umożliwić czystą populację RNA. Upewnij się, że Dnase jest świeży.
2-merkaptoetanol	Sigma Aldrich	M6250-100ML	Zakupiona objętość według uznania użytkownika. Niezbędny do dodania do buforu RLT w celu lizy komórek. Zapobiega aktywności RNazy.
Globe Naukowy  Certyfikowana probówka wirówkowa z podziałką Lot (2 ml)	Fisher Scientific	22-010-092	Wystarczy dowolna probówka o pojemności 2 ml, która jest wolna od RNazy, DNazy, ludzkiego DNA i pirogenów.