Artykuł metodologiczny

Trening oparty na aktywności na bieżni ze szczurami Wistar z uszkodzonym rdzeniem kręgowym

9.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58983

⸱

16 stycznia 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Anatomical Sciences and Neurobiology, University of Louisville, 2Kentucky Spinal Cord Injury Rehabilitation Center, University of Louisville

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół demonstruje nasz model treningu na bieżni lokomotorycznej opartego na aktywności dla szczurów z uszkodzeniem rdzenia kręgowego (SCI). Obejmuje to zarówno grupy czworonożne, jak i tylko kończyny przednie, a także dwa odrębne typy niewyszkolonych grup kontrolnych. Badacze są w stanie ocenić efekty treningu na szczurach SCI przy użyciu tego protokołu.

Streszczenie

Uraz rdzenia kręgowego (SCI) powoduje trwałe deficyty, które obejmują zarówno mobilność, jak i wiele dysfunkcji związanych z autonomią. Trening lokomotoryczny (LT) na bieżni jest szeroko stosowany jako narzędzie rehabilitacyjne w populacji SCI, przynosząc wiele korzyści i poprawy codziennego życia. Wykorzystujemy tę metodę treningu zadaniowego opartego na aktywności (ABT) u gryzoni po SCI, aby zarówno wyjaśnić mechanizmy stojące za takimi ulepszeniami, jak i ulepszyć istniejące protokoły rehabilitacji klinicznej. Naszym obecnym celem jest określenie mechanizmów leżących u podstaw wywołanej przez ABT poprawy funkcji moczowych, jelitowych i seksualnych u szczurów SCI po umiarkowanym lub ciężkim poziomie stłuczenia. Po zabezpieczeniu każdego zwierzęcia w specjalnie wykonanej regulowanej kamizelce, są one mocowane do wszechstronnego mechanizmu podtrzymującego ciężar ciała, opuszczane do zmodyfikowanej trzypasmowej bieżni i wspomagane w treningu krokowym przez 58 minut, raz dziennie przez 10 tygodni. Taka konfiguracja pozwala na szkolenie zarówno zwierząt czworonożnych, jak i tylko kończyn przednich, wraz z dwiema różnymi grupami niewyszkolonymi. Zwierzęta wyszkolone na czwórkach ze wsparciem masy ciała są wspomagane przez obecnego technika, który pomaga w chodzeniu z prawidłowym ustawieniem kończyn tylnych w razie potrzeby, podczas gdy zwierzęta wyszkolone tylko na kończynach przednich są podnoszone na końcu ogonowym, aby zapewnić brak kontaktu kończyn tylnych z bieżnią i brak przenoszenia ciężaru. Jedna niewyszkolona grupa zwierząt SCI jest umieszczana w uprzęży i odpoczywa obok bieżni, podczas gdy druga grupa kontrolna SCI pozostaje w swojej domowej klatce w pobliskiej sali treningowej. Ten paradygmat pozwala na szkolenie wielu zwierząt SCI jednocześnie, dzięki czemu jest bardziej efektywne czasowo, a także zapewnia, że nasz przedkliniczny model zwierzęcy naśladuje reprezentację kliniczną tak blisko, jak to możliwe, szczególnie w odniesieniu do podparcia masy ciała z pomocą ręczną.

Wprowadzenie

Globalnie, od 250 000 do 500 000 nowych przypadków urazów rdzenia kręgowego (SCI) powstaje z powodu zwyrodnień, chorób lub najczęściej (do 90%) urazów1. Po urazowym SCI ma miejsce szereg zdarzeń fizjologicznych, które skutkują deficytami neurologicznymi, które wpływają na wiele funkcji organizmu. Ze względu na przewlekłe deficyty, które są następstwem SCI, kluczowe znaczenie ma opracowanie i przetestowanie skutecznych metod leczenia. Do niedawna strategie rehabilitacji najczęściej koncentrowały się na odzyskaniu mobilności2,3. Po SCI pacjenci zaliczają zaburzenia pracy pęcherza moczowego/moczowego, jelit i funkcji seksualnych do powikłań o najwyższej jakości życia, które wymagają lepszego leczenia1,4,5. Dlatego skupienie się na pęcherzu, jelitach i funkcjach seksualnych ma ogromne znaczenie z punktu widzenia rehabilitacji1,4,5.

Ćwiczenia i trening lokomotoryczny (LT) są powszechnie stosowanymi terapiami rehabilitacyjnymi w populacji pacjentów SCI, przynosząc wiele korzyści, takich jak funkcja układu krążenia, funkcja pęcherza/moczu i mobilność6,7,8,9,10. Z tego powodu stosujemy podobną modalność w naszym przedklinicznym modelu SCI u szczurów. Naszym celem jest ustalenie, jaki wpływ ma LT na szczury SCI Wistar, w szczególności w odniesieniu do funkcji górnych (nerek), jak i dolnych (pęcherz moczowy, zwieracz zewnętrzny cewki moczowej), funkcji jelit i funkcji seksualnych. Ponadto wykazano, że LT jest wystarczający do aktywacji układów nerwowo-mięśniowych poniżej poziomu urazu, co może wpływać na ilość plastyczności w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN)11,12.

Sukces LT w badaniach przedklinicznych jest dobrze udokumentowany zarówno w dużych13,14, jak i małych15,16,17,18,19 SCI animal models. Dowody sugerują, że aferentne bodźce sensoryczne dostarczane przez LT są wystarczające do stymulacji ścieżek odruchu rdzeniowego, które skutkują plastycznością i poprawą funkcji czuciowo-motorycznych9,20. Korzyści LT dotyczące funkcji autonomicznych nie zostały dobrze scharakteryzowane. Z tego powodu wdrażamy nasz paradygmat treningowy, koncentrując się na autonomicznych pomiarach wyników, używając czterech odrębnych grup, które obejmują dwie nieprzeszkolone grupy kontrolne i grupę metaboliczną/fizyczną nieobciążającą wraz z grupą LT, która naśladuje czas, czas trwania sesji, pomoc manualną i wsparcie ciężaru, które są używane w badaniach klinicznych19,21,22, 23,24.

Protokół

Wszystkie opisane metody zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu w Louisville (IACUC).

1. Postępowanie i testy przed urazami (tydzień przed SCI)

  1. Z każdym szczurem należy obchodzić się przez okres 5 - 10 minut raz dziennie przez pięć dni.
    UWAGA: W tym protokole wykorzystuje się dorosłe samce szczurów rasy Wistar, które początkowo osiągają wiek ~50 dni i ważą 200 - 225 g. Szczury w tym momencie przed urazem nie są przyzwyczajone do uprzęży, która jest używana do LT, ponieważ pełne użycie tylnych kończyn pozwala szczurowi uciec z kurtki.
  2. Przeprowadzaj wszelkie badania przed urazem, które są specyficzne dla badania (np. autorzy przeprowadzają oceny klatek metabolicznych w badaniach, które obejmują wpływ SCI na czynność pęcherza i jelit).

2. Kontuzja rdzenia kręgowego25,26,27,28

  1. Znieczulać zwierzęta mieszaniną ketaminy (80 mg/kg) i ksylazyny (10 mg/kg) dootrzewnowo zgodnie z dostarczoną tabelą dawkowania (Tabela 1). W razie potrzeby należy podać dodatkowe dawkowanie. Testuj głębokość znieczulenia co najmniej co 10 minut, oceniając odruchy rogówki, palpebrala, pedału, szczypania ogona i małżowiny usznej.
  2. Ogolić sierść z grzbietu zwierzęcia, gdzie ma dojść do nacięcia i urazu. Oczyść obszar operowany za pomocą peelingu chirurgicznego Dermachlor 4%. Podawać długo działający antybiotyk ogólny (np. 0,5 ml Pro-Pen-G podskórnie).
  3. Umieść znieczulone zwierzę na poduszce grzewczej na niskim ustawieniu, aby utrzymać normalną temperaturę ciała.
  4. Oszacuj lokalizację docelowego poziomu zmiany na podstawie wypukłości kręgów i za pomocą skalpela #10 wykonaj około 5 cm nacięcia na grzbiecie zwierzęcia, bezpośrednio nad kręgami w linii środkowej.
  5. W przypadku stłuczenia środkowej części klatki piersiowej należy odsłonić poziom T8/T9 rdzenia kręgowego poprzez usunięcie (za pomocą rongeurs) nakładającej się blaszki kręgowej T7.
  6. Korzystając z urządzenia do kontuzjowania, takiego jak impaktor o nieskończonym horyzoncie29, wykonaj stłuczenie (dla umiarkowanego lub ciężkiego stopnia SCI, użyj siły 210 kdyn bez czasu oczekiwania)18.
  7. Zszyj warstwę mięśniową i powięź nad rdzeniem kręgowym za pomocą żyłki o średnicy 4-0 i zamknij skórę klipsami chirurgicznymi o średnicy 9 mm.
  8. Podawać leki pooperacyjne, takie jak siarczan gentamycyny (5 mg/kg dziennie przez 5 dni; antybiotyk w celu uniknięcia infekcji pęcherza moczowego) i meloksykam (1 mg/kg podskórnie, przeciwbólowo przez pierwsze 48 godzin, a następnie w razie potrzeby).
  9. Umieść zwierzęta w czystej klatce na poduszce grzewczej. Sprawdzaj parametry życiowe zwierząt co 15 minut, aż w pełni obudzą się ze znieczulenia. W pierwszym dniu po operacji zwierzęta są zachęcane do jedzenia słodkiego smakołyku. Przez pierwsze 48 godzin (trzy razy dziennie w czasie ręcznego leczenia - patrz 2.10) szczury są monitorowane pod kątem braku aktywności, wokalizacji w odpowiedzi na obchodzenie się z wodą oraz braku chęci do jedzenia i picia. Jeśli analgezja okaże się niewystarczająca, kontaktuje się z personelem weterynaryjnym. Przez początkową dwutygodniową fazę rekonwalescencji zwierzęta są obserwowane pod kątem oznak infekcji lub innych powikłań. Gdy powróci odruchowe oddawanie moczu, zwierzęta są pielęgnowane dwa razy dziennie (wcześnie rano i późnym popołudniem). Zwierzęta z infekcjami lub znaczną utratą masy ciała są natychmiast poddawane eutanazji. Jeśli chodzi o spożycie pokarmu i wody, punktem granicznym dla eutanazji jest moment, w którym zwierzę osiągnęło utratę masy ciała powyżej 20%. Normalna utrata masy ciała po operacji i zaniku mięśni po zaniku poniżej poziomu urazu wynosi 15-20%. Wszystkie zwierzęta są ważone co najmniej raz w tygodniu.
  10. Wykonuj procedury opróżniania pęcherza za pomocą ręcznego manewru Credé 3 razy dziennie (8 rano, 15, 22), aż do powrotu odruchowej funkcji pęcherza (średnio 3 - 6 dni w przypadku kontuzji)26,30.

3. Faza treningu

  1. LT należy rozpocząć nie wcześniej niż dwa tygodnie po SCI, ponieważ zbyt wczesne rozpoczęcie interwencji może zaostrzyć wtórne kaskady urazów31.
  2. Tydzień 1 aklimatyzacja do treningu na bieżni: Przetransportuj szczury do cichego pomieszczenia, które jest przeznaczone do treningu.
  3. W pierwszym dniu losowo i równomiernie podziel zwierzęta SCI na wyszkolone i niewyszkolone grupy kontrolne, aby uwzględnić potencjalną zmienność zarówno samego urazu, jak i stopnia spontanicznego powrotu do zdrowia po kontuzji. Na przykład podziel szczury na 4 oddzielne grupy: czworonożne wyszkolone (QT), wyszkolone tylko kończyny przednie (FT), niewyszkolone kontrolne (NT) i niewyszkolone kontrole w klatce domowej (HC). Grupa pozorowana, w której zwierzęta przechodzą laminektomię, ale nie odnoszą żadnych obrażeń, a poza tym są traktowane tak samo jak inne grupy, może być również wykorzystywana jako grupa kontrolna bez obrażeń bez szkolenia.
  4. Umieść każde zwierzę w odpowiedniej uprzęży (Rysunek 1) i przymocuj uprzęże do mechanizmu podtrzymującego ciężar ciała nad bieżnią za pomocą zacisków krokodylkowych, które są przymocowane do sprężyn podtrzymujących ciężar (Rysunek 2 i Rysunek 3). Wymaga to, aby zwierzę było unieruchomione w jednym miejscu na bieżni, upewniając się, że porusza się w wyznaczonym kierunku do przodu i z wyznaczoną prędkością.
    UWAGA: Ze względu na ograniczenia czasowe i kadrowe, laboratorium autorów przeprowadza codzienne treningi w grupach po dwanaście zwierząt, po trzy w każdej podgrupie.
  5. Rozpocznij proces aklimatyzacji zgodnie z wcześniej opublikowanym protokołem17. Rozpocznij aklimatyzację do LT (początek 3. tygodnia po SCI) od stopniowego schematu ekspozycji na bieżni, zwiększając od 10 minut w dniu 1 do pełnego celu 58 minut w pierwszym tygodniu (Tabela 2). Zazwyczaj do 4 dnia zwierzęta dobrze przyzwyczajają się do reżimu treningowego. Jeśli zwierzę nie wykaże progresji do trzeciego dnia aklimatyzacji, czas ten zostanie skrócony, a dodatkowe dni zostaną dodane w bardziej stopniowym tempie (rzadkie zjawisko).
    1. Jeśli zwierzę w ciągu pierwszego dnia lub dwóch nie przystosuje się do zamknięcia uprzęży i bieżni, przerwij sesję treningową, zdejmij je z uprzęży, umieść zwierzę z powrotem w klatce i daj mu dwa smakołyki, aby wzmocnić przyszłą uległość. Następnego dnia ponownie umieść zwierzę w uprzęży i systemie podtrzymywania ciężaru ciała na 10 minut. W kolejnych dniach początkowo wydłużaj czas trwania treningu o 20 minut, a następnie kontynuuj codzienne wydłużanie czasu trwania treningu, aby osiągnąć pełny trening do 10 dnia.
  6. Postępuj zgodnie ze szczegółowym schematem treningowym przedstawionym w Tabeli 2.
    1. Ze względu na ograniczone użycie kończyn tylnych po urazie, szczury z grupy QT będą wymagały ręcznej pomocy w celu prawidłowego ułożenia łapy podczas wchodzenia na bieżnię. Użyj jednego palca na każdej ręce (zwykle trzeciej cyfry), aby pomóc w podparciu bioder/talii. Kiedy zwierzę wymaga dalszej pomocy w chodzeniu, użyj tego samego palca, aby wywrzeć nacisk powyżej kolana, aby rozpocząć krok. W razie potrzeby użyj osobnego palca (zwykle piątej cyfry), aby pomóc stopie w chodzeniu.
      UWAGA: Stopień potrzebnego wsparcia masy ciała różni się w zależności od zwierzęcia i zmienia się wraz z postępem treningu. Sprężynowy system podparcia zapewnia wystarczającą pomoc, aby utrzymać zwierzę w pozycji do prawidłowego chodu. Dalsze wsparcie jest udzielane w razie potrzeby przez trenera zgodnie z powyższym. Należy pamiętać, że kluczowym elementem LT jest funkcjonalnie odpowiednie ułożenie łapy dla koordynacji kroków i kończyn, które jest promowane przez trenera i jest niezależne od systemu wsparcia.
    2. W przypadku grupy ćwiczącej FT wyreguluj system podtrzymywania masy ciała, aby nieznacznie unieść kończyny tylne, aby upewnić się, że żadne bodźce czuciowe nie docierają do łap i nie dochodzi do przenoszenia ciężaru poprzez kontakt z bieżnią.
      UWAGA: Grupa FT służy jako ćwiczenie i kontrola metaboliczna, podobna do ćwiczeń na korbkę w badaniach nad treningiem opartym na aktywności człowieka.
    3. Założyć grupę NT i przymocować ją do systemu nośnego ciężaru ciała w podobny sposób jak odstęp QT, a następnie umieścić grupę NT w pobliżu grupy QT na nieruchomej powierzchni (Rysunek 2 i Rysunek 3).
      UWAGA: Grupa NT nie otrzymuje żadnej aktywności i kontroli pod kątem potencjalnych skutków bycia zaprzęgniętym przez dłuższy czas.
    4. Grupa klatek domowych może służyć jako dodatkowa kontrolka. Przewieź te zwierzęta do ośrodka szkoleniowego jako dodatkowy krok dla tej grupy.
  7. Do dnia 7-10 po rozpoczęciu LT należy trenować każde zwierzę raz dziennie, codziennie aż do dnia zakończenia badania. Po każdym dniu treningu podawaj każdemu zwierzęciu słodki smakołyk, aby wzmocnić posłuszeństwo. Kontynuuj codzienną LT u zwierząt zgodnie ze schematem 1 godziny podanym w Tabeli 2 przez cały czas trwania badania (np. 8-12 tygodni, aby naśladować około 80 jednogodzinnych sesji, które są wykonywane w badaniach klinicznych)9.

4. Eutanazja i pobieranie tkanek

  1. Podać śmiertelną dawkę znieczulenia zwierzęciu, które przestrzega wytycznych AVMA dotyczących eutanazji.
  2. Kiedy serce ledwo bije, natychmiast rozpocznij perfuzję zwierzęcia w dedykowanym dygestorium, najpierw zimną heparynizowaną solą fizjologiczną, a następnie zimnym, 4% roztworem paraformaldehydu.
    1. Zacznij od użycia nożyczek chirurgicznych, aby wykonać nacięcie w poprzek przepony, odsłaniając jamę klatki piersiowej. Kontynuuj przecinanie klatki piersiowej po obu stronach, usuwając klatkę piersiową. Włóż igłę perfuzyjną do lewej komory serca i zaciśnij igłę hemostatykami, a następnie przypnij prawy przedsionek.
    2. Za pomocą mechanizmu pompy perfuzyjnej pozwól, aby zimna heparynizowana sól fizjologiczna przepływała przez naczynia krwionośne zwierzęcia. Gdy klarowna sól fizjologiczna wypłynie z prawego przedsionka, przełącz się na zimny 4% roztwór paraformaldehydu, aż ciało zesztywnieje.
  3. Usuń niezbędne tkanki, takie jak nerki, pęcherz moczowy, okrężnica, mózg, zwoje czuciowe i rdzeń kręgowy, i przechowuj w 4% paraformaldehydu do 48 godzin w temperaturze 4 °C. Po 24 - 48 godzinach przenieść tkankę do 30% sacharozy i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  4. Przenieś pobraną tkankę do 30% roztworu krioprotektantu buforowanego sacharozą/fosforanem, aż tkanka będzie gotowa do cięcia. Aby przeciąć tkankę, należy zatopić ją w związku do zamrażania tkanek i wyciąć na kriostacie o żądanej grubości w zależności od rodzaju użytej tkanki (np. 35 μm dla tkanki mózgu i rdzenia kręgowego, 5 - 7 μm dla tkanek narządów).

Wyniki

Po zastosowaniu tego protokołu treningowego udokumentowano, że tylko zwierzęta z grupy QT wykazują lepszą funkcję lokomotoryczną w porównaniu z pozostałymi grupami18. Jednakże, ze względu na specyfikę naszego laboratorium, głównym celem naszych badań jest analiza korzyści z treningu zadaniowego opartego na aktywności (ABT) w zakresie funkcji pozalokomotorycznych, w tym funkcji pęcherza, jelit oraz funkcji seksualnych. Na przykład opublikowaliśmy wcześniej dane wykazujące, że LT prowadzi do wywołanej ćwiczeniami redukcji wielomoczu w grupach QT i FT szczurów po SCI (Rycina 4)17. Ponadto w grupach QT i FT nie zaobserwowano wywołanego urazem spadku ekspresji czynnika wzrostu TGF-β (transforming growth factor-β) w nerkach, co wskazywałoby na zmienną odpowiedź immunologiczną; poziomy TGF-β w tych grupach były zbliżone do poziomu u zwierząt z grupy sham (bez urazu). W tej samej badaniu17, przed eutanazją i pobraniem tkanek przeprowadzono cystometrię u zwierząt budzących się. Maksymalna amplituda skurczów pęcherza podczas cykli oddawania moczu nie różniła się znacząco pomiędzy grupami sham, QT i FT, podczas gdy w grupach NT pozostawała istotnie zmieniona. Wspólnie dane te wskazują na pozytywny wpływ ćwiczeń na zdrowie nerek i funkcję pęcherza, co w konsekwencji poprawia funkcję moczową po SCI.

Mechanizmy leżące u podłoża wielomoczu w populacji osób z SCI nie są obecnie jasne, lecz prawdopodobnie mają charakter wieloczynnikowy32. Niektórzy wysunęli hipotezę, na przykład, że gromadzenie się płynów w kończynach dolnych u osób z SCI przebywających na wózku inwalidzkim może prowadzić do przeładowania płynami i zwiększonego ich wydalania podczas zmian pozycji ciała (np. przy przechodzeniu z pozycji siedzącej do leżącej)3. Takie wyjaśnienie nie ma zastosowania w modelu przedklinicznym, co skłoniło nas do początkowego skupienia uwagi na argininowej wazopresynie (AVP) – hormonie kontrolującym homeostazę płynów w organizmie, który może być modulowany poprzez ćwiczenia. AVP kontroluje homeostazę płynów poprzez aktywację receptora V2 w nerkach, co ułatwia resorpcję wody z kanalików zbiorczych nerek34. Wstępne dowody z eksperymentu pilotażowego (punkt czasowy chroniczny przy jednym stopniu nasilenia uszkodzenia – siła uderzenia 210 kdyn) wskazują na korzystny wpływ ćwiczeń (LT i FT) na poziom receptora V2 w nerkach szczura (Rysunek 5).

Spersonalizowany projekt rękawicy; tkanina z otworami i rzepami; badanie użyteczności i wygody.
Rycina 1: Specjalistyczne uprzęże dostosowane rozmiarem do samców szczurów Wistar. Zarówno zwierzęta z grupy QT, jak i NT, umieszcza się w kurtkach tego samego typu (A) umożliwiając wykorzystanie kończyn tylnych w przypadku zwierząt QT. Do szelek stosowanych u zwierząt FT przyszyto dodatkowe pasy (B) w celu uniesienia kończyn tylnych, zapewniając brak podparcia ciężarem ciała. Duże fragmenty szelek wykonane z materiału rzepowego umożliwiają łatnią dopasowanie do zwierząt o różnych rozmiarach oraz do wszelkich zmian rozmiaru poszczególnych zwierząt w czasie. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Układ testowy taśmociąga z czujnikami NT, QT i FT; wykorzystywany do analizy naprężenia i odkształcenia materiału.
Rycina 2: Konfiguracja stanowiska szkoleniowego. Mechanizm odciążenia masy ciała wokół bieżni dla grup NT (daleko po lewej), QT (środek) lub FT (po prawej). Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Konfiguracja testów wysiłkowych u gryzoni; szczury w uprzężach na bieżni, badanie mięśni szkieletowych.
Rysunek 3: Stanowisko treningowe ze zwierzętami. Góra (A) oraz (B) widoki boczne przedstawiające mechanizm podtrzymywania masy ciała oraz miejsce przymocowania klipsów wspierających do uprzęży. Zwróć uwagę, że kończyny tylne zwierzęcia w grupie FT (B) jest podniesiony i znajduje się poza pasem bieżni. Wstawka (C) przedstawia zbliżenie klipsa przymocowanego do uprzęży. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykresy analizy objętości moczu i wody; wpływ przed i po treningu na SCI w ciągu 24 godzin.
Rycina 4: Wpływ ABT na wielomocz u szczurów po SCI. Całkowita objętość wydalanego moczu (A) wzrosło po SCI (*; p < 0,05) i po 9 tygodniach treningu LT powróciły do wartości bliższych poziomowi wyjściowemu w grupach QT i FT, natomiast pozostały podwyższone w grupie NT w stosunku do grup trenujących (#; p < 0,05). We wszystkich grupach odnotowano zwiększoną ilość wydalanego moczu w porównaniu z wartością wyjściową w 9. tygodniu oraz zwiększoną objętość oddawanej moczu (B). Należy zauważyć, że liczba pustek (C) oraz ilość przyjmowanej wody (D) pozostały takie same we wszystkich grupach. Wartości przedstawiają średnie ± błąd standardowy. Rysunek przedrukowano za zgodą autora17. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Western blot oraz wykres słupkowy przedstawiające porównanie poziomów białka V2 w nerkach szczura w różnych warunkach.
Rysunek 5: Efekty ABT w nerce szczura. Wyniki analizy Western blot dla poziomu receptorów V2 w nerkach szczurów w 5 grupach po 4 szczury w każdej (łącznie 20), przedstawiające poziomy ekspresji dla prążków białkowych ukazanych na panelu A or wyniki analizy densytometrycznej średnich wartości grup dla prążków (przy użyciu programu ImageJ; OD = gęstość optyczna) na panelu B, co wskazuje na istotność (*; p < 0,05) spadek liczby receptorów w punkcie czasowym chronicznym (12 tygodni) po SCI oraz brak spadku w stosunku do wartości bazowej (kontrolne grupy operowane pozornie) dla grup otrzymujących 10 tygodni codziennej, jednogodzinnej ABT. Słupki błędów reprezentują błąd standardowy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Tabela dawkowania ketaminy/ksylazyny
Dawka skuteczna:***Przy zastosowaniu roztworu ketaminy 100 mg/mL i roztworu ksylazyny 20 mg/mL***
80 mg/kg ketaminy
10 mg/kg ksylazyny
Wstrzyknięcie 1,0 mL mieszaniny = 0,62 mL roztworu ketaminy (10 mg/mL) + 0,38 mL roztworu ksylazyny (20 mg/mL)
Masa zwierzęciaWstrzyknięcie mieszaninyMasa zwierzęciaWstrzyknięcie mieszaniny
(g)(mL)(g)(mL)
100,132750,36
1050,142850,37
100,142900,38
150,15300,39
1200,163050,4
1250,163100,4
1300,173150,41
1350,183200,42
1400,183250,42
1450,19300,43
1500,2350,4
150,23400,4
1600,213450,45
1650,213500,46
1700,2350,46
1750,233600,47
1800,233650,47
1850,243700,48
1900,253750,49
1950,253800,49
2000,263850,5
2050,273900,51
2100,273950,51
2150,28400,52
200,294100,53
2250,294200,5
2300,34300,56
2350,31400,57
2400,314500,59
2450,324600,6
2500,34700,61
250,34800,62
2600,344900,64
2650,34500,65
2700,355100,6

Tabela 1: Tabela dawkowania środków znieczulających w zależności od masy ciała poszczególnych zwierząt.

Czas szkolenia
(min)		Prędkość (cm/s)Czas trwania (min)
0-161
1-28.41
2-310.81
3-813.25
8-1310.85
13-2813.215
28-3310.85
33-3865
38-438.45
43-5813.215

Tabela 2: Schemat treningowy z ustawieniami prędkości bieżni w zależności od czasu spędzonego przy danej prędkości.

Dyskusja

Nasze metody ABT na szczurach po SCI to nowatorska interwencja terapeutyczna. Podczas gdy mogą istnieć inne metody ćwiczeń i treningu krokowego w modelach zwierzęcych 35,36,37, ta metoda naśladuje LT przeprowadzoną klinicznie w populacji ludzi po SCI, gdzie zaobserwowaliśmy obiecujące wyniki 23. Dzięki połączeniu naszej konfiguracji, schematu i wykorzystania zwierząt kontrolnych, wyniki uzyskane z zastosowania naszego paradygmatu treningowego pomogą zrozumieć korzyści płynące z ABT po SCI. Przyszłe zastosowania tego protokołu obejmują obserwację opisanych wyników ABT w różnych ramach treningowych, a także wpływu, jaki ABT ma na powrót do zdrowia po różnych poziomach i zakresach urazu.

Jednym z ograniczeń tej konstrukcji jest długość czasu na takie eksperymenty. Biorąc pod uwagę, że nasz program treningowy dla każdego zwierzęcia wymaga 1 godziny dziennie, codziennie przez 10 tygodni, konieczne jest poświęcenie znacznej ilości czasu personelu i zorganizowanego harmonogramu. Ważnym aspektem, który wymaga szczególnej uwagi, jest grupa FT, która posiada unikalne szelki z paskami materiałowymi na rzepy, które zabezpieczają tylne kończyny nad bieżnią w celu wyeliminowania podparcia ciężaru. Ważne jest, aby upewnić się, że zwierzę nie otrzymuje podparcia ciężaru ciała, dlatego pod tylnymi łapami szczura nie umieszcza się platformy. Ponadto, jak wykazały wcześniejsze badania, bodźce czuciowe są głównym czynnikiem wpływającym na plastyczność układu ruchu w rdzeniu kręgowym 38,39,40, istnieje ciągła potrzeba obchodzenia się z grupą QT, aby pomóc w chodzeniu tak samo, jak fizjoterapeuci w warunkach klinicznych.

Ważną modyfikacją wprowadzoną do dostępnego na rynku systemu bieżni stosowanego u zwierząt było odwrócenie polaryzacji. Po odświetleniu silnika przewody dodatnie i ujemne zostały zamienione, co odwraca kierunek ruchu bieżni. Pozwala to na uzyskanie większej przestrzeni i łatwiejszego dostępu, aby dotrzeć i pomóc w szkoleniu zwierząt (system jest wyposażony w siatkę amortyzującą na jednym końcu, która została zaprojektowana, aby zapobiec zejściu zwierząt bez uprzęży, nienaruszonych kręgosłupowo z pasa bieżni).

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują doktorom Patricii Ward, April Herrity i Susan Harkema za ich wkład i wskazówki, Christine Yarberry za pomoc chirurgiczną, Yangsheng Chen, Andrea Willhite i Johnny Morehouse za pomoc techniczną oraz Darlene Burke za pomoc w statystykach i ocenach zachowań. Wsparcie finansowe dla tych prac zostało zapewnione przez Departament Obrony (W81XWH-11-1-0668 i W81XWH-15-1-0656) oraz Kentucky Spinal Cord and Head Injury Research Trust (KSCHIRT 14-5).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Bieżnia Exer-3RColumbus Instrumentsodwrócona polaryzacja silnika
System podtrzymywania masy ciałaNieZmodyfikowane wagi sprężynowe z zaciskami krokodylkowymi
Uprząż dla szczurówNIE DOTYCZYNIE DOTYCZY Nasze uprzęże są wykonywane na zamówienie; proszę zapoznać się z rysunkiem 1, aby uzyskać wizualizacje.
Urządzenie udarowe Infinite Horizon (IH)Systemy precyzyjne i oprzyrządowanieModel 0400
Ketamina HClHospiraNDC 0409-2053-10
Ksylazyna (AnaSed Injection)Akorn Animal HealthNDC 59399-110-20
Meloksykam (Eloxiject)Henry Schein Zdrowie zwierzątNDC 116695-6925-2
Siarczan gentamycyny (GentaFuse)Henry Schein Animal HealthNDC 11695-4146-1
uretan, 97%Argos OrganicsCAS 51-79-6
4-0 zestaw szwów monofilamentowych (szew nylonowy 4-0 Ethilon)Ethicon, LLC205016
Klipsy do szwów Michel (automatyczne klipsy 9 mm)MikRon Precision, Inc.1629
Poduszka grzewczaMastex Industries, IncModel 500
Tootie Fruitys płatki zbożoweMalt O MealNa trening nagroda
Samce szczurów WistarEnvigo
Rozmiar 10 chirurgiczne ostrza skalpelaMiltexSKU: 4-110
dotyczy

Bibliografia

  1. World Health Organization (WHO). Spinal Cord Injury. , Available from: http://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/spinal-cord-injury (2013).
  2. Ahuja, C. S., et al. Traumatic spinal cord injury. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17018(2017).
  3. Behrman, A. L., Harkema, S. J. Locomotor training after human spinal cord injury: a series of case studies. Physical Therapy. 80 (7), 688-700 (2000).
  4. Anderson, K. D. Targeting recovery: priorities of the spinal cord-injured population. Journal of Neurotrauma. 21 (10), 1371-1383 (2004).
  5. Steadman, C. J., Hubscher, C. H. Sexual function after spinal cord injury: innervation, assessment, and treatment. Current Sexual Health Reports. 8 (2), 106-115 (2016).
  6. Behrman, A. L., et al. Locomotor training progression and outcomes after incomplete spinal cord injury. Physical Therapy. 85 (12), 1356-1371 (2005).
  7. Dietz, V., Harkema, S. J. Locomotor activity in spinal cord-injured persons. Journal of Applied Physiology. 96 (5), 1954-1960 (2004).
  8. Harkema, S., et al. Effect of epidural stimulation of the lumbosacral spinal cord on voluntary movement, standing, and assisted stepping after motor complete paraplegia: a case study. The Lancet. 377 (9781), 1938-1947 (2011).
  9. Harkema, S. J., et al. Locomotor training: as a treatment of spinal cord injury and in the progression of neurologic rehabilitation. Archives of physical medicine and rehabilitation. 93 (9), 1588-1597 (2012).
  10. Jayaraman, A., et al. Locomotor training and muscle function after incomplete spinal cord injury: case series. The Journal of Spinal Cord Medicine. 31 (2), 185-193 (2008).
  11. Behrman, A. L., Bowden, M. G., Nair, P. M. Neuroplasticity after spinal cord injury and training: an emerging paradigm shift in rehabilitation and walking recovery. Physical Therapy. 86 (10), 1406-1425 (2006).
  12. Edgerton, V. R., Tillakaratne, N. J., Bigbee, A. J., de Leon, R. D., Roy, R. R. Plasticity of the spinal neural circuitry after injury. Annual Review of Neuroscience. 27, 145-167 (2004).
  13. Barbeau, H., Rossignol, S. Recovery of locomotion after chronic spinalization in the adult cat. Brain Research. 412 (1), 84-95 (1987).
  14. Lovely, R. G., Gregor, R., Roy, R., Edgerton, V. R. Effects of training on the recovery of full-weight-bearing stepping in the adult spinal cat. Experimental Neurology. 92 (2), 421-435 (1986).
  15. Multon, S., Franzen, R., Poirrier, A. -L., Scholtes, F., Schoenen, J. The effect of treadmill training on motor recovery after a partial spinal cord compression-injury in the adult rat. Journal of Neurotrauma. 20 (8), 699-706 (2003).
  16. Moraud, E. M., et al. Closed-loop control of trunk posture improves locomotion through the regulation of leg proprioceptive feedback after spinal cord injury. Scientific Reports. 8 (1), 76(2018).
  17. Hubscher, C. H., et al. Effects of exercise training on urinary tract function after spinal cord injury. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 310 (11), F1258-F1268 (2016).
  18. Ward, P. J., et al. Novel multi-system functional gains via task specific training in spinal cord injured male rats. Journal of Neurotrauma. 31 (9), 819-833 (2014).
  19. Ward, P. J., et al. Optically-induced neuronal activity is sufficient to promote functional motor axon regeneration in vivo. PloS One. 11 (5), e0154243(2016).
  20. Edgerton, V. R., et al. Retraining the injured spinal cord. The Journal of physiology. 533 (1), 15-22 (2001).
  21. Angeli, C. A., Edgerton, V. R., Gerasimenko, Y. P., Harkema, S. J. Altering spinal cord excitability enables voluntary movements after chronic complete paralysis in humans. Brain. 137 (5), 1394-1409 (2014).
  22. Behrman, A. L., Ardolino, E. M., Harkema, S. J. Activity-Based Therapy: From basic science to clinical application for recovery after spinal cord injury. Journal of Neurologic Physical Therapy. 41, S39-S45 (2017).
  23. Hubscher, C. H., et al. Improvements in bladder, bowel and sexual outcomes following task-specific locomotor training in human spinal cord injury. PloS One. 13 (1), e0190998(2018).
  24. Rejc, E., Angeli, C. A., Bryant, N., Harkema, S. J. Effects of stand and step training with epidural stimulation on motor function for standing in chronic complete paraplegics. Journal of Neurotrauma. 34 (9), 1787-1802 (2017).
  25. Hall, B. J., et al. Spinal cord injuries containing asymmetrical damage in the ventrolateral funiculus is associated with a higher incidence of at-level allodynia. The Journal of Pain. 11 (9), 864-875 (2010).
  26. Hubscher, C. H., Johnson, R. D. Effects of acute and chronic midthoracic spinal cord injury on neural circuits for male sexual function. II. Descending pathways. Journal of Neurophysiology. 83 (5), 2508-2518 (2000).
  27. Hubscher, C. H., Johnson, R. D. Chronic spinal cord injury induced changes in the responses of thalamic neurons. Experimental Neurology. 197 (1), 177-188 (2006).
  28. Ward, P. J., Hubscher, C. H. Persistent polyuria in a rat spinal contusion model. Journal of Neurotrauma. 29 (15), 2490-2498 (2012).
  29. Scheff, S. W., Rabchevsky, A. G., Fugaccia, I., Main, J. A., Lumpp, J. E. Jr Experimental modeling of spinal cord injury: characterization of a force-defined injury device. Journal of Neurotrauma. 20 (2), 179-193 (2003).
  30. Ferrero, S. L., et al. Effects of lateral funiculus sparing, spinal lesion level, and gender on recovery of bladder voiding reflexes and hematuria in rats. Journal of Neurotrauma. 32 (3), 200-208 (2015).
  31. Smith, R. R., et al. Swim training initiated acutely after spinal cord injury is ineffective and induces extravasation in and around the epicenter. Journal of Neurotrauma. 26 (7), 1017-1027 (2009).
  32. Oelke, M., et al. A practical approach to the management of nocturia. International Journal of Clinical Practice. 71 (11), e13027(2017).
  33. Claydon, V., Steeves, J., Krassioukov, A. Orthostatic hypotension following spinal cord injury: understanding clinical pathophysiology. Spinal Cord. 44 (6), 341(2006).
  34. Antunes-Rodrigues, J., De Castro, M., Elias, L. L., Valenca, M. M., McCANN, S. M. Neuroendocrine control of body fluid metabolism. Physiological Reviews. 84 (1), 169-208 (2004).
  35. Côté, M. -P., Azzam, G. A., Lemay, M. A., Zhukareva, V., Houlé, J. D. Activity-dependent increase in neurotrophic factors is associated with an enhanced modulation of spinal reflexes after spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 28 (2), 299-309 (2011).
  36. Dupont-Versteegden, E. E., et al. Exercise-induced gene expression in soleus muscle is dependent on time after spinal cord injury in rats. Muscle & Nerve: Official Journal of the American Association of Electrodiagnostic Medicine. 29 (1), 73-81 (2004).
  37. De Leon, R., Hodgson, J., Roy, R., Edgerton, V. R. Full weight-bearing hindlimb standing following stand training in the adult spinal cat. Journal of Neurophysiology. 80 (1), 83-91 (1998).
  38. Pearson, K. G. Progress in brain research. 143, Elsevier. 123-129 (2004).
  39. Gerasimenko, Y., et al. Feed-forwardness of spinal networks in posture and locomotion. The Neuroscientist. 23 (5), 441-453 (2017).
  40. Courtine, G., et al. Transformation of nonfunctional spinal circuits into functional states after the loss of brain input. Nature Neuroscience. 12 (10), 1333(2009).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Uraz rdzenia kr gowegotrening lokomocyjnytrening na bie niodci enie masy cia atrening czworono nytrening ko czyn przednichuraz kontuzyjnyprotoko y rehabilitacyjne
Trening oparty na aktywności na bieżni ze szczurami Wistar z uszkodzonym rdzeniem kręgowym
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.