Test cytotoksyczności na płytce do oceny funkcji cytolitycznej komórek NK u szczurów łożyskowych

Podsumowanie

Tutaj przedstawiamy szczegółową metodologię izolowania i oceny cytotoksycznej funkcji komórek NK z łożysk za pomocą testu kolorymetrycznego na płytce. Szczurzy model niedokrwienia łożyska o obniżonym ciśnieniu perfuzji macicy został wybrany, aby zademonstrować izolację za pośrednictwem przeciwciał i ocenę cytotoksycznej funkcji komórek NK .

Streszczenie

Powszechnie wiadomo, że komórki NK odgrywają kluczową rolę w ustanowieniu i utrzymaniu prawidłowej ciąży. Ostatnie badania wykazały zmienioną populację krążących i dziesiętnych komórek NK u kobiet, które cierpią z powodu niekorzystnych powikłań ciąży, takich jak nawracające poronienia i stan przedrzucawkowy. Badania naszej grupy wykazały, że nadciśnienie tętnicze w ciąży wiąże się ze zwiększoną populacją aktywowanych komórek NK w łożysku w oparciu o ekspresję markerów aktywacji powierzchniowej. Niniejszy manuskrypt zawiera szczegółowy protokół oceny cytotoksycznej funkcji komórek NK wyizolowanych z łożysk w zwierzęcym modelu przypominającym stan przedrzucawkowy chirurgicznie wywołanego niedokrwienia łożyska. Szczegółowo opisano następujące etapy: wytwarzanie zawiesiny pojedynczej komórki, izolację komórek NK, stymulację ex vivo, kokulturę efektora-komórki docelowej oraz test cytotoksyczności.

Wprowadzenie

Stan przedrzucawkowy to nadciśnieniowe zaburzenie ciąży charakteryzujące się ograniczeniem wzrostu płodu, uszkodzeniem narządów końcowych i przewlekłą aktywacją immunologiczną. Przewlekła aktywacja immunologiczna u kobiet ze stanem przedrzucawkowym prowadzi do zwiększenia cytokiny zapalnej krążącej i łożyskowej, braku równowagi w populacjach limfocytów T CD4 ⁺ i zwiększonej populacji aktywowanych komórek NK (Natural Killer Cells)¹. Badania opublikowane niedawno przez nasze laboratorium pokazują rolę komórek NK w powodowaniu niektórych patofizjologii związanych ze stanem przedrzucawkowym w szczurzym modelu stanu przedrzucawkowego ze zmniejszonym ciśnieniem perfuzji macicy (RUPP). Stosując cytometrię przepływową do pomiaru powierzchniowej ekspresji markerów aktywacji na komórkach NK, zaobserwowano zwiększoną populację aktywowanych komórek NK w krążeniu i łożyskach szczurów RUPP w porównaniu z normalnymi ciężarnymi (NP) szczurami².

Aby potwierdzić obserwacje cytometrii przepływowej, przeprowadzono badania funkcjonalne oceniające aktywność cytotoksyczną komórek NK wyizolowanych z łożysk szczurów NP i RUPP. Dostępnych jest kilka metod oceny funkcji cytotoksycznej cytotoksycznych limfocytów T CD8⁺ i komórek NK. Złotym standardem funkcjonalnej analizy cytotoksycznej jest test uwalniania chromu³. Inne wykorzystane protokoły to cytometria przepływowa⁴, cytometria obrazu⁵, uwalnianie kalceiny^6, a ostatnio bioluminescencja⁷. Ten film zawiera szczegółowy protokół dotyczący stosowania dobrze znanego testu uwalniania dehydrogenazy mleczanowej (LDH) do pomiaru funkcji cytotoksycznej komórek NK przy użyciu dostępnego na rynku zestawu do badania cytotoksyczności LDH.

Protokół

Wszystkie protokoły zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee w University of Mississippi Medical Center. Opieka nad zwierzętami i obchodzenie się z nimi były zgodne z wytycznymi National Institutes of Health dotyczącymi etycznego traktowania zwierząt.

1. Izolacja limfocytów z łożysk

1. Wyjąć jedno łożysko z macicy szczura (19. dzień ciąży) i umieścić w 10 mL lodowatego PBS⁸.
2. Położyć jedno łożysko na filtrze 100 µm i umieścić w szalce Petri zawierającej 13,5 mL RPMI oraz 1,5 mL FBS (objętość całkowita wynosi 15 mL). Używając płaskiej strony tłoka strzykawki, przepchnąć łożysko przez filtr do szalki Petri.
3. Przygotować trzy stożkowe probówki 15 mL dla każdej tkanki. Do każdej probówki dodać 3 mL medium do gradientu gęstości (patrz Tabela materiałów), a następnie ostrożnie nanieść 5 mL homogenizowanego łożyska na wierzch w każdej probówce.
4. Wirować przez 25 min przy 300 x g w temperaturze pokojowej (RT) bez hamowania. zebrać cienką, białą warstwę leukocytarną (buffy coat) za pomocą pipety transferowej.
   UWAGA: Po wirowaniu widoczne są 3 warstwy: czerwone RPMI na górze, biała warstwa leukocytarna w środku i przejrzysta warstwa medium do gradientu gęstości na dole. Użyć pipety transferowej, aby pobrać białą warstwę leukocytarną z probówki. Połączyć warstwy leukocytarne ze wszystkich probówek pochodzących z tego samego łożyska w jednej probówce.
5. Do połączonych warstw leukocytarnych dodać 10 mL RPMI. Wirować przez 10 min, 300 x g, w temperaturze 4 °C i odrzucić nadsącz.

2. Izolacja komórek Natural Killer

1. Resuspendować osad komórkowy w 50 μL lodowatego PBS
2. Do osadu komórkowego należy dodać przeciwciało anty-CD3 znakowane biotyną zgodnie z protokołem producenta i dokładnie wymieszać za pomocą pipety. Probówkę należy umieścić w rotatorze i inkubować przez 20 min w temperaturze 4 °C.
3. Dodać 1 ml medium RPMI, odwirować przez 10 min przy 400 x g i 4 °Ci odrzucić nadosad.
4. Resuspendować osad w 1 ml RPMI i połączyć z 150 μL kulek magnetycznych w probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml. Umieścić probówkę w rotatorze do probówek i inkubować przez 30 min przy ciągłym obracaniu w temperaturze 4 °C.
   UWAGA: Wyjąć w tym momencie bufor uwalniający i pozostawić go w komorze z laminarnym przepływem powietrza do osiągnięcia temperatury pokojowej.
5. Umieść probówki w magnesie na 1 min. Zbierz nadsącz i przechowuj populację komórek CD3- w probówce 15 ml w lodzie.
   UWAGA: To jest CD3^- populacja komórek.
6. Wyjąć probówkę z magnesu i dodać 1 ml pożywki RPMI. Pomieszać komórki i kulki pięciokrotnie za pomocą pipety.
7. Powtórz krok 2.5.
8. Odwiruj CD3^- populację komórek przez 10 min przy 400 x g i 4 °C i odrzucić nadsącz. Osad komórkowy zawiesić ponownie w 50 μL lodowatego PBS
9. Dodać przeciwciało anty-CD161a znakowane biotyną do CD3^- komórki zgodnie z protokołem producenta i dokładnie wymieszać. Umieścić probówkę w rotatorze do probówek i inkubować przez 20 min w temperaturze 4 °C.
10. Dodać 1 ml RPMI, odwirować przez 10 min przy 400 x g i 4 °Ci odrzuć nadsącz. Przesuś osad w 1 ml pożywki RPMI i połącz z 150 μL kulek magnetycznych w probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml.
11. Umieść probówkę do mikrocentryfugi w rotatorze do probówek i inkubuj przy jednoczesnym obracaniu przez 30 min w temperaturze 4 °C.
12. Umieść probówki w magnesie na 1 min. Zbierz nadsącz i odrzuć CD3.^-/CD161a^- komórki
13. Wyjąć probówkę z magnesu i dodać 1 ml pożywki RPMI. Wymieszać komórki i kuleczki pięciokrotnie za pomocą pipety.
14. Powtórz krok 2.12.
15. Wyjąć probówki do mikrocentryfugi z magnesu i dodać 1 ml buforu RT Release. Umieścić probówkę w rotatorze i inkubować przez 15 min w temperaturze pokojowej podczas obracania.
16. Umieścić probówki w magnesie na 1 minutę. Zebrać nadsącz do nowej probówki stożkowej o pojemności 15 ml i przechowywać w lodzie.
    UWAGA: Jest to populacja komórek NK.
17. Wyjąć probówkę z magnesu i dodać 1 ml medium RPMI w temperaturze pokojowej. Wymieszać komórki i kulki pięciokrotnie za pomocą pipety.
18. Powtórz krok 2.16, przenosząc nadsącz do tej samej probówki. Wymieszaj dokładnie i pobierz 20 μL próbka do zliczania komórek
    UWAGA: Przechowywać probówkę w lodzie.
19. Wirowanie CD3^-/CD161a⁺ komórki przez 10 min, 400 x g g w 4 °Cnastępnie usunąć nadsącz. Resuspender komórki w pożywce RPMI (10% FBS, 1% Pen/Strep, 2 ng/ml IL-2) i wysiać w stężeniu 3 x 10⁵ komórek/dołek w płytce 6-dołkowej w 2,5 ml pożywki do aktywacji komórek NK. Inkubować komórki przez 48 h w temperaturze 37 °C, 5% CO2₂ w inkubatorze z nawilżaczem.

3. Test cytotoksyczności: odzyskiwanie komórek NK lub YAC1 z hodowli lub pasażowanie komórek

UWAGA: Wszystkie etapy należy przeprowadzać w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Wszystkie probówki z komórkami muszą być przez cały czas przechowywane w lodzie.

1. Za pomocą szklanej pipety serologicznej zebrać komórki YAC1 wraz z pożywką z kolby, przenieść do probówki 50 mL w lodzie i dobrze wymieszać. Odpiąć 20 µL w celu policzenia komórek.
2. Wirować komórki YAC1 przez 10 min przy 300 x g i 4 °C. Policzyć komórki podczas wirowania.
3. Do każdego dołka płytki 6-dołkowej z komórkami NK dodać trypsynę/EDTA. Opukać płytkę i umieścić w inkubatorze.
4. Po inkubacji komórek z trypsyną/EDTA przez ok. 5 min w 37 °C, zeskrobać zawartość płytki/kolby za pomocą sterylnego skrobaka do płytek. Do każdego dołka dodać 1 mL pożywki do komórek NK.
5. Zebrać komórki wraz z pożywką za pomocą pipety serologicznej i przenieść do probówki wirówkowej 15 mL. Odpiąć 20 µL w celu policzenia komórek.
6. Wirować komórki NK przez 10 min przy 400 x g w 4 °C. Podczas wirowania policzyć próbkę komórek z kroku 3.5.
   UWAGA: Przed wyrzuceniem płytek z hodowlą obejrzeć je pod mikroskopem, aby upewnić się, że do dna dołków nie przylgnęły już żadne komórki. Ponieważ w eksperymencie wykorzystuje się komórki NK i komórki YAC1, należy policzyć każdą z nich oddzielnie.
7. Policzyć komórki i resuspender do stężeń ustalonych w próbach optymalizacyjnych, aby przetestować odpowiedni stosunek liczby komórek docelowych do efektorowych. Zostanie to osiągnięte poprzez resuspensję osadu w odpowiednich pożywkach w celu uzyskania następujących stężeń komórek: YAC1 w stężeniu 4 x 10⁵ komórek/mL oraz komórki NK w stężeniu 2 x 10⁷ komórek/mL.

4. Test cytotoksyczności: Protokół badania

1. Użyj 96-dołkowej płytki o okrągłym dnie, przeznaczonej do hodowli komórek, aby przygotować układ zgodnie z sugestiami w Tabeli 1. Tabela ta przedstawia kontrole eksperymentalne oraz 3 zestawy kolumn eksperymentalnych dla komórek NK. Układ ten można rozszerzyć do maksymalnie 10 kolumn eksperymentalnych NK na jednej płytce 96-dołkowej.
2. Wiruj płytkę testową z prędkością 250 x g przez 4 min, aby upewnić się, że komórki efektorowe i komórki docelowe są w kontakcie. Inkubuj płytkę 96-dołkową przez 5 godzin w wilgotnej komorze inkubatora w temperaturze 37 °C i 5% CO₂, aby zapewnić wystarczający kontakt między komórkami docelowymi a efektorowymi oraz lizę komórek docelowych przez komórki efektorowe.
   UWAGA: Protokół można w tym miejscu przerwać.
3. Na 45 min przed pobraniem naddatków dodaj 10 µL 10x Lysis Solution do dołków Maksymalnego Uwolnienia LDH z Komórek Docelowych (dołki 1E, 1F, 1G i 1H) i umieść płytkę z powrotem w wilgotnej komorze.
4. Po zakończeniu czasu inkubacji wiruj płytkę z prędkością 250 x g przez 4 min. Za pomocą pipety wielokanałowej przenieś aliquoty o objętości 50 µL ze wszystkich dołków do nowej 96-dołkowej płytki testowej o płaskim dnie.
   UWAGA: Nie dotykaj dna dołków, aby uniknąć przeniesienia komórek do nowej płytki testowej. Jako nowej płytki testowej nie używaj płytki przeznaczonej do hodowli komórek.
5. Przygotowanie Odczynnika Testowego.
   1. Po osiągnięciu przez Assay Buffer temperatury pokojowej dodaj 12 mL Assay Buffer do jednej butelki Substrate Mix. Odwracaj i delikatnie wstrząsaj do całkowitego rozpuszczenia. Jedna butelka wystarcza na dwie płytki 96-dołkowe.
      UWAGA: Assay Buffer należy chronić przed światłem podczas rozmrażania. Wymieszaj bezpośrednio przed użyciem.
6. Dodaj 50 µL Odczynnika Testowego do wszystkich dołków na płytce testowej z kroku 4.6. Przykryj płytkę folią, aby chronić ją przed światłem, i inkubuj przez 30 min w temperaturze pokojowej.
   UWAGA: Świeżo przygotowany Odczynnik Testowy należy przechowywać w zamrażarce. Odczynnik jest stabilny przez około 8 tygodni.
7. Dodaj 50 µL Stop Solution do każdego dołka. Odczytaj wyniki z płytki w ciągu 1 godziny po dodaniu Stop Solution i zarejestruj absorbancję przy 490 nm. Reprezentatywne dane przedstawiono w Tabeli 2.

5. Obliczanie wyników

1. Obliczyć średnią wartość absorbancji dla dołków tła pożywki hodowlanej i odjąć ją od wszystkich wartości absorbancji dla dołków eksperymentalnych, dołków spontanicznego uwalniania LDH przez komórki docelowe oraz dołków spontanicznego uwalniania LDH przez komórki efektorowe.
2. Obliczyć średnie wartości absorbancji dla dołków kontroli korekcji objętości i odjąć je od wartości absorbancji uzyskanych dla dołków kontroli maksymalnego uwalniania LDH przez komórki docelowe.
3. Wykorzystać skorygowane wartości z kroków 5.1 i 5.2 w poniższym wzorze, aby obliczyć procent cytotoksyczności dla każdego dołka z układem efektor:komórka docelowa.
   

Wyniki

Łożyskowe komórki NK uzyskane od szczurów NP i RUPP były inkubowane przez 5 godzin z komórkami docelowymi w odpowiednich pożywkach w stosunku 50:1 (NK:target). Absorbancję zarejestrowano przy długości fali 490 nm, a surowe dane przedstawiono w tabeli 2. Obliczono średnią absorbancję studzienek kontrolnych tła pożywki hodowlanej i korekcji objętości. Średnie te zostały odjęte od odpowiednich studzienek wskazanych w protokole producenta i są przedstawione w tabeli 3. Skorygowane wartości w...

Dyskusja

Istnieje kilka ważnych kluczowych uwag, które należy wziąć pod uwagę, aby uzyskać optymalne wyniki. Bardzo ważna jest sterylność wykorzystywanych komórek. Po pobraniu łożyska ważne jest, aby przygotowanie i izolacja komórek NK zostały przeprowadzone w sterylnych warunkach w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Ponadto, ponieważ wszystkie komórki uwalniają LDH po uszkodzeniu komórki, należy zadbać o uzyskanie wysokiej żywotności komórek NK po izolacji i podczas procesu kohodowli. Zbyt duże spontaniczne uwalnianie LDH z k...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1,5 ml probówka Eppendorfa	Fisher	5408129
100 µ L Filtr	Fisher	22363549	Nylon Mesh
15 ml rurka stożkowa	Fisher	0553859A
		7203510
6-dołkowa płytka do hodowli komórkowych	Corning	720083
			Okrągłodenny
skrobak do komórek AOPI	Nexcelom	CS201065ML
	Celometr Fisher	8100241
Jednorazowe komory liczeniowe	Nexcelom	CHT4-SD100
Celometr Cytometr	Nexcelom N/	A
Cytotox 96 Zestaw do oznaczania cytotoksyczności nieradioaktywnej	Promega	G1780
Dynabeads Flowcomp Flexi Kit	Invitrogen	11061D
DynaMag-2 Magnet	Invitrogen	12321D
EDTA	Sigma Aldrich	EDS-100G
FBS	Atlanta Biologicals	S11150H
Rurka do cytometrii przepływowej	Corning	352008
Lymphoprep	Fisher	NC0460539	Gradient gęstości Średni; 4 x 250 ml
PBS	Fisher	SH3025801	10 x 500 ml
Penicylina/Streptomycyna	Gibco	15140122
szalki Petriego	Fisher	9720500	Bez podkładki
Oczyszczona mysz anty-szczura CD161a	BD Biosciences	555006
Oczyszczona mysz anty-szczura CD3	BD Biosciences	554829
Rekombinowany szczur IŁ-2	R& D Systems	502-RL
RPMI	Gibco	11875135	1640 Medium
T25 kolba	Corning	430639
Trypsin	ThermoFisher	15090046
YAC-1 komórka		ATCC TIB-160

Strzykawka 3 ml Fisher 14823436 50 ml stożkowa rurka Fisher 96-dołkowa płytka do hodowli tkankowej CELLTREAT 229190 Sterylny, obrazowy