Artykuł metodologiczny

Skuteczne różnicowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w komórki wątroby

DOI:

10.3791/58975

⸱

11 czerwca 2019

 ,  , 
1Institute for Stem Cell Biology & Regenerative Medicine, Stanford-UC Berkeley Siebel Stem Cell Institute, Stanford University School of Medicine, 2Department of Developmental Biology, Stanford University School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje monowarstwową, pozbawioną surowicy metodę efektywnego generowania komórek podobnych do hepatocytów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) w ciągu 18 dni. Obejmuje to sześć etapów, w których hPSC sekwencyjnie różnicują się w pośrednie typy komórek, takie jak prymitywna smuga, ostateczna endoderma, tylne jelito przednie i progenitorzy zawiązków wątroby, zanim utworzą komórki podobne do hepatocytów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wątroba detoksykuje szkodliwe substancje, wydziela niezbędne białka i wykonuje kluczowe czynności metaboliczne, podtrzymując w ten sposób życie. W związku z tym niewydolność wątroby - która może być spowodowana przewlekłym spożyciem alkoholu, zapaleniem wątroby, ostrym zatruciem lub innymi urazami - jest ciężkim stanem, który może zakończyć się krwawieniem, żółtaczką, śpiączką i ostatecznie śmiercią. Jednak podejścia do leczenia niewydolności wątroby, a także badania nad funkcją i chorobami wątroby, zostały częściowo utrudnione przez brak obfitego zaopatrzenia w ludzkie komórki wątroby. W tym celu protokół ten szczegółowo opisuje skuteczne różnicowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) w komórki podobne do hepatocytów, kierując się rozwojową mapą drogową, która opisuje, w jaki sposób los wątroby jest określany w sześciu kolejnych etapach różnicowania. Manipulując rozwojowymi szlakami sygnałowymi w celu promowania różnicowania wątroby i wyraźnego hamowania tworzenia się niepożądanych losów komórek, metoda ta skutecznie generuje populacje ludzkich komórek progenitorowych pączków wątroby i komórek podobnych do hepatocytów odpowiednio w 6 i 18 dniu różnicowania PSC. Osiąga się to poprzez czasowo precyzyjną kontrolę rozwojowych szlaków sygnałowych, wywieranych przez małe cząsteczki i czynniki wzrostu w pożywce hodowlanej bez surowicy. Różnicowanie w tym systemie zachodzi w monowarstwach i daje komórki podobne do hepatocytów, które wyrażają charakterystyczne enzymy hepatocytowe i mają zdolność do wszczepienia mysiego modelu przewlekłej niewydolności wątroby. Zdolność do wydajnego generowania dużej liczby ludzkich komórek wątroby in vitro ma konsekwencje w leczeniu niewydolności wątroby, badaniach przesiewowych leków i mechanistycznych badaniach chorób wątroby.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem tego protokołu jest efektywne różnicowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) na wzbogacone populacje komórek progenitorowych zawiązków wątroby i komórek podobnych do hepatocytów2. Dostęp do gotowego zapasu ludzkich komórek progenitorowych wątroby i komórek podobnych do hepatocytów przyspieszy wysiłki zmierzające do zbadania funkcji i chorób wątroby oraz może umożliwić nowe terapie przeszczepów komórkowych w przypadku niewydolności wątroby3,4,5. W przeszłości okazało się to wyzwaniem, ponieważ hPSC (które obejmują embrionalne i indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste) mogą różnicować się we wszystkich typach komórek ludzkiego ciała; W związku z tym trudno było je wyłącznie zróżnicować w czystą populację jednego typu komórek, takich jak komórki wątroby6.

Aby precyzyjnie rozróżnić hPSC na komórki wątroby, najpierw ważne jest zrozumienie nie tylko, jak komórki wątroby są określane, ale także jak rozwijają się typy komórek niezwiązanych z wątrobą. Wiedza o tym, jak rozwijają się komórki inne niż wątroba, jest ważna dla logicznego zahamowania tworzenia się linii niezwiązanych z wątrobą podczas różnicowania, kierując w ten sposób wyłącznie hPSC w kierunku losu wątroby2. Po drugie, konieczne jest nakreślenie wielu etapów rozwojowych, w których hPSC różnicują się w kierunku losu wątroby. Wiadomo, że hPSC sekwencyjnie różnicują się w wiele typów komórek znanych jako prymitywna smuga (APS), ostateczna endoderma (DE), tylne jelito przednie (PFG) i komórki progenitorowe zawiązków wątroby (LB) przed utworzeniem komórek podobnych do hepatocytów (HEP). Wcześniejsze prace ujawniły sygnały określające los wątroby oraz sygnały, które hamowały tworzenie się alternatywnych typów komórek niezwiązanych z wątrobą (w tym komórek progenitorowych żołądka, trzustki i jelit) w każdej wybranej linii rozwojowej2,7,8.

Łącznie, te spostrzeżenia dały początek bezsurowicy, jednowarstwowej metodzie różnicowania hPSC w kierunku prymitywnych smug, definitywnych endoderm, tylnego jelita przedniego, progenitorów pączków wątroby i wreszcie komórek podobnych do hepatocytów2. Ogólnie rzecz biorąc, metoda polega na wysiewie hPSC w monowarstwie o odpowiedniej gęstości, przygotowaniu sześciu koktajli pożywek różnicujących (zawierających czynniki wzrostu i małe cząsteczki, które regulują różne rozwojowe szlaki sygnałowe) i sekwencyjnym dodawaniu tych pożywek w celu wywołania różnicowania w ciągu 18 dni. Podczas tego procesu nie jest potrzebne pasażowanie komórek. Warto zauważyć, że ponieważ metoda ta wyraźnie obejmuje sygnały, które hamują tworzenie się komórek innych niż wątrobowe, to podejście różnicujące 1 bardziej efektywnie generuje komórki progenitorowe wątroby i komórki podobne do hepatocytów w porównaniu z istniejącymi metodami różnicowania2,9,10,11,12. Co więcej, protokół opisany w tym tekście umożliwia szybsze generowanie hepatocytów, które ostatecznie wyrażają wyższe poziomy wątrobowych czynników transkrypcyjnych i enzymów niż te wytwarzane przez inne protokoły9,10,11,12.

Opisany tutaj protokół ma pewne zalety w porównaniu z obecnymi protokołami różnicowania. Po pierwsze, pociąga za sobą jednowarstwowe różnicowanie hPSC, które jest technicznie prostsze w porównaniu z trójwymiarowymi metodami różnicowania, takimi jak te, które opierają się na ciałach embrionalnych13. Po drugie, metoda ta wykorzystuje niedawny postęp, dzięki któremu ostateczne komórki endodermy (wczesny prekursor komórek wątroby) mogą być skutecznie i szybko generowane w ciągu 2 dni od różnicowania hPSC2,7, umożliwiając w ten sposób późniejszą produkcję hepatocytów o zwiększonej czystości. Po trzecie, w porównaniach równoległych, komórki podobne do hepatocytów wytworzone tą metodą2 wytwarzają więcej albuminy i wyrażają wyższe poziomy wątrobowych czynników transkrypcyjnych i enzymów w porównaniu z hepatocytami wytwarzanymi innymi metodami10,11,12.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie mediów różnicujących

UWAGA: Zapoznaj się z Tabelą Materiałów, aby uzyskać informacje od producenta dotyczące użytych materiałów i odczynników.

  1. Przygotowanie bazowych pożywek zdefiniowanych chemicznie (CDM)
    UWAGA:     CDM2, CDM3, CDM4 i CDM5 są chemicznie zdefiniowanymi pożywkami, które są używane jako pożywki podstawowe do różnicowania hPSC do komórek wątroby na różnych etapach. Skład tych pożywek można znaleźć w tabeli 1.
    1. Aby zrobić CDM2 lub CDM3, przygotuj roztwór podstawowy zawierający alkohol poliwinylowy (PVA). Rozpuść 0,5 g proszku PVA w 50 ml zmodyfikowanego podłoża Dulbecco firmy Iscove (IMDM), aby uzyskać zapas 10 mg/ml PVA.
      nuta: Ponieważ PVA nie rozpuszcza się łatwo, mieszaninę PVA/IMDM należy przygotować w stożkowej kolbie, ciągle mieszając w temperaturze ~50 °C na poduszce grzewczej; Mieszanie można łatwo osiągnąć za pomocą mieszadła magnetycznego.
    2. Po jednorodnym rozpuszczeniu PVA w IMDM usuń roztwór PVA z poduszki grzewczej i pozwól mu ostygnąć do temperatury pokojowej.
    3. Użyj sterylnego filtra 0,2 μm do przefiltrowania roztworu PVA.
    4. Przygotuj CDM2 i CDM3, łącząc przefiltrowany PVA z kroku 1.1.1 i różne składniki zakupione w handlu, jak opisano w Tabeli 1 i Tabeli materiałów. Do filtrowania wszystkich mediów używaj sterylnych jednostek filtrujących 0,2 μm.
      nuta: Pożywka bazowa może być przechowywana w temperaturze 4 °C, ale nie dłużej niż 2 miesiące.
    5. Przygotuj pozostałe nośniki bazowe CDM4 i CDM5 zgodnie z tabelą 1.
  2. Przygotowanie pożywek różnicujących
    1. Aby przygotować roztwory podstawowe dla małych cząsteczek i czynników wzrostu, należy je rozpuścić zgodnie z zaleceniami producenta. Do przechowywania rozdzielić porcję do sterylnych probówek w celu skrócenia cykli zamrażania i rozmrażania i przechowywać w temperaturze -20 °C lub zgodnie z zaleceniami.
      nuta: Skład pożywki różnicującej, która ma być stosowana na różnych etapach różnicowania, opisano w tabeli 2 i w kolejnych krokach.
    2. Aby przygotować pożywkę różnicującą, należy najpierw rozmrozić zamrożone małe cząsteczki i/lub czynniki wzrostu w temperaturze pokojowej. Następnie podwielokrotnić wymaganą ilość podłoża bazowego. Na koniec należy przygotować końcowe pożywki różnicujące, dodając określone małe cząsteczki i czynniki wzrostu do podłoża bazowego w odpowiednich stężeniach (tabela 2).
      nuta: Świeżo przygotowane podłoże różnicujące najlepiej zużyć tego samego dnia; w przeciwnym razie można go przechowywać w temperaturze 4 °C i zużyć w ciągu trzech dni.
    3. Używając końcówki do pipety, wymieszaj pożywkę różnicującą kilka razy, aby upewnić się, że suplementy są jednorodnie rozprowadzone przed dodaniem pożywki do komórek (np. dodaj 1 ml pożywki różnicującej do każdego dołka na 12-dołkowej płytce).

2. Wysiewaj hPSC na płytki o określonych gęstościach w celu rozróżnienia

  1. Pokryj tworzywa sztuczne z kultur komórkowych, które będą używane do wysiewu, hPSC.
    1. Rozmrozić matrycę (np. Geltrex) w temperaturze 4 °C przez noc przed dniem użycia.
    2. Następnego dnia rozcieńczyć matrycę w stosunku 1:100, dodając 500 μl matrycy do 50 ml zimnej pożywki Modified Eagle's Medium (DMEM)/F12 firmy Dulbecco. Ponieważ matryca jest hydrożelem, który nieodwracalnie polimeryzuje pod wpływem temperatury pokojowej, podczas pracy z matrycą należy zawsze trzymać rurki i media matrycowe na lodzie.
    3. UWAGA: Matryca rozpuszczona w stosunku 1:100 w DMEM/F12 może być przechowywana w temperaturze 4 °C, ale powinna zostać zużyta w ciągu 2 miesięcy.
    4. Aby pokryć płytkę hodowlaną matrycą, należy pipetować rozcieńczoną matrycę do wymaganej liczby dołków, używając tylko takiej objętości roztworu matrycy, aby pokryć powierzchnię studzienki (np. dodać 0,5 ml matrycy do jednego dołka na płytce 12-dołkowej lub 1 ml do jednego dołka na płytce 6-dołkowej). W razie potrzeby delikatnie potrząśnij płytką, aby upewnić się, że roztwór matrycy całkowicie pokrył dno studzienki.
    5. Pozostawić płytkę pokrytą matrycą w inkubatorze o temperaturze 37 °C na co najmniej 60 minut. W tej temperaturze matryca polimeryzuje, tworząc cienką warstwę na dnie studni.
    6. UWAGA: Płytki pokryte matrycą można przechowywać w inkubatorze w temperaturze 37 °C i zużyć w ciągu 3 dni, dopóki matryca nie wyschnie.
    7. Odessać pozostały roztwór matrycy z powlekanych studzienek bezpośrednio przed zasianiem studzienek hPSC.
  2. Pasażowanie i wysiewanie powlekanych płytek za pomocą hPSCUWAGA: Środek dysocjacyjny zawiera enzymy, które dysocjują komórki i ważne jest, aby pozostawić hPSC w środku dysocjacyjnym na jak najkrótszy czas.
    1. Aby wysiać płytki hodowlane pokryte matrycą z hPSC przed różnicowaniem, należy wyhodować niezróżnicowane hPSC do >70% konfluencji w dostępnym na rynku podłożu mTeSR1 (tabela materiałów) zgodnie z protokołem producenta. Bardzo ważne jest, aby przejść przez hPSC, zanim staną się one w pełni zlewne, ponieważ hPSC mogą spontanicznie różnicować się przy dużej konfluencji.
      UWAGA: hPSC muszą być kariotypowane, aby upewnić się, że nie ma żadnych nieprawidłowości chromosomalnych przed użyciem ich do eksperymentów. Komórki hPSC użyte w tym protokole różnicowania utrzymywano w pożywkach mTeSR1 i pasażowano w postaci grudek z EDTA w celu zminimalizowania nieprawidłowości kariotypowych. Nieprawidłowe kariotypowo hPSC nie powinny być wykorzystywane do różnicowania, ponieważ mogą one rozprzestrzeniać się nieprawidłowo szybko; Tak więc zalecane tutaj gęstości zasiewu komórek nie są odpowiednie dla komórek nieprawidłowych kariotypowo.
    2. Aby wysiać hPSC w celu różnicowania, odessać mTeSR1 z płytki kultur hPSC w dużej mierze zlewających się i dodać komercyjnie zakupiony środek dysocjacyjny (Tabela materiałów) w celu dysocjacji hPSC, używając tylko tyle środka dysocjacyjnego, aby pokryć powierzchnię studzienki lub naczynia, na którym rosną komórki (np. dodać 0,5 ml środka dysocjacyjnego na dołek płytki 12-dołkowej, 1 ml na zagłębienie na płytkę 6-dołkową lub 3 ml na 10 cm naczynie).
    3. Inkubować hPSC w czynniku dysocjacyjnym w temperaturze 37 °C przez 5 minut lub do momentu, gdy niektóre kolonie zaczną się odłączać. Delikatnie postukaj kilka razy w dno studzienki/talerza; po kilku minutach dysocjacji większość kolonii hPSC powinna swobodnie wejść w stan zawieszenia.
    4. Aby usunąć zdysocjowane hPSC z płytki, dodaj 2 ml / dołek DMEM / F12 w przypadku pracy z płytką 6-dołkową (lub 1 ml / dołek w przypadku pracy z płytką 12-dołkową) w celu rozcieńczenia środka dysocjacyjnego. Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 ml delikatnie pipetować w górę i w dół wiele razy, aby zmyć wszystkie komórki z powierzchni studzienki; zebrać zawieszone pojedyncze komórki w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Umyć płytkę po raz drugi tą samą objętością DMEM/F12, aby zapewnić odzysk wszystkich hPSC.
    5. Do stożkowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej komórki dodać DMEM/F12 w celu rozcieńczenia pierwotnej objętości środka dysocjującego w stosunku 1:5-1:10 (np. jeśli pierwotna objętość środka dysocjującego wynosiła 1 ml, dostosować całkowitą objętość zawiesiny komórek do 10 ml za pomocą DMEM/F12, aby rozcieńczyć środek dysocjujący w stosunku 1:10)
    6. Odwirować zebrane hPSC w stożkowej probówce o pojemności 50 ml o masie 350 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C do osadzania komórek.
    7. Czekając, aż komórki się osadzą, odessaj matrycę z płytki, w której zostaną wysiane hPSCS. Następnie dodaj wystarczającą ilość mTesR1 uzupełnioną 1 μM uzyskanego komercyjnie tiazowiwiny (farmakologicznego inhibitora ROCK) do dołków biorców, aby je pokryć (np. Dodaj 0,5 ml mTeSR1 na dołek 12-dołkowej płytki lub 1 ml mTeSR1 na dołek 6-dołkowej płytki).
      nuta: Tiazowina w niskim stężeniu jest włączana na tym etapie w celu zwiększenia przeżywalności pojedynczych komórek, a tym samym późniejszej gęstości wysiewu hPSC.
    8. Po odwirowaniu hPSC ostrożnie zassać supernatant, pozostawiając granulowane hPSC na dnie stożkowej probówki. Supernatant zawiera czynnik dysocjacyjny, który hamuje późniejszą adhezję hPSC, dlatego ważne jest, aby przed kontynuowaniem odessać zdecydowaną większość supernatantu.
    9. Zawiesić osad komórkowy w mTeSR1 uzupełnionym 1 μM tiazowiwiny. Za pomocą pipety p1000 delikatnie rozetrzyj 2-3 razy, aby równomiernie zawiesić osad komórek w zawiesinie pojedynczej komórki. Nie należy nadmiernie rozcierać osadu komórkowego, ponieważ nadmierna siła mechaniczna uszkodzi hPSC i doprowadzi do słabej przeżywalności komórek.
    10. Po ponownym zawieszeniu hPSC należy natychmiast odpipetować 10 μl zawiesiny do hemocytometru i policzyć liczbę komórek. Ważne jest, aby pipetować komórki do liczenia tak szybko, jak to możliwe, ponieważ grawitacja doprowadzi do naturalnego osadzania się hPSC na dnie probówki o pojemności 50 ml, co zakłóci dokładne liczenie komórek.
    11. Dostosuj objętość ponownie zawieszonych hPSC za pomocą mTeSR1 uzupełnionego tiazowiwiną, aby osiągnąć pożądane stężenie komórek do posiewu. Na przykład, po dostosowaniu objętości ponownie zawieszonych hPSC, dodaj 0,5 ml zawiesiny komórek na studzienkę, aby wysiać 160 000-250 000 komórek do każdej studzienki 12-dołkowej płytki, uzyskując w ten sposób całkowitą objętość 1 ml w każdym dołku (0,5 ml pożywki dodano do dołka w kroku 2.2.7). Jeśli używane są większe lub mniejsze studzienki, odpowiednio zwiększaj lub zmniejszaj liczbę komórek/objętość mediów.
      nuta: Ważne jest, aby wysiewać hPSC we wskazanej gęstości komórek. Nadmiernie zlewające się hPSC nie będą się skutecznie różnicować, a niedostatecznie zlewające się hPSC nie przetrwają dobrze podczas różnicowania.
    12. Potrząśnij płytką na krzyż (w lewo, następnie w prawo; do przodu, a następnie do tyłu) kilka razy, aby upewnić się, że komórki są równomiernie rozmieszczone na płytce/dołku. Nie obracaj płytki ruchem okrężnym, ponieważ komórki osiądą na środku płytki/studzienki. Zazwyczaj hPSC zaczynają przylegać do powierzchni studni w ciągu ~3-30 minut. Pozwól komórkom rosnąć przez co najmniej 24 godziny przed rozpoczęciem różnicowania.

3. Różnicowanie hPSC na komórki endodermalne i progenitory wątroby

  1. Po posiewie hPSC przez co najmniej 24 godziny (zgodnie z opisem w kroku 2.2.12), przed przystąpieniem do różnicowania, należy sprawdzić morfologię komórek pod mikroskopem z kontrastem fazowym, ze szczególnym naciskiem na średnicę i gęstość posianych kolonii hPSC.
    nuta: Idealnie byłoby, gdyby kępy były łatwo rozmieszczone i miały odpowiednią wielkość i gęstość w całym dołku przed etapem 3.2. Duże (około >400 μm) lub małe kolonie (około <200 μm) hPSC nie nadają się do różnicowania (Rysunek 4). Sygnały różnicowania nie będą działać równomiernie w dużych koloniach hPSC, co prowadzi do nieefektywnego różnicowania. Kolonie, które są zbyt małe, nie przeżywają dobrze w ciągu pierwszych 3 dni różnicowania hPSC w tym protokole różnicowania. Jeśli gęstość wysianych hPSC jest prawidłowa, kolonie hPSC często tworzą "mosty" komórek między nimi, a ogólna konfluencja wyniesie ~ 30-50% przed dodaniem pożywki różnicującej dnia 1 (Rysunek 4).
  2. Jeśli rozmiary kolonii są idealne w kroku 3.1, przejdź do pierwszego dnia różnicowania, które pociąga za sobą różnicowanie hPSC w przednią prążek prymitywną (APS).
  3. Przygotować pożywkę do różnicowania APS z dnia 1., mieszając wszystkie odczynniki wymienione w tabeli 2, używając CDM 2 (tabela 1 i sekcja 1.2) jako pożywki bazowej. Odpipetować do kilkukrotnego wymieszania, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie składników w podłożu.
  4. Odessać w celu usunięcia mTeSR1 z tiazowiiną z posianych hPSC i krótko przemyć hPSC pożywką IMDM. Nie myć solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) zamiast IMDM, ponieważ PBS nie zawiera jonów wapnia (Ca2+) i dlatego jest toksyczny dla hPSC; To zakłóci morfologię komórki.
  5. Po krótkim przemyciu IMDM dodaj pożywkę z dnia 1 do hPSC. Zapisać czas i umieścić komórki z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C
  6. Kontynuuj kolejne etapy różnicowania, przygotowując (Tabela 2) i dodając odpowiednią pożywkę różnicującą do komórek w odpowiednich dniach (w odstępach 24-godzinnych) różnicowania mniej więcej o tej samej porze dnia (Ryc. 1). Codziennie zastępuj je świeżymi pożywkami, nawet jeśli w kolejnych dniach różnicowania używane są te same podłoża różnicujące. Pomiędzy wymianami pożywki należy raz umyć ogniwa pożywką IMDM, aby usunąć martwe komórki i resztki poprzednich składników pożywki.
  7. W miarę jak różnicowanie postępuje poza etap zawiązków wątroby, liczba komórek wzrasta, a co za tym idzie, dodaj więcej pożywki do każdej studzienki płytki, aby upewnić się, że ilość czynników różnicujących i składników odżywczych nie jest ograniczona. Na przykład, dodaj 1 ml pożywki różnicującej do każdej pożywki 12-dołkowej początkowo w dniach od 1 do 6 różnicowania, ale dodaj 1,5-2 ml kolejnych pożywek różnicujących w późniejszych dniach różnicowania (dni od 7 do 18 różnicowania).

4. Charakterystyka komórek endodermalnych i progenitorów wątroby za pomocą barwienia immunologicznego

  1. Przygotuj bufor blokujący: 10% surowicy osła + 0,1% Triton X100 w dejonizowanym roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (DPBS).
  2. Przygotuj bufor barwiący: 1% surowicy osła + 0,1% Triton X100 w DPBS.
  3. Odessać pożywkę z komórek na płytce 12-dołkowej.
  4. Dodaj 4% paraformaldehydu (w DPBS) przez 15 minut w temperaturze pokojowej, aby utrwalić komórki, a następnie dwukrotnie umyj komórki DPBS.
  5. Dodaj bufor blokujący na 1 godzinę w temperaturze pokojowej, aby zablokować i przepuszczalnie stałe komórki.
  6. Odessać roztwór blokujący i dodać pierwszorzędowe przeciwciało rozcieńczone w buforze barwiącym. (Patrz Tabela materiałów, aby zapoznać się ze stosunkami rozcieńczenia przeciwciał.)
  7. Wybarwić komórki przez noc w temperaturze 4 °C.
  8. Umyj ogniwa trzykrotnie 0,1% Triton X100 w DPBS.
  9. Dodać wtórne barwienie przeciwciałami do buforu barwiącego przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. (Patrz Tabela materiałów dla rozcieńczeń przeciwciał drugorzędowych.)
  10. Usuń przeciwciało wtórne i dodaj DAPI na 5 minut w temperaturze pokojowej, aby przeprowadzić przeciwbarwienie jądrowe.
  11. Przemyć dwukrotnie 0,1% Triton X100 w DPBS, aby usunąć nadmiar przeciwciał i DAPI.
  12. Przeprowadź mikroskopię fluorescencyjną za pomocą obserwatora Zeiss D1. Alternatywnie, przechowywać płytkę w temperaturze 4 °C do czasu wykonania obrazowania. Oczekiwane wyniki przedstawiono na rysunku 3.

5. Charakterystyka progenitorów wątroby za pomocą analizy sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS)

UWAGA: Użyj FACS, aby precyzyjnie określić procent zróżnicowanych komórek LB AFP+, które pojawiają się w 6 dniu różnicowania. Wykonaj te same kroki, aby określić ilościowo procent hepatocytów zróżnicowanych ALB+ do 18 dnia różnicowania.

  1. Sprzęgnąć przeciwciało anty-AFP.
  2. Dodać R-fikoerytrynę do przeciwciała anty-AFP w stężeniu (0,55 μg/μL) za pomocą zestawu do koniugacji R-fikoerytryny (patrz tabela materiałów).
    nuta: Upewnij się, że przeciwciała zostały oczyszczone i rozpuszczone w, które nie zawierają amin. Upewnij się, że ilość przeciwciała użytego w reakcji znakowania musi być mniejsza niż ilość PE (tj. 60 μg przeciwciała przy 100 μg PE). Słaba koniugacja przeciwciał może prowadzić do niewiarygodnych wyników.
  3. Dodać 1 μl odczynnika modyfikującego na 10 μl przeciwciała, które ma być znakowane. Delikatnie wymieszaj.
  4. Usunąć mieszaninę R-PE (100 μl) i odpipetować powyższą mieszaninę bezpośrednio do liofilizowanego materiału R-PE.
  5. Umieścić nakrętkę z powrotem i pozostawić fiolkę na 3 godziny w ciemności w temperaturze pokojowej.
  6. Po inkubacji trwającej 3 godziny lub dłużej dodać 1 μl odczynnika wygaszającego na 10 μl użytego przeciwciała. Koniugat można zużyć po 30 min.
  7. Sprzężone przeciwciało należy przechowywać w temperaturze 4 °C.
  8. Przemyć zróżnicowane lub niezróżnicowane hPSC w formacie 6-dołkowym za pomocą DMEM/F12.
  9. Krótko traktować środkiem dysocjacyjnym (1 ml / studzienkę na płytce 6-dołkowej) przez 5 minut w temperaturze pokojowej, aż komórki się odłączą. Zbierz i wybarwij zarówno niezróżnicowane hPSC, jak i zróżnicowane komórki progenitorowe wątroby identycznie i analizuj równolegle w tym samym eksperymencie, aby zapewnić swoistość barwienia przeciwciał.
  10. Delikatnie dotknij szalki Petriego, aby odłączyć komórki. Za pomocą pipety p1000 odłącz komórki od płytki i zbierz je do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Upewnij się, że komórki w większości się odłączyły, zanim przejdziesz do następnego kroku. Następnie umyj studzienki jeszcze dwukrotnie buforem 1xDPBS, aby zebrać resztki komórek.
  11. W stożkowej probówce o pojemności 50 ml rozcieńczyć środek dysocjacyjny w ~ 5 objętościach 1x buforu DPBS. Dokładnie rozcieraj 3-4 razy pipetą p1000, aby upewnić się, że wszystkie komórki są zdysocjowane na pojedyncze komórki.
    nuta: Konieczne jest wygenerowanie pojedynczych komórek przed wirowaniem, w przeciwnym razie późniejsze grudki nie mogą być łatwo zdysocjowane. Nie należy jednak nadmiernie tryturować, ponieważ może to uszkodzić integralność komórek. Policz liczbę komórek i użyj zalecanego stosunku komórek do przeciwciała, który został wcześniej zoptymalizowany pod kątem minimalnego tła i maksymalnego wykrywania sygnału.
  12. Odwirować stożkową probówkę zawierającą zawiesinę komórek o sile 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  13. Odessać supernatant ostrożnie, aby nie naruszyć osadu komórkowego.
  14. Dokładnie zawiesić osad komórkowy w buforze do utrwalania/trwałej ondulacji, aby wytworzyć zawiesinę jednokomórkową i utrwalić na lodzie w temperaturze 4 °C przez 20 minut. Uwaga do przeniesienia do probówki do mikrowirówki o pojemności 2 ml. Co więcej, użycie na tym etapie probówki mikrowirówkowej o pojemności 2 ml umożliwia osadzanie się granulki komórkowej w rogu probówki w kształcie litery V, minimalizując utratę komórek podczas mycia.
  15. Przemyj każdą granulkę dwukrotnie 1,8 ml buforu do trwałej ondulacji/płukania. Dokładnie zawiesić osad komórkowy w buforze do trwałej ondulacji/płukania, mieszając pipetą 6 razy z pipetą p1000. Następnie odwirować, usunąć supernatant i powtórzyć proces płukania z 1,8 ml buforu do trwałej ondulacji/płukania.
  16. Zawiesić osad komórkowy w buforze do trwałej ondulacji/płukania, tak aby pozostało 100 μl/pojedyncze zabarwienie, a następnie przenieść zawiesinę komórek do probówki do mikrowirówki o pojemności 2 ml.
    nuta: Na tym etapie konieczne jest wytworzenie zawiesiny jednokomórkowej przed barwieniem przeciwciał. Agregacje komórek nie zostaną zabarwione, a tym samym zakłócą analizę FACS. Co więcej, użycie na tym etapie probówki mikrowirówkowej o pojemności 2 ml umożliwia osadzanie się granulki komórkowej w rogu probówki w kształcie litery V, minimalizując utratę komórek podczas mycia.
  17. Po ponownym zawieszeniu komórek w buforze FACS, należy je podzielić na pojedyncze probówki o pojemności 2 ml (zarówno dla niebarwionych próbek kontrolnych, jak i barwionych przeciwciałami).
  18. Barwienie anty-AFP-PE 0,33 μl na 150 000 komórek przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Na przykład w przypadku pojedynczej barwie o objętości 100 μl należy zabarwić w następujący sposób: 0,33 μl a-AFP PE i 100 μl buforu do trwałej ondulacji/prania. Dobrze zawiesić komórki za pomocą pipety p200, aby zapewnić równomierne barwienie.
    nuta: Mieszać pipetami i nie wirować, ponieważ może to zmniejszyć stabilność białka.
  19. Przemyć, ponownie zawiesić komórki dwukrotnie w 1-2 ml buforu do trwałej ondulacji/płukania (1,9 ml/pojedynczą plamę) i odwirować przy 800 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Przemyć komórki nie mniej niż 1-2 ml buforu do trwałej ondulacji/płukania, aby zapewnić wystarczające mycie.
    nuta: Tylko mieszać pipetami i nie wirować, ponieważ może to zmniejszyć stabilność białka. Po odwirowaniu należy ostrożnie odessać supernatant, aby zapobiec przemieszczaniu się komórek i usunąć jak najwięcej supernatantu, aby zminimalizować przenoszenie przeciwciał i zapewnić pełniejsze płukanie.
  20. Ponownie zawiesić każdą umytą osadkę w 300 μl buforu do trwałej ondulacji/płukania i przecedzić ją przez filtr 100 μm do probówki FACS, aby odcedzić duże grudki komórek przed analizą FACS.
  21. Analizuj komórki w cytometrii przepływowej FACS Aria na kanale PE. Przeanalizuj co najmniej 10 000 zdarzeń dla każdej pojedynczej plamy i przeanalizuj zdarzenia na podstawie analizy FSC-A/SSC-A, wybierz pojedyncze komórki, bramkując na FSC-W/FSC-H, a następnie SSC-H/SSC-W.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Po 24 godzinach różnicowania APS, kolonie na ogół przyjmują inną morfologię niż niezróżnicowane kolonie, co wiąże się z utratą jasnej granicy, która zwykle otacza kolonie hPSC. Morfologicznie prymitywne komórki smugowe mają na ogół postrzępione granice i są bardziej rozproszone i mniej zwarte niż hPSC - sugeruje to przejście z nabłonka do mezenchymalnego, gdy pluripotencjalne komórki epiblastów różnicują się i wnikają do prymitywnej smugi in vivo. Jeśli wielkość kolonii hPSC przed różnico...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metoda ta umożliwia generowanie wzbogaconych populacji komórek progenitorowych pączków wątroby, a następnie komórek hepatocytopodobnych, z hPSC. Zdolność do generowania wzbogaconych populacji ludzkich komórek wątroby jest ważna dla praktycznego wykorzystania takich komórek. Poprzednie metody generowania hepatocytów z hPSC dawały zanieczyszczone populacje komórek zawierające zarówno komórki wątroby, jak i komórki niewątrobowe, które po przeszczepieniu gryzoniom dawały kości i chrząstki oprócz tkanki wątroby

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Bingowi Limowi za dyskusję oraz Stanfordzkiemu Instytutowi Biologii Komórek Macierzystych i Medycyny Regeneracyjnej za wsparcie infrastruktury. Prace te były wspierane przez Kalifornijski Instytut Medycyny Regeneracyjnej (DISC2-10679) oraz Stanford-UC Berkeley Siebel Stem Cell Institute (do L.T.A. i K.M.L.) oraz Stanford Beckman Center for Molecular and Genetic Medicine, a także rodziny Anonymous, Baxter i DiGenova (do K.M.L.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
  GeltrexThermofisher ScientificA1569601
1:1 DMEM/F12Gibco11320033
0,2  μ m Filtr membranowyporowy MilliporeGTTP02500
mTeSR1Stem Cell Technologies5850
TiazovivinTocris Bioscience3845
  AccutaseGibco lub Millipore Gibco A11105, Milipore  SCR005
IMDM, GlutaMAX&handel; SuplementThermofisher Scientific31980030
Mieszanka odżywcza F-12 dla szynki, GlutaMAX™ SuplementThermofisher Scientific31765035
KOSR, Zamiennik serum nokautującegoThermofisher Scientific10828028
Poli(alkohol winylowy)Sigma-Aldrich   P8136
Transferyna Sigma-Aldrich   
Chemicznie zdefiniowany koncentrat lipidowyThermofisher Scientific11905031
Human ActivinR& D338-AC
CHIR99201Tocris4423
PI103Tocris2930/1
Człowiek FGF2R& D233-FB
DM3189Tocris6053/10
A83-01Tocris2939/10
Człowiek BMP4R& D314-BP
C59Tocris5148
TTNPBTocris0761/10
ForskolinaTocris1099/10
Onkostatyna MR& D295-OM
DeksametazonTocris1126
Ro4929097Selleck ChemS1575
AA2PCayman chemicals16457
Ludzka rekombinowana insulinaSigma-Aldrich   11061-68-0
10652202001

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bernal, W., Wendon, J. Acute Liver Failure. New England Journal of Medicine. 369, 2525-2534 (2013).
  2. Ang, L. T., et al. A Roadmap for Human Liver Differentiation from Pluripotent Stem Cells. Cell Reports. 22, 2190-2205 (2018).
  3. Fisher, R. A., Strom, S. C. Human Hepatocyte Transplantation: Worldwide Results. Transplantation. 82, 441-449 (2006).
  4. Dhawan, A. Clinical human hepatocyte transplantation: Current status and challenges. Liver transplantation. 21, S39-S44 (2015).
  5. Salama, H., et al. Autologous Hematopoietic Stem Cell Transplantation in 48 Patients with End-Stage Chronic Liver Diseases. Cell Transplantation. 19, 1475-1486 (2017).
  6. Tan, A. K. Y., Loh, K. M., Ang, L. T. Evaluating the regenerative potential and functionality of human liver cells in mice. Differentiation. 98, 25-34 (2017).
  7. Loh, K. M., et al. Efficient Endoderm Induction from Human Pluripotent Stem Cells by Logically Directing Signals Controlling Lineage Bifurcations. Cell Stem Cell. 14, 237-252 (2014).
  8. Loh, K. M., et al. Mapping the Pairwise Choices Leading from Pluripotency to Human Bone, Heart, and Other Mesoderm Cell Types. Cell. , 451-467 (2016).
  9. Zhao, D., et al. Promotion of the efficient metabolic maturation of human pluripotent stem cell-derived hepatocytes by correcting specification defects. Cell Research. 23, 157-161 (2012).
  10. Si Tayeb, K., et al. Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells. Hepatology. 51, 297-305 (2010).
  11. Carpentier, A., et al. Hepatic differentiation of human pluripotent stem cells in miniaturized format suitable for high-throughput screen. Stem Cell Research. 16, 640-650 (2016).
  12. Avior, Y., et al. Microbial-derived lithocholic acid and vitamin K2 drive the metabolic maturation of pluripotent stem cells-derived and fetal hepatocytes. Hepatology. 62, 265-278 (2015).
  13. Ogawa, S., et al. Three-dimensional culture and cAMP signaling promote the maturation of human pluripotent stem cell-derived hepatocytes. Development. 140, 3285-3296 (2013).
  14. Rostovskaya, M., Bredenkamp, N., Smith, A. Towards consistent generation of pancreatic lineage progenitors from human pluripotent stem cells. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 370, 20140365(2015).
  15. Haridass, D., et al. Repopulation Efficiencies of Adult Hepatocytes, Fetal Liver Progenitor Cells, and Embryonic Stem Cell-Derived Hepatic Cells in Albumin-Promoter-Enhancer Urokinase-Type Plasminogen Activator Mice. The American Journal of Pathology. 175, 1483-1492 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Liver Cell DifferentiationHepatocyte like CellsDevelopmental Signaling PathwaysSmall Molecules Growth FactorsSerum free Culture MediumLiver Bud ProgenitorsDay 6 DifferentiationDay 18 DifferentiationPVA Stock Preparation

Powiązane artykuły