Artykuł metodologiczny

Inżynieria genetyczna komórek Dictyostelium discoideum oparta na selekcji i wzroście bakterii

15.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58981

⸱

25 stycznia 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1MRC Laboratory of Molecular Biology, 2Department of Molecular and Cell Biology, University of Connecticut, 3Cancer Research UK Beatson Institute Glasgow, 4MRC Laboratory for Molecular Cell Biology, University College London, 5Department of Cell and Developmental Biology, University College London

W tym artykule

Podsumowanie

Dictyostelium discoideum to popularny organizm modelowy do badania złożonych procesów komórkowych, takich jak migracja komórek, endocytoza i rozwój. Użyteczność organizmu zależy od wykonalności manipulacji genetycznej. W tym miejscu przedstawiamy metody transfekcji komórek Dictyostelium discoideum, które przezwyciężają istniejące ograniczenia hodowli komórek w płynnych pożywkach.

Streszczenie

Dictyostelium discoideum to intrygujący organizm modelowy do badania procesów różnicowania komórek podczas rozwoju, sygnalizacji komórkowej i innych ważnych zagadnień biologii komórkowej. Dostępne technologie genetycznej manipulacji komórkami Dictyostelium są dobrze rozwinięte. Transfekcje mogą być wykonywane przy użyciu różnych wybieralnych markerów i recyklingu markerów, w tym rekombinacji homologicznej i mutagenezy insercyjnej. Potwierdza to dobrze opisany genom. Jednak podejścia te są zoptymalizowane pod kątem linii komórek aksenowych rosnących w płynnych kulturach i są trudne do zastosowania w nieaksenicznych komórkach typu dzikiego, które żywią się tylko bakteriami. Mutacje, które są obecne w szczepach aksenowych, zaburzają sygnalizację Ras, powodując nadmierną makropinocytozę wymaganą do odżywiania się i upośledzają migrację komórek, co zakłóca interpretację eksperymentów z transdukcją sygnału i chemotaksją w tych szczepach. Wcześniejsze próby genetycznej manipulacji komórkami nieaksenicznymi były nieskuteczne i wymagały skomplikowanych procedur eksperymentalnych. Opracowaliśmy prosty protokół transfekcji, który po raz pierwszy pokonuje te ograniczenia. Ta seria dużych ulepszeń genetyki molekularnej Dictyostelium pozwala na manipulowanie komórkami typu dzikiego tak łatwo, jak standardowymi szczepami laboratoryjnymi. Oprócz korzyści płynących z badania nieuszkodzonych procesów sygnalizacji i ruchliwości, mutanty, które zakłócają wzrost oparty na makropinocytozie, można teraz łatwo wyizolować. Co więcej, cały proces transfekcji jest znacznie przyspieszony, dzięki rekombinowanym komórkom, które można wygenerować w ciągu kilku dni, a nie tygodni. Kolejną zaletą jest to, że genetyka molekularna może być dalej prowadzona na świeżo wyizolowanych próbkach Dictyostelium typu dzikiego ze środowiska. Może to przyczynić się do rozszerzenia zakresu podejść stosowanych w tych obszarach badawczych.

Wprowadzenie

Rodzaj Dictyostelium to żyjące w glebie ameby społeczne, które żywią się głównie bakteriami. Umieszczono je w gromadzie Amoebozoa, wyizolowano dużą liczbę gatunków, które można pogrupować w cztery różne klady1. Gatunek Dictyostelium discoideum (D. discoideum) stał się popularnym organizmem modelowym do badania złożonych procesów komórkowych, takich jak migracja komórek i fagocytoza. Aby kontrolować i standaryzować warunki eksperymentalne, opracowano linie komórek aksenicznych, które są w stanie rosnąć w złożonym lub zdefiniowanym płynnym podłożu pod nieobecność bakterii2. Szczególne znaczenie mają szczepy Ax2, Ax3 i Ax4, które zostały wygenerowane w latach siedemdziesiątych XX wieku i ostatecznie pochodzą z jednego dzikiego izolatu NC43. Narzędzia do inżynierii genetycznej zostały opracowane w tych odmianach aksonicznych, co zaowocowało pierwszym opublikowanym nokautem w 1987 roku4,5. Protokoły zostały dalej rozwinięte i zoptymalizowane do użytku w warunkach aksonicznych6,7.

Adaptacja tych protokołów do dzikich szczepów D. discoideum, które nie są w stanie rosnąć w płynnym bulionie, została podjęta przez kilka laboratoriów. Jednak nie udało się to w pełni, ponieważ protokoły transfekcji są złożone i brakuje im wydajności, częściowo ze względu na zdolność bakterii do działania jako pochłaniacz dla selektywnych odczynników8,9. W rezultacie, zasadniczo wszystkie dane molekularne dotyczące D. discoideum pochodzą od potomków pojedynczego izolatu typu dzikiego. Chcieliśmy przezwyciężyć to ograniczenie i opracować metodę genetycznej modyfikacji komórek D. discoideum niezależnie od ich zdolności do wzrostu w płynnym podłożu. Potrzebę takiej metody można wytłumaczyć obserwacją, że w przeszłości zakładano, iż mutacje umożliwiające wzrost akseniczny są głównie neutralne i nie upośledzają fizjologii komórki. Przypuszczenie to jest tylko częściowo słuszne. Ogólnie rzecz biorąc, istnieją dwie znaczące różnice; Po pierwsze, między różnymi izolowanymi szczepami aksenicznymi, a po drugie, gdy te szczepy akseniczne są porównywane z dzikimi izolatami nieaksenicznymi8,9.

Być może najbardziej krytycznym czynnikiem jest kluczowy gen aksoniczny, axeB, który został niedawno zidentyfikowany jako RasGAP NF1. Główną funkcją NF1 jako RasGAP jest ograniczanie aktywności Ras3. Delecja enzymu we wszystkich szczepach aksenicznych prowadzi do nadmiernej aktywności Ras, objawiającej się tworzeniem dużych aktywnych plam Ras. Te powiększone plamy Ras prowadzą do akumulacji PIP3 w błonie plazmatycznej. Te przypadkowo pojawiające się plamy PIP3 i aktywnego Ras są szablonem do tworzenia okrągłej falbanki, która ostatecznie zamyka się i prowadzi do powstania makropinosomów10. Konsekwencją jest nadmierny wzrost aktywności makropinocytarnej. Makropinocytoza jest procesem napędzanym przez aktynę. Wynikiem jest konkurencja o składniki cytoszkieletu w celu tworzenia makropinosomów lub pseudopodów. Jego wpływ na zachowanie komórek znajduje odzwierciedlenie w prawie całkowitym zapobieganiu chemotaksji komórek wegetatywnych do folianów11. Znacznie powiększone plastry PIP3 są bardzo trwałe. Nawet w wygłodzonych komórkach plamy PIP3 pozostają i mogą być błędnie interpretowane jako pseudopody, co może powodować problemy z interpretacją badań nad chemotaksją do cAMP.

W niektórych przypadkach mutacja NF1 jest eksperymentalnie użyteczna. To prowadzi nas do drugiej motywacji do opracowania metody transfekcji dla hodowanych bakteryjnie komórek D. discoideum, ponieważ wzrost częstości makropinocytozy sprawia, że komórki akseniczne są cenne dla badania podstawowych aspektów tego procesu12. Jednak mutacje w genach wymaganych do makropinocytozy, takich jak kinazy Ras i PI310, prawie zniosły wzrost aksenów, co spowodowało konieczność manipulowania tymi komórkami poprzez wzrost na bakteriach. Innym powodem, dla którego transfekcje oparte na bakteriach są cenne, jest coraz częstsze wykorzystanie Dictyostelids do badania kwestii związanych z ewolucją wielokomórkowości13,14, kin recognition15,16, oraz altruistyczne zachowania komórkowe, które zależą głównie od użycia świeżo wyizolowanych izolatów typu dzikiego17. Wszystkie wymienione obszary badawcze mogą być ułatwione dzięki skutecznym metodom manipulacji genetycznej dzikimi izolatami, które nie są akseniczne i nie rosną w płynnym bulionie.

Nasze protokoły pozwalają na pokonanie opisanych ograniczeń. Podsumowując, możliwość przeprowadzenia manipulacji genetycznych na wyhodowanych bakteryjnie komórkach D. discoideum przynosi korzyści wszystkim badaczom Dictyostelium, nawet jeśli jest to tylko zwiększona szybkość procesu selekcji ze względu na szybszy wzrost ameby (4 godziny czasu podwojenia) na bakteriach w porównaniu ze wzrostem w pożywce aksenicznej (10 godzin czasu podwojenia).

Protokół

1. Przygotowanie komórek i materiałów

  1. Przygotowanie buforu SorMC
    1. Przygotować 10 mL 10x buforu SorMC (bufor Sorensena z dodatkiem MgCl2 i CaCl2), rozpuszczając 20,36 g KH2PO4 (15 mM) oraz 5,47 g Na2HPO4·7 H2O (2mM) w 10 mL wody ddH2O. Mieszać roztwór w temperaturze pokojowej (RT) i dopełnić objętość do 100 mL wodą dH2O.
      UWAGA: Otrzymany bufor ma pH wynoszące 6 i nie wymaga dalszej regulacji.
    2. Przygotować 10 mL 1x roztworu roboczego w ddH2O. Dodać po 50 µL MgCl2 i CaCl2, aby uzyskać końcowe stężenia 50 µM dla każdego z nich. Przesiąć roztwór przez filtr 0,2 µm w celu sterylizacji.
      UWAGA: Zawsze dodawać MgCl2 i CaCl2 do buforu 1x, aby uniknąć wytrącania soli w 10x roztworze zapasem.
    3. Alternatywnie można przygotować bufor KK2 (2,2 g KH2PO4 i 0,7 g K2HPO4 na 1 L buforu) uzupełniony o 50 µM MgCl2 i 50 µM CaCl2 (zwany dalej KK2MC). Stosować ten bufor w całym procesie zamiast SorMC.
  2. Przygotowanie bakterii jako źródła pokarmu dla D. discoideum
    1. Użyć pojedynczej kolonii K. aerogenes i zaszczepić 1 L medium LB (lysogeny broth). Użyć kolby o pojemności 2 L. Inkubować bakterie przez noc w temperaturze 37 °C przy wytrząsaniu z prędkością 20 rpm.
      UWAGA: Jeśli wymagane są duże ilości bakterii, zamiast LB należy użyć bogatszych pożywek, takich jak 2xTY (pożywka tryptonowo-drożdżowa) lub SOB (super optimal broth). W przypadku, gdy użycie bakterii K. aerogenes nie jest dozwolone ze względu na ograniczenia bezpieczeństwa, można zamiast nich użyć BL21 E. coli.
    2. Następnego dnia zebrać komórki, wirowując je w dwóch probówkach wirówkowych 50 mL przy ok. 6 60 x g przez 20 min. Przemyć bakterie raz 50 mL buforu SorMC.
    3. Resuspendować osad w 20 mL SorMC. Sprawdzić OD600 (gęstość optyczną przy 600 nm) za pomocą fotometru. Rozcieńczyć tym samym buforem do OD60 na poziomie około 10.
      UWAGA: Bakterie K. aerogenes są trudne do osadzenia, dlatego konieczne jest zastosowanie stosunkowo wysokiej prędkości wirowania, aby uniknąć utraty bakterii pokarmowych. Otrzymany roztwór zapasowy bakterii można przechowywać do 4 miesięcy w lodówce w temperaturze 4 °C, zachowując jego użyteczność jako źródło pokarmu dla D. discoideum. 1 L nocnej zawiesiny K. aerogenes hodowanej w medium LB zazwyczaj daje 20 mL roztworu o OD60 około 100.
      OSTROŻNIE: Aby upewnić się, że przygotowane bakterie stanowią monokulturę K. aerogenes, wszystkie etapy należy przeprowadzać pod wyciągiem laminarnym.
  3. Przygotowanie buforu do elektroporacji H40
    1. Przygotować 10 mL roztworu buforowego: rozpuścić 0,952 g HEPES w wodzie ddH2O i dodać 10 µL MgCl2 z 1 M roztworu zapasu. Dostosować pH do 7, stosując KOH do miareczkowania. Sterylizować bufor za pomocą filtra 0,2 µm lub w autoklawie. Należy użyć HEPES wolnego od kwasów, a nie soli sodowej.
  4. Przeprowadzić preparację plazmidów zgodnie z protokołem producenta, korzystając z zestawów wymienionych w Tabeli materiałów. Użyć plazmidów podsumowanych w Tabeli 1.
    UWAGA: Jakość DNA użytego do transfekcji jest kluczowa. Selekcja transfektantów D. discoideum rosnących na bakteriach stawia specyficzne wymagania względem promotorów sterujących kasetą selekcyjną i ekspresyjną (patrz dyskusja).
nazwa plazmiduoporność/selekcja w bakteriachoporność/selekcja w Dictyosteliumznacznik
plazmidy ekspresyjne pozachromosomalne
pDM1203AmpicilinaG418brak
pDM1207AmpicilinaG418N-terminalny GFP
pDM1208AmpicilinaG418N-terminalny mCherry
pPI159AmpicilinaG418N-terminalny mNeon
pPI437AmpicilinaG418N-terminalny mScarlet
pPI54AmpicilinaG418N-terminalny mTurquoise2
pDM1209AmpicilinaG418C-terminalny GFP
pDM1210AmpicilinaG418C-terminalny mCherry
pPI143AmpicilinaG418C-terminalny mNeon
pPI459AmpicilinaG418C-terminalny mScarlet
pPI142AmpicilinaG418C-terminalny mTurquoise2
plazmidy wahadłowe
pDM34Ampicilinabrakbrak
pDM1019AmpicilinabrakN-terminalny GFP
pDM1018AmpicilinabrakN-terminalny mCherry
pPI152AmpicilinabrakN-terminalny mNeon
pPI418AmpicilinabrakN-terminalny mScarlet
pPI150AmpicilinabrakN-terminalny mTurquoise2
pDM1021AmpicilinabrakC-terminalny GFP
pDM1020AmpicilinabrakC-terminalny mCherry
pPI153AmpicilinabrakC-terminalny mNeon
pPI457AmpicilinabrakC-terminalny mScarlet
pPI151AmpicilinabrakC-terminalny mTurquoise2
indukowalne plazmidy ekspresyjne pozachromosomalne
pDM1038AmpicilinaHygromycynabrak
pDM1047AmpicilinaHygromycynaN-terminalny GFP
pDM1046AmpicilinaHygromycynaN-terminalny mCherry
pPI450AmpicilinaHygromycynaN-terminalny mNeon
pPI452AmpicilinaHygromycynaN-terminalny mScarlet
pPI49AmpicilinaHygromycynaN-terminalny mTurquoise2
pDM1049AmpicilinaHygromycynaC-terminalny GFP
pDM1048AmpicilinaHygromycynaC-terminalny mCherry
pPI470AmpicilinaHygromycynaC-terminalny mNeon
pPI460AmpicilinaHygromycynaC-terminalny mScarlet
pPI469AmpicilinaHygromycynaC-terminalny mTurquoise2
plazmidy celowane w bezpieczną przystań act5
pDM1501AmpicilinaHygromycynabrak
pDM1513AmpicilinaHygromycynaN-terminalny GFP
pDM1514AmpicilinaHygromycynaN-terminalny mCherry
pPI231AmpicilinaHygromycynaN-terminalny mNeon
pPI419AmpicilinaHygromycynaN-terminalny mScarlet
pPI28AmpicilinaHygromycynaN-terminalny mTurquoise2
pDM1515AmpicilinaHygromycynaC-terminalny GFP
pDM1516AmpicilinaHygromycynaC-terminalny mCherry
pPI230AmpicilinaHygromycynaC-terminalny mNeon
pPI458AmpicilinaHygromycynaC-terminalny mScarlet
pPI229AmpicilinaHygromycynaC-terminalny mTurquoise2
plazmidy ekspresyjne REMI
pDM120AmpicilinaHygromycynabrak
pDM1351AmpicilinaHygromycynaN-terminalny GFP
pDM1259AmpicilinaHygromycynaN-terminalny mCherry
pPI465AmpicilinaHygromycynaN-terminalny mNeon
pPI468AmpicilinaHygromycynaN-terminalny mScarlet
pPI46AmpicilinaHygromycynaN-terminalny mTurquoise2
pDM1352AmpicilinaHygromycynaC-terminalny GFP
pDM1305AmpicilinaHygromycynaC-terminalny mCherry
pPI471AmpicilinaHygromycynaC-terminalny mNeon
pPI467AmpicilinaHygromycynaC-terminalny mScarlet
pPI472AmpicilinaHygromycynaC-terminalny mTurquoise2
plazmidy celowane w ramce odczytu
pDM135AmpicilinaHygromycynaC-terminalny GFP
pPI461AmpicilinaHygromycynaC-terminalny mCherry
pPI462AmpicilinaHygromycynaC-terminalny mNeon
pPI464AmpicilinaHygromycynaC-terminalny mScarlet
pPI463AmpicilinaHygromycynaC-terminalny mTurquoise2
plazmidy do nokautu
pDM1079AmpicilinaBlastycydynabrak
pDM1080AmpicilinaNourseotrycynabrak
pDM1081AmpicilinaHygromycynabrak
pDM1082AmpicilinaG418brak
plazmidy ekspresyjne CRE
pDM1483AmpicilinaNourseotrycynabrak
pDM1489AmpicilinaHygromycynabrak
pDM148AmpicilinaG418brak

Tabela 1: Lista plazmidów do transfekcji nieaksenicznych.

  1. Przygotowanie komórek Dictyostelium do transfekcji
    1. Hodować K. aerogenes do osiągnięcia konfluencji w medium SM (medium bogate w składniki odżywcze) przez noc w temperaturze pokojowej (RT). Kultury można przechowywać do 2 tygodni w temperaturze 4 °C.
    2. Nanieść około 40 µL zawiesiny bakteryjnej na płytkę z agarem SM (pepton 10 g/L; ekstrakt drożdżowy 1 g/L; glukoza 10 g/L; KH2PO4 1,9 g/L; K2HPO4 x 3 H2O 1,3 g/L; MgSO4 bezwodny 0,49 g/L; 1,7% agaru) i równomiernie rozprowadzić. Za pomocą sterylnej pętli nanieść komórki Dictyostelium, rozprowadzając je przy jednej krawędzi płytki.
    3. Inkubować płytkę w temperaturze 2 °C przez 2 dni, aby zapewnić wystarczająco duże strefy wzrostu do transfekcji.
      UWAGA: W przypadku szczepów Dictyostelium, które nie tworzą dużych stref wzrostu (np. Ax3, DH1 lub JH10), lub dla mniej doświadczonych badaczy, należy zamiast tego zastosować płytki do oczyszczania (clearing plates). W tym celu należy postępować zgodnie z instrukcjami w krokach od 1.5.4 do 1.5.6.
    4. Za pomocą sterylnej pętli pobrać komórki Dictyostelium (około 2-4 x 105 komórek). Przenieść komórki do 80 µL gęstej zawiesiny K. aerogenes w medium SM. Wymieszać komórki poprzez pipetowanie w górę i w dół.
    5. Przenieść 40 µL, 200 µL, 10 µL i 50 µL na świeże płytki z agarem SM. Na każdą płytkę dodać 40 µL dodatkowej zawiesiny K. aerogenes w SM, równomiernie rozprowadzić i wysuszyć.
    6. Inkubować płytki w temperaturze 22 °C przez około 2 dni, aż staną się półprzezroczyste.
      UWAGA: Ze względu na szybsze tempo wzrostu, bakterie początkowo tworzą konfluencyjny trawnik, a następnie ameby „oczyszczają” płytkę z bakterii. Czas potrzebny na ten proces może się różnić w zależności od tła szczepu oraz zdolności komórek mutantów do wzrostu na bakteriach.

2. Transfekcja komórek Dictyostelium w oparciu o selekcję bakteryjną

Schemat procesu edycji genów z wykorzystaniem metody elektroporacji w celu insercji plazmidu z użyciem buforu SorMC.
Rysunek 1Procedura transfekcji bakterii hodowlanych Dictyostelium komórki Kroki transfekcji przedstawiono poniżej. Hodować komórki D. discoideum na płytce SM z wysianymi K. aerogenes bakterie (czerwone). Zbierać komórki wyłącznie z frontu odżywiania (zielonego), unikając komórek, które już się rozwijają (ciemnozielonych). Przemyć komórki w H40. Resuspender komórki do końcowej gęstości 2-4 x 107 komórek/ml. Wymieszać zawiesinę komórkową z 1-2 µg DNA. Przenieś mieszaninę do kuwety do elektroporacji i poddaj komórki impulsowi elektrycznemu. Bezpośrednio po elektroporacji przenieś komórki na szalkę z SorMC i bakteriami. Pozostaw komórki na 5 h w celu regeneracji przed dodaniem markera selekcyjnego. W przypadku plazmidów pozachromosomalnych dodaj czynnik selekcyjny bezpośrednio na szalkę. Transfektanty są zazwyczaj widoczne po około 2 dniach. W przypadku linearyzowanych konstruktów przeznaczonych do pojedynczej integracji z genomem, przygotuj trzy wskazane rozcieńczenia i dodaj czynnik selekcyjny. Bakterie pobiera się przy wartości OD600 = roztwór stokowy 10. Dobrze wymieszać zawartość probówek i przenieść komórki do 96-dołkowych płytek do hodowli tkanek z płaskim dnem. Należy użyć dwóch płytek na każde rozcieńczenie. Pipetować 150 µL zawiesiny komórkowej do każdej studzienki. Powstanie gęstych kolonii zajmuje około 5 dni. Czerwone studzienki pokazują przykład typowej ilości uzyskanych skutecznie przetransformowanych komórek (panel górny zmodyfikowany z poprzedniej publikacji22). Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Aby przygotować płytki z zawiesiną K. aerogenes, należy dodać 10 mL buforu SorMC zawierającego bakterie K. aerogenes o gęstości OD60 = 2 (dodaj 20 µL przygotowanego roztworu zapasu K. aerogenes o OD60 = 10 dla pożądanej koncentracji bakterii) do 10-centymetrowej szalki Petriego traktowanej do hodowli tkanek.
    UWAGA: Ta płytka będzie później potrzebna do hodowli transfekowanych komórek D. discoideum. Alternatywnie można zastosować płytkę do hodowli tkanek z 6 dołkami. W przypadku transfekcji plazmidów pozachromosomalnych płytka z 6 dołkami jest bardziej efektywna pod względem zasobów. Należy użyć 2 mL zawiesiny K. aerogenes w SorMC (OD60 = 2) na jeden dołek.
  2. Przygotowanie komórek Dictyostelium
    1. Za pomocą jednorazowej pętli szczepiącej o pojemności 10 µL zebrać komórki ze stref wzrostu (około 3 cm) z płytki hodowlanej (krawędź obszaru oczyszczonego) lub płytki oczyszczającej. Przenieść komórki do probówki 1,5 mL zawierającej 1 mL lodowatego buforu H40.
      UWAGA: Moment zbioru komórek z płytek oczyszczających jest kluczowy. Zbiór zbyt wczesny skutkuje zbyt małą ilością komórek, natomiast zbiór zbyt późny zwiększa ryzyko uzyskania komórek częściowo rozwiniętych.
    2. Przemyć komórki, wirując przez 2 min przy 1 0 x g lub stosując szybkie wirowanie (flash-spinning) przez 2 s przy 10 00 x g. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w buforze H40 do końcowej gęstości 2-4 x 107 komórek/mL. Przez cały proces transfekcji należy utrzymywać komórki w niskiej temperaturze. Użyć mieszaniny lodu i wody, aby zapewnić bezpośredni kontakt probówek z lodem.
  3. Elektroporacja
    1. Dodać 10 µL komórek do probówki z 1-2 µg DNA. Wymieszać dokładnie, pipetując w górę i w dół.
    2. Przenieść mieszaninę komórek i DNA do schłodzonej wcześniej kuwety do elektroporacji (przerwa 2 mm).
    3. poddać komórki impulsowi, korzystając z następujących ustawień fali prostokątnej: 350 V, 8 ms, 2 impulsy i interwał między impulsami 1 s.
      UWAGA: Nie dodawać więcej niż 2 µg DNA. Wyższe ilości są toksyczne dla komórek i zmniejszają wydajność transfekcji. Całkowita objętość dodanego DNA nie powinna przekraczać 5 µL.
    4. Niezwłocznie przenieść komórki do wcześniej przygotowanej 10-centymetrowej szalki Petriego z K. aerogenes SorMC i pozwolić komórkom regenerować się przez 5 h.
      UWAGA: Sprawdzić komórki w szalce Petriego pod mikroskopem odwróconym. Bezpośrednio po elektroporacji komórki będą okrągłe, ale po około 30 min odzyskają swój ameboidalny kształt, gdy będą miały wystarczająco dużo czasu, aby prawidłowo przytwierdzić się do powierzchni.
  4. Selekcja transfekcianek: w zależności od tego, czy celem transfekcji jest wygenerowanie knock-outu, knock-inu, knock-inu act5, czy ekspresja fluorescencyjnego białka reporterowego z plazmidu pozachromosomalnego, przeprowadzić proces selekcji za pomocą jednej z poniższych opisanych metod.
    UWAGA: W przeciwieństwie do komórek hodowanych aksenicznie, komórki hodowane na bakteriach są wysoce odporne na blastycydynę. Dlatego selekcja jest zawsze przeprowadzana przy użyciu G418 lub hygromycyny (patrz dyskusja).
    1. Knock-outy, knock-iny i act5 knock-ins
      1. Ostrożnie odseparować komórki od szalki Petriego, wielokrotnie kierując strumień cieczy z pipety na powierzchnię.
      2. Przygotować trzy rozcieńczenia w zawiesinie SorMC z K. aerogenes (OD60 = 2) i dodać czynnik selekcyjny zgodnie z zastosowaną odpornością (patrz Rycina 1).
      3. Niskie rozcieńczenie: zmieszać 9 mL zawiesiny komórkowej z 20,4 mL SorMC i 60 µL roztworu zapasu K. aerogenes.
      4. Średnie rozcieńczenie: zmieszać 90 µL zawiesiny komórkowej z 28,5 mL SorMC i 60 µL roztworu zapasu K. aerogenes.
      5. Wysokie rozcieńczenie: zmieszać 90 µL zawiesiny komórkowej z 29,3 mL SorMC i 60 µL roztworu zapasu K. aerogenes.
      6. Dodać 30 µL markera selekcyjnego (roztwór zapasu 10x).
      7. Rozdzielić przygotowane rozcieńczenia na 96-dołkowe płytki do hodowli tkanek o płaskim dnie, pipetując 150 µL zawiesiny komórkowej do każdego dołka.
        UWAGA: Procedura ta ma na celu przesiewanie pojedynczych klonów, a nie populacji. Selekcja trwa około 5-7 dni, w zależności od zastosowanego konstruktu.
    2. Plazmidy pozachromosomalne
      1. Dodać marker selekcyjny bezpośrednio do 10-milimetrowej szalki (patrz Rycina 1).
        UWAGA: Nie ma potrzeby przygotowywania rozcieńczeń, ponieważ nie dąży się do uzyskania populacji klonalnych. Proces selekcji plazmidów pozachromosomalnych jest szybszy ze względu na wysoką liczbę kopii obecnych w komórkach D. discoideum . Transfekcianek można spodziewać się po 32 h do 2 dni.
        OSTRZEŻENIE: Antybiotyki stosowane jako marker selekcyjny są toksyczne. Należy używać rękawiczek.
  5. Przesiewać uzyskane klony w celu zidentyfikowania pozytywnych transfekcianek. W przypadku prób knock-outu lub knock-inu postępować zgodnie z instrukcjami w punkcie 2.5.1. Sprawdzać sukces transfekcji dla plazmidów pozachromosomalnych zgodnie z instrukcjami w punkcie 2.5.2.
    1. Dla knock-outów, knock-inów i act5 knock-inów przeprowadzić wstępny przesiew za pomocą PCR, aby potwierdzić integrację konstruktu w odpowiednim locus genomowym.
      UWAGA: Aby zmaksymalizować prawdopodobieństwo uzyskania populacji klonalnych, należy zastosować najwyższe możliwe rozcieńczenie, które daje transfekcianki po selekcji. Dążyć do tego, aby zajęta była maksymalnie jedna trzecia dołków.
      1. Aby powiększyć populacje klonalne, przenieść klony, które wyrosły po selekcji z 96-dołkowej płytki do hodowli tkanek, do 12-dołkowej płytki do hodowli tkanek w celu namnożenia wystarczającej liczby komórek do izolacji DNA genomowego. Do każdego dołka dodać 1 mL SorMC K. aerogenes (OD60 = 2) i świeży marker selekcyjny.
        UWAGA: Zazwyczaj 1 dzień jest wystarczający do uzyskania konfluencyjnego dołka nadającego się do izolacji DNA.
      2. Aby przeprowadzić mini-izolację DNA genomowego, zebrać komórki z konfluencyjnego dołka i wyizolować DNA genomowe za pomocą zestawu do mini-ekstrakcji DNA zgodnie z instrukcją producenta.
      3. Wykorzystać wyizolowane DNA genomowe wraz z odpowiednimi starterami i polimerazą Taq (patrz Tabela materiałów) do przesiewania PCR w celu znalezienia pozytywnych integrandów.
        UWAGA: Po potwierdzeniu pozytywnej integracji w odpowiednim locus genomowym należy przeprowadzić analizę Southern blot. Zapewnia to większą pewność, że nie doszło do dodatkowych zdarzeń insercyjnych w niespecyficznych regionach genomowych.
    2. W przypadku fluorescencyjnych białek reporterowych zidentyfikować wizualnie pozytywne fluorescencyjne komórki i sprawdzić je za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Alternatywnie przeprowadzić western blot z odpowiednimi przeciwciałami w celu identyfikacji biochemicznej.
Program PCR
etaptemperaturaczas
Denaturacja wstępna94 °C30 s
30 cykli94 °C15-30 s
42 °C15-60 s
68 °C1 min/kb
Ekstensja końcowa68 °C5 min
Przechowywanie4-10 °C
Skład reakcji
składnikreakcja 25 μLstężenie końcowe
10 µM starter przedni (Forward Primer)0.5 µL0.2 µM
10 µM starter odwrotny (Reverse Primer)0.5 µL0.2 µM
Matryca DNAzmienna (ok. 5 µL)< 1 0 ng
2x Master Mix ze standardowym buforem, zawierający polimerazę (patrz tabela materiałów)12.5 µL1x
Woda wolna od nukleazdo 25 µL< 1 0 ng

Tabela 2: Program PCR i skład próbek do amplifikacji genomicznego DNA D. discoideum.

Wyniki

Plasmidy pozachromosomalne są wykorzystywane w badaniach reporterowych, których celem jest identyfikacja lokalizacji określonych białek wewnątrz komórki lub zmian w strukturze komórkowej komórek mutantów. W wielu podejściach, takich jak monitorowanie cyklu komórkowego, kluczowe jest jednoczesna ekspresja dwóch reporterów. Jest to obecnie możliwe dzięki naszemu systemowi pozachromosomalnych plazmidów z podwójnym reporterem (Tabela 1). W 1. dniu przeprowadzono transfekcję komórek, a po 5 h dodano marker selekcyjny G418 (Rysunek 1). W przykładzie linie NC4, DdB, Ax2 oraz niezależnie wyizolowane szczepy dzikie V12M2 i WS2162 (Tabela uzupełniająca 1) zostały poddane transfekcji plazmidem pPI289, który koduje GFP-TubulinA, marker mikrotubul, oraz mCherry-PCNA, białko wykorzystywane do monitorowania cyklu komórkowego (Rysunek 2A). Po 32 h komórki obserwowano pod mikroskopem. Większość komórek wykazywała ekspresję obu białek fuzyjnych znakowanych fluorescencyjnie, co jest zgodne z wcześniejszymi doniesieniami, według których ekspresja dwóch reporterów z tego samego plazmidu wykazuje podobne poziomy ekspresji, co jest niemal niemożliwe do osiągnięcia przy użyciu dwóch różnych plazmidów18,19. Reprezentatywna komórka dla każdej linii komórkowej (NC4, DdB, Ax2, V12M2 i WS2162) wykazująca pożądaną podwójną ekspresję reportera przedstawiona jest na Rysunku 2B. Efektywność transfekcji podsumowano na Rysunku2C. Linie komórkowe pochodzące z NC4 wykazują najwyższą efektywność transfekcji. Jednakże w przypadku linii V12M2 i WS2162 uzyskano znacząco wysoką liczbę transfektantów.

Mapa plazmidu, mikroskopia fluorescencyjna, wykres słupkowy; GFP-tubulina i mCherry-PCNA w komórkach.
Rysunek 2Ekspresja pozachromosomalnego plazmidu. (A) Plazmidy pozachromosomalne są transfekowane bezpośrednio w formie kolistej. Jako przykład przedstawiono podwójny reporter pPI289. NgoMiejsca MIV wskazują na wstawienie drugiego reportera do pozachromosomalnego plazmidu ekspresyjnego. (B) Projekcja Z reprezentatywnej komórki wykazującej ekspresję GFP-Tubuliny A (cytoplazmatycznej) oraz mCherry-PCNA (głównie jądrowej) dla pięciu różnych linii komórkowych typu dzikiego, które zostały wykorzystane (NC4, DdB, Ax2, V12M2, WS2162). (CObliczono wydajność transfekcji dla pięciu linii komórkowych przedstawionych na panelu (B). Przedstawiono średnią z dwóch eksperymentów. Słupki błędów oznaczają ± SD. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Integracja wektora celującego w określone miejsce genomiczne jest bardziej wymagająca i wymaga dokładniejszej analizy wygenerowanej linii komórkowej. Na Rysunku 3 przedstawiono próbę wykonania KI act5-mCherry w NC4. W pierwszej kolejności plazmid musi zostać zlinearyzowany, aby zwiększyć częstotliwość zdarzeń rekombinacyjnych po transfekcji. W tym celu plazmid pDM1514 zostaje przecięty enzymem NgoMIV. Po przeprowadzeniu elektroforezy produktów trawienia na żelu agarozowym otrzymuje się dwa prążki. Prążek o wielkości 4127 bp zawiera pożądany konstrukt (Rysunek 3). Do transfekcji trawione DNA musi zostać wyekstrahowane z żelu i oczyszczone za pomocą zestawu do ekstrakcji z żelu zgodnie z instrukcjami producenta.

Mapowanie plazmidu, miejsca cięcia enzymów, schemat elektroforezy żelowej, analiza DNA, trawienie enzymem NgoMIV.
Rycina 3Przygotowanie akt5 knock-in i DNA do transfekcji. Przykład zastosowania actPrzedstawiono plazmid knock-in pDM1514. Kroki przygotowania są wymienione poniżej. (A) Przed elektroporacją zlinearyzuj plazmid, używając wskazanego Ngomiejsca MIV. (B, C) Rozdziel pocięty plazmid w żelu agarozowym, aż do momentu prawidłowego rozdzielenia dwóch oczekiwanych prążków. Wytnij prążek o wielkości 4127 bp zawierający ramiona rekombinacyjne, mCherry oraz kasetę oporności, a następnie przeprowadź ekstrakcję DNA z żelu. DNA jest teraz gotowe do transfekcji. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Oczyszczone DNA wykorzystano do transfekcji komórek NC4. Po 5-6 dniach selekcji uzyskano klony. Reprezentatywna wydajność transfekcji oraz liczba zidentyfikowanych pozytywnych klonów dla kilku prób knock-in act5 zostały podsumowane w Tabeli 3. Dwa klony z transfekcji NC4 wybrano losowo i poddano analizie PCR (Rysunek 4A); oba wykazały przewidywane wzorce prążków oczekiwane dla knock-in, a następnie zostały zwalidowane analizą Southern blot, aby upewnić się, że doszło do pojedynczego zdarzenia integracji konstruktu w genomie20. Blot wykazuje wyraźną pojedynczą integrację w pożądanym locus act5 (Rysunek 4B). Wygenerowana linia komórkowa NC4::act5-mCherry może teraz zostać wykorzystana w eksperymentach.

edycja genu act5 knock-in; schemat z elektroforezą żelową i analizą wielkości prążków DNA.
Rysunek 4Walidacja act5-mCherry KI w NC4. (A) Schemat i kontrolne reakcje PCR w celu walidacji pozytywnych integracji do act5 locus. Wskazane primery zostały użyte do analizy dwóch niezależnych klonów oraz szczepu rodzicielskiego. Oba klony wykazują oczekiwane prążki dla kasety oporności oraz prymera poniżej (P1) lub powyżej (P2) miejsca wstawienia, których nie ma w szczepie rodzicielskim. Kombinacja primerów (P1/P2) potwierdza prawidłową integrację mCherry i kasety oporności w obrębie act5 locus. Typ dziki NC4 wykazuje oczekiwany prążek o wielkości 280 bp, natomiast w obu klonach KI prążek ten nie występuje, a zamiast niego widoczny jest produkt PCR większy o około 140 par zasad. (B) Schemat zastosowanego trawienia restrykcyjnego i analizy Southern blot. Oba klony knock-in wykazują mniejszy prążek o wielkości 340 bp, który jest wynikiem integracji konstruktu do Działaj5 loci, a konkretnie dodatkowe Bcl-2W miejscu kasety oporności na hygromycynę. Kontrola typu dzikiego wykazuje oczekiwany prążek o wielkości 5,8 kb, wynikający z dwóch lokalizacji w regionie downstream. Bcl2miejsca. W celu zwiększenia przejrzystości blot został przycięty i złożony. Prosimy o kliknięcie tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

ukierunkowany konstrukt do locus act5nazwa plazmiduliczba zajętych studzienekliczba sprawdzonych klonówKlon pozytywnePoprawnie wyselekcjonowane klony (%)Wykorzystany szczep Dictyosteliumwydajność transfekcji (transfektanty/ 2x10^6/1 µg DNA)
LifeAct-mCherrypPI2677114.2AX23,5x10^-6
LifeAct-GFPpPI271212541.6AX26x10^-6
GFPpDM151333266.6AX21,5x10^-6
mCherrypDM151433133.3AX21,5x10^-6
GFPpDM1513669555.5AX23,3x10^-5
mCherrypDM1514221121083.3AX21,1x10^-4
H2B-mCherrypPI42033133.3AX21,5x10^-6
H2B-mCherrypPI42077685.7AX23,5x10^-6
mCherrypDM15141010770DdB5x10^-6
mCherrypDM1514240121191.6DdB1,2x10^-4
mCherrypDM15143201212100NC41,6x10^-4

Tabela 3: Wydajność transfekcji i liczba uzyskanych pozytywnych transfektantów podczas generowania act5 KI w różnych liniach szczepów2.

Locus act5 zapewnia stosunkowo jednorodną ekspresję zintegrowanego reportera21. Wygenerowane komórki NC4::act5-mCherry umożliwiają przeprowadzanie eksperymentów z mieszaninami komórek wraz z innymi liniami z nokinami act5 wykorzystującymi inne białko fluorescencyjne, takie jak GFP. Aby podkreślić ogromną zaletę tego systemu, przedstawiono eksperymenty z mieszaninami z Ax2::act5-GFP. Ze względu na brak możliwości transfekcji nieaksenicznych komórek typu dzikiego, tego typu podejście nie mogło być wcześniej zastosowane. Eksperymenty z mieszaninami są ważnym narzędziem do analizy zachowania komórek, ponieważ pozwalają na bezpośrednie porównanie różnych linii komórkowych poddanych identycznym warunkom eksperymentalnym. Komórki NC4 rosną na trawnikach bakteryjnych szybciej niż komórki Ax2 (Rysunek 5A). Może to wynikać z wyższej zdolności do fagocytozy bakterii lub lepszej zdolności do ruchu i wykazania chemotaksji w kierunku źródła pokarmu. Za pomocą testu chemotaksji folianowej pod agarem przeprowadzono bezpośrednie porównanie populacji NC4::act5-mCherry i Ax2::act5-GFP, co wykazało, że NC4::act5-mCherry są znacznie wydajniejsze w wykrywaniu folianów. Po 4 h więcej komórek NC4::act5-mCherry było w stanie przemieszczać się pod agarozy niż komórek Ax2::act5-GFP (Rysunek 5B). Analiza standardowych wskaźników chemotaksji dla komórek migrujących pod agarozy wykazała, że komórki NC4::act5-mCherry były szybsze i wykazywały silniejszą odpowiedź chemotaktyczną niż komórki Ax2::act5-GFP (Rysunek 5C-E).

Wyniki testu plackowego; wykresy słupkowe, wykresy rozrzutu, mikroskopia komórkowa; analiza chemotaksji w kierunku folianów.
Rysunek 5Zastosowanie Działanie5 kluczowych wskaźników (KI) dla eksperymentów z mieszaninami w chemotaksji opartej na obrazowaniu. (A) NC4::act5-mCherry i Ax2::act5-GFP wyrażanie wskazanego białka fluorescencyjnego z actPrzeanalizowano 5 loci pod kątem zdolności do wzrostu na trawniku bakteryjnym. Po 4 dniach zmierzono średnicę placków powstałych z pojedynczych kolonii. Dictyostelium pomiary przeprowadzono dla komórek. Nieakseniczne act5Komórki NC4 tworzą znacznie większe plakki niż komórki akseniczne Ax2::act5-GFP komórki (średnia ± SD, ***p < 0,01, n = 3, pasek skali 5 mm). (B) Do zastosowania w teście chemotaksji folianowej pod agarozą22 aby bezpośrednio porównać zdolności chemotaktyczne NC4::act5-mCherry i Ax2::act5-GFP zastosowano w (A), ameby obu szczepów hodowane na bakteriach zmieszano w stosunku 50:50. Pozwolono komórkom przemieszczać się pod agarozą. Po 4 h wykonano obrazowanie komórek migrujących w górę gradientu folianów za pomocą mikroskopu konfokalnego. Liczba NC4::act5-mCherry i Ax2::act5-GFP następnie określono liczbę komórek. NC4::act5-mCherry komórki wykazywały większą wydajność w wykrywaniu folianów, około 10-krotnie większą. NC4::act5-mCherry stwierdzono obecność komórek w porównaniu do Ax2::act5-GFP komórki (średnia ± SD, ***p < 0,001, n = 6, pasek skali 100 µm). (C, D) Komórki filmowano przez 60 min, a następnie obliczono ich prędkość oraz indeks chemotaktyczny. Po wstępnej selekcji komórek wykazujących najsilniejszą odpowiedź chemotaktyczną (wyłącznie tych, które migrowały pod agarozy), Ax2::act5-GFP komórki wykazały niższe wartości zarówno dla prędkości komórek, jak i dla chemotaksji. Analizie poddano pięćdziesiąt komórek z każdej linii komórkowej. (mediana ± SD, *p < 0,01, n = 3). (EŚlady NC4::act5-mCherry i Ax2::act5-GFPactNaniesiono wykres dla 5 linii knock-in w czasie 60 min, wykazujący bardziej ukierunkowany ruch w stronę źródła chemoatraktanta NC4::act5-mCherry komórki (mediana ± SD, ***p < 0,001, n = 6). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Linie komórkowe z knock-in act5 mogą być również wykorzystane do cytometrii przepływowej. Podobnie jak w przypadku wzrostu na bakteriach, występują znaczne różnice w rozwoju między szczepami aksenicznymi a nieaksenicznymi typami dzikimi. Po zakończeniu rozwoju ciała owocnikowe komórek NC4 są około dwa razy większe od tych pochodzących z komórek Ax2. W przypadku zmieszania komórek uzyskuje się ciało owocnikowe o rozmiarze pośrednim. Aby bardziej ilościowo przeanalizować wkład obu linii komórkowych, zastosowano cytometrię przepływową. Analizy te wykazały jednoznacznie, że ciała owocnikowe o rozmiarze pośrednim wynikają z różnych poziomów wkładu obu linii komórkowych. Podczas gdy komórki NC4::act5-mCherry stanowiły około 75% zmierzonych zarodników, wkład komórek Ax2::act5-GFP wyniósł jedynie 25%, co ujawniło potencjalną przewagę przystosowawczą szczepów nieaksenicznych (Ryc. 6). Ponieważ analiza nie monitoruje populacji komórek trzonu, istnieją dwie możliwości wyjaśnienia braku równowagi w rozwoju między Ax2 a NC4. Jedną z możliwości jest to, że komórki Ax2 przyczyniają się głównie do populacji komórek trzonu, zamiast wchodzić w skład populacji komórek zarodników. Alternatywnie, więcej komórek NC4 może wchodzić w cykl rozwojowy, podczas gdy rozwój Ax2 jest relatywnie opóźniony, przez co nie są one w stanie przyczynić się do budowy ciała owocnikowego. Możliwość transfekcji nieaksenicznych komórek typu dzikiego pozwala na dalszy rozwój innych podejść i znacznie upraszcza procedury eksperymentalne.

Analiza białek fluorescencyjnych; zastosowanie GFP i mCherry w eksperymencie dotyczącym tworzenia przetrwalników; obejmuje wyniki mikroskopii oraz wykresy danych.
Rysunek 6: Działać5 KIs umożliwiają analizę eksperymentów z użyciem mieszanin metodą cytometrii przepływowej. (A) NC4::act5-mCherry i Ax2::act5-GFP hodowano osobno lub w mieszaninie w stosunku 50:50 na płytkach z agarem beznutrientowym. NC4::act5-mCherry komórki tworzą większe ciała owocnikowe niż Ax2::act5-GFPMieszanina wykazuje natomiast rozmiar pośredni (pasek skali 5 mm). Konfokalna mikroskopia fluorescencyjna sugeruje większą ilość NC4::act5-mCherry zarodniki w głowach zarodnikowych pochodzących z mieszanek. (B) Aby ilościowo określić tę obserwację, zawartość przetrwalników w zebranych głowiczkach przetrwalnikowych z eksperymentu mieszania opisanego w punkcie (A) przeanalizowano za pomocą cytometrii przepływowej. Około 75% przetrwalników pochodziło z NC4::act5-mCherry komórki, z których tylko 25% pochodzi z Ax2::act5-GFP komórki. (C) Reprezentatywny rozkład zarodników z obu linii komórkowych przedstawiony na wykresie rozrzutu cytometrii przepływowej. Około 0,05% wykazuje pozytywne sygnały mCherry i GFP, co sugeruje, że doszło do procesów fuzji paraseksualnej lub że zarodniki przywierają do siebie. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Linia komórkowaTło genetyczneNumer referencyjnyOpublikowano wcześniejTyp
AX2 (Ka)DBS023521Bloomfield i wsp., 208typ dziki
NC4 (S)Bloomfield i in., 208typ dziki
klon 5 act5::mCherryNC4HM1912Paschke i in., 2018knock-in act5
akt5::GFP Klon 2AX2HM1930Paschke i in., 2018knock-in act5
V12M2Bloomfield i wsp., 208typ dziki
WS2162Bloomfield i in., 2008typ dziki

Tabela uzupełniająca 1: Badane szczepy Dictyostelium.

Dyskusja

Wykorzystanie nieaksenicznych, dzikich komórek Dictyostelium było do tej pory bardzo ograniczone w badaniach molekularnych. Dostępne metody inżynierii genetycznej tych szczepów są niewystarczająco niezawodne i skuteczne23, co uniemożliwia ich powszechne przyjęcie. Przedstawione tutaj uzyskane materiały i protokoły mogą być wykorzystane dla dowolnego szczepu D. discoideum, niezależnie od jego zdolności do wzrostu w płynnym podłożu. Należy wspomnieć, że protokół ten jest zoptymalizowany pod kątem linii komórkowych pochodzących z NC4. Skuteczność transfekcji dla świeżo wyizolowanych szczepów ze środowiska naturalnego różni się od NC4, jak zaobserwowaliśmy wcześniej i jest pokazana tutaj dla V12M2 i WS2162 8,9. Wydaje się, że warunki elektroporacji mają w szczególności znaczący wpływ na wydajność transfekcji i mogą wymagać dalszej optymalizacji w przypadku niektórych szczepów. Ogólnie rzecz biorąc, we wszystkich testowanych do tej pory szczepach zaobserwowano wystarczającą ilość transfektantów, co pokazuje, że metody te są wykonalne. Liczba dodatnich transfektantów uzyskanych przy użyciu szczepów pochodzących z NC4 jest wyższa w porównaniu z innymi nieaksenicznymi szczepami typu dzikiego, ale we wszystkich przypadkach uzyskuje się wystarczającą liczbę transfektantów, aby umożliwić dalsze eksperymenty. To, w połączeniu z prostotą naszego protokołu, jest znaczną poprawą w porównaniu z wcześniejszymi próbami 8,9.

Te nowe protokoły nieakseniczne obejmują wszystkie standardowe procedury genetyczne i dodają dalszych korzyści, ponieważ transfekcje mogą być wykonywane szybko i wydajnie równolegle. Dodatnie klony można uzyskać w ciągu kilku dni, a nie tygodni, ponieważ wzrost bakterii skraca czas podziału o połowę. Nowo powstałe plazmidy działają również w warunkach aksenicznych i mogą być rutynowo używane w obu warunkach wzrostu, co jest kolejnym osiągnięciem tej metodologii22. Jak wprowadzono w protokole, plazmid używany do selekcji na bakteriach ma specjalne wymagania, które są kluczowe dla powodzenia transfekcji. W szczególności promotory napędzające kasety ekspresji i oporu są ważne dla udanej transfekcji. Często stosowany promotor act6 (aktyna 6)24 do napędzania kaset oporności lub ekspresji nie jest skuteczny, gdy komórki są hodowane na bakteriach. W naszym układzie plazmidowym wysoce aktywny promotor act15 (aktyna 15) napędza wszystkie kasety ekspresyjne, podczas gdy kasety oporności są pod kontrolą promotora coA (koaktozyny A), z których oba są aktywne w warunkach aksonicznych i w komórkach hodowanych na bakteriach. Wymagania dotyczące ekspresji konstruktów reporterowych oraz konstruktów knock-in i knock-out sprawiają, że konieczne jest korzystanie z naszego repertuaru plazmidowego, ale niestety ograniczają użycie już utworzonych wektorów, które wykorzystują nieefektywny promotor act6 .

Wydajność promotora jest szczególnie istotna w przypadku transfekcji, które zależą od pojedynczego zdarzenia integracji z właściwym locus genomu. Ze względu na nasze ulepszenie promotorów napędzających ekspresję genów oporności, wystarczająca ilość białka oporności jest wytwarzana z integracji pojedynczego locus. Głównym problemem było faworyzowanie wielu integracji z genomem podczas stosowania higromycyny lub G418, jak opisano. Do tej pory nie zaobserwowano faworyzowania wielu integracji, o czym informowano wcześniej w przypadku selekcji G418 korzystających ze starszych systemów promotorów25. Oznacza to, że zarówno higromycyna, jak i G418 są odpowiednimi markerami do generowania czystych wybijaczy i wybijających. Niestety, wybieralny marker blasticydyna nie działa w warunkach nieaksenicznych. Jest to główna wada naszej metody, ponieważ kaseta oporności na blasticydynę jest rutynowo używana do generowania konstruktów nokautujących w D. discoideum. Konstrukty, które zostały już wygenerowane przy użyciu kaset oporności na blasticydynę, będą musiały zostać ponownie wyprowadzone przy użyciu jednego z działających markerów do wyboru. Inną możliwością przezwyciężenia tego ograniczenia jest połączenie niedawno opracowanej technologii CRISPR D . discoideum z tym protokołem transfekcji26. Generowanie odpowiednich, jednoprowadnicowych RNA (sgRNA) jest prostsze i szybsze niż rekonstrukcja kompletnych konstruktów nokautujących. Jeśli chodzi o przyszłe kierunki, możliwość generowania wielu nokautów za pomocą CRISPR/Cas9 w połączeniu z tym protokołem transfekcji jest atrakcyjna i może utorować drogę wielu badaczom w społeczności Dictyostelium . Należy jednak dokładnie zbadać wykonalność ustalonego przejściowego systemu ekspresji stosowanego w CRISPR/Cas9 w komórkach hodowanych aksenicznie.

Przedstawiony system knock-in act5 oferuje niezawodny i bezpieczny system integracji do generowania stabilnych linii komórkowych w D. discoideum, z przewagą podobnych miejsc powstałych w innych organizmach22. Zależy również od pojedynczego zdarzenia integracyjnego w genomie i daje wiele możliwości dla różnych kierunków badań. Promotor act5 jest silnie aktywny i gwarantuje prawie jednorodną ekspresję27 niezależnie od warunków uprawy. Fluorescencyjne białka reporterowe można łatwo zintegrować z tym bezpiecznym miejscem za pomocą zmodyfikowanych plazmidów docelowych. Może to być przydatne na przykład do celów śledzenia komórek, jak pokazano w eksperymencie mieszanym. Komórki wykazują minimalną zmienność ekspresji między komórkami, co może pomóc w automatycznym śledzeniu komórek. Co ważne, wstawienie pożądanej sekwencji do locus aktu5 wydaje się fenotypowo neutralne28,29. Ponieważ ekspresja nie zależy od selektywnego markera w celu utrzymania ekspresji białka, jak to widać w losowych integrantach lub liniach komórkowych zawierających wektory pozachromosomalne, system act5 może być również przydatny w eksperymentach ratunkowych. Ponieważ linie komórkowe są jednorodne, wszystkie komórki mogą być analizowane. Nie jest to możliwe przy użyciu plazmidu pozachromosomalnego do ekspresji, w którym występuje znaczna niejednorodność ekspresji.

Oprócz tych ogólnych ulepszeń dla wszystkich szczepów, możliwość wykorzystania nieaksenicznych komórek typu dzikiego do badań molekularnych pozwala na ocenę skutków skumulowanych mutacji w obecnych szczepach laboratoryjnych. Od czasu przyjęcia szczepu Ax2 w 1970 r. stwierdzono wiele rearanżacji genetycznych, jak wykazały wcześniej opublikowane analizy mikromacierzy26. Syntetyczne fenotypy są obserwowane ze względu na obecność tych mutacji. Na przykład zgłoszony mutant phg2 wykazuje zmniejszoną adhezję w jednym tle szczepu laboratoryjnego i zwiększoną przyczepność w innych3. Takie sprzeczne dane można teraz rozwiązać, powtarzając eksperyment na wspólnym szczepie przodka (w tym przypadku DdB). Siła tego podejścia została ostatnio pokazana dla małej GTPazy RasS30,31.

Możliwość przeprowadzania eksperymentów genetycznych na dowolnym szczepie D. discoideum rozszerza potencjał nowych kierunków badań, które zależą od wykorzystania dzikich izolatów, w szczególności tych związanych z ewolucją społeczną, rozpoznawaniem krewniactwa i cyklem płciowym22.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Autorzy dziękują laboratorium Kay za wkład w tę metodę oraz urządzeniom mikroskopii LMB i cytometrii przepływowej za doskonałe wsparcie naukowe i techniczne. Praca ta została sfinansowana z grantu Rady ds. Badań Medycznych MC_U105115237 dla R. R. Kaya, grantu BBSRC (Rada ds. Badań Biotechnologii i Nauk Biologicznych) BB/K009699/1 dla R. R. Kaya, grantu Cancer Research UK A15672 dla R. H. Insalla, stypendium Wellcome Trust Senior Fellowship 202867/Z/16/Z dla Jonathana R. Chubba oraz finansowania MRC (MC_U12266B) dla MRC LMCB University Unit na UCL.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Equipment
Eppendorf Mikrowirówki 5424/5424RThermoScientific05-400-002
Wirówki Eppendorf 5702R z wirnikiem modelu A-4-38ThermoScientific12823252
Eppendorf Mastercycler Nexus Thermal CyclersSigma AldrichEP6331000025
Gene Pulser X Cell, w tym CE & Moduły PCSzafa bezpieczeństwa BioRad1652660
Foruna - SCANLAFLabogene
BioPhotometer PlusEppendorf
CLSM 710Zeiss
Media & Agarozy
LoFlo MediumFormediumLF0501
Seakem GTG AgarozaLonza50071
Low EEO AgarozaBioGene300-200
Agar CzystyOxoidLP0028
SM RosółFormediumSMB0102
2x LB bulionFormediumLBD0102
Chemicals
SYBR Bezpieczny barwnik żelowy DNAThermoScientificS33102
1 Kb Plus Drabinka DNAThermoScientific10787018
1 Kb Drabinka DNANEBN3232L
Kwas wolny od HEPESSigma Aldrich/Merck391340 EMD
KH2PO4VWRP/4800/53
Na2HPO4 * 2 H2OVWR10028-24-7
MgCl2 * 6 H2OSigma Aldrich/Merck5982 EMD
CaCl2 * 2 H2OSigma Aldrich442909
Kwas foliowySigma AldrichF7876
KOHVWR26668.263
Cult Dish
96 Klaster hodowli komórkowych studzienek, płaskie dno z pokrywką o niskiej parowaniu, poddany hodowli tkankowejCorning Incorporated3595
6-dołkowy klaster hodowli komórkowych, płaskie dno z pokrywką, Corning Incorporated poddany hodowli tkankowej3516
Naczynie do hodowli tkankowej w stylu 100 x 20 mm,Corning353003
Naczynia Microwell ze szklanym dnem 50 mm No1.5MatTek CorporationP50G-1.5-30-F
Antybiotyki
Geneticin G418-siarczanGibco firmy Life Technologies11811-023
Hygromycin BGold InvivoGenant-hg-1
Dodatkowe materiały eksploatacyjne
2 mm kuwety elektroporacyjne szczelinowe, długa elektrodaGeneflowLimited E6-0062
10 µ L Pętla do zaszczepiania, niebieska 10 mikro L129399ThermoScientific
, sterylnyGreiner Bio-one730190
Combitips advanced 5 mlEppendorf BIOPUR30089669
Kits
ZR Plasmid Miniprep ClassicZymoresearchD4016
Quick DNA Zestaw MiniprepZymoresearchD3025
Zymoclean Zestaw do odzyskiwania DNAZymoresearchD40002
Enzymes
Restriction enzymyNEB
OneTaq 2X Master Mix ze standardowym buforemNEBM0482L
Ligaza DNA T4NEBM0202S
PrimeSTAR Max Polimeraza DNATakaraBioR045A
Incorporated Rozsiewacz

Bibliografia

  1. Schaap, P. Evolutionary crossroads in developmental biology: Dictyostelium discoideum. Development. 138 (3), 387-396 (2011).
  2. Sussman, R., Sussman, M. Cultivation of Dictyostelium discoideum in axenic culture. Biochemical and Biophysical Research Communications. 29, 53-55 (1967).
  3. Bloomfield, G., Tanaka, Y., Skelton, J., Ivens, A., Kay, R. R. Widespread duplications in the genomes of laboratory stocks of Dictyostelium discoideum. Genome Biology. 9 (4), 75(2008).
  4. Witke, W., Nellen, W., Noegel, A. Homologous recombination in the Dictyostelium alpha-actinin gene leads to an altered mRNA and lack of the protein. The EMBO Journal. 6, 4143-4148 (1987).
  5. De Lozanne, A., Spudich, J. A. Disruption of the Dictyostelium myosin heavy chain gene by homologous recombination. Science. 236, 1086-1091 (1987).
  6. Howard, P. K., Ahern, K. G., Firtel, R. A. Establishment of a transient expression system for Dictyostelium discoideum. Nucleic Acids Research. 16, 2613-2623 (1988).
  7. Knecht, D., Pang, K. M. Electroporation of Dictyostelium discoideum. Methods in Molecular Biology. 47, 321-330 (1995).
  8. Wetterauer, B., et al. Wild-type strains of Dictyostelium discoideum can be transformed using a novel selection cassette driven by the promoter of the ribosomal V18 gene. Plasmid. 36, 169-181 (1996).
  9. Lloyd, M. M., Ceccarelli, A., Williams, J. G. Establishment of conditions for the transformation of nonaxenic Dictyostelium strains. Developmental Genetics. 11, 391-395 (1990).
  10. Bloomfield, G., et al. Neurofibromin controls macropinocytosis and phagocytosis in Dictyostelium. eLife. 4, (2015).
  11. Veltman, D. M., et al. A plasma membrane template for macropinocytic cups. eLife. 5, (2016).
  12. Veltman, D. M., Lemieux, M. G., Knecht, D. A., Insall, R. H. PIP(3)-dependent macropinocytosis is incompatible with chemotaxis. The Journal of Cell Biology. 204 (4), 497-505 (2014).
  13. Hoeller, O., Kay, R. R. Chemotaxis in the absence of PIP3 gradients. Current Biology. 17, 813-817 (2007).
  14. Chubb, J. R., Wilkins, A., Thomas, G. M., Insall, R. H. The Dictyostelium RasS protein is required for macropinocytosis, phagocytosis and the control of cell movement. Journal of Cell Science. 113, 709-719 (2000).
  15. Schaap, P., et al. Molecular phylogeny and evolution of morphology in the social amoebas. Science. 314, 661-663 (2006).
  16. Du, Q., Kawabe, Y., Schilde, C., Chen, Z. H., Schaap, P. The Evolution of Aggregative Multicellularity and Cell-Cell Communication in the Dictyostelia. Journal of Molecular Biology. 427 (23), 3722-3733 (2015).
  17. Hirose, S., Benabentos, R., Ho, H. I., Kuspa, A., Shaulsky, G. Self-recognition in social amoebae is mediated by allelic pairs of tiger genes. Science. 333 (6041), 467-470 (2011).
  18. Strassmann, J. E., Queller, D. C. Evolution of cooperation and control of cheating in a social microbe. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (2), 10855-10862 (2011).
  19. Wolf, J. B., et al. Fitness Trade-offs Result in the Illusion of Social Success. Current Biology. 25 (8), 1086-1090 (2015).
  20. Veltman, D. M., Akar, G., Bosgraaf, L., Van Haastert, P. J. A new set of small, extrachromosomal expression vectors for Dictyostelium discoideum. Plasmid. 61 (2), 110-118 (2009).
  21. Southern, E. M. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. Journal of Molecular Biology. 98 (3), 503-517 (1975).
  22. Paschke, P., et al. Rapid and efficient genetic engineering of both wild type and axenic strains of Dictyostelium discoideum. PLoS One. 13 (5), 0196809(2018).
  23. Woznica, D., Knecht, D. A. Under-agarose chemotaxis of Dictyostelium discoideum. Methods in Molecular Biology. 346, 311-325 (2006).
  24. Dubin, M., Nellen, W. A versatile set of tagged expression vectors to monitor protein localisation and function in Dictyostelium. Gene. 465 (1-2), 1-8 (2010).
  25. de Hostos, E. L., et al. Dictyostelium mutants lacking the cytoskeletal protein coronin are defective in cytokinesis and cell motility. Journal of Cell Biology. 120, 163-173 (1993).
  26. Sekine, R., Kawata, T., Muramoto, T. CRISPR/Cas9 mediated targeting of multiple genes in Dictyostelium. Scientific Reports. 8 (1), 8471(2018).
  27. Sadelain, M., Papapetrou, E. P., Bushman, F. D. Safe harbours for the integration of new DNA in the human genome. Nature Reviews Cancer. 12 (1), 51-58 (2011).
  28. Rosengarten, R. D., et al. Leaps and lulls in the developmental transcriptome of Dictyostelium discoideum. BMC Genomics. 16, 294(2015).
  29. Tunnacliffe, E., Corrigan, A. M., Chubb, J. R. Promoter-mediated diversification of transcriptional bursting dynamics following gene duplication. Proc Natl Acad Sci USA. 115 (33), 8364-8369 (2018).
  30. Gebbie, L., et al. Phg2, a kinase involved in adhesion and focal site modeling in Dictyostelium. Molecular Biology of the Cell. 15, 3915-3925 (2004).
  31. Jeon, T. J., Lee, D. J., Merlot, S., Weeks, G., Firtel, R. A. Rap1 controls cell adhesion and cell motility through the regulation of myosin II. Journal of Cell Biology. 176, 1021-1033 (2007).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Selekcja bakteryjnaprotok elektroporacjiwalidacja transfekcjianaliza Southern blottest chemotaksjiwzrost makropinocytozywie e izolatyplazmid pozachromosomalny
Inżynieria genetyczna komórek Dictyostelium discoideum oparta na selekcji i wzroście bakterii
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.