Izolacja chemiczna, kwantyfikacja i separacja lipidów skóry

Podsumowanie

U, lipidy skórne od przedstawicieli tego samego gatunku są kluczowe dla sygnalizacji seksualnej, z potencjalnym zastosowaniem w zarządzaniu gatunkami inwazyjnymi. W tym miejscu opisujemy protokoły ekstrakcji lipidów skóry ze zrzuconej skóry lub całych zwierząt, określania i analizowania całkowitej masy lipidów oraz oddzielania lipidów za pomocą frakcjonowania za pomocą chromatografii kolumnowej.

Streszczenie

sygnalizują swoim przedstawicielom za pomocą lipidów w ich skórze, przede wszystkim w celu umożliwienia śledzenia i oceny partnerów. Izolacja tych lipidów ma zastosowanie w badaniach skoncentrowanych na wzorcach ewolucyjnych i mechanizmach komunikacji chemicznej, a także w zrozumieniu wodoodpornej roli lipidów w ewolucji życia ziemskiego. W podejściu stosowanym, takie wskazówki oparte na skórze mogą być przydatne dla osób zarządzających dziką przyrodą zajmujących się gatunkami inwazyjnymi. Główne etapy ilościowego oznaczania lipidów skóry w przedstawionym tutaj protokole obejmują ekstrakcję, całkowite oznaczenie lipidów i frakcjonowanie za pomocą chromatografii kolumnowej, przy czym ten ostatni proces prowadzi do oczyszczenia eluatów związków, które mogą być następnie analizowane w celu przypisania identyfikacji związków (np. chromatografia gazowa ze spektrometrią mas [GC-MS]) i / lub stosowane bezpośrednio w bardziej wyrafinowanych testach biologicznych. Lipidy skóry można ekstrahować z żywej skóry, zrzuconej skóry lub martwych całych zwierząt przy użyciu niepolarnych rozpuszczalników organicznych (np. heksanu, benzenu, toluenu). Ekstrakcja rozpuszcza lipidy, a następnie rozpuszczalnik można odparować, aby uzyskać mierzalny ekstrakt zawierający tylko lipidy. Frakcjonowanie polega na rozdzieleniu całkowitego ekstraktu lipidowego na określone eluaty za pomocą tradycyjnej chromatografii kolumnowej. Całkowity ekstrakt lipidowy jest najpierw wiązany z kolumną opartą na substracie (np. tlenku glinu), a następnie poszczególne eluaty ("frakcje") rozpuszczalnika o określonych objętościach są kolejno przepuszczane przez kolumnę w celu wymycia zestawów związków z mieszaniny lipidowej w oparciu o wspólną polarność. Frakcje postępują w polarności w znormalizowanej kolejności poprzez zwiększenie względnej ilości rozpuszczalnika polarnego (np. eteru dietylowego) w rozpuszczalniku niepolarnym. W tym manuskrypcie opisujemy kilka metod ekstrakcji lipidów skóry, a następnie przedstawiamy standardowy protokół izolowania różnych zestawów związków w oparciu o polarność, przy użyciu tradycyjnej chromatografii kolumnowej. Całe ekstrakty lipidowe lub określone frakcje mogą być następnie wykorzystane w testach biologicznych w celu określenia jakiejkolwiek aktywności biologicznej wywołanej przez zawarte w nich związki.

Wprowadzenie

wytwarzają lipidy w naskórku, albo bezpośrednio z komórek skóry, albo z odrębnych gruczołów, które są wykorzystywane w komunikacji społecznej, takiej jak ocena i śledzenie partnerów, terytorialność oraz rozpoznawanie wewnątrz- i międzygatunkowe1^,2,3,4. Izolacja tych lipidów skórnych ma zastosowanie w badaniach skoncentrowanych na wzorcach ewolucyjnych i mechanizmach komunikacji chemicznej, a także w zrozumieniu wodoodpornej roli lipidów w ewolucji życia lądowego^2,3,4. Co więcej, wiele, zwłaszcza łuskokształtne (jaszczurki, węże), jest gatunkami inwazyjnymi budzącymi obawy we wrażliwych ekosystemach, a rozwój przynęt na bazie feromonów w celu poprawy pułapek i usuwania jest w toku^5,6. Nieprzepuszczalność skóry ułatwia ekstrakcję obecnych lipidów w celu uzyskania stosunkowo czystej ekstrakcji potencjalnie solidnego źródła sygnałów chemicznych. Podstawowe kroki ilościowego oznaczania lipidów skóry w opisanym protokole obejmują ekstrakcję, całkowite oznaczenie lipidów i frakcjonowanie za pomocą chromatografii kolumnowej^1,6,7. Metody te są stosowane rutynowo, ponieważ dają bioaktywne izolaty, które wyjaśniają wiele na temat wyboru partnera i selekcji, szczególnie u węży².

Lipidy skóry mogą być ekstrahowane zarówno z żywej skóry, zrzuconej skóry, jak i martwych całych, przy użyciu niepolarnych lub polarnych rozpuszczalników organicznych^1,7,8,9. Należy zauważyć, że okazy muzealne przechowywane w rozpuszczalnikach, takich jak etanol, nie są optymalne do ekstrakcji lipidów skóry, a jedynie świeże lub świeżo mrożone tusze powinny być brane pod uwagę jako możliwe źródła ekstrakcji. Lipidy skóry są obojętne, co sprawia, że są stabilne na powierzchni skóry i łatwe do ekstrakcji⁷. W swoich rolach sygnalizacyjnych w ekologii, sygnały lipidowe skóry są często odkładane w trudnych warunkach, ale ze względu na ich silne właściwości chemiczne, takie sygnały mogą zachować swoją wartość informacyjną przez długi czas^10,11,12. W procesie ekstrakcji dochodzi do rozpuszczenia lipidów przy użyciu rozpuszczalnika niepolarnego (np. heksanu, benzenu, toluenu) przez wiele godzin, po którym następuje odparowanie rozpuszczalnika, aby pozostawić mierzalną masę ekstraktu lipidowego^7,8. Lipidy skóry są wysoce mieszalne z rozpuszczalnikami niepolarnymi, a szeroka gama węglowodorów może być ekstrahowana z podobnie zróżnicowanej gamy źródeł.

Frakcjonowanie jest bardziej pracochłonne niż ekstrakcja, ale służy do rozdzielenia całkowitego ekstraktu lipidowego na określone frakcje za pomocą chromatografii kolumnowej, aby pomóc w oczyszczaniu i możliwej identyfikacji zawartych w nim związków^1,6,7,8. Całkowity ekstrakt lipidowy jest wiązany z kolumną opartą na substracie, a następnie poszczególne eluaty ("frakcje") rozpuszczalnika o określonych objętościach są kolejno przepuszczane przez kolumnę w celu wymycia zestawów związków z mieszaniny lipidowej, które mają wspólną polarność^6,7,8. W chromatografii lipidowej frakcje postępują w polarności w pewnej znormalizowanej kolejności poprzez zwiększenie względnej ilości rozpuszczalnika polarnego (np. eteru dietylowego) w rozpuszczalniku niepolarnym (zwykle wyrażonego w procentach: 0%, 2%, 4% eteru itp.)^6,7,8. Chociaż metody takie jak chromatografia cienkowarstwowa (TLC) mogą być stosowane do rozdzielania lipidów w mieszaninie i są prostsze, preferowana jest chromatografia kolumnowa, ponieważ wykorzystuje system zamknięty, jest łatwa do kontrolowania, może oddzielać bardziej skoncentrowane mieszaniny i jest kompatybilna z multipleksowaniem w celu zwiększenia wydajności. W tym manuskrypcie opisujemy kilka metod ekstrakcji lipidów skóry, a następnie przedstawiamy standardowy protokół izolowania różnych zestawów związków w oparciu o polarność, przy użyciu tradycyjnej chromatografii kolumnowej. W wielu projektach badawczych obejmujących izolację sygnałów chemicznych ostatecznym celem jest wywołanie zmian w odbiornikach wystawionych na te sygnały. Całe ekstrakty lipidowe lub określone frakcje mogą być zatem używane w testach biologicznych w celu określenia dowolnej aktywności biologicznej wywołanej przez zawarte w nich związki^1,2,6,7. Na przykład w podstawowych badaniach biologicznych testy biologiczne z wykorzystaniem określonych frakcji mogą ujawnić badaczom, że oczyszczone źródło feromonów zostało wyizolowane, a następnie można zastosować metody identyfikacji docelowych związków. Z punktu widzenia zarządzania dziką przyrodą identyfikacja może nie być celem, a zamiast tego aktywna frakcja może być wykorzystana w terenie do zwabienia przedstawicieli tego samego gatunku do pułapek lub zahamowania śledzenia partnerów w nierodzimym siedlisku^13,14.

Protokół

Wszystkie procedury związane z wykorzystaniem kręgowców zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Uniwersytetu Jamesa Madisona.

1. Ekstrakcja

1. Ekstrakcja zrzuconej skóry
   1. Zbierz około 30^cm2 szopy z jednego, usuwając głowę i kloakę, które mogą zanieczyścić próbki. Załóż rękawice chloroprenowe i oczyść szopę z gruzu.
   2. Wytaruj wagę za pomocą torby lub łódki do ważenia i zważ szopę (± 0,01 g).
      UWAGA: Dokładność masy jest określana na podstawie precyzji wagi. Zrzucona masa skóry jest czynnikiem standaryzacyjnym dla ekstrahowanej masy lipidowej skóry (patrz poniżej) i znacznie współzmienia się z wyekstrahowaną masą lipidową.
   3. Podziel szopę na mniejsze (5 cm²) kawałki i dodaj je do zamykanego szklanego pojemnika z pokrywką kompatybilną z heksanem (np. szklany słoik z metalową pokrywką lub kolba laboratoryjna z pokrywką z PTFE). Zdekantować wystarczającą ilość heksanu do pojemnika, aby całkowicie zanurzyć zrzucone kawałki skóry. Zamknij pojemnik.
      UWAGA: Heksan jest łatwopalny, działa drażniąco na drogi oddechowe i wiąże się z kilkoma krótko- i długoterminowymi zagrożeniami dla zdrowia. Zabiegi z użyciem heksanu wykonuje się w dygestoriach (laboratorium) lub na zewnątrz (w terenie) przy zachowaniu odpowiednich środków ochrony osobistej (PPE) (np. okulary przeciwbryzgowe, rękawice chloroprenowe, długie rękawy, obuwie z zakrytymi palcami).
   4. Oznacz pojemnik(i) ołówkiem lub pisakiem odpornym na rozpuszczalniki. Pozostawić pojemnik(i) w dygestorii w temperaturze pokojowej na noc lub do 24 godzin.
   5. Usuń kawałki szopy za pomocą czystych metalowych kleszczy lub szczypiec. Wstrząśnij kawałkami, aby zachować pozostały heksan w pojemniku. Pozostaw kawałki skóry do wyschnięcia na ręcznikach papierowych; Następnie wyrzuć je. Jeśli przeprowadzanych jest wiele ekstrakcji, wyczyść szczypce/kleszcze między każdą próbką. Aby wyczyścić szczypce/kleszcze, opłucz je w ~50 ml heksanu w zlewce.
   6. Jeśli ekstrakt nie ma być natychmiast zużyty, należy zdekantować lub odpipetować ekstrakt do szklanej fiolki o odpowiedniej objętości, zamknąć ją nakrętką wyłożoną PTFE, oznaczyć i przechowywać w temperaturze -20 °C.
      UWAGA: Ponieważ ekstrakt zawiera heksan, fiolki należy przechowywać w zamrażarce przeciwwybuchowej.
2. Ekstrakcja całych martwych zwierząt
   1. Należy zanotować długość pyska i otworu wentylacyjnego (SVL; w centymetrach) oraz masę (w gramach) zwierzęcia. Jeśli ma być określona całkowita produkcja lipidów lub feromonów na jednostkę powierzchni skóry, użyj miarki krawieckiej, aby uzyskać maksymalny obwód ciała (w centymetrach).
   2. Do ekstrakcji wybierz pojemnik o średnicy 1/3 długości zwierzęcia. Ułóż tuszę bezpiecznie na dnie pojemnika z głową i kloaką na górze. Zdekantować wystarczającą ilość heksanu do pojemnika, aby zmaksymalizować zanurzoną powierzchnię korpusu.
      UWAGA: Jeśli głowa lub kloaka zostaną zanurzone na dowolny czas podczas ekstrakcji, zwróć uwagę.
   3. Zabezpiecz pokrywkę, oznacz pojemnik i namocz go w dygestorium w temperaturze pokojowej na noc lub do 24 godzin.
   4. Podczas wyjmowania tuszy należy używać czystych metalowych kleszczy lub szczypiec. Pozostałości heksanu na tuszy należy zatrzymać w pojemniku, pozwalając mu kapać z ciała, a nie z głowy lub ogona. Zamknij pojemnik.
   5. Jeżeli ekstrakt nie ma być natychmiast zużyty, zdekantować ekstrakt lub odpipetować go do szklanej fiolki o odpowiedniej objętości, zamknąć ją nakrętką wyłożoną PTFE, oznaczyć i przechowywać w temperaturze -20 °C.

2. Oznaczanie masy lipidów

UWAGA: Pobraną masę lipidową można określić na dwa sposoby: za pomocą szklanej fiolki lub za pomocą kolby okrągłodennej, za pomocą obrotowego parownika.

1. Oznaczyć wyekstrahowaną masę lipidową metodą szklanej fiolki.
   1. Użyć wstępnie zważonej fiolki o odpowiedniej wielkości (7 ml, 22 ml, 50 ml itp.). Włączyć wieczko i etykietę do masy całkowitej lub zawsze ważyć fiolkę bez wieczka i etykiety (oznaczenia na etykiecie również zwiększają masę). Umieść etykietę na szyjce kolby, aby uniknąć kontaktu z wodą.
      UWAGA: Parowanie w szklanych fiolkach jest wydajne, jeśli badacz ma dostęp do systemu kolektora gazowego, w którym wiele fiolek może być jednocześnie odparowywanych pod strumieniem_N2.
   2. Przenieść ekstrakt do fiolki za pomocą szklanej pipety z gumową gruszką lub, w przypadku ekstraktów o dużej objętości, elektronicznego kontrolera pipet z jednorazową szklaną pipetą o pojemności 10 ml. Przepłukać pojemnik ~3 ml heksanu i również przenieść do fiolki.
   3. Odparować próbkę pod delikatnym strumieniem_N2. Przechylić fiolkę pod kątem, aby uzyskać maksymalną powierzchnię rozpuszczalnika. Kondensat tworzy się na zewnątrz fiolki, gdy heksan odparowuje.
      UWAGA: Pierścienie lipidowe utworzą się w fiolce, gdy heksan odparuje, więc okresowo wiruj ekstrakt.
   4. Odparować próbkę do sucha, a następnie ponownie zważyć. Zapisz całkowitą wydajność lipidów.
      UWAGA: W przypadku analizy w różnych grupach ustandaryzuj masę lipidową, aby uzyskać masę zrzutu (masa lipidowa [w gramach] podzielona przez masę zrzuconą [w gramach] x 100 daje procent masy lipidowej szopy) lub do SVL zwierzęcia (masa lipidowa [w miligramach podzielona przez SVL [w centymetrach]; daje masę lipidową na jednostkę długości). Większe zwierzęta produkują więcej lipidów, a wiele gatunków jest silnie dymorficznych płciowo, co narzuca znaczne odchylenia w danych.
2. Określić wyekstrahowaną masę lipidową za pomocą wyparki obrotowej.
   1. W celu szybszego odparowania pojedynczej próbki należy przenieść ekstrakt do wstępnie zważonej kolby okrągłodennej i odparować go za pomocą wyparki obrotowej.
      1. Jeżeli w ekstrakcie widoczne są cząstki stałe, należy przefiltrować próbkę, umieszczając stożek z bibuły filtracyjnej w szyjce kolby; następnie przenieść ekstrakt do kolby i pozostawić go do przefiltrowania grawitacyjnego. Bibułę filtracyjną należy usunąć po przeniesieniu pełnego ekstraktu.
         UWAGA: Przenieść objętość próbki (do ~80% objętości kolby) przed odparowaniem obrotowym. Jakiekolwiek bulgotanie ekstraktu do skraplacza wyparki obrotowej powoduje zanieczyszczenie i wymaga oczyszczenia skraplacza. Pułapkę uderzeniową można umieścić między kolbą a szyjką skraplacza, jeśli w większości próbek występują pęcherzyki lub "uderzenia".
   2. Włączyć zasilanie parownika obrotowego i łaźni wodnej (50 °C; niższa niż temperatura wrzenia rozpuszczalnika). Włącz dopływ zimnej wody do skraplacza.
      UWAGA: Skraplacz parownika obrotowego jest podłączony do agregatu cyrkulacyjnego lub króćca zimnej wody odprowadzającego do odpływu. Natężenie przepływu może być powolne, jeśli woda jest chłodniejsza niż w otoczeniu, aby skroplić parę rozpuszczalnika opuszczającą kolbę i wchodzącą do skraplacza.
   3. Włącz źródło podciśnienia (próżnię wodną lub pompę). Upewnij się, że podciśnienie jest wystarczające, aby przytrzymać kolbę do szyjki skraplacza. Otwórz odpowietrznik na końcu skraplacza przed podłączeniem kolby. Wsunąć kolbę na szyjkę skraplacza, zamknąć odpowietrznik w celu uszczelnienia i upewnić się, że kolba nie może odłączyć się od skraplacza po zwolnieniu kolby.
   4. Obniżyć kolbę do momentu, aż ~50% zostanie zanurzone w kąpieli. Rozpocząć obracanie kolby ze średnią prędkością. Jeśli podciśnienie, prędkość, przepływ skraplacza i temperatura kąpieli są optymalne, para rozpuszczalnika opuszczająca kolbę skrapla się na wężownicy i kapie do kolby odzysku.
      1. Jeśli próbka się wrze (np. duże pęcherzyki, szybkie gazowanie), należy natychmiast zmniejszyć podciśnienie i/lub prędkość obrotowej wyparki. Jeśli gotowanie będzie kontynuowane, wyłącz obrót kolby, wyłącz podciśnienie, podnieś kolbę z kąpieli i zwolnij uszczelkę próżniową. Powtórz kroki 2.2.3 i 2.2.4.
         UWAGA: Jeśli w kolbie odzysku nie gromadzi się rozpuszczalnik, ale ekstrakt ewidentnie paruje, próżnia jest najprawdopodobniej nieoptymalna i należy ją ponownie wyregulować.
   5. Odparować próbkę w próżni do momentu, gdy w kolbie pozostanie ~2 ml rozpuszczalnika (ekstrakty o dużej objętości) lub, jeśli używana jest kolba z wagą, odparować do momentu, gdy na dnie kolby pojawi się kropla cieczy o średnicy <1 cm. Wyłącz obrót i odkurzanie; Następnie wyjąć kolbę z wanny.
   6. Trzymać szyjkę kolby, gdy uszczelka próżniowa jest zwalniana, a następnie przekręcić szyjkę, aby wysunąć ją ze skraplacza. Jeżeli używana jest kolba o dużej pojemności, zamieszać skondensowany ekstrakt w kolbie w celu rozpuszczenia widocznych lipidów; Następnie przenieść roztwór za pomocą pipety do wstępnie zważonej kolby o mniejszej objętości. Dodać 3 ml heksanu, aby przepłukać dużą kolbę, zakręcić ją, pipetować do mniejszej kolby i ponownie odparować (kroki 2.2.3 - 2.2.5).
   7. Kropla cieczy w ekstrakcie zestala się, gdy heksan odparowuje. Po wyschnięciu pozwól mu osiągnąć temperaturę pokojową. Lipidy utworzą w kolbie półprzezroczysty, biały lub żółty wosk (~5 min). Zważyć kolbę, aby uzyskać ostateczną masę.
      UWAGA: W zależności od charakteru ekstrahowanych lipidów, będą one miały właściwości stałe (np. wosk) lub półstałe (np. ropa naftowa), zwłaszcza gdy frakcjonowane lipidy są odparowywane (patrz poniżej).
3. Rozpuścić lipidy w zarejestrowanej objętości heksanu, aby uzyskać ≥1 mg lipidów na 1 ml heksanu. Objętość robocza potrzebna do przejścia do chromatografii wynosi ~5 ml. W przypadku przenoszenia z kolby do fiolki należy zachować 2 ml całkowitej objętości w celu przepłukania kolby po przeniesieniu większości ekstraktu do fiolki.
4. Oznaczyć fiolki, zamknąć je kapslami wyłożonymi PTFE i przechowywać w temperaturze -20 °C.

3. Chromatografia kolumnowa

UWAGA: Aby rozdzielić nieznane związki na podstawie polarności na określone frakcje, wyekstrahowana masa lipidowa może być dodana do przygotowanych kolumn do chromatografii cieczowej i frakcjonowana przy użyciu standardowej elucji.

1. Przygotowanie kolumny
   1. W zależności od masy lipidowej w ekstrakcie należy użyć szklanej kolumny chromatograficznej o dużej lub małej objętości z kranem teflonowym. Kolumna jest wyposażona w zbiornik o stałej objętości lub z nim połączony (500 ml dla dużej kolumny; 250 ml dla małej kolumny). Odtąd protokół ten odnosi się tylko do kolumny chromatograficznej o dużej objętości połączonej ze zbiornikiem. Dokładnie oczyścić wszelkie nowe naczynia szklane i części, które mają być używane w chromatografii, jak opisano w sekcji 4; Następnie spłucz je heksanem lub innym rozpuszczalnikiem niepolarnym.
   2. Złóż kilkakrotnie kawałek wełny z włókna szklanego (~14 cm długości [L] x 4 cm szerokości [W]), aż powstanie kwadrat o wymiarach ~4 cm x 4 cm. Użyj drewnianego pręta kołkowego dłuższego niż kolumna, aby umieścić włókno szklane na dole kolumny.
   3. Przymocuj kolumnę w okapie do standardowego stojaka pierścieniowego za pomocą dwóch zacisków (np. obrotowych lub modułowych), jeden nad kranem i jeden pod szyjką zbiornika. Wyrównaj kolumnę. Ustawić kolumnę na takiej wysokości, aby zapewnić wystarczającą odległość roboczą, aby zlewka o pojemności 500 ml mogła z łatwością zmieścić się pod kolumną. Otwórz zawór odcinający.
   4. Wlej umyty i wysuszony piasek do kolumny, aż ~3 cm piasku spocznie nad włóknem szklanym. Umieść lub ciemny papier pod kolumną i delikatnie go postukaj. Jeśli piasek spada z kolumny przy każdym kranie, bariera z włókna szklanego jest niewystarczająca. Powtórz kroki 3.1.2 - 3.1.4.
      UWAGA: Użyj rozłożonego spinacza do papieru przyklejonego do końca pręta ustalającego, aby pobrać włókno szklane od dołu.
   5. Umieścić zlewkę o pojemności 500 ml pod kolumną. Powoli zdekantuj ~25 ml heksanu ze zlewki o pojemności 100 ml lub cylindra z podziałką do zbiornika kolumny, aby zwilżyć piasek. Zamknij kurek, gdy nad piaskiem znajduje się ~0,5 cm heksanu.
   6. Odważyć neutralny tlenek glinu. Na każdą małą kolumnę użyj ~50 g; ~175 g na każdą dużą kolumnę. Wlać tlenek glinu do kolby Erlenmeyera o pojemności 1 l. Ograniczyć ilość tlenku glinu do 400 g na kolbę o pojemności 1 l.
   7. Aby aktywować tlenek glinu (czynność III), należy pipetować wodę dejonizowaną o objętości równej 6% masy tlenku glinu (tj. na 100 g tlenku glinu dodać 6 ml wody). Dodaj wodę w postaci kropli do tlenku glinu.
   8. Przykryj kolbę folią aluminiową lub korkiem. Energicznie obracaj (nie potrząsaj), aby równomiernie rozprowadzić ładunek. Kontynuuj, aż nie pozostaną żadne widoczne grudki.
      UWAGA: Kolba nagrzewa się, gdy woda reaguje z tlenkiem glinu, czego można się spodziewać.
   9. Dodawaj heksan, aż tlenek glinu zostanie całkowicie pokryty, z ~0,5 cm heksanu nad tlenkiem glinu. Zamieszaj kolbą, aby utworzyć zawiesinę.
   10. Umieścić odpowietrzony lejek w zbiorniku kolumny i szklaną zlewkę o pojemności 500 ml pod kolumną. Otwórz zawór odcinający. Zakręć tlenkiem glinu i równomiernie wlewaj go do kolumny. Upewnij się, że tlenek glinu osiada równomiernie w kolumnie i nie tworzy się w niej duże pęcherzyki ani pęknięcia. Delikatnie postukaj w bok kolumny, aby równomiernie osadzić tlenek glinu.
       UWAGA: W przypadku dodatkowych nalewań należy dodać dodatkowy heksan, aby utrzymać gnojowicę. Heksan zbierający się w zlewce pod kolumną może być ponownie wykorzystany, jeśli szklana zlewka była na początku czysta.
   11. Kolumna powstaje, gdy górna część tlenku glinu jest stabilna i ~4 cm poniżej szyjki kolumny u podstawy zbiornika. Za pomocą pipety przepłukać wnętrze zbiornika heksanem w celu uzyskania resztek tlenku glinu. Za pomocą lejka delikatnie dodaj drugą warstwę piasku na wierzch tlenku glinu, do ~1 cm poniżej zbiornika.
       UWAGA: Heksan będzie wypływał z kolumny, gdy kran pozostanie otwarty. Nie pozwól, aby kolumna wyschła. Jeśli kolumna wyschnie, proces należy rozpocząć od nowa, zaczynając od kroku 3.1.2. W tym miejscu protokół można zatrzymać, jeśli kolumny są przygotowywane dzień przed frakcjonowaniem. Mocno umieść korek w górnej części zbiornika lub przykryj go szczelnie folią. Napełnij zbiornik ~100 ml heksanu. Dokręcić zawór odcinający.
2. Frakcjonowanie ekstraktu lipidowego
   UWAGA: Niezależnie od wielkości kolumny, frakcje ekstraktu lipidowego mogą być zbierane pojedynczo i łączone na podstawie ich polarności frakcji lub całkowicie odrzucane, jeśli nie zawierają żadnych znanych/zidentyfikowanych związków docelowych. Rundy kontrpróbowanej elucji (n = 3 objętości) przepuszcza się przez kolumnę w celu zapewnienia wystarczającej elucji lipidów. Postępuj zgodnie z tabelą 1 dla elucji w dużych kolumnach (z masą ekstraktu >30 mg) lub elucji w małych kolumnach (z masą ekstraktu <30 mg). Dostosowany protokół elucji do izolowania tylko ketonów metylowych znajduje się w tabeli 2.
   1. Usuń pozostały heksan z górnej części kolumny za pomocą pipety o dużej objętości lub pozwól, aby heksan wypłynął do czystej zlewki. Pozostaw ~3 ml heksanu nad piaskiem w górnej części kolumny.
      UWAGA: Zebrany heksan jest czysty, jeśli zetknął się tylko z czystym szkłem i może być poddany recyklingowi w pierwszej frakcji.
   2. Przenieść ekstrakt lipidowy do kolumny za pomocą długiej szklanej pipety. Powoli odpipetuj ekstrakt, aby nie naruszyć warstwy piasku. Przepłukać fiolkę lub kolbę z ekstraktem ~5 ml heksanu i przenieść do kolumny.
      UWAGA: Jeśli ekstrakt był przechowywany w temperaturze -20 °C, lipidy zostaną wytrącone. Ogrzać fiolkę do momentu, gdy osad przestanie być widoczny.
   3. Otwórz zawór odcinający i pozwól, aby próbka została załadowana do kolumny. Jeśli ekstrakt ma dużą masę (>30 mg), w tlenku glinu, tuż pod piaskiem u góry, może być widoczny żółtawy pas. Zbierz przepływ do zlewki na odpady, ponieważ ten heksan nie jest już czysty. Zamknij kurek, gdy ~3 ml pozostaną na wierzchu piasku.
      UWAGA: Lipid w ekstrakcie, teraz związany z tlenkiem glinu i kolumną, nie może wyschnąć, w przeciwnym razie próbka zostanie utracona.
   4. Umieścić wstępnie zważoną i oznakowaną kolbę okrągłodenną (100 ml, 250 ml lub 500 ml) pod kolumną przed wlaniem pierwszej frakcji. Frakcje przeznaczone do wyrzucenia można zebrać do zwykłego szklanego pojemnika.
   5. Przygotować pierwszą frakcję (100% heksanu:0% eteru dietylowego [zwanego dalej "eterem"]) w cylindrze miarowym. W przypadku wcześniejszego przygotowania frakcji należy przykryć folią lub korkiem z korkiem.
      UWAGA: Ułamki postępują w polaryzacji; Dzięki temu cylinder nie musi być płukany między frakcjami.
   6. Pierwszą frakcję dodać do zbiornika, wsypując przez wentylowany szklany lejek skierowany na bok zbiornika, aby nie naruszyć warstwy piasku. Otwórz zawór odcinający, aby rozpocząć elucję. Zamknij kurek, gdy ~3 ml heksanu pozostanie nad piaskiem w górnej części kolumny.
      UWAGA: Nigdy nie należy przerywać elucji w obrębie pojedynczej frakcji poprzez zamknięcie kranu przed zebraniem większości eluatu. Pomiędzy frakcjami nie pozostawiaj zamkniętego kranu na dłużej niż ~1 godzinę, ponieważ opóźnienia mogą zmienić jakość i powtarzalność elucji.
   7. Powtórz kroki 3.2.4 - 3.2.6 dla frakcji 2 i 3. Zebrać frakcje w kolbach o odpowiedniej wielkości, które pozostawiają przestrzeń do odparowania obrotowego, zwłaszcza jeśli frakcje są łączone.
   8. Przygotuj czwartą frakcję (2% eteru) i dodaj ją do zbiornika. Umieść następną kolbę pod kolumną, otwórz kran i zbierz czwartą frakcję. Przygotuj piątą frakcję; Następnie kontynuuj zgodnie z potrzebami.
      UWAGA: Możliwe jest odparowanie pierwszej frakcji (frakcji) poprzez odparowanie rotacyjne podczas zbierania kolejnych frakcji.
   9. W celu przygotowania frakcji do wykorzystania w analizach GC-MS należy uzyskać masę frakcji za pomocą wagi precyzyjnej 0,01 lub 0,1 mg. Rozpuścić frakcje lipidowe, aby uzyskać 1 mg lipidów na 1 ml heksanu.

4. Czyszczenie

1. Pozostawić otwarty kran i odwrócić kolumnę w zlewce na odpady. Tlenek glinu i piasek wydostaną się z kolumny; Możesz też wstrząsnąć, aby przyspieszyć proces. Użyj pręta do kołków, aby pobrać wełnę z włókna szklanego, jeśli utknęła (unikaj zarysowania szkła) lub przedmuchaj ją strumieniem N₂.
2. Zdemontuj i wyczyść wszystkie szklane naczynia, używając detergentu klasy laboratoryjnej w gorącej wodzie w plastikowej wannie ze szczotką do szkła (z włosiem lub plastikowym włosiem). Umyć 3x. Dobrze spłucz dużą ilością ciepłej wody, aż szklanka przestanie być śliska w dotyku.
3. Opłucz szklane naczynia i narzędzia 3x wodą dejonizowaną. Umieść je na stojaku do wyschnięcia na powietrzu. Aby przyspieszyć suszenie, dodaj niewielką objętość acetonu (3 ml) do szkła, zamieszaj i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu lub przepuść pod strumieniem_N2.

Wyniki

Po ekstrakcji, całkowita masa lipidów jest pierwszym rodzajem danych, które można uzyskać za pomocą przedstawionego tutaj protokołu. Jednak nigdy nie należy analizować całkowitych wartości masy lipidów bez próby standaryzacji uzyskanych wartości. Można zastosować kilka podejść, ale zalecamy standaryzację wyekstrahowanej masy lipidowej do SVL zwierzęcia (w centymetrach) lub do masy zrzuconej skóry, która została usunięta. Pierwsza z nich daje wartość masy lipidów na długość, a druga będzie proporcją masy źródłowej. Powodem standaryzacji jest to, że większe zwierzęta naturalnie wytwarzają więcej lipidów skóry, ponieważ mają większą całkowitą powierzchnię skóry. Rysunek 1A ilustruje ten związek, gdzie wyekstrahowana masa lipidowa skóry skaluje się liniowo wraz z masą zrzuconej skóry. Po standaryzacji do całkowitej masy zrzucanej skóry, ta liniowa zależność jest całkowicie usunięta (Rysunek 1B).

Po frakcjonowaniu, to samo podejście do standaryzacji może być stosowane z masami poszczególnych frakcji (Rysunek 2). W tym przykładowym zestawie danych każda frakcja nie przyczynia się w równym stopniu do całkowitej wyekstrahowanej masy lipidowej: obojętne lipidy (frakcje 1 - 3) są dominującym zestawem związków pod względem proporcji masowej w porównaniu z każdym zestawem bardziej polarnych lipidów (frakcje 4 - 6, 7 - 9 i 10 - 12).

Rysunek 1: Zależności między wyekstrahowaną masą lipidową a materiałem wejściowym. (A) U zależność między całkowitą zrzuconą masą skóry a wyekstrahowaną masą lipidową skóry jest dodatnio skorelowana (P < 0,001). (B) Gdy wyekstrahowana masa lipidowa skóry jest standaryzowana na całkowitą masę zrzuconą (masa lipidowa podzielona przez masę zrzucenia), zależność ta nie jest już obecna (P = 0,46). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Standaryzowane masy frakcji po elucji. Za pomocą chromatografii kolumnowej ekstrakty lipidowe skóry można eluować na frakcje w oparciu o polarność związków. Masa frakcji jest zatem wyrażana jako proporcja całkowitego ekstraktu lipidowego (masa frakcji [w miligramach ] podzielona przez całkowitą masę ekstraktu lipidowego [w miligramach) w celu określenia różnic między frakcjami lub grupami eksperymentalnymi⁸. Słupki reprezentują środki. Głównym błędem jest SEM; dolny błąd to 95% CI. Dla przejrzystości podano poszczególne punkty danych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Reprezentatywne chromatografy gazowe frakcji ketonu metylowego. (A) Przy prawidłowej elucji ketony metylowe są najobficiej występującymi związkami we frakcji 7 z tabeli 2 i mogą być postrzegane jako kuplety pików (czas retencji = 24 - 34 min). (B) Frakcja 6 z tabeli 2 daje jednak tylko związki niebędące przedmiotem zwalczania. Ten sam wynik może wystąpić, gdy rozpuszczalnik polarny użyty w fazie ruchomej wygaśnie lub jeśli kolumna zostanie zatrzymana na długie okresy czasu (>1 h) między frakcjami. Zwróć uwagę na różnicę w obfitości molekularnej między tymi dwoma śladami. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

ułamek	Heksan (ml)	Eter dietylowy (ml)
1,2,3	100 [30]	0 [0]
4,5,6	98 [29.4]	2 [0,6]
7,8,9	96 [28,8]	4 [1.2]
10,11,12	92 [27,6]	8 [2.4]
13,14,15	84 [25,2]	16 [4.8]

Tabela 1: Standardowe objętości elucji dla frakcjonowania lipidów w skórze. Objętości i procenty rozpuszczalnika są podane zarówno dla kolumn chromatograficznych o dużej objętości (np. 250 ml), jak i [o małej objętości] (np. 100 ml) przy użyciu tlenku glinu (aktywność III). Heksan jest rozpuszczalnikiem nośnikowym; Eter dietylowy jest fazą ruchomą.

ułamek	Heksan (ml)	Eter dietylowy (ml)	Notatki
1, 2, 3	Rozdział 30	0	eluować; nie zbieraj
4, 5	Klasa 28,8	Rozdział 1.2	eluować; nie zbieraj
6, 7, 8	Klasa 28,8	Rozdział 1.2	zbierać pojedynczo; większość masy ketonu metylowego będzie znajdować się we frakcji 7; Kontrole jakości GC-MS powinny być przeprowadzane na 6 i 8, aby zapewnić prawidłowe wymywanie ketonów

Tabela 2: Zmodyfikowany schemat elucji ketonów metylowych węża do pończoch. Objętości te są przeznaczone do stosowania z kolumną chromatograficzną o małej objętości oraz z aktualnie dostępną marką tlenku glinu. Frakcja eluowana dodatnia dla ketonów metylowych ma silną bioaktywność w testach terenowych z dzikimi, zalotnymi samcami węży do pończoch^1,7. Aby potwierdzić obecność ketonów metylowych we frakcjach docelowych, próbki można rozcieńczyć do 1 mg/ml i przeanalizować za pomocą GC-MS. Rysunek 3 przedstawia reprezentatywne chromatogramy zarówno dla pozytywnych, jak i negatywnych wyników po elucji.

Dyskusja

Ekstrakcja lipidów skórnych u może być stosowana do żywej lub martwej skóry, oprócz zrzucania skóry, co zapewnia wszechstronność w eksperymentalnym zastosowaniu tej techniki. Co więcej, ekstrakcje lipidów skóry mogą być wykonywane w terenie, aby umożliwić dynamiczne zastosowanie metody do szerokiego grona biologów ^2,13. Ekstrakcja lipidów skóry jest prosta; W związku z tym łatwo jest zwiększyć skalę ekstrakcji w zależności od potrzeb dla eksperymentu lub projektu, a praktycy nie muszą mieć znaczącej wiedzy specjalistycznej, aby wykonać te metody. Jedynymi czynnikami ograniczającymi zwiększenie skali są dostępność miejsca pod wyciągiem, duża ilość czystych, zamykanych naczyń szklanych oraz miejsce do przechowywania rozpuszczalników.

Frakcjonowanie ekstraktu lipidowego ze skóry może być dostosowane do potrzeb badacza, a zatem ma podobną elastyczność do ekstrakcji lipidów. Na przykład neutralne lipidy można eluować, a następnie odrzucać, aby uzyskać frakcje docelowe, które mogą oczyścić interesujące związki lub uprościć testy biologiczne. Frakcjonowanie można przeprowadzać w wielu skalach w próbkach lipidów i między nimi. Na przykład wiele kolumn może być uruchamianych jednocześnie, aby proces był bardziej wydajny. Lub tylko część całkowitego ekstraktu lipidowego może być frakcjonowana na małej kolumnie, aby w ten sposób zaoszczędzić odczynniki i czas. Frakcjonowanie jest ograniczone przede wszystkim masą całkowitego ekstraktu lipidowego oraz precyzją sprzętu, jakim dysponuje badacz. Na przykład, jeśli badacz posiada wagę z dokładnością do 10,0 mg, określenie masy frakcji, a tym samym dokładność przygotowania próbki do analizy GC-MS, jest znacznie, jeśli nie całkowicie, utrudnione. To samo dotyczy wyrobów szklanych. Jeśli badacz ma kolumnę o dużej objętości do frakcjonowania, ale ma małą całkowitą masę lipidową do oddzielenia, elucja lub separacja związków będzie postępować, ale będzie wymagała znacznego marnotrawstwa rozpuszczalników, odczynników, czasu i potencjalnie samych związków docelowych.

Zaleca się przeprowadzenie kontroli jakości przed określeniem schematu elucji, jak pokazano w tabeli 2, i podjęcie decyzji, które frakcje można odrzucić. Aby potwierdzić elucję pożądanych lipidów, można uruchomić kolumnę, w której każda frakcja, 1 - 15, jest zbierana indywidualnie, a następnie analizowana za pomocą GC-MS. Na rysunku 3 reprezentatywne ślady chromatografu gazowego pokazują, że ketony metylowe z węży do pończoch wymywają się z kolumny tylko w określonej frakcji. Wykonując ten etap kontroli jakości, można opracować zmodyfikowany schemat elucji dla danego gatunku, aby zapewnić maksymalną wydajność interesujących związków. Zmiany w materiałach, takie jak dostawca lub partia tlenku glinu lub wiek eteru dietylowego, z pewnością spowodują różnice w elucji, które należy kontrolować poprzez przeprowadzenie testu kontroli jakości.

Opisane techniki są ograniczone głównie przez chemiczny charakter sygnałów, które można uzyskać. Przede wszystkim metody te pozwalają naukowcom jedynie na wyizolowanie i oddzielenie długołańcuchowych lipidów od skóry. Wiele gatunków wykorzystuje sygnały unoszące się w powietrzu i/lub białkowe jako sygnały chemiczne, a opisane metody są niekompatybilne z izolacją tych sygnałów. Co więcej, rozpuszczalniki niepolarne nie będą ekstrahować wodnych sygnałów z powierzchni lub źródeł osadzania się sygnałów (np. wody w klatce, kału, podłoża wodnego), które mogą rzeczywiście zawierać obfite sygnały chemiczne. Odpowiednie metody wychwytywania tego typu sygnałów są dostępne dla badaczy (np. mikroekstrakcja do fazy stałej [SPME] dla sygnałów lotnych i wysokosprawna chromatografia cieczowa [HPLC] dla wskazówek wodnych), chociaż, podobnie jak w przypadku metod opisanych powyżej, istnieje techniczna krzywa uczenia się.

Co najważniejsze, użyteczność końcowej mieszaniny chemicznej dla badacza powinna kierować stosowanymi metodami. Na przykład, jeśli badacz chce wiedzieć, czy samiec zwierzęcia ogniskowego może rozróżnić sygnały wytwarzane przez samce i samice współplemieńców w ukierunkowanym teście biologicznym, ekstrakcja jest jedyną potrzebną metodą ^2,3. Jeśli jednak celem jest identyfikacja związków dymorficznych płciowo, ekstrakt powinien zostać oczyszczony, aby umożliwić większą pewność w przypisywaniu identyfikacji określonym cząsteczkom lub grupom cząsteczek za pomocą analizy chemicznej 1,6,9,11. Jednak, aby nawet przeprowadzić chromatografię ze źródłem lipidów, wymagana jest znaczna masa ekstraktu wyjściowego, aby można było uzyskać mierzalne masy frakcji; W przeciwnym razie można dążyć do łączenia próbek, ale nie jest to optymalne¹⁴.

Przyszły rozwój tego protokołu obejmuje środki mające na celu wykorzystanie i dostosowanie procedury do większej liczby gatunków. Opracowywane są również dodatkowe nieinwazyjne metody ekstrakcji lipidów skóry.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Bezpudrowe rękawice chloroprenowe	Microflex	NEC-288	Zobacz "1.1 Konfiguracja ekstrakcji szopy" (krok 1.1.2 "rękawice")
Ohaus Adventurer Precision Balance	Ohaus	AX622	Zobacz "1.1 Konfiguracja ekstrakcji szopy" (krok 1.1.3 "równowaga")
Freund Container Ball 16 uncji słoika Mason & Kulka pokrywy		NC9661590	Patrz "1.1 Konfiguracja ekstrakcji szopy" (krok 1.1.5 "słoik z masonem")
Heksan, mieszaniny izomerów	Sigma-Aldrich	650544	Zobacz "1.1 Konfiguracja ekstrakcji szopy" (krok 1.1.6 "heksan")
Taśma temperaturowa Hi/Lo Write-On	Mikroskopia elektronowa Nauki	5029927	Zobacz "1.1 Konfiguracja ekstrakcji szopy" (krok 1.1.8 "taśma")
Kolba okrągłodenna z pojedynczą szyjką, pojemność 500 ml	Sigma-Aldrich	Z414514	Patrz "2. Ekstrakcja" (krok 2.1.2.4 "500 ml")
Kolba okrągłodenna z pojedynczą szyjką, pojemność 100 ml	Sigma-Aldrich	Z414492	Patrz "3.2 Frakcjonowanie" (krok 3.2.4 "100 ml")
Pierścień podtrzymujący kolbę korkową	Sigma-Aldrich	Z512419	Patrz "2. Ekstrakcja" (krok 2.1.2.1 "korkowy pierścień podtrzymujący")
Kontroler pipet Accu-jet Pro	Sigma-Aldrich	Z671533	Patrz "2. Ekstrakcja" (krok 2.1.1.3 "elektryczny sterownik pipet")
Jednorazowe szklane pipety serologiczne pakowane pojedynczo, 10 ml	Pyrex	13-666-7E	Patrz "2. Ekstrakcja" (krok 2.1.1.3 "Pipeta 10 ml")
Rotavapor R II	Buchi	2422A0	Patrz "2. Ekstrakcja" (krok 2.1.2.1 "wyparka obrotowa")
Eliptyczna pułapka uderzeniowa	Chemglass Nauki przyrodnicze	501215241	Patrz "2. Ekstrakcja" (krok 2.1.2.1 "pułapka uderzeniowa")
Fiolki 7 ml, zakrętka, przezroczyste szkło	Supelco	27151	Patrz "1.1 Konfiguracja ekstrakcji szopowej" (krok 1.1.11 "Fiolka 7 ml")
Zakrętka fiolki 7 mL, solidna góra z wkładką PTFE	Supelco	27152	Patrz "1.1 Konfiguracja ekstrakcji szopy" (krok 1.1.11 "nakrętka")
Fiolki 22 ml, Zakrętka, przezroczyste szkło	Supelco	27173	Patrz "1.1 Konfiguracja ekstrakcji szopy" (krok 1.1.11 "Fiolka 22 ml")
Zakrętka fiolki 22 mL, solidna nakrętka z wkładką PTFE	Supelco	27174-U	Patrz "1.1 Konfiguracja ekstrakcji szopy" (krok 1.1.11 "nasadka")
Waga analityczna Excellence XS	Mettler-Toledo	XS205DU	Patrz "2. Ekstrakcja" (krok 2.1.2.1 "równowaga")
5 3/4" Jednorazowa szklana pipeta	Fisherbrand	NC0418555	Patrz "1.1 Konfiguracja ekstrakcji szopy" (krok 1.1.11 "pipeta")
Kolumna chromatograficzna z zespołem krana PTFE	Kimble-Chase	17810-19300	Patrz "3.1 Przygotowanie kolumny" (krok 3.1.1 "mała szklana kolumna")
Żeliwna podstawa w kształcie litery L Stojaki	Fischerbrand	11474207	Patrz "3.1 Przygotowanie kolumny" (krok 3.1.1 "Podstawa podporowa")
3-bolcowy podwójnie regulowany niklowany Clamp	Troemner	2300203	Patrz "3.1 Przygotowanie kolumny" (krok 3.1.1 "zaciski")
Clamp Regular Holder	Fischerbrand	05754Q	Patrz "3.1 Przygotowanie kolumny" (krok 3.1.1 "clamp holder")
Piasek, umyty i wysuszony	Macron Fine Chemical	MK-7062-212	Patrz "3.1 Przygotowanie kolumny" (krok 3.1.5 "piasek")
Tlenek glinu, neutralny	Sorbtech	15740-5	Patrz "3.1 Przygotowanie kolumny" (krok 3.1.7 "tlenek glinu"); jedyny znany producent w USA
Szklana kolba Erlenmeyera o wąskiej szyjce, 1000 ml	Pyrex	4980-1L	Patrz "3.1 Przygotowanie kolumny" (krok 3.1.6 "Kolba Erlenmeyera")
Kolba okrągłodenna z pojedynczą szyjką, pojemność 250 ml	Sigma-Aldrich	Z100684	Patrz "3.1 Przygotowanie kolumny" (krok 3.2.4 "Kolba okrągłodenna 250 ml")
Skalibrowana kolumna chromatograficzna ze zbiornikiem rozpuszczalnika	Sigma-Aldrich	Z560553	Patrz "3.2 Przygotowanie kolumny" (Krok 3.2.1 "duża szklana kolumna" )
Eter etylowy bezwodny	Fisher Chemical	E138500	Patrz "3.2 Frakcjonowanie" (krok 3.2.5 "Eter")
Alconox Detergnet	Sigma-Aldrich	242985	Patrz "4. Czyszczenie" (krok 4.2 "Alconox")
Aceton (certyfikowany ACS)	Fisher Chemical	A18P-4	Patrz "4. Czyszczenie" (krok 4.4 "aceton")