Montaż i charakterystyka memrystorów biomolekularnych składających się z błon lipidowych domieszkowanych kanałami jonowymi

Podsumowanie

Miękkie, biomolekularne memrystory o niskiej mocy wykorzystują podobny skład, strukturę i mechanizmy przełączania biosynaps. Przedstawiono protokół składania i charakterystyki memrystorów biomolekularnych otrzymywanych z izolacji dwuwarstw lipidowych powstałych pomiędzy kropelkami wody w oleju. Włączenie aktywowanych napięciem peptydów alametycyny powoduje memrystywne przewodnictwo jonowe w poprzek błony.

Streszczenie

Zdolność do odtwarzania funkcji synaptycznych w syntetycznych elementach obwodów jest niezbędna dla neuromorficznych systemów obliczeniowych, które starają się naśladować zdolności poznawcze mózgu z porównywalną wydajnością i gęstością. Do tej pory tranzystory trójkońcowe i memrystory dwukońcowe na bazie krzemu były szeroko stosowane w obwodach neuromorficznych, w dużej mierze ze względu na ich zdolność do kolokacji przetwarzania informacji i pamięci. Jednak urządzenia te nie są w stanie osiągnąć wzajemnych połączeń i złożoności mózgu, ponieważ są energochłonne, nie naśladują kluczowych funkcji synaptycznych i cierpią z powodu wysokiego szumu i wysokich napięć przełączania. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, opracowaliśmy i scharakteryzowaliśmy memrystor biomolekularny, który naśladuje skład, strukturę i charakterystykę przełączania synaps biologicznych. W tym miejscu opisano proces składania i charakteryzowania memrystorów biomolekularnych składających się z dwuwarstwy lipidowej o grubości 5 nm utworzonej między funkcjonalizowanymi lipidami kropelkami wody w oleju i domieszkowanymi peptydami alametycyny aktywowanymi napięciem. Podczas gdy podobne protokoły składania zostały wykorzystane do zbadania właściwości biofizycznych błon lipidowych opartych na kropelkach i kanałów jonowych związanych z błoną, niniejszy artykuł koncentruje się na kluczowych modyfikacjach metody dwuwarstwowej granicy faz kropel, niezbędnych do osiągnięcia spójnej wydajności memrystora. W szczególności opisujemy proces przygotowania liposomów i włączenia peptydów alamietycyny do dwuwarstwowych błon lipidowych oraz odpowiednie stężenia każdego składnika, a także ich wpływ na ogólną odpowiedź memrystorów. Szczegółowo opisujemy również proces charakterystyki memrystorów biomolekularnych, w tym pomiar i analizę memrystywnych zależności prąd-napięcie uzyskanych za pomocą cyklicznej woltamperometrii, a także krótkotrwałą plastyczność i uczenie się w odpowiedzi na skokowe ciągi impulsów napięciowych.

Wprowadzenie

Powszechnie uznaje się, że synapsy biologiczne są odpowiedzialne za wysoką wydajność i ogromną równoległość mózgu, ze względu na ich zdolność do uczenia się i przetwarzania informacji w wysoce adaptacyjny sposób. Ta skoordynowana funkcjonalność wyłania się z wielu, wysoce złożonych mechanizmów molekularnych, które napędzają zarówno krótko-, jak i długoterminową plastyczność synaptyczną^1,2,3,4,5. Neuromorficzne systemy obliczeniowe mają na celu emulację funkcji synaptycznych na poziomach zbliżonych do gęstości, złożoności i efektywności energetycznej mózgu, które są potrzebne dla następnej generacji komputerów podobnych do mózgu^6,7,8. Jednak odtworzenie cech synaptycznych przy użyciu tradycyjnych elementów obwodów elektronicznych jest praktycznie niemożliwe⁹, zamiast tego wymaga zaprojektowania i wyprodukowania nowych elementów sprzętowych, które mogą dostosować się do przychodzących sygnałów i zapamiętywać historie informacji⁹. Tego typu urządzenia inspirowane synapsami są znane jako mem-elements^9,10,11 (skrót od elementów pamięci), które według Di Ventra et al.9^,11, są pasywnymi, dwuterminalowymi urządzeniami, których rezystancja, pojemność lub indukcyjność mogą być rekonfigurowane w odpowiedzi na bodźce zewnętrzne i które mogą zapamiętywać wcześniejsze stany¹¹. Aby osiągnąć poziom zużycia energii zbliżony do tego w mózgu, elementy te powinny wykorzystywać podobne materiały i mechanizmy plastyczności synaptycznej¹².

Do tej pory, dwuterminalowe memrystory ^13,14,15 zostały zbudowane głównie przy użyciu komplementarnej technologii CMOS (metal-tlenek-półprzewodnik), charakteryzującej się wysokimi napięciami przełączania i wysokim szumem. Ta technologia nie skaluje się dobrze ze względu na wysokie zużycie energii i niską gęstość. Aby zaradzić tym ograniczeniom, niedawno zbudowano wiele organicznych i polimerowych memrystorów. Jednak urządzenia te wykazują znacznie wolniejszą dynamikę przełączania ze względu na czasochłonną dyfuzję jonów przez przewodzącą matrycę polimerową^16,17. W rezultacie, mechanizmy, za pomocą których zarówno oparte na CMOS, jak i organiczne urządzenia memrystywne emulują funkcje inspirowane synapsami, są wysoce fenomenologiczne, obejmując tylko kilka funkcji synaptycznych, takich jak plastyczność zależna od czasu skoku (STDP)¹⁸, pomijając jednocześnie inne kluczowe cechy, które również odgrywają istotną rolę w uczynieniu mózgu potężnym i wydajnym komputerem, takie jak presynaptyczna, krótkotrwała plastyczność¹⁹.

Niedawno wprowadziliśmy nową klasę urządzeń memrystywnych¹² z aktywowanymi napięciem peptydami wbudowanymi w biomimetyczne błony lipidowe, które naśladują biomolekularny skład, strukturę błony i mechanizmy przełączania kanałów biologicznych synaps²⁰. Tutaj opisujemy, jak montować i elektrycznie przesłuchiwać te dwuterminalowe urządzenia, ze szczególnym naciskiem na to, jak oceniać krótkoterminowe. Plastyczność do implementacji w aplikacjach do nauki online12. Montaż urządzenia opiera się na metodzie dwuwarstwowej interfejsu kropelkowego (DIB)²¹, która jest szeroko stosowana w ostatnich latach do badania biofizyki błon modelowych²¹ i kanałów jonowych związanych z błoną^22,23,24, oraz jako elementy składowe do rozwoju materiałów reagujących na bodźce^25,26. Szczegółowo opisujemy proces składania i badania błon dla osób zainteresowanych zastosowaniami neuromorficznymi, ale mających ograniczone doświadczenie w biomateriałach lub biologii błon. Protokół zawiera również pełny opis procedury charakteryzacji, która jest równie ważna jak proces montażu, biorąc pod uwagę dynamiczne i rekonfigurowalne właściwości elektryczne urządzenia²⁷. Opisana tu procedura i reprezentatywne wyniki stanowią podstawę dla nowej klasy tanich, energooszczędnych, miękkich elementów mem opartych na interfejsach lipidowych i innych biomolekułach do zastosowań w obliczeniach neuromorficznych, autonomicznych strukturach i systemach, a nawet adaptacyjnych interfejsach mózg-komputer.

Protokół

1. Ogólne instrukcje i środki ostrożności

1. Wybrać odpowiednie, nieuszkodzone naczynia szklane do odmierzania/mieszania (kolby, zlewki itp.) oraz inne przybory laboratoryjne (szpatułki, miarki itp.) do użytku.
2. Ze szkłem należy obchodzić się ostrożnie, aby uniknąć uszkodzenia, i nosić rękawice lateksowe lub nitrylowe, aby uniknąć zanieczyszczenia szkła/sprzętu laboratoryjnego pozostałościami z opuszków palców i chronić skórę.
3. Dokładnie wyczyść wybrane szkło/przybory laboratoryjne roztworem detergentu i wodą, szorując miękką szczotką do butelek, aż będą czyste, a wszystkie pozostałości zostaną usunięte.
4. Dokładnie spłucz wodą z kranu, a następnie wodą dejonizowaną (DI). Umieść na suszarce do wyschnięcia na powietrzu.
5. Opcjonalnie: Opłucz oczyszczone szkło/przybory laboratoryjne izopropylem (IPA, 99,5%) i umieść w próżni, aby odparować wszystkie resztki IPA, aby upewnić się, że są wolne od wszelkich zanieczyszczeń (~2 h). Wyjmij z komory próżniowej i umieść w czystym środowisku.
   UWAGA: Używaj niestrzępiących się chusteczek do wycierania szkła i sprzętu laboratoryjnego. Kupuj i używaj sterylnych małych szklanych fiolek i probówek z bezpiecznym zamkiem do przygotowania materiałów i przechowywania próbek. Więcej informacji na temat czyszczenia naczyń szklanych i innych standardowych procedur operacyjnych w laboratorium można znaleźć w Bazie Danych Edukacji Naukowej JoVE²⁸.

2. Przygotowanie wodnego roztworu buforowego

1. Zakładając rękawice lateksowe lub nitrylowe, wybierz odpowiedni i czysty szklany pojemnik do przygotowania 50 ml wodnego buforu (500 mM chlorku sodu (KCl), 10 mM kwasu 3-(N-morfolino)propanosulfonowego (MOPS), pH 7,0).
2. Za pomocą cyfrowej, precyzyjnej wagi masowej i czystej szpatułki naniec 1,86378 g KCl na czysty papier wagowy, a następnie dodaj do szklanego pojemnika.
   UWAGA: Ilości KCl i MOPS powinny się różnić w zależności od pożądanej objętości i pożądanych stężeń końcowych.
3. Odważyć 0,10463 g mopsa i dodać do szklanego pojemnika. Następnie dodaj 50 ml wody DI do szklanego pojemnika i dokładnie mieszaj, aż KCl i MOPS całkowicie się rozpuszczą.
4. Roztwór buforowy należy przechowywać w temperaturze pokojowej i stosować w razie potrzeby.
   UWAGA: Chociaż roztwory buforowe mogą być przechowywane przez stosunkowo długi czas, zaleca się stosowanie świeżo przygotowanych roztworów buforowych w celu uzyskania lepszych i bardziej spójnych wyników.

3. Przygotowanie liposomów

UWAGA: Krok 3.1 ma zastosowanie tylko wtedy, gdy fosfolipidy są pozyskiwane w postaci liofilizowanych proszków, a zatem można go pominąć, jeśli fosfolipidy są kupowane w chloroformie.

1. Rozpuścić 5 mg 1,2-difitanoilo-sn-glicero-3-fosfocholiny (DPhPC) lub lipidów z ekstraktów lipidowych całkowitych w mózgu (BTLE) w 1 ml chloroformu w sterylnej szklanej fiolce o pojemności 5 ml.
2. Delikatnie wirując, odparować chloroform pod delikatnym strumieniem suchego azotu, aż na dnie fiolki pozostanie film lipidowy.
3. Umieścić fiolkę zawierającą film lipidowy pod próżnią na 10-12 godzin, aby umożliwić całkowite usunięcie pozostałości chloroformu.
4. Wyjąć fiolkę z komory próżniowej i ponownie uwodnić film lipidowy, dodając 10 ml wodnego roztworu buforowego przygotowanego w Kroku 2, aby osiągnąć końcowe stężenie lipidów 2 mg/ml.
5. Zamrozić (-20 °C) i całkowicie rozmrozić zawiesinę lipidową sześć razy, aby ułatwić montaż liposomów wielopłytkowych.
   UWAGA: Pozwól mieszaninie rozmrozić się w temperaturze pokojowej, nigdy w ogrzewanym otoczeniu.
6. Za pomocą dostępnej na rynku wytłaczarki wytłaczaj roztwór liposomowy, przetłaczając pełną zawiesinę lipidową przez membranę z wytrawionymi torami o średnicy porów 0,1 μm. Wytłaczaj zawiesinę 11 razy w bezpośrednim odstępie czasu, aby uzyskać liposomy jednowarstwowe o średnicach ok. 100 nm potrzebne do prawidłowego wytworzenia monowarstwy lipidowej. Zawiesinę liposomową należy przechowywać w temperaturze 4 °C i zużyć w ciągu 1 tygodnia od przygotowania. Dla uproszczenia odnieś się do otrzymanego roztworu liposomowego jako "A".
   UWAGA: W przypadku wytłaczania liposomów BTLE zachęca się badacza do rozgrzania ekstrudera do 45-50 °C, wyższej niż temperatura przemiany fazowej lipidów BTLE (~ 37 °C)^23,29, aby umożliwić łatwiejsze wytłaczanie. Uwodnione zawiesiny liposomów BTLE można również przygotować bezpośrednio (zamiast zamrażania-rozmrażania i wytłaczania), umieszczając zamkniętą fiolkę z zawiesiną w sonikatorze do kąpieli w temperaturze 55 °C na ~15 min.

4. Rekonstytucja peptydów alametykiny

UWAGA: Ta procedura opisuje proces rekonstytucji alametycyny w liposomach do końcowego stężenia 1 μM. Stężenie to jest wystarczające do indukowania prądów na poziomie nA podobnych do tych wcześniej publikowanych¹². Zwiększenie stężenia peptydów zmniejszy próg przełączania i zwiększy amplitudy prądów indukowanych przez przyłożone napięcie²⁹.

1. Rozpuścić peptydy alamitycyny w etanolu do końcowego stężenia 2,5 mg/ml, krótko zmieszać, aby dobrze wymieszać, i przechowywać roztwór podstawowy w zamrażarce (-20 °C).
   UWAGA: Peptydy alamitycyny są zwykle kupowane w postaci proszku.
2. W probówce o pojemności 1,5 ml z zabezpieczeniem Safe-Lock wymieszać 99 μl roztworu "A" z 1 μl roztworu podstawowego alametycyny, aby uzyskać końcowe stężenie almetycyny wynoszące 13 μM w zawiesinie liposomów. Wirować, aby dobrze wymieszać. Odnosić się do otrzymanego roztworu peptyd-liposom jako "B".
3. Zmieszać 117 μl roztworu "A" z 10 μl roztworu B, aby uzyskać końcowe stężenie alamietycyny 1 μM, a następnie zwirować, aby dobrze wymieszać. Odnieś się do otrzymanego roztworu jako "C".
4. Roztwory "B" i "C" należy przechowywać w temperaturze 4 °C i stosować w razie potrzeby.

5. Przygotowanie żelu agarozowego

1. Za pomocą cyfrowej, precyzyjnej wagi masowej i czystej szpatułki dodaj 0,5 g proszku agarozy do czystej masy papierowej.
2. Przenieś zważoną agarozę do 100 ml czystej szklanej zlewki i dodaj 50 ml wody DI do agarozy.
   UWAGA: W ten sposób otrzymamy 1% (wag./obj.) roztwór żelu agarozowego.
3. Umieść czysty magnes mieszający w szklanej zlewce i umieść zlewkę na mieszającej płycie grzejnej.
4. Mieszając, doprowadź mieszaninę do wrzenia, aż agaroza całkowicie się rozpuści.
5. Wyjmij zlewkę z płyty grzejnej, aby mieszanina ostygła do temperatury pokojowej. Przechowywać w temperaturze 4 °C i stosować w razie potrzeby.
6. Przed ponownym użyciem rozpuść agarozę, podgrzewając ją za pomocą płyty grzejnej lub kuchenki mikrofalowej.

6. Budowa zbiornika oleju

UWAGA: Procedura opisana poniżej to tylko jeden z wielu sposobów na wyprodukowanie zbiornika oleju. Czytelnik jest zachęcany do zaprojektowania i wytworzenia zbiornika w oparciu o dostępne materiały, możliwości obróbki i konkretne potrzeby.

1. Za pomocą piły taśmowej wytnij akrylową kostkę o wymiarach 12 x 12 x 12 mm z większego arkusza akrylowego o grubości 12 mm.
2. Wyfrezuj otwór o średnicy 12 mm na głębokość 8-12 mm w rurce akrylowej (Rysunek 1a).

7. Przygotowanie elektrod

1. Za pomocą nożyczek wytnij dwa kawałki (75 mm) srebrnych drutów (o średnicy 125 μm).
2. Używając zapalniczki z otwartym płomieniem, stopij jeden koniec każdego srebrnego drutu, aby utworzyć małe kuliste kulki (o średnicy około 250 μm).
3. Zanurz końcówki kulek w wybielaczu na 1-2 godziny, aby uzyskać powłokę srebrno-chlorkowo-srebrową (Ag/AgCl). Ciemnoszary kolor oznacza, że powłoka Ag/AgCl została uformowana (Rysunek 2a).
4. Wyjmij oba druty z wybielacza, dokładnie spłucz wodą DI i odłóż na czystą, niestrzępiącą się chusteczkę.
5. Zanurz końce kulek w stopionym żelu agarozowym, aby utworzyć cienką warstwę. Ta żelowa powłoka pomaga zakotwiczyć kropelki wody na drutach pod olejem.  
6. Za pomocą noża do szkła podziel kapilarnę ze szkła borokrzemianowego o długości 10 cm i średnicy 1/0,58 OD/ID na dwie kapilary o średnicy 5 cm.
7. Włóż jedną ze szklanych kapilar do uchwytu elektrody ( Rysunek 2b, c), a następnie wprowadź jeden z drutów Ag / AgCl do szklanej kapilary ( Rysunek 2d). Wprowadzić drugi drut Ag/AgCl do drugiej szklanej kapilary.
8. Zamontuj drugą szklaną kapilarnę na szklanym uchwycie do mikropipet (Rysunek 2e, f).

8. Przygotowanie eksperymentu

1. Umieść szkiełko o grubości 1 mm i wymiarach 25 x 75 mm na stoliku mikroskopu odwróconego (Rysunek 1a).
2. Dozuj kilka kropel oleju heksadekanowego na środek szkiełka podstawowego, a następnie umieść zbiornik oleju bezpośrednio na oleju na szkiełku podstawowym.
   UWAGA: Dodanie oleju między szkiełkiem podstawowym a zbiornikiem oleju służy do dopasowania współczynnika załamania światła podłoża w celu uzyskania wyraźniejszych i ostrzejszych obrazów.
3. Całkowicie napełnij zbiornik oleju olejem sześciokątnym. Upewnij się, że zbiornik znajduje się nad soczewką obiektywu.
   UWAGA: Można również stosować inne oleje hydrofobowe.
4. Podłącz uchwyt elektrody do stopnia czołowego wzmacniacza prądowego. Scenografia musi być zamontowana na mikromanipulatorze (Rysunek 1a), aby zminimalizować długość elektrody i szumy elektryczne.
5. Zamontuj szklany uchwyt na mikropipety wraz z drugim przewodem Ag/AgCl na innym mikromanipulatorze (Rysunek 1a).
6. Za pomocą manipulatorów ustaw elektrody w taki sposób, aby pokryte agarozą końcówki drutów Ag/AgCl były całkowicie zanurzone w zbiorniku oleju w podobnej płaszczyźnie pionowej.
7. Wyrównaj dwie elektrody i odsuń je od siebie o kilka milimetrów (Rysunek 1a, b).
   UWAGA: Po dodaniu kropelek (opisanych w kroku 13) przewody należy sprowadzić do samego dołu, aż końcówki elektrod dotkną dna zbiornika oleju. Ten krok zapewni, że przewody nie będą oscylować, a co za tym idzie, zminimalizuje niepotrzebne wahania mierzonego prądu.

9. Prawidłowe uziemienie w celu zmniejszenia szumów elektrycznych

1. Utwórz magistralę uziemiającą, wkręcając w stół antywibracyjny, na którym umieszczony jest mikroskop (Rysunek 3a).
   UWAGA: Korzystanie ze stołu antywibracyjnego jest wymagane w celu zminimalizowania wibracji z otoczenia, które mogą powodować niepożądane wahania mierzonego prądu.
2. Za pomocą przewodu przewodzącego podłącz do uziemienia (Rysunek 3a), a następnie podłącz stolik mikroskopu do szyny uziemiającej.
3. Umieść klatkę Faradaya nad zestawem eksperymentalnym, aby zredukować hałas, a następnie podłącz ją elektrycznie do magistrali uziemiającej (Rysunek 3b).
   UWAGA: Zawsze zaleca się unikanie niepotrzebnych pętli uziemienia, ponieważ mogą one prowadzić do wzrostu poziomu szumów pomiaru.

10. Ogrzewanie sterowane zwrotnie

1. Obrób aluminiową powłokę grzewczą, w której zbiornik oleju może się dobrze zmieścić²⁹.
2. Upewnij się, że zostawiłeś otwór na dole skorupy, aby móc view przez skorupę przez odwrócony mikroskop.
3. Umieść rezystancyjny elastyczny element grzejny z poliimidu o wymiarach 30 x 30 mm pod aluminiową powłoką.
4. Umieść izolacyjną płytkę z polidimetylosiloksanu (PDMS) pod grzejnikiem, aby zmniejszyć straty ciepła w dół i chronić stolik mikroskopu.
5. Włóż termoparę do fazy olejowej. Po upewnieniu się, że termopara nie dotyka żadnego przewodu Ag/AgCl, podłącz przewody termopary do płytki akwizycji danych termopary i zarejestruj temperaturę za pomocą niestandardowego oprogramowania do programowania.
   UWAGA: Napisz regulator temperatury ze sprzężeniem zwrotnym On-Off, proporcjonalnie całkowany (PI), aby umożliwić ogrzewanie i pasywne chłodzenie temperatury oleju do żądanej wartości. Kody mogą być dostarczone do czytelników na żądanie.

11. Konfiguracja oprogramowania i sprzętu

1. Przygotuj oprogramowanie do akwizycji danych, włączając komputer(y), mikroskop, generator funkcyjny, wzmacniacz prądu i systemy akwizycji danych o niskim poziomie szumów.
   UWAGA: Chociaż można używać dowolnego aktualnego sprzętu czujnikowego, poniższe instrukcje dotyczą w szczególności tego, który wymieniono w Tabeli materiałów. Naukowcy, którzy chcą zbudować własny wzmacniacz prądowy, mogą zwrócić się do Shlyonsky et al.³⁰.
2. Na panelu przednim patch clamp current amplifier ustaw wyświetlacz na panelu przednim i pokrętła trybu pomiaru źródła odpowiednio na VHOLD/IHOLD i V-CLAMP.
3. Na panelu przednim ustaw dolnoprzepustowy filtr Bessela na 1 kHz, a wzmocnienie wyjściowe na 0.5.
   UWAGA: Wybór niskiego wzmocnienia wyjściowego umożliwia rejestrację większych amplitud wyższego prądu, podczas gdy zwiększenie wzmocnienia poświęca zakres pomiarowy w celu zmniejszenia szumu pomiaru.
4. Ustaw konfigurację na CAŁA KOMÓRKA β = 1. Wartość ta może być później zmieniona na 0,1, aby umożliwić rejestrację prądów o większej amplitudzie.
5. Ustaw wszystkie inne pokrętła sterujące w pozycji zerowej lub neutralnej.
6. Zainicjuj oprogramowanie, klikając dwukrotnie ikonę na pulpicie.
7. Kliknij opcję Konfiguracja | Digitizer, aby otworzyć okno dialogowe Digitizer, a następnie kliknij przycisk Zmień.
8. W oknie dialogowym Change Digitizer (Zmień digitizer) wybierz odpowiedni digitizer z listy Digitizer Type (Typ digitizera).
9. Kliknij przycisk Skanuj, aby wykryć digitizer.
10. Kliknij przycisk OK, aby zamknąć okno dialogowe Zmień digitizer, a następnie kliknij przycisk OK, aby zamknąć okno dialogowe Digitizer.
11. Kliknij Configure | Ławka laboratoryjna.
12. Na karcie Input Signals (Sygnały wejściowe) na stole laboratoryjnym ustaw współczynnik skali na 0,0005 V/pA.
    UWAGA: Ta wartość musi zostać zaktualizowana, jeśli zmienią się wartości wzmocnienia lub β.

12. Przesunięcie pipety

UWAGA: Procedura opisana poniżej dotyczy tylko wzmacniacza prądu wymienionego w Tabeli Materiałów.

1. Za pomocą mikropipety nanieść 200 nl wodnego roztworu lipidowego "A" na końce każdego drutu Ag/AgCl pod olejem.
2. Doprowadź kropelki do kontaktu i naciśnij przycisk ZAP na przednim panelu amplifier, aby połączyć kropelki w jedną objętość obejmującą obie elektrody. Powinno to wywołać reakcję zwarciową.
3. Ustaw pokrętło trybu pomiaru źródła na TRACK.
4. Zmień pokrętło wyświetlacza na panelu przednim na V_TRACK.
5. Obracaj pokrętłem PIPETTER OFFSET (zgodnie z ruchem wskazówek zegara lub przeciwnie do ruchu wskazówek zegara), aż miernik wskaże 0 mV i będzie stabilny.
6. Ustaw pokrętło trybu pomiaru źródła w pozycji V-CLAMP, a pokrętło wyświetlacza na panelu przednim w pozycji V_{HOLD/I HOLD.}

13. Tworzenie dwuwarstwy lipidowej

1. Uwolnij kropelki, które wcześniej się osadzały, przesuwając elektrody pionowo poza fazę olejową. Powoduje to, że kropelki spadają z elektrod do oleju. Ponownie zanurz i umieść elektrody w oleju.
2. Za pomocą mikropipety nanieś 200 nl roztworu lipidowego "A" na każdy z przewodów.
3. Odczekaj 3-5 minut, aby umożliwić spontaniczne złożenie się monowarstwy lipidowej na każdym granicy faz woda/olej.
   UWAGA: W miarę tworzenia się monowarstwy lipidowej napięcie powierzchniowe granicy faz woda/lipid/olej maleje, co może powodować opadanie kropel, jeśli otaczający olej jest wystarczająco gęsty²¹.
4. Opuść elektrody (i kropelki) tak, aby końce obu elektrod ledwo dotykały dna zbiornika oleju (Rysunek 1b), a następnie przesuń je poziomo, aby kropelki się zetknęły.
   UWAGA: Dwuwarstwa lipidowa samoistnie rozrzedzi się, wykluczając nadmiar oleju spomiędzy stykających się kropel. Zazwyczaj proces ten zachodzi w ciągu 1 minuty.

14. Charakterystyka elektryczna memrystora biomolekularnego

1. Tworzenie dwuwarstw lipidowych
   1. Aby zarejestrować tworzenie się dwuwarstwy lipidowej, które odpowiada wzrostowi pojemności elektrycznej między kropelkami, należy zastosować trójkątne napięcie falowe 10 Hz, 10 mV za pomocą generatora funkcyjnego (Rysunek 4) podłączonego do zewnętrznego wejścia wzmacniacza patch clamp.
      UWAGA: Ze względu na pojemnościowy charakter błony lipidowej, wynikowa odpowiedź prądowa powinna być przebiegiem prostokątnym ( Rysunek 4). Podczas tworzenia dwuwarstwy lipidowej, Krok 11.6, badacz powinien zauważyć wzrost amplitudy prądu między szczytami, a także zaobserwować wizualną zmianę między połączonymi kroplami (Rysunek 4).
2. Pomiary prądowo-napięciowe
   UWAGA: Memrystor biomolekularny jest modelowany jako rezystor i kondensator równolegle^12,21. W związku z tym odpowiedź prądowa urządzenia może zawierać zarówno składowe rezystancyjne, jak i pojemnościowe w zależności od częstotliwości przyłożonego napięcia. Aby zbadać memrystywną naturę urządzenia i uzyskać ściśniętą histeretyczną zależność prąd-napięcie¹², może być konieczne odjęcie prądu pojemnościowego od całkowitego prądu. Poniższy protokół opisuje tę procedurę.
   1. Za pomocą generatora funkcyjnego nanieść przebieg napięcia (trójkątny lub sinusoidalny) na błonę lipidową wolną od alametycyny zmontowaną z kropelkami roztworu "A".
   2. Zapisz odpowiedź prądu indukowanego na wielu częstotliwościach.
      UWAGA: Prądy pojemnościowe są zminimalizowane przy częstotliwościach poniżej 10 mHz.
   3. Zapisz rozmiar międzyfazowej dwuwarstwy lipidowej, mierząc średnicę błony lipidowej na komputerze lub rejestrując amplitudę prądu międzyszczytowego wynikającą z fali trójkątnej 10 Hz, 10 mV. Amplituda prądu jest proporcjonalna do pojemności membrany, która z kolei jest proporcjonalna do powierzchni membrany.
   4. Usuń kropelki, które nie zawierają alametycyny.
   5. Dodaj nowe kropelki wodne za pomocą roztworu "C" i utwórz dwuwarstwę lipidową.
   6. Użyj mikromanipulatorów, aby wyregulować kontakt między kropelkami tak, aby dwuwarstwa miała podobny obszar (średnicę lub amplitudę prądu fali prostokątnej) jak ta utworzona wcześniej.
   7. Powtórz kroki 14.2.1 i 14.2.2.
   8. Odejmij prąd zarejestrowany w kroku 14.2.2 od prądu zarejestrowanego w kroku 14.2.7.
   9. Wykreśl prąd indukowany w funkcji przyłożonego napięcia dla każdej częstotliwości i przebiegu, aby uzyskać odpowiedź memrystywną "ściśnięta histereza".
3. Eksperymenty pulsacyjne
   1. Korzystając z niestandardowego oprogramowania do programowania i analogowego źródła napięcia, generuj impulsy napięciowe o określonych amplitudach wysokich i niskich, czasie włączenia i czasie wyłączenia.
      UWAGA: Nie jest to konieczne, jeśli impulsy napięciowe mogą być generowane za pomocą komercyjnego generatora funkcyjnego.
   2. Rejestruj prąd w odpowiedzi na przyłożone impulsy.
   3. Ze względu na pojemnościowy charakter memrystora rejestrowane będą skoki pojemnościowe. Usuń skoki, stosując filtr dolnoprzepustowy o odpowiednim paśmie przepustowym.

Wyniki

Rysunek 1 przedstawia eksperymentalny zestaw użyty do złożenia i scharakteryzowania biomolekularnego memrystora. Obniżenie wolnych końców elektrod na dno zbiornika oleju, jak pokazano na rysunku Rysunek 1b, okazało się pomocne w zminimalizowaniu drgań elektrod i kropel, które mogą powodować zmiany mierzonego prądu i powierzchni dwuwarstwowej, szczególnie w przypadkach, gdy podgrzewanie oleju może generować przepływ konwekcyjny w oleju. Rysun...

Dyskusja

W pracy przedstawiono protokół montażu i charakterystyki memrystorów biomolekularnych opartych na syntetycznych biomembranach domieszkowanych kanałami jonowymi utworzonych między dwiema kropelkami wody w oleju. Dwuterminalowe urządzenie z miękką materią zostało zaprojektowane i badane w celu: 1) przezwyciężenia ograniczeń związanych z technologią półprzewodnikową, takich jak wysoki poziom hałasu, wysokie zużycie energii i wysokie napięcia przełączania, 2) dokładniejszego naśladowania składu, struktury, mechanizmów przełą...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1,2-diphytanoy-sn-glycero-3-fosfocholina (DPhPC)	Avanti Polar Lipids	850356P/850356C	Zakupiony jako liofilizowany proszek (P) lub w chloroformie (C)
Agaroza	Sigma-Aldrich	A9539
Agaroza (0,5 g Agaroza w tabletkach)	Benchmark	A2501	Możesz użyć postaci proszku lub tabletek
Alametycyna	AG Scientific	A-1286
Waga analityczna	Wzmacniacz METTLER TOLEDO	ME204TE/00
Axopatch 200B	Urządzenia molekularne-BK
Precision 4017B 10 MHz DDs Generator przemiatania/funkcyjny	Digi-Key	BK4017B-ND
Kapilary ze szkła borokrzemianowego	Światowe instrumenty precyzyjne	1B100F-4
Całkowite ekstrakty lipidowe mózgu (świnie)	Avanti Polar Lipids	131101
System DigiData 1440A	Urządzenia molekularne	-
Zestaw ekstrudera z uchwytem/blokiem grzewczym	Avanti Polar Lipids	610000	Obejmuje to mini-ekstruder, 2 strzykawki, 100 membran PC, 100 wsporników filtrów i 1 uchwyt/blok grzewczy
Zamrażarka (-20 & deg; C)	Wyroby szklane VWR International	SCUCBI0420AD
	VWR
, 99%	Sigma-Aldrich	544-76-3
Alkohol izopropylowy	VWR International	BDH1133-4LP
Uchwyt mikroelektrody	World Precision Instruments	MEH1S
MOPS	Sigma-Aldrich	M1254
Azot (N2) Gaz	Airgas	UN1066
Parafilm M Uniwersalna folia laboratoryjna	Parafilm	PM999
Bezpudrowe miękkie rękawice nitrylowe	VWR International	CA89-38-272
Wstępnie oczyszczony mikroskop Sildes	Fisher Naukowy	22-267-013
Chłodnica (4 ° C)	VWR International	SCUCFS-0504G
Drut srebrny	GoodFellow	147-346-94	W zależności od zastosowania można stosować różne średnice
Chlorek sodu (KCl)	Sigma-Aldrich	P3911
Mieszająca płyta grzejna	Thermo Scientific
Lekkie wycieraczki do tkanek VWR	VWR International	82003-820
Myjka ultradźwiękowa VWR Scientific 50D	VWR International	13089