Artykuł metodologiczny

Inżynieria genetyczna komórek Dictyostelium discoideum oparta na selekcji i wzroście bakterii

DOI:

10.3791/58981

⸱

25 stycznia 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1MRC Laboratory of Molecular Biology, 2Department of Molecular and Cell Biology, University of Connecticut, 3Cancer Research UK Beatson Institute Glasgow, 4MRC Laboratory for Molecular Cell Biology, University College London, 5Department of Cell and Developmental Biology, University College London

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dictyostelium discoideum to popularny organizm modelowy do badania złożonych procesów komórkowych, takich jak migracja komórek, endocytoza i rozwój. Użyteczność organizmu zależy od wykonalności manipulacji genetycznej. W tym miejscu przedstawiamy metody transfekcji komórek Dictyostelium discoideum, które przezwyciężają istniejące ograniczenia hodowli komórek w płynnych pożywkach.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dictyostelium discoideum to intrygujący organizm modelowy do badania procesów różnicowania komórek podczas rozwoju, sygnalizacji komórkowej i innych ważnych zagadnień biologii komórkowej. Dostępne technologie genetycznej manipulacji komórkami Dictyostelium są dobrze rozwinięte. Transfekcje mogą być wykonywane przy użyciu różnych wybieralnych markerów i recyklingu markerów, w tym rekombinacji homologicznej i mutagenezy insercyjnej. Potwierdza to dobrze opisany genom. Jednak podejścia te są zoptymalizowane pod kątem linii komórek aksenowych rosnących w płynnych kulturach i są trudne do zastosowania w nieaksenicznych komórkach typu dzikiego, które żywią się tylko bakteriami. Mutacje, które są obecne w szczepach aksenowych, zaburzają sygnalizację Ras, powodując nadmierną makropinocytozę wymaganą do odżywiania się i upośledzają migrację komórek, co zakłóca interpretację eksperymentów z transdukcją sygnału i chemotaksją w tych szczepach. Wcześniejsze próby genetycznej manipulacji komórkami nieaksenicznymi były nieskuteczne i wymagały skomplikowanych procedur eksperymentalnych. Opracowaliśmy prosty protokół transfekcji, który po raz pierwszy pokonuje te ograniczenia. Ta seria dużych ulepszeń genetyki molekularnej Dictyostelium pozwala na manipulowanie komórkami typu dzikiego tak łatwo, jak standardowymi szczepami laboratoryjnymi. Oprócz korzyści płynących z badania nieuszkodzonych procesów sygnalizacji i ruchliwości, mutanty, które zakłócają wzrost oparty na makropinocytozie, można teraz łatwo wyizolować. Co więcej, cały proces transfekcji jest znacznie przyspieszony, dzięki rekombinowanym komórkom, które można wygenerować w ciągu kilku dni, a nie tygodni. Kolejną zaletą jest to, że genetyka molekularna może być dalej prowadzona na świeżo wyizolowanych próbkach Dictyostelium typu dzikiego ze środowiska. Może to przyczynić się do rozszerzenia zakresu podejść stosowanych w tych obszarach badawczych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rodzaj Dictyostelium to żyjące w glebie ameby społeczne, które żywią się głównie bakteriami. Umieszczono je w gromadzie Amoebozoa, wyizolowano dużą liczbę gatunków, które można pogrupować w cztery różne klady1. Gatunek Dictyostelium discoideum (D. discoideum) stał się popularnym organizmem modelowym do badania złożonych procesów komórkowych, takich jak migracja komórek i fagocytoza. Aby kontrolować i standaryzować warunki eksperymentalne, opracowano linie komórek aksenicznych, które są w stanie rosnąć w złożonym lub zdefiniowanym płynnym podłożu pod nieobecność bakterii2. Szczególne znaczenie mają szczepy Ax2, Ax3 i Ax4, które zostały wygenerowane w latach siedemdziesiątych XX wieku i ostatecznie pochodzą z jednego dzikiego izolatu NC43. Narzędzia do inżynierii genetycznej zostały opracowane w tych odmianach aksonicznych, co zaowocowało pierwszym opublikowanym nokautem w 1987 roku4,5. Protokoły zostały dalej rozwinięte i zoptymalizowane do użytku w warunkach aksonicznych6,7.

Adaptacja tych protokołów do dzikich szczepów D. discoideum, które nie są w stanie rosnąć w płynnym bulionie, została podjęta przez kilka laboratoriów. Jednak nie udało się to w pełni, ponieważ protokoły transfekcji są złożone i brakuje im wydajności, częściowo ze względu na zdolność bakterii do działania jako pochłaniacz dla selektywnych odczynników8,9. W rezultacie, zasadniczo wszystkie dane molekularne dotyczące D. discoideum pochodzą od potomków pojedynczego izolatu typu dzikiego. Chcieliśmy przezwyciężyć to ograniczenie i opracować metodę genetycznej modyfikacji komórek D. discoideum niezależnie od ich zdolności do wzrostu w płynnym podłożu. Potrzebę takiej metody można wytłumaczyć obserwacją, że w przeszłości zakładano, iż mutacje umożliwiające wzrost akseniczny są głównie neutralne i nie upośledzają fizjologii komórki. Przypuszczenie to jest tylko częściowo słuszne. Ogólnie rzecz biorąc, istnieją dwie znaczące różnice; Po pierwsze, między różnymi izolowanymi szczepami aksenicznymi, a po drugie, gdy te szczepy akseniczne są porównywane z dzikimi izolatami nieaksenicznymi8,9.

Być może najbardziej krytycznym czynnikiem jest kluczowy gen aksoniczny, axeB, który został niedawno zidentyfikowany jako RasGAP NF1. Główną funkcją NF1 jako RasGAP jest ograniczanie aktywności Ras3. Delecja enzymu we wszystkich szczepach aksenicznych prowadzi do nadmiernej aktywności Ras, objawiającej się tworzeniem dużych aktywnych plam Ras. Te powiększone plamy Ras prowadzą do akumulacji PIP3 w błonie plazmatycznej. Te przypadkowo pojawiające się plamy PIP3 i aktywnego Ras są szablonem do tworzenia okrągłej falbanki, która ostatecznie zamyka się i prowadzi do powstania makropinosomów10. Konsekwencją jest nadmierny wzrost aktywności makropinocytarnej. Makropinocytoza jest procesem napędzanym przez aktynę. Wynikiem jest konkurencja o składniki cytoszkieletu w celu tworzenia makropinosomów lub pseudopodów. Jego wpływ na zachowanie komórek znajduje odzwierciedlenie w prawie całkowitym zapobieganiu chemotaksji komórek wegetatywnych do folianów11. Znacznie powiększone plastry PIP3 są bardzo trwałe. Nawet w wygłodzonych komórkach plamy PIP3 pozostają i mogą być błędnie interpretowane jako pseudopody, co może powodować problemy z interpretacją badań nad chemotaksją do cAMP.

W niektórych przypadkach mutacja NF1 jest eksperymentalnie użyteczna. To prowadzi nas do drugiej motywacji do opracowania metody transfekcji dla hodowanych bakteryjnie komórek D. discoideum, ponieważ wzrost częstości makropinocytozy sprawia, że komórki akseniczne są cenne dla badania podstawowych aspektów tego procesu12. Jednak mutacje w genach wymaganych do makropinocytozy, takich jak kinazy Ras i PI310, prawie zniosły wzrost aksenów, co spowodowało konieczność manipulowania tymi komórkami poprzez wzrost na bakteriach. Innym powodem, dla którego transfekcje oparte na bakteriach są cenne, jest coraz częstsze wykorzystanie Dictyostelids do badania kwestii związanych z ewolucją wielokomórkowości13,14, kin recognition15,16, oraz altruistyczne zachowania komórkowe, które zależą głównie od użycia świeżo wyizolowanych izolatów typu dzikiego17. Wszystkie wymienione obszary badawcze mogą być ułatwione dzięki skutecznym metodom manipulacji genetycznej dzikimi izolatami, które nie są akseniczne i nie rosną w płynnym bulionie.

Nasze protokoły pozwalają na pokonanie opisanych ograniczeń. Podsumowując, możliwość przeprowadzenia manipulacji genetycznych na wyhodowanych bakteryjnie komórkach D. discoideum przynosi korzyści wszystkim badaczom Dictyostelium, nawet jeśli jest to tylko zwiększona szybkość procesu selekcji ze względu na szybszy wzrost ameby (4 godziny czasu podwojenia) na bakteriach w porównaniu ze wzrostem w pożywce aksenicznej (10 godzin czasu podwojenia).

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie komórek i materiałów

  1. Przygotowanie buforu SorMC
    1. Przygotować 100 ml 100x buforu SorMC (bufor Sorensena, w tym MgCl2 i CaCl2), rozpuszczając 20,36 g KH2PO4 (15 mM) i 5,47 g Na2HPO4·7 H2O (2mM) w 100 ml wody ddH2O. Wymieszać roztwór w temperaturze pokojowej (RT) i doprowadzić objętość do 100 ml za pomocą dH2O.
      nuta: Powstały bufor ma pH 6 i nie wymaga dalszej regulacji.
    2. Wyprodukować 1000 ml 1x roztworu roboczego w ddH2O. Dodać po 50 μL MgCl2 i CaCl2, aby osiągnąć końcowe stężenia 50 μM każdy. Filtr wysterylizuj roztwór za pomocą filtra 0,22 μm.
      nuta: Zawsze dodawaj MgCl2 i CaCl2 do buforu 1x, aby uniknąć wytrącania się soli w 100x roztworze podstawowym.
    3. Alternatywnie należy przygotować bufor KK2 (2,2 g KH2PO4 i 0,7 g K2HPO4 na 1 l buforu) uzupełniony 50 μM MgCl2 i 50 μM CaCl2 (zwany dalej KK2MC). Użyj tego bufora przez cały czas zamiast SorMC.
  2. Przygotowanie bakterii jako źródła pożywienia dla D. discoideum
    1. Użyj pojedynczej kolonii K. aerogenes i zaszczepij 1 l pożywki LB (bulion lizogeniczny). Użyć kolby o pojemności 2 l. Pozwól bakteriom rosnąć przez noc w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 220 obr./min.
      nuta: Jeśli wymagane są duże ilości bakterii, użyj bogatszych pożywek, takich jak 2xTY (pożywka tryptonowa z ekstraktu drożdżowego) lub SOB (super optymalny bulion) zamiast LB. W przypadku, gdy stosowanie bakterii K. aerogenes nie jest dozwolone ze względu na ograniczenia bezpieczeństwa, zamiast tego można użyć BL21 E. coli.
    2. Zbierz komórki następnego dnia, obracając je w dwóch probówkach wirówkowych o pojemności 500 ml przy ~6,600 x g przez 20 minut. Umyj bakterie raz 500 ml buforu SorMC.
    3. Zawiesić osad w 20 ml SorMC. Sprawdź OD600 (gęstość optyczna przy 600 nm) za pomocą fotometru. Rozcieńczyć tym samym buforem do OD600 około 100,
      UWAGA: Bakterie K. aerogenes są trudne do granulowania, dlatego konieczna jest stosunkowo duża prędkość do obracania bakterii, aby uniknąć utraty bakterii pokarmowych. Otrzymany bakteryjny roztwór podstawowy może być przechowywany do 4 miesięcy w lodówce w temperaturze 4 °C i zachowuje swoją użyteczność jako źródło pożywienia dla D. discoideum. 1 l zawiesiny K. aerogenes wyhodowanej na noc na podłożu LB zwykle daje 20 ml OD600 około 100,
      ostrożność: Aby upewnić się, że przygotowane bakterie są monokulturą K. aerogenes, należy wykonać wszystkie czynności pod maską.
  3. Przygotowanie buforu do elektroporacji H40
    1. Przygotować 100 ml roztworu buforowego, rozpuścić 0,952 g HEPES w wodzieddH 2O i dodać 100 μl MgCl2 z 1 M roztworu podstawowego. Dostosuj do pH 7 za pomocą KOH do miareczkowania. Wysterylizuj bufor za pomocą filtra 0,22 μm lub autoklawu. Używaj bezkwasowego HEPES, a nie soli sodowej.
  4. Preparat plazmidu należy wykonać zgodnie z protokołem producenta i przy użyciu zestawów podsumowanych w Tabeli Materiałów. Należy użyć plazmidów podsumowanych w tabeli 1.
    nuta: Jakość DNA używanego do transfekcji ma kluczowe znaczenie. Selekcja transfektantów D. discoideum rosnących na bakteriach ma specyficzne wymagania dla promotorów napędzających kasetę selekcji i ekspresji (patrz dyskusja).
nazwa plazmidu Oporność/selekcja u bakterii odporność/selekcja w Dictyostelium znacznik plazmidy ekspresji pozachromosomalnej pDM1203 powiedział: Ampicilin (Ampicilin) Zobacz materiał G418 Nie pDM1207 powiedział: Ampicilin (Ampicilin) Zobacz materiał G418 Wskaźnik GFP z końcówką N pDM1208 powiedział: Ampicilin (Ampicilin) Zobacz materiał G418 Zacisk N mCherry pPI159 powiedział: Ampicilin (Ampicilin) Zobacz materiał G418 N-zacisk mNeon pPI437 powiedział: Ampicilin (Ampicilin) Zobacz materiał G418 N-terminal mScarlet pPI54 powiedział: Ampicilin (Ampicilin) Zobacz materiał G418 N-końcowy mTurkusowy2 pDM1209 powiedział: Ampicilin (Ampicilin) Zobacz materiał G418 Zacisk C GFP pDM1210 powiedział: Ampicilin (Ampicilin) Zobacz materiał G418 Zacisk C mCherry pPI143 powiedział: Ampicilin (Ampicilin) Zobacz materiał G418 Zacisk C mNeon pPI459 powiedział: Ampicilin (Ampicilin) Zobacz materiał G418 C-terminal mScarlet pPI142 powiedział: Ampicilin (Ampicilin) Zobacz materiał G418 C-terminal mTurkusowy2 plazmidy wahadłowe pDM344 powiedział: Ampicilin (Ampicilin) Nie Nie pDM1019 powiedział: Ampicilin (Ampicilin) Nie Wskaźnik GFP z końcówką N pDM1018 powiedział: Ampicilin (Ampicilin) Nie Zacisk N mCherry pPI152 powiedział: Ampicilin (Ampicilin) Nie N-zacisk mNeon pPI418 powiedział: Ampicilin (Ampicilin) Nie N-terminal mScarlet pPI150 powiedział: Ampicilin (Ampicilin) Nie N-końcowy mTurkusowy2 pDM1021 powiedział: Ampicilin (Ampicilin) Nie Zacisk C GFP pDM1020 powiedział: Ampicilin (Ampicilin) Nie Zacisk C mCherry pPI153 powiedział: Ampicilin (Ampicilin) Nie Zacisk C mNeon pPI457 powiedział: Ampicilin (Ampicilin) Nie C-terminal mScarlet pPI151 powiedział: Ampicilin (Ampicilin) Nie C-terminal mTurkusowy2 indukowane plazmidy o ekspresji pozachromosomalnej pDM1038 powiedział: Ampicilin (Ampicilin) Higromycyna Nie pDM1047 powiedział: Ampicilin (Ampicilin) Higromycyna Wskaźnik GFP z końcówką N pDM1046 powiedział: Ampicilin (Ampicilin) Higromycyna Zacisk N mCherry pPI450 powiedział: Ampicilin (Ampicilin) Higromycyna N-zacisk mNeon pPI452 powiedział: Ampicilin (Ampicilin) Higromycyna N-terminal mScarlet pPI449 powiedział: Ampicilin (Ampicilin) Higromycyna N-końcowy mTurkusowy2 pDM1049 powiedział: Ampicilin (Ampicilin) Higromycyna Zacisk C GFP pDM1048 powiedział: Ampicilin (Ampicilin) Higromycyna Zacisk C mCherry pPI470 powiedział: Ampicilin (Ampicilin) Higromycyna Zacisk C mNeon pPI460 powiedział: Ampicilin (Ampicilin) Higromycyna C-terminal mScarlet pPI469 powiedział: Ampicilin (Ampicilin) Higromycyna C-terminal mTurkusowy2 act5 bezpieczna przystań dla plazmidów docelowych pDM1501 powiedział: Ampicilin (Ampicilin) Higromycyna Nie pDM1513 powiedział: Ampicilin (Ampicilin) Higromycyna Wskaźnik GFP z końcówką N pDM1514 powiedział: Ampicilin (Ampicilin) Higromycyna Zacisk N mCherry pPI231 powiedział: Ampicilin (Ampicilin) Higromycyna N-zacisk mNeon pPI419 powiedział: Ampicilin (Ampicilin) Higromycyna N-terminal mScarlet pPI228 powiedział: Ampicilin (Ampicilin) Higromycyna N-końcowy mTurkusowy2 pDM1515 powiedział: Ampicilin (Ampicilin) Higromycyna Zacisk C GFP pDM1516 powiedział: Ampicilin (Ampicilin) Higromycyna Zacisk C mCherry pPI230 powiedział: Ampicilin (Ampicilin) Higromycyna Zacisk C mNeon pPI458 powiedział: Ampicilin (Ampicilin) Higromycyna C-terminal mScarlet pPI229 powiedział: Ampicilin (Ampicilin) Higromycyna C-terminal mTurkusowy2 plazmidy ekspresji REMI pDM1220 powiedział: Ampicilin (Ampicilin) Higromycyna Nie pDM1351 powiedział: Ampicilin (Ampicilin) Higromycyna Wskaźnik GFP z końcówką N pDM1259 powiedział: Ampicilin (Ampicilin) Higromycyna Zacisk N mCherry pPI465 powiedział: Ampicilin (Ampicilin) Higromycyna N-zacisk mNeon pPI468 powiedział: Ampicilin (Ampicilin) Higromycyna N-terminal mScarlet pPI466 powiedział: Ampicilin (Ampicilin) Higromycyna N-końcowy mTurkusowy2 pDM1352 powiedział: Ampicilin (Ampicilin) Higromycyna Zacisk C GFP pDM1305 powiedział: Ampicilin (Ampicilin) Higromycyna Zacisk C mCherry pPI471 powiedział: Ampicilin (Ampicilin) Higromycyna Zacisk C mNeon pPI467 powiedział: Ampicilin (Ampicilin) Higromycyna C-terminal mScarlet pPI472 powiedział: Ampicilin (Ampicilin) Higromycyna C-terminal mTurkusowy2 namierzone w plazmidach ramki pDM1355 powiedział: Ampicilin (Ampicilin) Higromycyna Zacisk C GFP pPI461 powiedział: Ampicilin (Ampicilin) Higromycyna Zacisk C mCherry pPI462 powiedział: Ampicilin (Ampicilin) Higromycyna Zacisk C mNeon pPI464 powiedział: Ampicilin (Ampicilin) Higromycyna C-terminal mScarlet pPI463 powiedział: Ampicilin (Ampicilin) Higromycyna C-terminal mTurkusowy2 plazmidy nokautujące pDM1079 powiedział: Ampicilin (Ampicilin) Blasticydyna Nie pDM1080 powiedział: Ampicilin (Ampicilin) Nourseotrycyna Nie pDM1081 powiedział: Ampicilin (Ampicilin) Higromycyna Nie pDM1082 powiedział: Ampicilin (Ampicilin) Zobacz materiał G418 Nie plazmidy ekspresji CRE pDM1483 powiedział: Ampicilin (Ampicilin) Nourseotrycyna Nie pDM1489 powiedział: Ampicilin (Ampicilin) Higromycyna Nie pDM1488 powiedział: Ampicilin (Ampicilin) Zobacz materiał G418 Nie

Tabela 1: Lista plazmidów dla transfekcji nieaksenicznych.

  1. Ustawianie komórek Dictyostelium do transfekcji
    1. Uprawiaj K. aerogenes do konfluencji w pożywce SM (pożywce bogatej w składniki odżywcze) przez noc w temperaturze pokojowej. Kultury można przechowywać do 2 tygodni w temperaturze 4 °C.
    2. Dodać około 400 μl tej zawiesiny bakteryjnej na płytkę agarową SM (pepton 10 g/L; ekstrakt drożdżowy 1 g/L; glukoza 10 g/L; KH2PO4 1,9 g/L; K2HPO4 x 3 H2O, 1,3 g/L; MgSO4 bezwodny 0,49 g/L; 1,7% agaru) i równomiernie rozprowadzić. Weź sterylną pętlę i zaszczep komórkami Dictyostelium. Rozłóż komórki na jednej krawędzi płytki.
    3. Inkubować płytkę w temperaturze 22 °C przez 2 dni, aby zapewnić wystarczająco duże strefy wzrostu do transfekcji.
      nuta: W przypadku szczepów Dictyostelium, które nie tworzą dużych stref wzrostu (np. Ax3, DH1 lub JH10) lub dla niedoświadczonych eksperymentatorów, zamiast tego należy użyć płytek czyszczących. W tym celu postępuj zgodnie z instrukcjami w krokach od 1.5.4 do 1.5.6.
    4. Weź sterylną pętlę i zaszczep komórkami Dictyostelium (około 2-4 x 105 komórek). Przenieść komórki do 800 μl gęstej zawiesiny K. aerogenes w SM. Wymieszać komórki, pipetując w górę i w dół.
    5. Przenieś 400 μl, 200 μl, 100 μl i 50 μl na świeże płytki agarowe SM. Do każdej płytki dodać 400 μl dodatkowej zawiesiny SM K. aerogenes, równomiernie rozprowadzić i wysuszyć.
    6. Inkubować płytki w temperaturze 22 °C przez około 2 dni, aż staną się przezroczyste.
      nuta: Ze względu na szybsze tempo wzrostu, bakterie początkowo wytwarzają zlewający się trawnik, a następnie ameby "oczyszczają" płytkę z bakterii. Czas potrzebny na ten proces może się różnić w zależności od tła szczepu i zdolności zmutowanych komórek do wzrostu na bakteriach.

2. Transfekcja komórek dictyostelium na podstawie selekcji bakteryjnej

figure-protocol-1
Rysunek 1: Przebieg pracy transfekcji komórek Dictyostelium wyhodowanych przez bakterie. Kroki transfekcji są wymienione poniżej. Hoduj komórki D. discoideum na płytce SM wysianej bakteriami K. aerogenes (czerwony). Zbieraj komórki tylko z frontu żerowania (kolor zielony), unikając komórek, które już się rozwijają (kolor ciemnozielony). Umyj komórki w H40. Ponownie zawiesić komórki do końcowej gęstości 2-4 x 107 komórek/ml. Wymieszać zawiesinę komórkową z 1-2 μg DNA. Przenieść mieszaninę do kuwety do elektroporacji i ogniw impulsowych. Przenieść ogniwa bezpośrednio po elektroporacji do naczynia z SorMC i bakteriami. Pozwól komórkom zregenerować się przez 5 godzin przed dodaniem markera, który można wybrać. W przypadku plazmidów pozachromosomalnych dodaj wybór bezpośrednio do naczynia. Transfektanty są zwykle widoczne po ~2 dniach. W przypadku linearyzowanych konstruktów, które mają na celu pojedynczą integrację z genomem, ustaw trzy rozcieńczenia, jak wskazano, i dodaj wybór. Bakterie pobiera się z roztworu podstawowego OD600 = 100. Dobrze wymieszaj probówki i przenieś komórki do 96-dołkowych płaskodennych płytek do hodowli tkankowych. Użyć dwóch płytek na rozcieńczenie. Odpipetować 150 μl zawiesiny komórek do każdej studzienki. Potrzeba około 5 dni, aby zobaczyć ciasne kolonie. Czerwone studzienki pokazują przykład zwykłej ilości uzyskanych pomyślnie przekształconych komórek (górny panel zmodyfikowany w stosunku do poprzedniej publikacji22). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Aby przygotować płytki z zawiesiną K. aerogenes, dodać 10 ml buforu SorMC zawierającego bakterie K. aerogenes do gęstości OD600 = 2 (dodać 200 μl przygotowanego roztworu podstawowego OD600 = 100 K. aerogenes dla pożądanego stężenia bakterii) do 10-centymetrowej płytki Petriego poddanej działaniu kultur tkankowych.
    nuta: Płytka ta jest później potrzebna do hodowli transfekowanych komórek D. discoideum. Alternatywnie można użyć 6-dołkowej płytki do hodowli tkankowej. W przypadku transfekcji plazmidów pozachromosomalnych 6-dołkowa płytka do hodowli tkankowej jest bardziej zasobooszczędna. Użyć 2 ml zawiesiny K. aerogenes SorMC (OD600 = 2) na studzienkę.
  2. Przygotowanie komórek Dictyostelium
    1. Używając jednorazowej pętli do inokulacji o pojemności 10 μl, zeskrobać komórki ze stref wzrostu (około 3 cm) płytki hodowlanej (krawędź oczyszczonego obszaru) lub płytki czyszczącej. Przenieś komórki do probówki o pojemności 1,5 ml zawierającej 1 ml lodowatego buforu H40.
      UWAGA: Czas pobierania komórek z płytek czyszczących ma kluczowe znaczenie. Zbyt wczesny zbiór daje zbyt małą ilość komórek, podczas gdy zbyt późny zbiór zwiększa ryzyko uzyskania częściowo rozwiniętych komórek.
    2. Umyj ogniwa, obracając je w dół przez 2 minuty przy 1 000 x g lub wirując przez 2 s przy 10 000 x g. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w buforze H40 do końcowej gęstości 2-4 x 107 komórek/ml. Utrzymuj komórki w chłodzie podczas całej procedury transfekcji. Użyj zawiesiny lodowato-wodnej, aby zapewnić bezpośredni kontakt rur z lodem.
  3. Elektroporacja
    1. Dodaj 100 μl komórek do probówki z 1-2 μg DNA. Dokładnie wymieszać, pipetując w górę i w dół.
    2. Przenieś mieszaninę komórka/DNA do wstępnie schłodzonej kuwety do elektroporacji (odstęp 2 mm).
    3. Pulsuj komórki przy użyciu następujących ustawień fali prostokątnej: 350 V, 8 ms, 2 impulsy i interwał impulsów 1 s.
      nuta: Nie należy dodawać więcej niż 2 μg DNA. Większe ilości są toksyczne dla komórek i zmniejszają skuteczność transfekcji. Całkowita objętość dodanego DNA nie powinna przekraczać 5 μl.
    4. Przenieść komórki natychmiast na wcześniej przygotowaną 10 cm szalkę Petriego z K. aerogenes SorMC i pozwolić komórkom na regenerację przez 5 godzin
      nuta: Sprawdź komórki na szalce Petriego pod odwróconym mikroskopem. Komórki będą wyglądały na okrągłe bezpośrednio po elektroporacji, ale powrócą do swojego ameboidalnego kształtu po około 30 minutach, kiedy będą miały wystarczająco dużo czasu, aby prawidłowo przyczepić się do powierzchni.
  4. Selekcja transfektantów: w zależności od tego, czy transfekcja ma na celu wytworzenie knock-out, knock-in lub act5 knock-in, czy też ekspresję fluorescencyjnego białka reporterowego z plazmidu pozachromosomalnego, należy przeprowadzić proces selekcji za pomocą jednej z następujących opisanych metod.
    nuta: W przeciwieństwie do komórek hodowanych osiowo, komórki hodowane bakteryjnie są wysoce odporne na blasticydynę. Dlatego selekcja odbywa się zawsze przy użyciu G418 lub higromycyny (patrz dyskusja).
    1. Nokauty, nokaucze i akty 5
      1. Ostrożnie odłącz komórki od szalki Petriego, kilkakrotnie wypychając płyn z pipety na powierzchnię.
      2. Ustawić trzy rozcieńczenia w zawiesinie SorMC K. aerogenes (OD600 = 2) i dodać środek selektywny zgodnie z zastosowaną odpornością (patrz Rysunek 1).
      3. Niskie rozcieńczenie: zmieszać 9 ml zawiesiny komórek z 20,4 ml SorMC i 600 μl roztworu podstawowego K. aerogenes.
      4. Średnie rozcieńczenie: zmieszać 900 μl zawiesiny komórek z 28,5 ml SorMC i 600 μl roztworu podstawowego K. aerogenes.
      5. Wysokie rozcieńczenie: zmieszać 90 μl zawiesiny komórek z 29,3 ml SorMC i 600 μl roztworu podstawowego K. aerogenes.
      6. Dodać 30 μl markera do wyboru (100x roztwór podstawowy).
      7. Rozprowadzić przygotowane roztwory na 96-dołkowe płaskodenne płytki do hodowli tkankowych, pipetując 150 μl zawiesiny komórkowej do każdej studzienki.
        nuta: Procedura ta ma na celu badanie przesiewowe pojedynczych klonów, a nie populacji. Selekcja trwa około 5-7 dni, w zależności od użytej konstrukcji.
    2. Plazmidy pozachromosomalne
      1. Dodaj marker do wyboru bezpośrednio do naczynia o pojemności 10 ml (patrz Rysunek 1).
        UWAGA: Nie ma potrzeby ustawiania rozcieńczeń, ponieważ nie ma potrzeby tworzenia populacji klonalnych. Proces selekcji plazmidów pozachromosomalnych jest szybszy ze względu na dużą liczbę kopii obecnych w komórkach D. discoideum. Transfektantów można spodziewać się po 32 godzinach do 2 dni.
        UWAGA: Antybiotyki stosowane jako markery selekcyjne są toksyczne. Nosić rękawice.
  5. Przebadać otrzymane klony pod kątem dodatnich tranfektantów. W przypadku prób wyeliminowania lub wyeliminowania należy postępować zgodnie z instrukcjami w kroku 2.5.1. Sprawdź powodzenie transfekcji plazmidów pozachromosomalnych, korzystając z instrukcji w kroku 2.5.2.
    1. W przypadku knock-outów, knock-inów i knock-inów act5 należy przeprowadzić wstępne badanie przesiewowe za pomocą PCR, aby potwierdzić integrację konstruktu z prawidłowym locus genomu.
      nuta: Aby zmaksymalizować prawdopodobieństwo wystąpienia populacji klonalnych, należy użyć najwyższego możliwego rozcieńczenia, które daje transfektanty po selekcji. Celuj w talerze, które stanowią maksymalnie jedną trzecią zajętych studni.
      1. Aby rozszerzyć populacje klonów, przenieś klony, które wyrosły po selekcji, z 96-dołkowej płytki do 12-dołkowej płytki do hodowli tkankowej, aby wyhodować wystarczającą liczbę komórek do izolacji genomowego DNA. Zaopatrz każdą studzienkę w 1 ml SorMC K. aerogenes (OD600 = 2) i świeży marker do wyboru.
        UWAGA: 1 dzień jest zwykle wystarczający do uzyskania zlewającego się studzienki nadającej się do izolacji DNA.
      2. Aby wykonać mini izolację genomowego DNA, zbierz komórki ze zlewającej się studzienki i wyizoluj genomowe DNA za pomocą mini zestawu do ekstrakcji DNA, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.
      3. Użyj wyizolowanego genomowego DNA wraz z odpowiednimi starterami i polimerazą Taq (patrz tabela materiałów) do badania przesiewowego PCR w kierunku całek dodatnich.
        nuta: Po potwierdzeniu pozytywnej integracji z prawidłowym locus genomowym należy przeprowadzić analizę Southern blot. Daje to większą pewność, że nie wystąpiły dodatkowe zdarzenia insercji w niespecyficznych regionach genomu.
    2. W przypadku fluorescencyjnych białek reporterowych wizualnie zidentyfikuj dodatnie komórki fluorescencyjne i sprawdź za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Alternatywnie, wykonaj western blot z odpowiednimi przeciwciałami do identyfikacji biochemicznej.
Program PCR krok temperatura Godzina Początkowa denaturacja 94 °C 30 sekund 30 cykli 94 °C 15-30 s 42 °C 15-60 s 68 °C 1 min/kb Końcowe przedłużenie 68 °C Czas trwania: 5 min trzymać 4-10 °C Skład reakcji składnik 25 μL reakcji Stężenie końcowe Podkład 10 μM do przodu 0,5 μL 0,2 μM 10 μM Podkład odwrotny 0,5 μL 0,2 μM Matrycowy DNA zmienna (ok. 5 μL) < 1 000 ng 2x Master Mix z buforem standardowym zawierającym polimerazę (patrz tabela materiałów) 12,5 μl 1x Woda wolna od nukleaz do 25 μL < 1 000 ng

Tabela 2: Program PCR i skład próbki do amplifikacji genomowego DNA D. discoideum.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Plazmidy pozachromosomalne są wykorzystywane do badań reporterowych, które mają na celu zidentyfikowanie lokalizacji pewnych białek wewnątrz komórki lub zmian w strukturze komórkowej zmutowanych komórek. W przypadku wielu podejść, takich jak monitorowanie cyklu komórkowego, kluczowe znaczenie ma jednoczesne odciąganie dwóch reporterów. Jest to teraz możliwe przy użyciu naszego podwójnego reporterowego pozachromosomalnego systemu plazmidowego (Tabela 1). W pierwszym dniu komórki zostały przetransfekowane przed dodaniem wybieralnego markera G418 po 5 godzinach (Rysunek 1). W tym przykładzie NC4, DdB, Ax2 i niezależnie uzyskane dzikie izolaty V12M2 i WS2162 (Tabela uzupełniająca 1) zostały transfekowane plazmidem pPI289, który koduje GFP-tubulinę, marker mikrotubul i mCherry-PCNA, białko używane do monitorowania cyklu komórkowego (Rysunek 2A). Po 32 godzinach komórki obserwowano pod mikroskopem. Większość komórek wykazywała ekspresję obu znakowanych fluorescencyjnie białek fuzyjnych, co jest zgodne z wcześniejszymi doniesieniami, że ekspresja dwóch reporterów z tego samego plazmidu wykazuje podobne poziomy ekspresji, co jest prawie niemożliwe przy użyciu dwóch różnych plazmidów18,19. Reprezentatywna komórka dla każdej linii komórkowej (NC4, DdB, Ax2, V12M2 i WS2162) wyrażająca żądany podwójny reporter jest pokazana w Rysunek 2B. Wydajność transfekcji podsumowano na rysunku2C. Linie komórkowe wywodzące się z NC4 wykazują najlepszą skuteczność transfekcji. Jednak w przypadku linii komórkowych V12M2 i WS2162 uzyskano znacznie dużą liczbę transfektantów.

figure-results-1
Rysunek 2: Ekspresja plazmidu pozachromosomalnego. (A) Plazmidy pozachromosomalne są bezpośrednio transfekowane w formie kolistej. Jako przykład pokazano podwójny reporter pPI289. Miejsca MIV organizacji pozarządowejwskazują na insercję drugiego reportera do plazmidu o ekspresji pozachromosomalnej. (B) Projekcja Z reprezentatywnej komórki wykazującej ekspresję GFP-tubuliny A (cytoplazmatyczna) i mCherry-PCNA (w dużej mierze jądrowa) dla pięciu różnych stosowanych linii komórek typu dzikiego (NC4, DdB, Ax2, V12M2, WS2162). (C) Obliczono wydajność transfekcji dla pięciu linii komórkowych przedstawionych w (B). Pokazana jest średnia z dwóch eksperymentów. Słupki błędów wskazują ± SD. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Integracja wektora docelowego z określonym locus genomowym jest trudniejsza i wymaga dokładniejszej analizy wygenerowanej linii komórkowej. W Rysunek 3, próba wykonania act5-mCherry KI w NC4 jest próbowana. Po pierwsze, plazmid musi zostać zlinearyzowany, aby zwiększyć częstotliwość zdarzeń rekombinacji po transfekcji. W tym celu plazmid pDM1514 jest cięty za pomocą NgoMIV. Dwa prążki uzyskuje się po przeprowadzeniu trawienia na żelu agarozowym. Pasmo 4127 pz zawiera pożądaną konstrukcję (Rysunek 3). W celu transfekcji strawione DNA musi zostać wyekstrahowane z żelu i oczyszczone za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu zgodnie z instrukcjami producenta.

figure-results-2
Rysunek 3: Przygotowanie aktu5 knock-in i DNA do transfekcji. Pokazano przykład użycia plazmidu pDM1514 w akcie5. Kroki przygotowania są wymienione poniżej. (A) Przed elektroporacją należy zlinearyzować plazmid przy użyciu wskazanych miejsc NGOMIV. (B, C) Uruchom przecięty plazmid na żelu agarozowym, aż dwa oczekiwane prążki zostaną prawidłowo oddzielone. Wytnij pasmo 4127 pz zawierające ramiona rekombinacji, mCherry i kasetę oporową, a następnie wyekstrahuj DNA żelem. DNA jest teraz gotowe do transfekcji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Oczyszczone DNA zostało użyte do transfekcji komórek NC4. Po 5-6 dniach selekcji uzyskano klony. Reprezentatywne skuteczność transfekcji i liczbę pozytywnie zidentyfikowanych klonów dla kilku prób knock-in act5 podsumowano w tabeli 3. Dwa klony transfekcji NC4 zostały losowo wybrane i przeanalizowane metodą PCR ( Rysunek 4A) i oba wykazały przewidywane wzorce pasm oczekiwane od knock-in i zostały następnie zweryfikowane za pomocą analizy Southern blot, aby zapewnić pojedyncze zdarzenie integracji konstruktu z genomem20. Plama pokazuje wyraźną pojedynczą integrację w pożądanym locus act5 (Rysunek 4B). Wygenerowana linia komórkowa NC4::act5-mCherry może być teraz używana w eksperymentach.

figure-results-3
Rysunek 4: Walidacja aki act5-mCherry w NC4. (A) Schematyzowanie i kontrolowanie PCR w celu walidacji pozytywnych integracji z locus act5. Wskazane startery wykorzystano do analizy dwóch niezależnych klonów oraz rodzica. Oba klony wykazują oczekiwane pasma dla kasety oporowej i startera za (P1) lub startera (P2), które nie występują w szczepie rodzicielskim. Kombinacja starterów (P1/P2) potwierdza prawidłową integrację mCherry i kasety rezystancyjnej z locus act5. NC4 typu dzikiego wykazuje oczekiwane pasmo 2800 pz, podczas gdy oba klony KI nie mają tego pasma, a zamiast tego wykazują produkt PCR o około 1400 par zasad większy. (B) Schemat stosowanego restrykcyjnego trawienia i Southern blot. Oba klony knock-in wykazują mniejsze pasmo 3400 pz, które jest wynikiem integracji konstruktu z locus aktu5, a konkretnie z dodatkowym miejscem BclI w kasecie oporności higromycyny. Kontrolka typu dzikiego pokazuje oczekiwane 5,8 kb wynikające z dwóch znajdujących się dalej lokalizacji BclI. Kleks został przycięty i splany dla jasności. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ukierunkowana konstrukcja do locus ACT5 nazwa plazmidu liczba zajętych studni Liczba sprawdzonych klonów Pozytywne klony Poprawne klony (%) Zastosowany szczep Dictyostelium skuteczność transfekcji (transfektanty/ 2x10^6/1 μg DNA) LifeAct-mWiśnia pPI226 powiedział: 7 7 1 Rozdział 14,2 Złącze AX2 3,5x10^-6 LifeAct-GFP (Certyfikat GFP) pPI227 powiedział: 12 12 5 41,6 pkt. Złącze AX2 6x10^-6 Dobra praktyka rolna pDM1513 powiedział: 3 3 cyfra arabska 66,6 pkt. Złącze AX2 1,5x10^-6 mWiśnia pDM1514 powiedział: 3 3 1 33,3 pkt. Złącze AX2 1,5x10^-6 Dobra praktyka rolna pDM1513 powiedział: Rozdział 66 9 5 55,5 pkt. Złącze AX2 3,3x10^-5 mWiśnia pDM1514 powiedział: 221 szt. 12 10 83,3 pkt. Złącze AX2 1,1x10^-4 H2B-mWiśnia pPI420 powiedział: 3 3 1 33,3 pkt. Złącze AX2 1,5x10^-6 H2B-mWiśnia pPI420 powiedział: 7 7 6 85,7 pkt. Złącze AX2 3,5x10^-6 mWiśnia pDM1514 powiedział: 10 10 7 70 Rozdział Ddb 5x10^-6 mWiśnia pDM1514 powiedział: 240 szt. 12 11 91,6 pkt. Ddb 1,2x10^-4 mWiśnia pDM1514 powiedział: 320 szt. 12 12 100 szt. NC4 powiedział: 1,6x10^-4

Tabela 3: Wydajność transfekcji i ilość uzyskanych dodatnich transfektantów dla wytworzenia KI act5 w różnych tłach szczepów22.

Locus aktu5 oferuje względnie jednorodne wyrażenie zintegrowanego reportera21. Wygenerowane komórki NC4::act5-mCherry pozwalają na przeprowadzanie eksperymentów mieszanych z innymi knock-inami act5 przy użyciu innego białka fluorescencyjnego, takiego jak GFP. Aby podkreślić wielką zaletę tego systemu, pokazano eksperymenty z mieszaniem z Ax2::act5-GFP. Ze względu na niemożność transfekcji komórek nieaksenicznego typu dzikiego, tego typu podejście nie mogło być wcześniej wykonane. Eksperymenty mieszane są ważnym narzędziem do analizy zachowania komórek, ponieważ umożliwiają bezpośrednie porównanie różnych linii komórkowych doświadczających identycznych warunków eksperymentalnych. Komórki NC4 rosną szybciej na trawnikach bakteryjnych niż komórki Ax2 (Rysunek 5A). Może to być spowodowane większą zdolnością bakterii do fagocytozy lub lepszą zdolnością do poruszania się i wykazywania chemotaksji w kierunku źródła pożywienia. Korzystając z testu chemotaksji kwasu foliowego pod agarem, przeprowadzono bezpośrednie porównanie populacji NC4::act5-mCherry i Ax2::act5-GFP, pokazując, że NC4::act5-mCherry są znacznie bardziej wydajne w wykrywaniu kwasu foliowego. Po 4 godzinach więcej komórek NC4::act5-mCherry było w stanie wpełznąć pod agarozę niż komórki Ax2::act5-GFP (Rysunek 5B). Analiza standardowych wskaźników chemotaksji dla komórek migrujących pod agarozą wykazała, że komórki NC4::act5-mCherry były szybsze i wykazywały silniejszą odpowiedź chemotaktyczną niż komórki Ax2::act5-GFP (Figura 5CE).

figure-results-4
Rysunek 5: Użycie KI aktu5 do eksperymentów z mieszaniem chemotaksji opartych na obrazach. (A) NC4::act5-mCherry i Ax2::act5-GFP wyrażające wskazane białko fluorescencyjne z locus act5 zostały przeanalizowane pod kątem zdolności do wzrostu na trawniku bakteryjnym. Po 4 dniach zmierzono średnicę płytki nazębnej powstałej z pojedynczych posianych komórek Dictyostelium. Nieakseniczne komórki act5::NC4 tworzą znacznie większe blaszki niż komórki akseniczne Ax2::act5-GFP (średnia ± SD, ***p < 0,0001, n = 3, podziałka 5 mm). (B) W celu zastosowania testu chemotaksji kwasu foliowego pod agarozą22 w celu bezpośredniego porównania zdolności chemotaktycznych NC4::act5-mCherry i Ax2::act5-GFP stosowanych w (A), wyhodowane przez bakterie ameby obu szczepów zmieszano w stosunku 50:50. Komórkom pozwolono wpełznąć pod agarozę. Po 4 godzinach komórki, które migrowały w górę gradientu kwasu foliowego, zobrazowano za pomocą mikroskopu konfokalnego. Następnie określono liczbę komórek NC4::act5-mCherry i Ax2::act5-GFP. Komórki NC4::act5-mCherry były bardziej wydajne w wykrywaniu kwasu foliowego. Znaleziono około 10-krotnie więcej komórek NC4::act5-mCherry w porównaniu z komórkami Ax2::act5-GFP (średnia ± SD, ***p < 0,0001, n = 6, podziałka 100 μm). (C, D) Komórki filmowano przez 60 minut, a następnie obliczono ich prędkość i indeks chemotaktologiczny. Po wstępnej selekcji komórek najbardziej reagujących chemotaktycznie (tylko tych, które migrowały pod agarozą), komórki Ax2::act5-GFP wykazały niższe wartości zarówno dla szybkości komórki, jak i chemotaksji. Przeanalizowano pięćdziesiąt komórek na linię komórkową. (mediana ± SD, *p < 0,01, n = 3). (E) Ślady knock-inów NC4::act5-mCherry i Ax2::act5-GFPact5 są wykreślane w ciągu 60 minut, pokazując bardziej ukierunkowany ruch w kierunku źródła chemoatraktentu komórek NC4::act5-mCherry (mediana ± SD, ***p < 0,0001, n = 6). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Linie komórkowe act5 knock-in mogą być również używane do cytometrii przepływowej. Podobnie jak w przypadku wzrostu na bakteriach, istnieją duże różnice w rozwoju między szczepami aksenicznymi a nieaksenicznymi typami dzikimi. Po rozwoju owocniki komórek NC4 są około dwa razy większe niż te pochodzące z komórek Ax2. Jeśli komórki zostaną wymieszane, uzyskuje się owocnik średniej wielkości. Aby bardziej ilościowo przeanalizować udział obu linii komórkowych, zastosowano cytometrię przepływową. Analizy te wykazały wyraźnie, że owocniki średniej wielkości wynikają z różnych poziomów udziału obu linii komórkowych. Podczas gdy komórki NC4::act5-mCherry stanowiły około 75% mierzonych zarodników, Ax2::act5-GFP przyczynił się tylko do 25%, ujawniając potencjalną przewagę w zakresie dopasowania dla szczepów nieaksenicznych (Ryc. 6). Ponieważ analiza nie monitoruje populacji komórek łodygowych, istnieją dwie możliwości wyjaśnienia braku równowagi w rozwoju między Ax2 i NC4. Jedną z możliwości jest to, że komórki Ax2 przyczyniają się głównie do populacji komórek łodygowych, a nie wchodzą do populacji komórek przetrwalnikowych. Alternatywnie, więcej komórek NC4 może wejść w cykl rozwojowy, przy czym Ax2 jest stosunkowo opóźniony, a w konsekwencji nie są w stanie przyczynić się do złożenia owocnika. Możliwość transfekcji nieaksenicznych komórek typu dzikiego rozwija inne podejścia i znacznie upraszcza procedury eksperymentalne.

figure-results-5
Rysunek 6: Akt5 KI umożliwia analizę eksperymentów mieszanych za pomocą cytometrii przepływowej. (A) NC4::act5-mCherry i Ax2::act5-GFP opracowano oddzielnie lub w mieszaninie 50:50 na płytkach agarowych bez składników odżywczych. Komórki NC4::act5-mCherry tworzą większe owocniki niż Ax2::act5-GFP. Zamiast tego mieszanka pokazuje rozmiar pośredni (podziałka 5 mm). Konfokalna mikroskopia fluorescencyjna sugeruje większą ilość zarodników NC4::act5-mCherry w główkach zarodników pochodzących z mieszanek. (B) Aby określić ilościowo tę obserwację, ilości zarodników w główkach zarodników zebranych z eksperymentu mieszania w (A) analizowano za pomocą cytometrii przepływowej. Około 75% zarodników pochodziło z komórek NC4::act5-mCherry, a tylko 25% z komórek Ax2::act5-GFP. (C) Reprezentatywny rozkład zarodników z obu linii komórkowych pokazany w rozproszeniu cytometrii przepływowej. Około 0,05% wykazuje dodatnie sygnały mCherry i GFP, co sugeruje, że zaszły procesy fuzji paraseksualnej lub że zarodniki przylegają do siebie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Linia komórkowa Podłoże genetyczne Numer referencyjny Opublikowano wcześniej typ AX2 (Ka) DBS0235521 Bloomfield i wsp., 2008 Typ dziki NC4 (S) Bloomfield i wsp., 2008 Typ dziki act5::mWiśniowy klon 5 NC4 powiedział: Zobacz materiał HM1912 Paschke i wsp., 2018 Uderzenie w Act5 act5::GFP Klon 2 Złącze AX2 Zobacz materiał HM1930 Paschke i wsp., 2018 Uderzenie w Act5 Zobacz materiał V12M2 Bloomfield i wsp., 2008 Typ dziki Zobacz materiał WS2162 Bloomfield i wsp., 2008 Typ dziki

Tabela uzupełniająca 1: Badane różne szczepy Dictyostelium.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykorzystanie nieaksenicznych, dzikich komórek Dictyostelium było do tej pory bardzo ograniczone w badaniach molekularnych. Dostępne metody inżynierii genetycznej tych szczepów są niewystarczająco niezawodne i skuteczne23, co uniemożliwia ich powszechne przyjęcie. Przedstawione tutaj uzyskane materiały i protokoły mogą być wykorzystane dla dowolnego szczepu D. discoideum, niezależnie od jego zdolności do wzrostu w płynnym podłożu. Należy wspomnieć, że protokół ten jest zoptymalizowany pod kątem linii komórkowych pochodzących z NC4. Skuteczność transfekcji dla świeżo wyizolowanych szczepów ze środowiska naturalnego różni się od NC4, jak zaobserwowaliśmy wcześniej i jest pokazana tutaj dla V12M2 i WS2162 8,9. Wydaje się, że warunki elektroporacji mają w szczególności znaczący wpływ na wydajność transfekcji i mogą wymagać dalszej optymalizacji w przypadku niektórych szczepów. Ogólnie rzecz biorąc, we wszystkich testowanych do tej pory szczepach zaobserwowano wystarczającą ilość transfektantów, co pokazuje, że metody te są wykonalne. Liczba dodatnich transfektantów uzyskanych przy użyciu szczepów pochodzących z NC4 jest wyższa w porównaniu z innymi nieaksenicznymi szczepami typu dzikiego, ale we wszystkich przypadkach uzyskuje się wystarczającą liczbę transfektantów, aby umożliwić dalsze eksperymenty. To, w połączeniu z prostotą naszego protokołu, jest znaczną poprawą w porównaniu z wcześniejszymi próbami 8,9.

Te nowe protokoły nieakseniczne obejmują wszystkie standardowe procedury genetyczne i dodają dalszych korzyści, ponieważ transfekcje mogą być wykonywane szybko i wydajnie równolegle. Dodatnie klony można uzyskać w ciągu kilku dni, a nie tygodni, ponieważ wzrost bakterii skraca czas podziału o połowę. Nowo powstałe plazmidy działają również w warunkach aksenicznych i mogą być rutynowo używane w obu warunkach wzrostu, co jest kolejnym osiągnięciem tej metodologii22. Jak wprowadzono w protokole, plazmid używany do selekcji na bakteriach ma specjalne wymagania, które są kluczowe dla powodzenia transfekcji. W szczególności promotory napędzające kasety ekspresji i oporu są ważne dla udanej transfekcji. Często stosowany promotor act6 (aktyna 6)24 do napędzania kaset oporności lub ekspresji nie jest skuteczny, gdy komórki są hodowane na bakteriach. W naszym układzie plazmidowym wysoce aktywny promotor act15 (aktyna 15) napędza wszystkie kasety ekspresyjne, podczas gdy kasety oporności są pod kontrolą promotora coA (koaktozyny A), z których oba są aktywne w warunkach aksonicznych i w komórkach hodowanych na bakteriach. Wymagania dotyczące ekspresji konstruktów reporterowych oraz konstruktów knock-in i knock-out sprawiają, że konieczne jest korzystanie z naszego repertuaru plazmidowego, ale niestety ograniczają użycie już utworzonych wektorów, które wykorzystują nieefektywny promotor act6 .

Wydajność promotora jest szczególnie istotna w przypadku transfekcji, które zależą od pojedynczego zdarzenia integracji z właściwym locus genomu. Ze względu na nasze ulepszenie promotorów napędzających ekspresję genów oporności, wystarczająca ilość białka oporności jest wytwarzana z integracji pojedynczego locus. Głównym problemem było faworyzowanie wielu integracji z genomem podczas stosowania higromycyny lub G418, jak opisano. Do tej pory nie zaobserwowano faworyzowania wielu integracji, o czym informowano wcześniej w przypadku selekcji G418 korzystających ze starszych systemów promotorów25. Oznacza to, że zarówno higromycyna, jak i G418 są odpowiednimi markerami do generowania czystych wybijaczy i wybijających. Niestety, wybieralny marker blasticydyna nie działa w warunkach nieaksenicznych. Jest to główna wada naszej metody, ponieważ kaseta oporności na blasticydynę jest rutynowo używana do generowania konstruktów nokautujących w D. discoideum. Konstrukty, które zostały już wygenerowane przy użyciu kaset oporności na blasticydynę, będą musiały zostać ponownie wyprowadzone przy użyciu jednego z działających markerów do wyboru. Inną możliwością przezwyciężenia tego ograniczenia jest połączenie niedawno opracowanej technologii CRISPR D . discoideum z tym protokołem transfekcji26. Generowanie odpowiednich, jednoprowadnicowych RNA (sgRNA) jest prostsze i szybsze niż rekonstrukcja kompletnych konstruktów nokautujących. Jeśli chodzi o przyszłe kierunki, możliwość generowania wielu nokautów za pomocą CRISPR/Cas9 w połączeniu z tym protokołem transfekcji jest atrakcyjna i może utorować drogę wielu badaczom w społeczności Dictyostelium . Należy jednak dokładnie zbadać wykonalność ustalonego przejściowego systemu ekspresji stosowanego w CRISPR/Cas9 w komórkach hodowanych aksenicznie.

Przedstawiony system knock-in act5 oferuje niezawodny i bezpieczny system integracji do generowania stabilnych linii komórkowych w D. discoideum, z przewagą podobnych miejsc powstałych w innych organizmach22. Zależy również od pojedynczego zdarzenia integracyjnego w genomie i daje wiele możliwości dla różnych kierunków badań. Promotor act5 jest silnie aktywny i gwarantuje prawie jednorodną ekspresję27 niezależnie od warunków uprawy. Fluorescencyjne białka reporterowe można łatwo zintegrować z tym bezpiecznym miejscem za pomocą zmodyfikowanych plazmidów docelowych. Może to być przydatne na przykład do celów śledzenia komórek, jak pokazano w eksperymencie mieszanym. Komórki wykazują minimalną zmienność ekspresji między komórkami, co może pomóc w automatycznym śledzeniu komórek. Co ważne, wstawienie pożądanej sekwencji do locus aktu5 wydaje się fenotypowo neutralne28,29. Ponieważ ekspresja nie zależy od selektywnego markera w celu utrzymania ekspresji białka, jak to widać w losowych integrantach lub liniach komórkowych zawierających wektory pozachromosomalne, system act5 może być również przydatny w eksperymentach ratunkowych. Ponieważ linie komórkowe są jednorodne, wszystkie komórki mogą być analizowane. Nie jest to możliwe przy użyciu plazmidu pozachromosomalnego do ekspresji, w którym występuje znaczna niejednorodność ekspresji.

Oprócz tych ogólnych ulepszeń dla wszystkich szczepów, możliwość wykorzystania nieaksenicznych komórek typu dzikiego do badań molekularnych pozwala na ocenę skutków skumulowanych mutacji w obecnych szczepach laboratoryjnych. Od czasu przyjęcia szczepu Ax2 w 1970 r. stwierdzono wiele rearanżacji genetycznych, jak wykazały wcześniej opublikowane analizy mikromacierzy26. Syntetyczne fenotypy są obserwowane ze względu na obecność tych mutacji. Na przykład zgłoszony mutant phg2 wykazuje zmniejszoną adhezję w jednym tle szczepu laboratoryjnego i zwiększoną przyczepność w innych3. Takie sprzeczne dane można teraz rozwiązać, powtarzając eksperyment na wspólnym szczepie przodka (w tym przypadku DdB). Siła tego podejścia została ostatnio pokazana dla małej GTPazy RasS30,31.

Możliwość przeprowadzania eksperymentów genetycznych na dowolnym szczepie D. discoideum rozszerza potencjał nowych kierunków badań, które zależą od wykorzystania dzikich izolatów, w szczególności tych związanych z ewolucją społeczną, rozpoznawaniem krewniactwa i cyklem płciowym22.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują laboratorium Kay za wkład w tę metodę oraz urządzeniom mikroskopii LMB i cytometrii przepływowej za doskonałe wsparcie naukowe i techniczne. Praca ta została sfinansowana z grantu Rady ds. Badań Medycznych MC_U105115237 dla R. R. Kaya, grantu BBSRC (Rada ds. Badań Biotechnologii i Nauk Biologicznych) BB/K009699/1 dla R. R. Kaya, grantu Cancer Research UK A15672 dla R. H. Insalla, stypendium Wellcome Trust Senior Fellowship 202867/Z/16/Z dla Jonathana R. Chubba oraz finansowania MRC (MC_U12266B) dla MRC LMCB University Unit na UCL.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Equipment
Eppendorf Mikrowirówki 5424/5424RThermoScientific05-400-002
Wirówki Eppendorf 5702R z wirnikiem modelu A-4-38ThermoScientific12823252
Eppendorf Mastercycler Nexus Thermal CyclersSigma AldrichEP6331000025
Gene Pulser X Cell, w tym CE & Moduły PCSzafa bezpieczeństwa BioRad1652660
Foruna - SCANLAFLabogene
BioPhotometer PlusEppendorf
CLSM 710Zeiss
Media & Agarozy
LoFlo MediumFormediumLF0501
Seakem GTG AgarozaLonza50071
Low EEO AgarozaBioGene300-200
Agar CzystyOxoidLP0028
SM RosółFormediumSMB0102
2x LB bulionFormediumLBD0102
Chemicals
SYBR Bezpieczny barwnik żelowy DNAThermoScientificS33102
1 Kb Plus Drabinka DNAThermoScientific10787018
1 Kb Drabinka DNANEBN3232L
Kwas wolny od HEPESSigma Aldrich/Merck391340 EMD
KH2PO4VWRP/4800/53
Na2HPO4 * 2 H2OVWR10028-24-7
MgCl2 * 6 H2OSigma Aldrich/Merck5982 EMD
CaCl2 * 2 H2OSigma Aldrich442909
Kwas foliowySigma AldrichF7876
KOHVWR26668.263
Cult Dish
96 Klaster hodowli komórkowych studzienek, płaskie dno z pokrywką o niskiej parowaniu, poddany hodowli tkankowejCorning Incorporated3595
6-dołkowy klaster hodowli komórkowych, płaskie dno z pokrywką, Corning Incorporated poddany hodowli tkankowej3516
Naczynie do hodowli tkankowej w stylu 100 x 20 mm,Corning353003
Naczynia Microwell ze szklanym dnem 50 mm No1.5MatTek CorporationP50G-1.5-30-F
Antybiotyki
Geneticin G418-siarczanGibco firmy Life Technologies11811-023
Hygromycin BGold InvivoGenant-hg-1
Dodatkowe materiały eksploatacyjne
2 mm kuwety elektroporacyjne szczelinowe, długa elektrodaGeneflowLimited E6-0062
10 µ L Pętla do zaszczepiania, niebieska 10 mikro L129399ThermoScientific
, sterylnyGreiner Bio-one730190
Combitips advanced 5 mlEppendorf BIOPUR30089669
Kits
ZR Plasmid Miniprep ClassicZymoresearchD4016
Quick DNA Zestaw MiniprepZymoresearchD3025
Zymoclean Zestaw do odzyskiwania DNAZymoresearchD40002
Enzymes
Restriction enzymyNEB
OneTaq 2X Master Mix ze standardowym buforemNEBM0482L
Ligaza DNA T4NEBM0202S
PrimeSTAR Max Polimeraza DNATakaraBioR045A
Incorporated Rozsiewacz

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schaap, P. Evolutionary crossroads in developmental biology: Dictyostelium discoideum. Development. 138 (3), 387-396 (2011).
  2. Sussman, R., Sussman, M. Cultivation of Dictyostelium discoideum in axenic culture. Biochemical and Biophysical Research Communications. 29, 53-55 (1967).
  3. Bloomfield, G., Tanaka, Y., Skelton, J., Ivens, A., Kay, R. R. Widespread duplications in the genomes of laboratory stocks of Dictyostelium discoideum. Genome Biology. 9 (4), 75(2008).
  4. Witke, W., Nellen, W., Noegel, A. Homologous recombination in the Dictyostelium alpha-actinin gene leads to an altered mRNA and lack of the protein. The EMBO Journal. 6, 4143-4148 (1987).
  5. De Lozanne, A., Spudich, J. A. Disruption of the Dictyostelium myosin heavy chain gene by homologous recombination. Science. 236, 1086-1091 (1987).
  6. Howard, P. K., Ahern, K. G., Firtel, R. A. Establishment of a transient expression system for Dictyostelium discoideum. Nucleic Acids Research. 16, 2613-2623 (1988).
  7. Knecht, D., Pang, K. M. Electroporation of Dictyostelium discoideum. Methods in Molecular Biology. 47, 321-330 (1995).
  8. Wetterauer, B., et al. Wild-type strains of Dictyostelium discoideum can be transformed using a novel selection cassette driven by the promoter of the ribosomal V18 gene. Plasmid. 36, 169-181 (1996).
  9. Lloyd, M. M., Ceccarelli, A., Williams, J. G. Establishment of conditions for the transformation of nonaxenic Dictyostelium strains. Developmental Genetics. 11, 391-395 (1990).
  10. Bloomfield, G., et al. Neurofibromin controls macropinocytosis and phagocytosis in Dictyostelium. eLife. 4, (2015).
  11. Veltman, D. M., et al. A plasma membrane template for macropinocytic cups. eLife. 5, (2016).
  12. Veltman, D. M., Lemieux, M. G., Knecht, D. A., Insall, R. H. PIP(3)-dependent macropinocytosis is incompatible with chemotaxis. The Journal of Cell Biology. 204 (4), 497-505 (2014).
  13. Hoeller, O., Kay, R. R. Chemotaxis in the absence of PIP3 gradients. Current Biology. 17, 813-817 (2007).
  14. Chubb, J. R., Wilkins, A., Thomas, G. M., Insall, R. H. The Dictyostelium RasS protein is required for macropinocytosis, phagocytosis and the control of cell movement. Journal of Cell Science. 113, 709-719 (2000).
  15. Schaap, P., et al. Molecular phylogeny and evolution of morphology in the social amoebas. Science. 314, 661-663 (2006).
  16. Du, Q., Kawabe, Y., Schilde, C., Chen, Z. H., Schaap, P. The Evolution of Aggregative Multicellularity and Cell-Cell Communication in the Dictyostelia. Journal of Molecular Biology. 427 (23), 3722-3733 (2015).
  17. Hirose, S., Benabentos, R., Ho, H. I., Kuspa, A., Shaulsky, G. Self-recognition in social amoebae is mediated by allelic pairs of tiger genes. Science. 333 (6041), 467-470 (2011).
  18. Strassmann, J. E., Queller, D. C. Evolution of cooperation and control of cheating in a social microbe. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (2), 10855-10862 (2011).
  19. Wolf, J. B., et al. Fitness Trade-offs Result in the Illusion of Social Success. Current Biology. 25 (8), 1086-1090 (2015).
  20. Veltman, D. M., Akar, G., Bosgraaf, L., Van Haastert, P. J. A new set of small, extrachromosomal expression vectors for Dictyostelium discoideum. Plasmid. 61 (2), 110-118 (2009).
  21. Southern, E. M. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. Journal of Molecular Biology. 98 (3), 503-517 (1975).
  22. Paschke, P., et al. Rapid and efficient genetic engineering of both wild type and axenic strains of Dictyostelium discoideum. PLoS One. 13 (5), 0196809(2018).
  23. Woznica, D., Knecht, D. A. Under-agarose chemotaxis of Dictyostelium discoideum. Methods in Molecular Biology. 346, 311-325 (2006).
  24. Dubin, M., Nellen, W. A versatile set of tagged expression vectors to monitor protein localisation and function in Dictyostelium. Gene. 465 (1-2), 1-8 (2010).
  25. de Hostos, E. L., et al. Dictyostelium mutants lacking the cytoskeletal protein coronin are defective in cytokinesis and cell motility. Journal of Cell Biology. 120, 163-173 (1993).
  26. Sekine, R., Kawata, T., Muramoto, T. CRISPR/Cas9 mediated targeting of multiple genes in Dictyostelium. Scientific Reports. 8 (1), 8471(2018).
  27. Sadelain, M., Papapetrou, E. P., Bushman, F. D. Safe harbours for the integration of new DNA in the human genome. Nature Reviews Cancer. 12 (1), 51-58 (2011).
  28. Rosengarten, R. D., et al. Leaps and lulls in the developmental transcriptome of Dictyostelium discoideum. BMC Genomics. 16, 294(2015).
  29. Tunnacliffe, E., Corrigan, A. M., Chubb, J. R. Promoter-mediated diversification of transcriptional bursting dynamics following gene duplication. Proc Natl Acad Sci USA. 115 (33), 8364-8369 (2018).
  30. Gebbie, L., et al. Phg2, a kinase involved in adhesion and focal site modeling in Dictyostelium. Molecular Biology of the Cell. 15, 3915-3925 (2004).
  31. Jeon, T. J., Lee, D. J., Merlot, S., Weeks, G., Firtel, R. A. Rap1 controls cell adhesion and cell motility through the regulation of myosin II. Journal of Cell Biology. 176, 1021-1033 (2007).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Selekcja bakteryjnaprotok elektroporacjiwalidacja transfekcjianaliza Southern blottest chemotaksjiwzrost makropinocytozywie e izolatyplazmid pozachromosomalny

Powiązane artykuły