Artykuł metodologiczny

Sekwencjonowanie z bardzo długim odczytem do analizy całego genomu DNA

27.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58954

⸱

15 marca 2019

 ,  ,  ,  , 
1Genome Technologies, Jackson Laboratory for Genomic Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Długie sekwencje znacznie ułatwiają tworzenie złożonych genomów i charakteryzację zmienności strukturalnej. Opisujemy metodę generowania ultradługich sekwencji za pomocą platform sekwencjonowania opartych na nanoporach. Podejście to wykorzystuje zoptymalizowaną ekstrakcję DNA, a następnie zmodyfikowane przygotowania biblioteczne w celu wygenerowania setek odczytów kilobazowych z umiarkowanym pokryciem z komórek ludzkich.

Streszczenie

Technologie sekwencjonowania pojedynczych cząsteczek DNA trzeciej generacji oferują znacznie dłuższy czas odczytu, co może ułatwić składanie złożonych genomów i analizę złożonych wariantów strukturalnych. Platformy nanoporowe wykonują sekwencjonowanie pojedynczych cząsteczek poprzez bezpośredni pomiar zmian prądu, w których pośredniczy przejście DNA przez pory i mogą generować setki odczytów kilozasad (kb) przy minimalnych kosztach kapitałowych. Platforma ta została przyjęta przez wielu badaczy do różnych zastosowań. Osiągnięcie dłuższych długości odczytu sekwencjonowania jest najważniejszym czynnikiem pozwalającym na wykorzystanie wartości platform sekwencjonowania nanoporowego. Aby wygenerować bardzo długie odczyty, należy zwrócić szczególną uwagę na to, aby uniknąć pęknięć DNA i zwiększyć wydajność generowania produktywnych matryc sekwencjonowania. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół sekwencjonowania ultradługiego DNA, w tym ekstrakcję DNA o wysokiej masie cząsteczkowej (HMW) ze świeżych lub zamrożonych komórek, budowę biblioteki poprzez mechaniczne ścinanie lub fragmentację transpozazy oraz sekwencjonowanie na urządzeniu nanoporowym. Od 20-25 μg DNA HMW, metoda może osiągnąć długość odczytu N50 50-70 kb przy mechanicznym ścinaniu i N50 o długości odczytu 90-100 kb z fragmentacją za pośrednictwem transpozazy. Protokół można zastosować do DNA wyekstrahowanego z komórek ssaków w celu przeprowadzenia sekwencjonowania całego genomu w celu wykrycia wariantów strukturalnych i złożenia genomu. Dodatkowe ulepszenia w zakresie ekstrakcji DNA i reakcji enzymatycznych jeszcze bardziej zwiększą długość odczytu i rozszerzą jego użyteczność.

Wprowadzenie

W ciągu ostatniej dekady, masowo równoległe i bardzo dokładne technologie sekwencjonowania drugiej generacji o wysokiej przepustowości doprowadziły do eksplozji odkryć biomedycznych i innowacji technologicznych1,2,3. Pomimo postępu technicznego, dane o krótkim odczycie generowane przez platformy drugiej generacji są nieskuteczne w rozwiązywaniu złożonych regionów genomu i są ograniczone w wykrywaniu wariantów strukturalnych genomu (SV), które odgrywają ważną rolę w ewolucji człowieka i chorobach4,5. Co więcej, dane o krótkim odczycie nie są w stanie rozpoznać powtarzającej się zmienności i nie nadają się do rozróżniania faz haplotypów wariantów genetycznych6.

Niedawny postęp w sekwencjonowaniu pojedynczych cząsteczek oferuje znacznie dłuższy czas odczytu, co może ułatwić wykrycie pełnego spektrum SVs7,8,9, i oferuje dokładne i kompletne składanie złożonych genomów mikroorganizmów i ssaków6,10. Platforma nanoporowa przeprowadza sekwencjonowanie pojedynczych cząsteczek poprzez bezpośredni pomiar zmian prądu, w których pośredniczy przejście DNA przez pory11,12,13. W przeciwieństwie do jakiejkolwiek istniejącej chemii sekwencjonowania DNA, sekwencjonowanie nanoporowe może generować długie (dziesiątki do tysięcy kilozasad) odczyty w czasie rzeczywistym bez polegania na kinetyce polimerazy lub sztucznej amplifikacji próbki DNA. W związku z tym sekwencjonowanie nanoporowe z długim odczytem (NLR-seq) jest bardzo obiecujące w generowaniu ultradługich odczytów znacznie przekraczających 100 kb, co znacznie posunęłoby naprzód analizy genomiczne i biomedyczne14, szczególnie w regionach genomów o niskiej złożoności lub bogatych w powtórzenia15.

Unikalną cechą sekwencjonowania nanoporowego jest jego potencjał do generowania długich odczytów bez teoretycznego ograniczenia długości. W związku z tym długość odczytu zależy od fizycznej długości DNA, na którą bezpośredni wpływ ma integralność DNA i jakość matrycy sekwencjonowania. Ponadto, w zależności od zakresu manipulacji i liczby etapów, takich jak siły pipetowania i warunki ekstrakcji, jakość DNA jest bardzo zróżnicowana. W związku z tym trudno jest uzyskać długie odczyty, stosując tylko standardowe protokoły ekstrakcji DNA i metody budowy biblioteki dostarczone przez producenta. W tym celu opracowaliśmy solidną metodę generowania danych sekwencjonowania o bardzo długim odczycie (setki kilozasad), zaczynając od zebranych granulek komórkowych. Przyjęliśmy wiele ulepszeń w procedurach ekstrakcji DNA i przygotowania biblioteki. Uprościliśmy protokół, aby wykluczyć niepotrzebne procedury, które powodują degradację i uszkodzenia DNA. Protokół ten składa się z ekstrakcji DNA o wysokiej masie cząsteczkowej (HMW), budowy ultradługiej biblioteki DNA i sekwencjonowania na platformie nanoporowej. Dobrze wyszkolonemu biologowi molekularnemu zajmuje to zazwyczaj 6 godzin od pobrania komórek do zakończenia ekstrakcji DNA HMW, 90 minut lub 8 godzin na budowę biblioteki w zależności od metody ścinania i do kolejnych 48 godzin na sekwencjonowanie DNA. Wykorzystanie protokołu umożliwi społeczności genomicznej lepsze zrozumienie złożoności genomu i uzyskanie nowego wglądu w zmienność genomu w chorobach ludzkich.

Protokół

UWAGA: Protokół NLR-seq składa się z trzech następujących po sobie kroków: 1) ekstrakcji genomowego DNA o wysokiej masie cząsteczkowej (HMW); 2) ultradługa budowa biblioteki DNA, która obejmuje fragmentację DNA HMW do pożądanych rozmiarów i ligację adapterów sekwencjonowania do końców DNA; oraz 3) załadowanie ligowanego adapterem DNA na matryce nanoporów (Rysunek 1).

1. Ekstrakcja DNA HMW

  1. Konfiguracja odczynnika. Przygotuj 1x bufor soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) (1,000 ml), dodając 100 ml PBS (10x) do 900 ml wody i dobrze wymieszaj. Przygotuj bufor do lizy (50 ml), dodając 43,5 ml wody do probówki o pojemności 50 ml. Dodać 500 μl Tris (1 M, pH 8,0), 1 ml chlorku sodu (NaCl) (5 M), 2,5 ml kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) (0,5 M, pH 8,0) i 2,5 ml dodecylosiarczanu sodu (SDS) (10%, wag./obj.) do probówki i dobrze wymieszać.
    UWAGA: Ten bufor PBS może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez okres do 6 miesięcy. Gotowy bufor do lizy może być przechowywany w temperaturze pokojowej do 2 miesięcy.
  2. Sprawdź śmiertelność komórek i policz komórki. Upewnij się, że współczynnik transmisji na żywo wynosi > 85%, a całkowita liczba komórek wynosi 30 x 106.
    UWAGA: Komórki użyte w tym protokole pochodzą z linii komórkowej HG00733, ludzkiej linii komórek limfoblastoidalnych pochodzenia portorykańskiego, szeroko stosowanej w konsorcjum 1000 Genome do analizy zmienności strukturalnej (patrz tabela materiałów w celu uzyskania informacji o zamawianiu), która należy do International Genome Sample Resource.
  3. Zebrać komórki, odwirowując przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Wyrzucić pożywkę i ponownie zawiesić osad komórkowy (30 x 106 komórek) z 5 ml buforu 1x PBS. Odwirować ponownie przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i odrzucić supernatant.
    UWAGA: 25-35 x 106 komórek jest akceptowalnych dla tego podejścia. Dalsze różnice w liczbie używanych komórek będą wymagały dalszej optymalizacji. Osad komórkowy może być przechowywany w temperaturze -80 °C przez okres do 6 miesięcy.
  4. Zawiesić osad komórkowy w 200 μl buforu 1x PBS. W przypadku użycia zamrożonych komórek należy przemyć 5 ml buforu 1x PBS. Odwirować roztwór o stężeniu 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 200 μl 1 buforu PBS.
  5. Przygotować 10 ml buforu do lizy w probówce o pojemności 50 ml. Dodać zawiesinę komórek o objętości 200 μl do buforu do lizy i wirować z najwyższą prędkością przez 3 s. Inkubować roztwór w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
  6. Dodać 2 μl RNazy A (100 mg/ml) do lizatu. Delikatnie obróć probówkę o pojemności 50 ml, aby wymieszać próbkę. Inkubować roztwór w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
  7. Dodać 50 μl proteinazy K (20 mg/ml) do lizatu. Delikatnie obróć probówkę o pojemności 50 ml, aby wymieszać próbkę. Inkubować roztwór w temperaturze 50 °C przez 2 godziny. Podczas inkubacji delikatnie mieszać próbkę co 30 minut.
  8. Wyjąć probówkę o pojemności 50 ml z 50 °C i odstawić w temperaturze RT na 5 minut.
  9. Dodać 10 ml warstwy fenolowej alkoholu fenolowo-chloroformowego:izoamylowego (25:24:1, obj./obj./obj.) do lizatu i obracać probówkę na mieszalniku rotatorowym (patrz tabela materiałów) w temperaturze RT w dygestorium przy 20 obr./min przez 10 min. Owinąć nakrętkę probówki parafilmem, aby zapobiec wyciekom podczas obracania.
  10. Przygotować dwie probówki żelowe o pojemności 50 ml (patrz Tabela Materiałów) przez odwirowanie przy 1 500 x g przez 2 minuty w temperaturze RT.
    UWAGA: Żel tworzy stabilną barierę między fazą wodną zawierającą kwas nukleinowy a rozpuszczalnikiem organicznym.
  11. Wlać próbkę/roztwór fenolu do jednej z przygotowanych probówek żelowych o pojemności 50 ml z kroku 1.10. Odwirować roztwór o stężeniu 3 000 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  12. Wlać supernatant do nowej probówki o pojemności 50 ml. Dodać 10 ml warstwy fenolowej fenolu: chloroformu: alkoholu izoamylowego (25:24:1, obj./obj./obj.) i obracać probówkę na mieszalniku rotatorowym o temperaturze pokojowej w dygestorium z prędkością 20 obr./min przez 10 min.
  13. Powtórz krok 1.11 raz z drugą przygotowaną tubką żelową.
  14. Wlać supernatant do nowej probówki o pojemności 50 ml. Dodaj 25 ml lodowatego 100% etanolu i delikatnie obracaj probówkę ręcznie, aż DNA się wytrąci (Rysunek 2).
    UWAGA: Podejście oparte na wytrącaniu pomaga ustabilizować DNA HMW.
  15. Zegnij końcówkę o pojemności 20 μl, aby zrobić haczyk. Ostrożnie wyjmij HMW DNA za pomocą haczyka i pozwól, aby płyn opadł.
  16. Umieść DNA HMW w probówce o pojemności 50 ml zawierającej 40 ml 70% etanolu. Umyj DNA, delikatnie odwracając probówkę 3 razy.
  17. Powtórz krok 1.15 raz, aby pobrać DNA z probówki z 70% etanolem.
  18. Umieść HMW DNA w probówce o pojemności 2 ml zawierającej 1,8 ml 70% etanolu.
  19. Odwirować przemyte HMW DNA przy 10 000 x g przez 3 s w temperaturze pokojowej. Usunąć jak najwięcej pozostałego etanolu za pomocą pipetowania.
    UWAGA: Nie naruszaj osadu DNA podczas pipetowania pozostałego etanolu.
  20. Inkubować probówkę o pojemności 2 ml w temperaturze 37 °C przez 10 minut z otwartą pokrywką w celu wysuszenia próbki.
    1. Jeśli kontynuujesz krok 2.1 (z mechanicznym ścinaniem i zestawem do sekwencjonowania ligacji 1D), dodaj 1 ml TE (10 mM Tris i 1 mM EDTA, pH 8,0) do probówki o pojemności 2 ml.
    2. Jeśli kontynuujesz krok 2.2 (z fragmentacją opartą na transpozazie i zestawem do szybkiego sekwencjonowania), dodaj 200 μl 10 mM Tris (pH 8,0) z 0,02% Triton X-100,
      UWAGA: Nie naruszaj osadu DNA. Pozostawienie probówki w temperaturze 4 °C w ciemności przez 48 godzin pomoże w całkowitym zawieszeniu próbki. DNA HMW może być przechowywane w temperaturze 4 °C przez okres do 2 tygodni. Dłuższy czas przechowywania lub inne warunki przechowywania mogą powodować powstawanie krótszych fragmentów.

2. Konstrukcja biblioteki DNA o bardzo długim czasie

UWAGA: Istnieją dwa sposoby konstruowania ultradługich bibliotek DNA w oparciu o dwie różne metody ścinania w połączeniu z zestawami do sekwencjonowania nanoporowego. Biblioteka oparta na ścinaniu mechanicznym generuje dane o wartości N50 50-70 kb, co zajmuje około 8 godzin na budowę biblioteki. Biblioteka oparta na fragmentacji transpozazy generuje N50 o wielkości 90-100 kb danych, co zajmuje tylko 90 minut na zbudowanie biblioteki. Protokół mechanicznego ścinania zapewnia wyższą wydajność z tego samego wejścia DNA przy użyciu identycznych wersji adaptera sekwencjonowania i jakości komórek przepływowych z nanoporami.

  1. Budowa biblioteki oparta na ścinaniu mechanicznym
    1. Rozmrozić i wymieszać odczynniki z zestawu do podwiązywania (patrz Tabela materiałów). Rozmrozić bufor naprawczy DNA FFPE i zakończyć naprawę/bufor ogonowy dA na lodzie, a następnie wirować i wirować, aby wymieszać. Rozmrozić mieszankę adaptera (AMX) i bufor do wiązania kulek adaptera (ABB) na lodzie, a następnie odpipetować i odwirować, aby wymieszać. Rozmrozić działający bufor z mieszanką paliwową (RBF) i buforem elucyjnym (ELB) w temperaturze pokojowej, a następnie wirować i wirować w dół, aby wymieszać. Rozmrozić koraliki ładujące (LLB) w temperaturze pokojowej i pipetę, aby wymieszać przed użyciem.
      1. Po rozmrożeniu trzymaj wszystkie elementy zestawu na lodzie. Enzymy należy usuwać tylko wtedy, gdy jest to potrzebne. Przynieś koraliki magnetyczne do RT w celu użycia.
        UWAGA: Zalecenia dotyczące koralików magnetycznych, których należy używać, znajdują się w tabeli materiałów.
    2. Sprawdź jakość i ilość HMW DNA od kroku 1.21.1. Odpipetować 20 μl DNA do nowych probówek o pojemności 1,5 ml z trzech różnych miejsc w probówce HMW DNA za pomocą końcówek o szerokim otworze P200. Weź 1 μl z trzech podwielokrotności, aby wykryć stężenie za pomocą fluorometru, a jakość za pomocą odczytu UV. Sprawdź wiele razy, aby potwierdzić wyniki.
      UWAGA: Oczekiwane wyniki są pokazane w Rysunek 3A. Wartość OD260/280 wynosi około 1,9, a wartość OD260/230 wynosi około 2,3.
    3. Przenieś pozostałe 940 μl DNA HMW do nasadki probówki o pojemności 50 ml z końcówką P1000 o szerokim otworze.
    4. Odessać całe DNA do strzykawki o pojemności 1 ml bez igły.
    5. Umieścić igłę 27 G na strzykawce i delikatnie i powoli wysunąć całe DNA do nasadki (~10 s). Zdjąć igłę 27 G ze strzykawki.
    6. Powtórzyć kroki 2.1.4 i 2.1.5 29 razy, co daje w sumie 30 przejść przez igłę.
      UWAGA: Ścięte DNA HMW można przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności do 24 godzin. Kontrola jakości (QC) jest wysoce zalecana przez elektroforezę żelową w polu pulsacyjnym, ale jest kosztowna i czasochłonna. W przypadku wykonywania kontroli jakości na zautomatyzowanej maszynie do elektroforezy żelowej w polu pulsacyjnym należy użyć protokołu 5-150 kb na 20-godzinny przebieg. Oczekiwane wyniki są pokazane w Rysunek 4.
    7. Przygotuj reakcję naprawy DNA w probówce o pojemności 0,2 ml, dodając 100 μl ściętego DNA HMW (20 μg), 15 μl buforu do naprawy DNA FFPE, 12 μl mieszanki naprawy DNA FFPE i 16 μl wody wolnej od nukleaz. Wymieszaj reakcję, delikatnie przesuwając 6 razy i odwiruj, aby usunąć bąbelki.
    8. Inkubować reakcję w temperaturze 20 °C przez 60 minut. Przenieść próbkę do nowej probówki o pojemności 1,5 ml z końcówką o szerokim otworze P200.
    9. Ponownie zawiesić kulki magnetyczne przez pipetowanie lub wirowanie. Dodaj 143 μl kulek (1x) do reakcji naprawy DNA i delikatnie wymieszaj, przesuwając probówkę 6 razy. Obracaj rurkę w mieszalniku rotatorowym z prędkością obrotową 20 obr./min przez 30 min.
    10. Odwirować próbkę przy 1,000 x g przez 2 s w temperaturze pokojowej. Umieść probówkę na stojaku magnetycznym na 10 minut. Trzymaj probówkę na stojaku magnetycznym i wyrzuć supernatant.
    11. Trzymając probówkę na stojaku magnetycznym, dodaj 400 μl świeżo przygotowanego 70% etanolu, nie naruszając granulatu. Usuń 70% etanolu po 30 sekundach.
    12. Powtórz krok 2.1.11 raz.
    13. Wirować próbkę przy 1,000 x g przez 2 s przy RT. Umieść probówkę z powrotem na stojaku magnetycznym. Usuń resztki etanolu i susz na powietrzu przez 30 sekund. Nie przesuszaj granulek.
    14. Wyjmij probówkę ze stojaka magnetycznego i dodaj 103 μl TE (10 mM Tris i 1 mM EDTA, pH 8,0). Delikatnie przesuń rurkę, aby upewnić się, że kulki są pokryte buforem, i inkubuj na mieszalniku rotatorowym w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Delikatnie przesuwaj rurkę co 5 minut, aby ułatwić ponowne zawieszenie granulki.
    15. Granuluj kulki na stojaku magnetycznym przez co najmniej 10 minut. Przenieś 100 μl eluatu za pomocą końcówki o szerokim otworze P200 do probówki o pojemności 0,2 ml.
    16. Przygotować reakcję naprawy końcówki i ogona dA w probówce o pojemności 0,2 ml, dodając 100 μl naprawionego DNA HMW, 14 μl buforu do naprawy końcówek/dA-tailingu i 7 μl mieszaniny naprawy końcówek/dA-ogonów. Wymieszaj reakcję, delikatnie przesuwając 6 razy i odwiruj, aby usunąć bąbelki.
    17. Inkubować reakcję w temperaturze 20 °C przez 60 minut, następnie w temperaturze 65 °C przez 20 minut, a następnie utrzymywać w temperaturze 22 °C. Przenieść próbkę do nowej probówki o pojemności 1,5 ml za pomocą końcówki P200 o szerokim otworze.
    18. Ponownie zawiesić kulki magnetyczne przez pipetowanie lub wirowanie. Dodać 48 μl kulek (0,4x) do końcowej reakcji naprawy/dA-tailingu i delikatnie wymieszać, przesuwając probówkę 6 razy. Obracaj rurkę w mieszalniku rotatorowym z prędkością obrotową 20 obr./min przez 30 min.
    19. Powtórz kroki 2.1.10-2.1.13 raz.
    20. Wyjmij probówkę ze stojaka magnetycznego i dodaj 33 μl TE (10 mM Tris i 1 mM EDTA, pH 8,0). Delikatnie przesuń rurkę, aby upewnić się, że kulki są pokryte buforem, i inkubuj na mieszalniku rotatorowym w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Delikatnie przesuwaj rurkę co 5 minut, aby ułatwić ponowne zawieszenie granulki.
    21. Granuluj kulki na stojaku magnetycznym przez co najmniej 10 minut. Przenieś 30 μl eluatu za pomocą końcówki o szerokim otworze P200 do nowej probówki o pojemności 1,5 ml. Weź dodatkowe 1-2 μl, aby wykryć stężenie za pomocą fluorometru.
      UWAGA: Na tym etapie oczekuje się odzysku 5-6 μg.
    22. Przygotować reakcję ligacji w probówce z próbką o pojemności 1,5 ml, dodając 30 μl DNA HMW z naprawioną końcówką, 20 μl mieszanki adaptera (AMX 1D) i 50 μl mieszanki głównej do ligacji/TA. Wymieszaj reakcję, delikatnie przesuwając 6 razy między każdym sekwencyjnym dodawaniem i odwiruj, aby usunąć pęcherzyki.
    23. Inkubować reakcję w temperaturze pokojowej przez 60 minut.
    24. Ponownie zawiesić kulki magnetyczne przez pipetowanie lub wirowanie. Dodać 40 μl kulek (0,4x) do reakcji ligacji i delikatnie wymieszać, przesuwając probówkę 6 razy. Obracaj rurkę w mieszalniku rotatorowym z prędkością obrotową 20 obr./min przez 30 min.
    25. Powtórz krok 2.1.10 raz.
    26. Dodać 400 μl bufora do wiązania koralików adaptera (ABB) do probówki. Delikatnie przesuń rurkę 6 razy, aby ponownie zawiesić koraliki. Umieść probówkę z powrotem na stojaku magnetycznym, aby oddzielić kulki od bufora i wyrzuć supernatant.
    27. Powtórz krok 2.1.26 raz.
    28. Wirować próbkę przy 1,000 x g przez 2 s przy RT. Umieść probówkę z powrotem na stojaku magnetycznym. Usuń resztki buforu i susz na powietrzu przez 30 sekund. Nie przesuszaj granulek.
    29. Wyjąć probówkę ze stojaka magnetycznego i ponownie zawiesić osad w 43 μl buforu elucyjnego. Delikatnie przesuń rurkę, aby upewnić się, że kulki są pokryte buforem i inkubuj na mieszalniku rotatorowym w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Delikatnie przesuwaj rurkę co 5 minut, aby ułatwić ponowne zawieszenie granulki.
    30. Granuluj kulki na stojaku magnetycznym przez co najmniej 10 minut. Przenieś 40 μl eluatu za pomocą końcówki o szerokim otworze P200 do nowej probówki o pojemności 1,5 ml. Weź dodatkowe 1-2 μl, aby wykryć stężenie za pomocą fluorometru.
      UWAGA: Na tym etapie oczekuje się odzysku 1-2 μg. Biblioteka oparta na ścinaniu mechanicznym jest gotowa do załadunku. Biblioteka może być przechowywana na lodzie do 2 godzin do momentu załadowania w celu sekwencjonowania w razie potrzeby.
  2. Budowa biblioteki opartej na fragmentacji transpozazy
    1. Rozmrozić odczynniki z zestawu do transpozazy (patrz tabela materiałów). Rozmrażanie mieszanki rozdrabniającej (FRA) i szybki adapter (RAP) na lodzie i pipeta do mieszania. Rozmrażanie bufora sekwencjonującego (SQB), kulki ładujące (LB), bufor do płukania (FLB) i uwięzi do spłukiwania (FLT) w temperaturze pokojowej i pipeta do mieszania. Rozmrozić kulki ładujące (LB) w temperaturze pokojowej i odpipetować do wymieszania przed użyciem. Po rozmrożeniu trzymaj wszystkie elementy zestawu na lodzie. Enzymy należy usuwać tylko wtedy, gdy jest to potrzebne.
    2. Sprawdź jakość i ilość DNA HMW od kroku 1.21.2. Odpipetować 20 μl DNA do nowych probówek o pojemności 1,5 ml z trzech różnych miejsc w probówce HMW DNA za pomocą końcówek o szerokim otworze P200. Weź 1 μl z trzech podwielokrotności, aby wykryć stężenie za pomocą fluorometru, a jakość za pomocą odczytu UV. Sprawdź wiele razy, aby potwierdzić wyniki.
      UWAGA: Oczekiwane wyniki są pokazane w Rysunek 3B. Wartość OD260/280 wynosi około 1,9, a wartość OD260/230 wynosi około 2,3.
    3. Przygotować reakcję znakowania DNA w probówce o pojemności 0,2 ml, dodając 22 μl DNA HMW, 1 μl 10 mM Tris (pH 8,0) z 0,02% Triton X-100 i 1 μl mieszanki fragmentacyjnej (FRA). Wymieszać pipetując końcówką o szerokim otworze P200 tak wolno, jak to możliwe, 6 razy, uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków.
    4. Inkubować reakcję w temperaturze 30 °C przez 1 minutę, następnie w temperaturze 80 °C przez 1 minutę, a następnie utrzymywać w temperaturze 4 °C. Przenieść mieszaninę do nowej probówki o pojemności 1,5 ml z końcówką o szerokim otworze P200 i natychmiast przejść do następnego etapu.
    5. Dodać 1 μl szybkiego adaptera (RAP) do probówki z próbką o pojemności 1,5 ml. Wymieszać pipetując końcówką o szerokim otworze P200 tak wolno, jak to możliwe, 6 razy, uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków.
    6. Inkubować reakcję w temperaturze pokojowej przez 60 min.
      UWAGA: Biblioteka oparta na fragmentacji transpozazy jest gotowa do wczytania. Biblioteka może być przechowywana na lodzie do 2 godzin do momentu załadowania w celu sekwencjonowania w razie potrzeby.

3. Sekwencjonowanie na urządzeniu nanoporowym

  1. Sprawdź urządzenie do sekwencjonowania nanoporowego (patrz Tabela materiałów). Upewnij się, że zarówno oprogramowanie, jak i sprzęt działają i jest wystarczająco dużo miejsca do przechowywania.
  2. Sprawdź komórkę przepływową. Otwórz nową komórkę przepływową i włóż komórkę przepływową do urządzenia nanoporowego. Zaznacz pole miejsca, w którym została włożona komórka przepływowa (X1-X5). Wybierz odpowiedni typ komory przepływowej. Kliknij przepływ pracy Sprawdź komórki przepływu. Kliknij przycisk Rozpocznij test, aby rozpocząć analizę QC w komórce przepływowej.
    UWAGA: Jeśli podana całkowita liczba aktywnych porów jest mniejsza niż 800, użyj innej nowej komórki przepływowej do sekwencjonowania.
  3. Przygotować bufor zasysający. Aby uzyskać bibliotekę opartą na ścinaniu mechanicznym, dodaj 576 μl buforu roboczego z mieszanką paliwową (RBF) i 624 μl wody wolnej od nukleaz do probówki o pojemności 1,5 ml. Odwiruj i odwiruj, aby wymieszać bufor zalewający. W przypadku biblioteki opartej na fragmentacji transpozazy dodaj 30 μl uwięzi do spłukiwania (FLT) do probówki bufora do spłukiwania (FLB). Odwiruj i odwiruj, aby wymieszać bufor zalewający.
  4. Na komorze przepływowej przesuń pokrywę portu zalewowego zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aby odsłonić port zalewowy.
  5. Ustaw pipetę P1000 na 100 μl i włóż końcówkę do portu zasysającego. Pobrać niewielką objętość buforu (mniej niż 30 μl), aby usunąć wszelkie pęcherzyki z komory przepływowej. Należy przerwać pipetowanie, gdy niewielka ilość żółtego płynu dostanie się do końcówki.
  6. Za pomocą pipety P1000 załadować 800 μl mieszanki zalewającej do komory przepływowej przez port zasysający. Aby uniknąć wprowadzania pęcherzyków powietrza, dodaj 30 μl mieszanki gruntującej, aby najpierw pokryć górną część portu gruntowania, a następnie włóż końcówkę do portu zalewania i powoli dodawaj resztę mieszanki gruntującej. Wyjmij końcówkę, gdy pozostanie około 50 μl. Dodaj resztę mieszanki gruntującej na górze portu zalewowego. Płyn sam wejdzie do środka.
  7. Pozostaw nastawę do inkubacji na 5 minut. W międzyczasie przygotuj mieszankę biblioteczną w probówce o pojemności 1,5 ml zawierającej bibliotekę.
    UWAGA: W przypadku biblioteki opartej na ścinaniu mechanicznym dodać 35 μl buforu roboczego z mieszanką paliwową (RBF) do 40 μl biblioteki DNA. W przypadku biblioteki opartej na fragmentacji transpozazy dodać 34 μl buforu sekwencjonującego (SQB) i 16 μl wody wolnej od nukleaz do 25 μl biblioteki DNA.
  8. Delikatnie otwórz pokrywę portu próbki komory przepływowej, aby odsłonić port próbki. Za pomocą pipety P1000 dodaj 200 μl mieszanki zalewającej przez port zasysający do komory przepływowej, jak opisano w kroku 3.5. Upewnij się, że mieszanka gruntująca nie jest załadowana do komory przepływowej przez port próbki.
  9. Ustaw pipetę P200 na 80 μl. Delikatnie wymieszaj bibliotekę z końcówką o szerokim otworze, pipetując w górę i w dół 6 razy tuż przed załadowaniem.
  10. Załaduj miks biblioteczny kroplami przez port próbki do komory przepływowej. Dodaj każdą kroplę dopiero po całkowitym załadowaniu poprzedniej kropli do portu.
  11. Delikatnie załóż pokrywę portu próbki i upewnij się, że port próbki jest całkowicie zakryty. Przesuń pokrywę portu zalewowego w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara, aby zakryć port zalewania. Zamknij pokrywę urządzenia.
  12. Kliknij przepływ pracy Nowy eksperyment. Wpisz nazwę biblioteki, wybierz odpowiedni zestaw zgodnie z zastosowanymi procedurami i sprawdź, czy ustawienia są poprawne (48 godzin pracy, włączone dzwonienie do bazy w czasie rzeczywistym).
  13. Kliknij przycisk Rozpocznij uruchamianie. Po 10 minutach zapisz identyfikator komórki przepływowej i liczbę aktywnych nanoporów (całkowita liczba i liczby każdej z czterech grup) z informacji o przebiegu.
  14. analiza danych. Skopiuj dane na komputer lokalny lub do klastra w dowolnym momencie sekwencjonowania lub po zakończeniu przebiegu. Użyj Minimap216 (https://github.com/lh3/minimap2), aby dopasować dane sekwencji do genomu referencyjnego. Podsumuj wydajność sekwencjonowania na podstawie surowych danych sekwencji i wyrównań według NanoPlot17 (https://github.com/wdecoster/NanoPlot).

Wyniki

Protokół sekwencjonowania ultra-długiego DNA wykorzystuje HMW DNA do konstrukcji biblioteki. Dlatego w kroku zbierania komórek krytyczne jest wybranie dobrze hodowanych komórek z odsetkiem żywych komórek >85%. Liczba komórek użytych do ekstrakcji DNA wpłynie na jakość i ilość HMW DNA. Liza komórek nie przebiega prawidłowo, jeśli proces rozpocznie się od zbyt dużej liczby komórek. Zastosowanie zbyt małej liczby komórek nie pozwala na uzyskanie wystarczającej ilości DNA do konstrukcji biblioteki, ponieważ wytrącanie HMW DNA odbywa się poprzez delikatne obracanie ręczne, a nie wirowanie przy wysokich prędkościach. Przykład HMW DNA po dodaniu lodowatego 100% etanolu i obracaniu przedstawiono jako biały, przypominający watę osad na Rysunku 2.

Przed rozpoczęciem konstrukcji biblioteki ważne jest sprawdzenie jakości wejściowego DNA. Degradacja, nieprawidłowe ilościowe oznaczenie, zanieczyszczenia (np. białka, RNA, detergenty, surfaktanty oraz pozostałości fenolu lub etanolu) oraz DNA o niskiej masie cząsteczkowej mogą mieć istotny wpływ na kolejne procedury i końcową długość odczytu. Zalecamy przeprowadzenie analizy kontroli jakości (QC) z wykorzystaniem DNA pobranego z trzech różnych miejsc w probówce zawierającej HMW DNA. Z wyników pomiarów UV dla HMW DNA wynika, że wartość OD260/OD280 wynosi około 1,9, a wartość OD260/OD230 wynosi około 2,3 (Rycina 3A,B). W przypadku dobrej próbki HMW DNA wartości tych stosunków są spójne we wszystkich trzech testach. Różne metody fragmentacji wymagają różnych objętości wejściowego DNA. Stężenie HMW DNA musi być >200 ng/µL w przypadku fragmentacji mechanicznej, natomiast >1 µg/µL w przypadku fragmentacji za pomocą transpozazy. Stężenie wykryte za pomocą fluorometru jest nieco niższe niż w pomiarze UV. Niemniej jednak współczynnik zmienności stężenia tej samej próbki HMW DNA powinien być mniejszy niż 15% zarówno w analizie fluorometrycznej, jak i w pomiarze UV. Fragmentacja mechaniczna wykorzystuje strzykawkę z igłą do rozrywania HMW DNA, zatem liczba przejść przez igłę wpływa na rozmiar pofragmentowanego DNA i końcową długość odczytu. Zaleca się przeprowadzenie kontroli jakości rozmiaru po fragmentacji igłą, aby upewnić się, że większość HMW DNA ma rozmiar większy niż 50 kb, co zilustrowano na Rycini 4. W metodzie fragmentacji mechanicznej 30 przejść dało najlepsze wyniki sekwencjonowania, biorąc pod uwagę zarówno długość, jak i wydajność.

Wartość N50 biblioteki przygotowanej metodą mechanicznego ścinania wynosi 50-70 kb, natomiast biblioteki przygotowanej metodą fragmentacji za pomocą transpozazy wynosi 90-100 kb. Wyniki czterech przebiegów z wykorzystaniem linii komórkowej HG00733 przedstawiono w Tabeli 1. We wszystkich czterech przebiegach uzyskano ponad 2300 odczytów o długości przekraczającej 100 kb. Maksymalna długość jest większa w bibliotekach przygotowanych metodą fragmentacji za pomocą transpozazy (455 kb i 489 kb) w porównaniu z bibliotekami przygotowanymi metodą mechanicznego ścinania (348 kb i 387 kb), podczas gdy te ostatnie wygenerowały więcej odczytów całkowitych, co wskazuje na wyższą wydajność. Konstrukcja biblioteki metodą fragmentacji za pomocą transpozazy obejmuje mniej etapów i wymaga krótszego czasu przygotowania, dzięki czemu powstaje mniej krótkich fragmentów. Dwa przebiegi z wykorzystaniem transpozazy charakteryzowały się dłuższą średnią długością (>30 kb) i medianą długości (>10 kb). Ponadto dane wykazują spójną, wysoką jakość we wszystkich przebiegach (średni wynik jakości wynosi około 10,0, co odpowiada ok. 90% dokładności zasad). Ponad 97% wszystkich zasad zostało dopasowanych do ludzkiego genomu referencyjnego (hg19) przy użyciu programu Minimap216 z ustawieniami domyślnymi. Oczekiwane rozkłady wielkości surowych odczytów przedstawiono na Rysunku 5. We wszystkich przebiegach duża część danych przekracza 50 kb, natomiast biblioteki przygotowane metodą fragmentacji za pomocą transpozazy mają wyższy stosunek odczytów ultradługich (np. > 100 kb). Niniejszy protokół został z powodzeniem zastosowany w wielu ludzkich liniach komórkowych (Tabela uzupełniająca 1).

Schemat procesu sekwencjonowania DNA: ekstrakcja, fragmentacja, ligacja adapterów, etapy sekwencjonowania.
Rycina 1: Schematyczny przegląd przepływu pracy sekwencjonowania długich odczytów nanoporowych (NLR-seq). Kolor pomarańczowy: kompleks transpozazy. Kolor żółto-zielony: adapter nanoporowy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Proces wirowania, rozdzielanie cieczy, probówka laboratoryjna, gradient gęstości, strzałka wskazująca prążek.
Rysunek 2: Reprezentatywne wytrącanie DNA w metodzie ekstrakcji fenol-chloroformowej. Biała strzałka wskazuje HMW DNA. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykresy ilościowego oznaczania DNA; analiza spektroskopowa, dane o stężeniu, piki absorbancji, tabele próbek.
Rycina 3: Przykład wyników kontroli jakości HMW DNA na podstawie pomiarów UV. (A) HMW DNA z etapu 1.21.1 gotowe do konstrukcji biblioteki opartej na mechanicznym ścinaniu. (B) HMW DNA z etapu 1.21.2 do konstrukcji biblioteki opartej na fragmentacji za pomocą transpozazy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wyniki elektroforezy żelowej; rozdział DNA z markerami 15 Kb i 48,5 Kb; analiza molekularna.
Rysunek 4: Wyniki kontroli jakości (QC) HMW DNA poddanego ścinaniu igłowym za pomocą elektroforezy w polu pulsującym. L1: drabinka DNA Quick-load 1 kb; L2: rozszerzona drabinka DNA Quick-load 1 kb. 1-8: DNA o różnych czasach przejścia przez igłę podczas ścinania. 1-3, brak ścinania; 4, 10 razy; 5, 20 razy; 6, 30 razy; 7, 40 razy; 8, 50 razy. Ten etap kontroli jakości jest opcjonalny. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres porównawczy procentowego udziału zasad DNA, długość (Kb) względem procenta względnego, analiza danych eksperymentalnych.
Rycina 5: Oczekiwane rozkłady rozmiarów bibliotek ultra-długiego DNA do sekwencjonowania nanoporowego. MS, biblioteki otrzymane w drodze mechanicznego ścinania. TF, biblioteki otrzymane poprzez fragmentację za pomocą transpozazy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Mechaniczne ścinanie_rep1Mechaniczne ścinanie_rep2Fragmentacja transpozazą_rep1Fragmentacja transpozazą_rep2
Linia komórkowaHG00733HG00733HG00733HG00733
N50 odczytów55,18063,00798,23795,629
Liczba odczytów dłuższych niż 100 Kb2,5003,0822,3862,355
Całkowita liczba odczytów97,85980,46524,16621,032
Maksymalna długość (bp)348,482387,113454,660489,426
Średnia długość (bp)17,86120,39533,52838,175
Mediana długości (bp)5,3355,89410,24915,656
Średnia jakość odczytów10.010.19.910.0
Całkowita liczba zasad w surowych odczytach1,747,849,8221,641,058,932810,229,733802,886,304
Całkowita liczba zasad w dopasowanych odczytach1,693,300,8321,607,975,925791,422,077778,417,627
Stosunek mapowania całkowitej liczby zasad (hg19, Minimap2)96.9%98.0%97.7%97.0%
Liczba aktywnych porów1225: 480, 402, 254, 891058: 480, 356, 176, 46958: 452, 328, 148, 301092: 487, 367, 195, 43

Tabela 1: Podsumowanie wskaźników wydajności z serii pomiarowych z zastosowaniem różnych protokołów ścinania.

Biblioteka 1Biblioteka 2
Linia komórkowaK562GM19240
Informacje dotyczące zamawiania komórekATCC, nr kat. CCL-243Coriell Institute, nr kat. GM19240
Protokółścinanie mechaniczneścinanie mechaniczne
Wartość N50 odczytów60,06355,295
Całkowita liczba odczytów193,783120,807
Długość mediana (bp)1,8434,688
Średnia długość (bp)9,82517,408
Maksymalna długość (bp)548,780212,338
Całkowita liczba zasad surowych odczytów1,903,989,6862,103,015,331
Całkowita liczba zasad zmapowanych odczytów1,837,350,0471,997,419,761
Zmapowany stosunek całkowitej liczby zasad (hg19, Minimap2)96.6%95.0%
Liczba aktywnych porów1111: 482, 371, 203, 551032: 447, 333, 196, 56

Tabela uzupełniająca 1: Podsumowanie dwóch przebiegów NLR-seq z wykorzystaniem innych linii komórkowych przy zastosowaniu protokołu ścinania mechanicznego.

Dyskusja

Zasadniczo sekwencjonowanie nanoporowe jest w stanie wygenerować odczyty od 100 kb do megabazy o długości 11,12,13. Cztery główne czynniki będą miały wpływ na wydajność sekwencjonowania i jakość danych: 1) liczba aktywnych porów i aktywność porów; 2) białko motoryczne, które kontroluje prędkość DNA przechodzącego przez nanopory; 3) Matryca DNA (długość, czystość, jakość, masa); 4) skuteczność ligacji adaptera sekwencjonowania, która określa użyteczne DNA z próbki wejściowej. Pierwsze dwa czynniki zależą od wersji celi przepływowej i zestawu do sekwencjonowania dostarczonego przez producenta. Pozostałe dwa czynniki są krytycznymi etapami tego protokołu (ekstrakcja DNA HMW, ścinanie i ligacja).

Ten protokół wymaga cierpliwości i praktyki. Jakość DNA HMW jest ważna dla ultradługich bibliotek DNA6. Protokół rozpoczyna się od komórek pobranych z wysoką żywotnością (preferowana >85% żywotna komórka), co ogranicza degradację DNA z martwych komórek. Należy unikać wszelkich trudnych procesów, które mogą spowodować uszkodzenie DNA (np. silne zakłócenia, wstrząsy, wiry, wielokrotne pipetowanie, wielokrotne zamrażanie i rozmrażanie). W projekcie protokołu pomijamy pipetowanie w całym procesie ekstrakcji DNA. Końcówki o szerokim otworze muszą być używane, gdy pipetowanie jest konieczne po mechanicznym ścinaniu podczas budowy biblioteki i sekwencjonowania. Ponieważ nanopory są wrażliwe na substancje chemiczne w buforzekomory 12, w DNA powinno być jak najmniej zanieczyszczeń resztkowych (np. detergentów, środków powierzchniowo czynnych, fenolu, etanolu, białek RNA itp.). Biorąc pod uwagę długość i wydajność, metoda ekstrakcji fenolem daje najlepsze i najbardziej powtarzalne wyniki w porównaniu z wieloma różnymi testowanymi do tej pory metodami ekstrakcji.

Pomimo zdolności tego protokołu do tworzenia długich sekwencji odczytu, nadal pozostaje kilka ograniczeń. Po pierwsze, protokół ten został zoptymalizowany w oparciu o urządzenie do sekwencjonowania nanoporowego dostępne w momencie publikacji; W związku z tym jest ograniczony do selektywnej chemii sekwencjonowania opartej na nanoporach i może być nieoptymalny, gdy jest wykonywany w innych typach urządzeń do sekwencjonowania z długim odczytem. Po drugie, wynik w dużym stopniu zależy od jakości DNA wyekstrahowanego z materiału wyjściowego (tkanek lub komórek). Długość odczytu będzie zagrożona, jeśli początkowe DNA jest już zdegradowane lub uszkodzone. Po trzecie, chociaż w protokole uwzględniono wiele etapów kontroli jakości DNA w celu sprawdzenia jakości DNA, na ostateczną wydajność i długość odczytów może mieć wpływ aktywność komórki przepływowej i porów, która może być zmienna na tym wczesnym etapie rozwoju platformy sekwencjonowania nanoporowego.

Opisany tutaj protokół wykorzystuje próbki ludzkiej zawiesiny linii komórkowej do ekstrakcji DNA. Zoptymalizowaliśmy czasy przejścia podczas strzyżenia igły, stosunek DNA HMW do transpozazy oraz czas ligacji, aby uzyskać opisane wyniki. Protokół można rozbudować na cztery sposoby. Po pierwsze, użytkownicy mogą zacząć od innych hodowanych komórek ssaków i z różną ilością komórek, tkanek, próbek klinicznych lub innych organizmów. Konieczna będzie dalsza optymalizacja czasu inkubacji lizy, objętości reakcji i wirowania. Po drugie, trudno jest przewidzieć docelowy rozmiar dla bardzo długiego sekwencjonowania odczytu. Jeśli długości odczytu są krótsze niż oczekiwano, użytkownicy mogą dostosować czasy przejścia w metodzie mechanicznego opartej na ścinaniu lub zmienić stosunek DNA HMW do transpozazy w metodzie opartej na fragmentacji transpozy. Dłuższy czas wiązania i elucji podczas etapów oczyszczania jest pomocny, ponieważ DNA HMW jest bardzo lepkie. Po trzecie, za pomocą różnych urządzeń do sekwencjonowania nanoporowego można dostosować ilość i objętość DNA, aby spełnić kryteria sekwencera. Po czwarte, sekwencjonowane będzie tylko to DNA, które zostało zligowane za pomocą adapterów do sekwencjonowania. Aby jeszcze bardziej poprawić skuteczność ligacji, można spróbować miareczkować stężenie adaptera i ligazy. W przyszłości można zastosować zmodyfikowany czas ligacji i molekularne środki tłumiące, takie jak PEG18. Ultradługi protokół sekwencjonowania DNA w połączeniu z CRISPR19,20 może stanowić skuteczne narzędzie do sekwencjonowania wzbogacającego cel.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Autorzy dziękują Y. Zhu za jej komentarze do manuskryptu. Badania opisane w tej publikacji były częściowo wspierane przez National Cancer Institute of the National Institutes of Health w ramach nagrody numer P30CA034196. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów National Institutes of Health.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Reodczynniki
Absolute ethanolSigma-AldrichE7023
Agencourt AMPure XPbeads KulkiBeckmanA63881do czyszczenia
Konwencjonalne igły BDBecton Dickinson30513627G, do mechanicznego ścinania
Strzykawka BD Luer-LokBecton Dickinson309628do mechanicznego ścinania
Blunt/TA Ligase Master MixNEBM0367S Szkiełka
z komorą do liczenia komórek CountessInvitrogenC10228do zliczania komórek
EDTAInvitrogenAM9261pH 8,0, 0,5 m, 500 mL
Flow CellOxford Nanopore TechnologiesFLO-MIN106R9.4.1
HG00773 ogniwaCoriell InstytutHG00733komórek użytych w tym protokole
Zestaw do sekwencjonowania ligacji 1DOxford Nanopore TechnologiesSQK-LSK108Zestaw do ligacji nanoporowej
Probówki MaXtract o wysokiej gęstości Probówkiżelowe Qiagen129073
NEBNext FFPE DNA Repair MixNEBM6630S
NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing ModuleNEBM7546S
Woda wolna od nukleazInvitrogenAM9937
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami, PBSGibco 7001104410X, pH 7,4
Fenol:chloroform:IAAInvitrogenAM9730
Proteinaza KQiagen1913120 mg / ml
Zestaw testowy Qubit dsDNA BRInvitrogenQ32850do kwantyfikacji DNA
Zestaw do szybkiego sekwencjonowaniaOxford Nanopore TechnologiesSQK-RAD004do transpozazy nanoporowej
RNaza AQiagen19101100 mg/ml
SDSInvitrogenAM982210% (wt/vol)
Roztwór chlorku soduInvitrogenAM97595,0 M
bufor TEInvitrogenAM9849pH 8,0
TrisInvitrogenAM9856pH 8,0, 1 M
Triton X-100 roztwórSigma-Aldrich93443~10%
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
>Equipment
Bio-Rad C1000 Thermal CyclerWirówka Bio-Rad1851196EDU
5810REppendorf22628180
Countess II FL Automatyczny licznik komórekTechnologie żywotnościAMQAF1000do zliczania komórek
DynaMag-2 MagnetLife Technologies12321DStojak magnetyczny
Eppendorf ThermoMixerEppendorf5382000023do inkubacji
ZamrażarkaLabRepCoLHP-5-UFMB
GridIONOxford Nanopore TechnologiesGridION X5używane w tym protokole
Mieszalnik próbek HulaMixerMieszalnik rotatorówThermo Fisher Scientific15920D
MikrowirówkaBenchmark ScientificC1012
NanoDrop ND-1000Thermo Fisher ScientificND-1000do odczytu UV
Pippin PulseSage SciencePPI0200żelowy przyrząd do elektroforezy w polu pulsacyjnym
Fluorometr Qubit 3.0InvitrogenQ33216fluorometr
Lodówka LabRepCoLABHP-5-URBSS
Vortex-Genie 2Scientific IndustriesSI-A236
Łaźnia wodnaVWRNumer katalogowy: 89501-464
magnetyczne Testy fluorometryczne zestaw Urządzenie nanoporowe Spektrofotometr

Bibliografia

  1. Mardis, E. R. Next-generation sequencing platforms. Annual Review of Analytical Chemistry. 6, 287-303 (2013).
  2. Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies. Nature Reviews Genetics. 17 (6), 333-351 (2016).
  3. Shendure, J., et al. DNA sequencing at 40: past, present and future. Nature. 550 (7676), 345-353 (2017).
  4. Alkan, C., Coe, B. P., Eichler, E. E. Genome structural variation discovery and genotyping. Nature Reviews Genetics. 12 (5), 363-376 (2011).
  5. Weischenfeldt, J., Symmons, O., Spitz, F., Korbel, J. O. Phenotypic impact of genomic structural variation: insights from and for human disease. Nature Reviews Genetics. 14 (2), 125-138 (2013).
  6. Pollard, M. O., Gurdasani, D., Mentzer, A. J., Porter, T., Sandhu, M. S. Long reads: their purpose and place. Human Molecular Genetics. 27 (R2), R234-R241 (2018).
  7. Cretu Stancu, M., et al. Mapping and phasing of structural variation in patient genomes using nanopore sequencing. Nature Communications. 8 (1), 1326(2017).
  8. Gong, L., et al. Picky comprehensively detects high-resolution structural variants in nanopore long reads. Nature Methods. 15 (6), 455-460 (2018).
  9. Sedlazeck, F. J., et al. Accurate detection of complex structural variations using single-molecule sequencing. Nature Methods. 15 (6), 461-468 (2018).
  10. Jain, M., et al. Nanopore sequencing and assembly of a human genome with ultra-long reads. Nature Biotechnology. 36 (4), 338-345 (2018).
  11. Jain, M., et al. Improved data analysis for the MinION nanopore sequencer. Nature Methods. 12 (4), 351-356 (2015).
  12. Deamer, D., Akeson, M., Branton, D. Three decades of nanopore sequencing. Nature Biotechnology. 34 (5), 518-524 (2016).
  13. Jain, M., Olsen, H. E., Paten, B., Akeson, M. The Oxford Nanopore MinION: delivery of nanopore sequencing to the genomics community. Genome Biology. 17 (1), 239(2016).
  14. Editorial, The long view on sequencing. Nature Biotechnology. 36 (4), 287(2018).
  15. Jain, M., et al. Linear assembly of a human centromere on the Y chromosome. Nature Biotechnology. 36 (4), 321-323 (2018).
  16. Li, H. Minimap2: pairwise alignment for nucleotide sequences. Bioinformatics. 34, 3094-3100 (2018).
  17. De Coster, W., D'Hert, S., Schultz, D. T., Cruts, M., Van Broeckhoven, C. NanoPack: visualizing and processing long-read sequencing data. Bioinformatics. 34, 2666-2669 (2018).
  18. Akabayov, B., Akabayov, S. R., Lee, S. J., Wagner, G., Richardson, C. C. Impact of macromolecular crowding on DNA replication. Nature Communications. 4, 1615(2013).
  19. Gabrieli, T., Sharim, H., Michaeli, Y., Ebenstein, Y. Cas9-Assisted Targeting of CHromosome segments (CATCH) for targeted nanopore sequencing and optical genome mapping. bioRxiv. , (2017).
  20. Gabrieli, T., et al. Selective nanopore sequencing of human BRCA1 by Cas9-assisted targeting of chromosome segments (CATCH). Nucleic Acids Research. , (2018).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Sekwencjonowanie nanoporowewysokocz steczkowe DNAcinanie mechanicznefragmentacja transpozazprzygotowanie bibliotekiadowanie kom rki przep ywowejekstrakcja fenolowo chloroformowapulsacyjna elektroforeza elowadetekcja wariant w strukturalnych
Sekwencjonowanie z bardzo długim odczytem do analizy całego genomu DNA
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.