Artykuł metodologiczny

Reaktywny druk atramentowy i analiza napędu samobieżnych mikromieszadeł na bazie jedwabiu

DOI:

10.3791/59030

⸱

26 kwietnia 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemical and Biological Engineering, University of Sheffield, 2School of Engineering, University of Liverpool

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół demonstruje zdolność do wykorzystania reaktywnego druku atramentowego do drukowania samoruchomych, biokompatybilnych i przyjaznych dla środowiska mikromieszadeł do użytku w zastosowaniach biomedycznych i środowiskowych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym badaniu opisano protokół użycia reaktywnego druku atramentowego do produkcji enzymatycznie napędzanych jedwabnych pływaków o dobrze zdefiniowanych kształtach. Powstałe w ten sposób urządzenia są przykładem samonapędzających się obiektów zdolnych do generowania ruchu bez zewnętrznego uruchamiania i mają potencjalne zastosowania w medycynie i naukach o środowisku do różnych celów, począwszy od mikromieszania, poprzez ukierunkowane dostarczanie terapeutyczne, aż po remediację wody (np. usuwanie wycieków oleju). Metoda ta wykorzystuje reaktywny druk atramentowy do generowania dobrze zdefiniowanych struktur stałego jedwabiu na małą skalę poprzez przekształcanie rozpuszczalnej w wodzie regenerowanej fibroiny jedwabiu (jedwab I) w nierozpuszczalną fibroinę jedwabiu (jedwab II). Struktury te są również selektywnie domieszkowane w określonych regionach enzymem katalazą w celu wytworzenia ruchu poprzez wytwarzanie pęcherzyków i odłączanie. Liczba drukowanych warstw determinuje trójwymiarową (3D) strukturę urządzenia, a stąd w tym miejscu raportowany jest wpływ tego parametru na trajektorie napędu. Wyniki pokazują zdolność do dostrojenia ruchu poprzez zmianę wymiarów drukowanych struktur.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sztuczne mikromieszadła samobieżne (SPMS) wykorzystują różne mechanizmy napędowe do wytwarzania ruchu, które można sklasyfikować jako napęd chemiczny1,2,3,4,5,6 lub fizyczny napęd zewnętrzny. Powszechnym mechanizmem napędu chemicznego jest wykorzystanie aktywności katalitycznej lub enzymatycznej do generowania gradientów wytwarzających ruch lub generowania pęcherzyków, które nadają pęd obiektowi po odłączeniu. Poprzednie badania dotyczyły kilku katalitycznych i chemicznych SPMS, w tym kulek polistyrenowych z nanocząstkami platyny i chromem zaadsorbowanym na powierzchni1, złoto-platynowe bimetaliczne nano-pręty Janusa2, mikromieszadła magnezowe Janus3, mikromieszadła wykonane z rdzenia magnezowego i powłoki z dwutlenku tytanu z osadzonymi nanocząstkami złota4oraz mikrorakiety Janus z fibroiny jedwabnej z katalazą osadzoną w rusztowaniu5. Fizyczne mechanizmy napędowe obejmują systemy napędowe magneticic7,8, optical9 i ultrasonic10, wszystkie kontrolowane przez zewnętrzne źródło fizyczne. W zależności od zamierzonego zastosowania, rozmiar SPMS może wynosić od kilku nanometrów do kilkuset mikrometrów. Przykładami potencjalnych zastosowań tych i innych SPMS są medyczna diagnostyka chorób za pomocą urządzeń lab-on-a-chip11, ładowanie i ukierunkowane dostarczanie leków in vivo12, remediacja środowiska3 (np. czyszczenie wycieków oleju) oraz fotokatalityczna degradacja chemicznych i biologicznych środków bojowych, takich jak Bacillus anthracis i czynniki nerwowe4. W zależności od zastosowania docelowego, pożądana jest zatem możliwość produkcji SPMS, które przechodzą określone trajektorie, takie jak długie trajektorie liniowe w przypadku wyzwań związanych z transportem lub trajektorie obrotowe w zastosowaniach mikromieszania. Nacisk kładziony jest tutaj na ruch obrotowy w zastosowaniach mieszających.

Nie ma jednej ustalonej metody wytwarzania SPMS, ale do zastosowań medycznych i środowiskowych niezbędne jest użycie materiału, który jest biokompatybilny, biodegradowalny, przyjazny dla środowiska, łatwo dostępny, tani i pozwala na łatwe wytwarzanie skomplikowanych SPMS bez konieczności stosowania zaawansowanego sprzętu. Fibroina z regenerowanego jedwabiu (RSF) jest jednym z takich materiałów, który spełnia wszystkie te parametry, a także jest zatwierdzony przez Agencję ds. Żywności i Leków (FDA).

Jedwab to ogólny termin używany dla kilku naturalnie występujących białek włóknistych, z których najbardziej znanym jest to wytwarzane przez larwy jedwabnej, Bombyx mori, przed jej przepoczwarzeniem. Te kokony są zbudowane z fibroiny, włóknistego białka, sklejonego z innym białkiem zwanym serycyną. Stwierdzono, że fibroina jedwabiu (SF) ma doskonałe właściwości mechaniczne, biokompatybilność i biodegradowalność13, co czyni ją idealnym wyborem do produkcji SPMS. SF występuje w trzech formach polimorficznych, a mianowicie jedwabiu I, II i III. Jedwab I jest rozpuszczalną w wodzie metastabilną formą zawierającą głównie helisy i losowe zwoje; jedwab II jest nierozpuszczalną w wodzie formą zawierającą głównie antyrównoległe arkusze β skrystalizowanego jedwabiu; a jedwab III jest potrójną spiralną strukturą poliglicyny II, która występuje na granicy faz woda-powietrze roztworu jedwabiu. Podobnie jak inne białka włókniste, SF ma powtarzające się jednostki sekwencji aminokwasowych. Naturalnie występujący SF kokonu składa się z trzech głównych domen heksapeptydowych takich powtarzających się jednostek (GAGAGX), podczas gdy X może być A, S lub Y. Poprzez wiązanie wodorem, motywy (GA)n z antyrównoległych struktur arkuszowych β dalej kumulują się przez siły van der Waalsa i tworzą hydrofobowe nanokrystalizacje14,15.

Biokompatybilność może być jeszcze bardziej poprawiona, starając się napędzać napęd za pomocą naturalnie występujących enzymów do generowania gradientu stężeń lub pęcherzyków gazu w ciekłym medium (paliwie). W związku z tym w tym badaniu enzym katalaza jest używany jako "silnik" do generowania napędu, a nadtlenek wodoru jest używany jako wodne medium paliwowe. Katalaza jest enzymem występującym w prawie wszystkich organizmach żywych. Katalizuje rozkład nadtlenku wodoru (H2O2) na wodę i tlen16. Uwolnienie pęcherzyków tlenu z miejsc enzymatycznych SPMS generuje siłę działającą na obiekt, powodując jego napęd w kierunku przeciwnym do uwolnienia pęcherzyka5 (Rysunek 1).

W trybie SPMS napędzanym katalitycznie różne umiejscowienie miejsca katalitycznego skutkuje odmiennym zachowaniem i trajektoriami napędu1. W dążeniu do uzyskania wydajnych mikromieszadeł konieczne jest zatem wytwarzanie mieszadeł o dobrze zdefiniowanych kształtach geometrycznych i pozycjach silnika oraz porównywanie różnych mocy silnika. Tutaj, aby ułatwić te badania, opisano, w jaki sposób regenerowane fibroiny jedwabiu są wytwarzane w skali milimetrowej przy użyciu technologii reaktywnego druku atramentowego (RIJ). Druk atramentowy to bezkontaktowa metoda osadzania materiałów. To sprawia, że wytwarzanie małych, złożonych struktur z dużą precyzją w generowaniu różnych kształtów jest proste. RIJ ma miejsce, gdy dwa lub więcej różnych reagujących materiałów jest osadzanych i reaguje na podłożu, tworząc pożądany materiał produktu. W związku z tym SPMS drukowane z jednym mieszadłem katalitycznym poza środkiem nadaje obiektowi asymetrię, która powoduje ruch obrotowy. Takie podejście ułatwia również produkcję mikromieszadeł w różnych kształtach i konfiguracjach projektowych zdefiniowanych przez projektowanie wspomagane komputerowo (CAD), umożliwiając w ten sposób łatwiejszą i dokładniejszą kontrolę pożądanego ruchu podczas praktycznych zastosowań. Na koniec wykazano zdolność urządzeń drukujących o różnej grubości, które wykazują różne właściwości napędowe.

To badanie dostarcza planu produkcji SPMS z RSF w skali od mikrometra do milimetra. Zastosowanie technologii RIJ do produkcji mikromieszadeł RSF otwiera drzwi do wysoce wszechstronnej produkcji mikromieszadeł z materiałów takich jak rusztowania produkowane in situ lub hydrożele, które w inny sposób nie mogłyby zostać zdeponowane lub wytworzone za pomocą innych środków, takich jak odparowanie. Po odpowiedniej dalszej funkcjonalizacji (np. enzymów), te SPMS mogą być odpowiednie do remediacji środowiska3, takich jak czyszczenie toksyn biologicznych, zanieczyszczeń organicznych oraz chemicznych i biologicznych środków bojowych4.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Proszę zapoznać się z odpowiednimi kartami charakterystyki substancji przed użyciem nadtlenku wodoru, węglanu sodu, etanolu, chlorku wapnia i metanolu. Upewnij się, że nosisz wszystkie odpowiednie środki ochrony osobistej, w tym środki kontroli technicznej, podczas obchodzenia się z chemikaliami stosowanymi w tym protokole.

1. Ekstrakcja fibroiny

  1. Pokrój 5 g oczyszczonych jedwabnych kokonów na ~ 1 cm2 małe kawałki za pomocą nożyczek.
  2. Zagotuj 2 l wody dejonizowanej (DI) w zlewce o pojemności 2 l na magnetycznej płycie grzejnej pod okapem ekstrakcyjnym.
  3. Stopniowo i powoli dodawać 4,24 g węglanu sodu do wrzącej wody, aby uniknąć wykipienia i pozostawić do rozpuszczenia za pomocą mieszadła magnetycznego.
  4. Poczekaj, aż roztwór zacznie ponownie wrzeć i dodaj pokrojone kawałki kokonów do roztworu. Upewnij się, że cały jedwab jest zanurzony w roztworze i utrzymuj roztwór w stanie wrzenia pod ciągłym mieszaniem przez 90 minut. Lekko przykryj zlewkę folią aluminiową i regularnie uzupełniaj podgrzaną wodą DI, aby uzupełnić straty wody spowodowane parowaniem.

2. Suszenie fibroiny

  1. Usunąć wyekstrahowane włókna fibroiny z roztworu węglanu sodu za pomocą szklanej pałeczki lub szpatułki i przemyć 3x 1 litrem podgrzanej wody demineralizowanej do każdego prania, stopniowo obniżając temperaturę dla każdego etapu prania (około 60 °C, 40 °C i temperatura pokojowa 25 °C).
  2. Rozłóż włókna fibroiny na naczyniu krystalizacyjnym ze szkła borokrzemianowego o pojemności 750 ml i umieść je w piecu do suszenia w temperaturze 60 °C pod ciśnieniem atmosferycznym i pozostaw do wyschnięcia na noc. Po wysuszeniu przechowuj fibroinę w zamkniętym pojemniku w temperaturze pokojowej.

3. Rozpuszczenie fibroiny

  1. Przygotuj roztwór trójskładnikowy (odczynnik Ajisawa) zawierający 4,8 g wody DI, 3,7 g etanolu i 3,1 g chlorku wapnia17.
  2. Umieścić kolbę okrągłodenną z dwiema szyjkami (100 ml) w łaźni wodnej, wykonanej przez napełnienie 750 ml naczynia krystalizującego ze szkła borokrzemianowego 600 ml wody DI, na magnetycznej płycie grzejnej. Umieścić roztwór trójskładnikowy w kolbie.
  3. Umieść termometr w jednej z szyjek, aby dokładnie monitorować temperaturę roztworu. Przykryj drugą szyjkę folią aluminiową, aby zapobiec wysychaniu roztworu w wyniku parowania (lub użyj skraplacza zwrotnego chłodzonego wodą). Podgrzać roztwór do temperatury 80 °C.
    UWAGA: Upewnij się, że bańka termometru znajduje się wewnątrz roztworu.
  4. Gdy temperatura roztworu ustabilizuje się na poziomie 80 °C, usunąć folię aluminiową i dodać do roztworu 1 g suszonej fibroiny. Dodaj małe mieszadło magnetyczne, aby upewnić się, że roztwór jest dobrze wymieszany podczas całego procesu rozpuszczania. Ponownie przykryj drugą szyjkę folią aluminiową, aby zminimalizować parowanie, ale pozostaw system otwarty. Pozostaw do rozpuszczenia na 90 minut.

4. Dializa roztworu fibroiny

  1. Po 90 minutach od rozpuszczenia pozostaw roztwór fibroiny na 10 minut, aby ostygł do temperatury pokojowej.
  2. Weź jedną rurkę dializacyjną o długości 15 cm (odcięcie masy cząsteczkowej 12 000−14 000 kDa) i zawiąż węzeł na jednym z dwóch końców. Myj go przez kilka minut pod bieżącą wodą DI z kranu.
  3. Otwórz drugi koniec i wlej do środka roztwór fibroiny. Za pomocą metalowego zacisku zamknij drugi koniec rurki do dializy, upewniając się, że rurka jest zamknięta tak szczelnie, jak to możliwe. Przymocować jeden z końców rurki do dializy za pomocą zakrętki do pustej plastikowej fiolki o pojemności 30 ml, aby rurka dializowa mogła unosić się w wodzie.
  4. Napełnij zlewkę o pojemności 2 l 2 litrami wody demineralizowanej i umieść w niej rurkę dializacyjną. Zmieniaj wodę w regularnych odstępach czasu. Sprawdzaj przewodność wody za każdym razem, gdy jest zmieniana, aby postępować zgodnie z procesem dializy. Etap dializy kończy się, gdy przewodność wody spadnie poniżej 10 μS/cm.
    UWAGA: Proces ten trwa zwykle około 24−36 godzin przy 5 podmianach wody.
  5. Po zakończeniu dializy odciąć nożyczkami jeden koniec rurki dializacyjnej i wlać roztwór do szeregu probówek o pojemności 1,5 ml. Następnie wirować przez 5 minut przy 16 000 x g, aby usunąć wszelkie cząstki z roztworu fibroiny. Zebrać supernatant do plastikowej fiolki o pojemności 30 ml i przechowywać w temperaturze 4 °C.

5. Oznaczanie stężenia roztworu RSF

  1. Zważyć czyste szkiełko podstawowe (W1). Dodać 200 μl roztworu jedwabiu (V1).
  2. Szkiełko należy pozostawić w piekarniku w temperaturze 60 °C na 2 godziny.
  3. Ponownie zważyć szkiełko podstawowe (W2).
  4. Obliczyć stężenie roztworu jedwabiu (w/v) według następującego wzoru:
    figure-protocol-1

6. Przygotowanie farb do druku

  1. Przygotuj tusz A (końcowa objętość 1,5 ml), mieszając roztwór fibroiny (40 mg/ml), glikol polietylenowy 400 (PEG400; 14 mg/ml) i wodę dejonizowaną do drukowania głównej części SPMS.
  2. Aby wydrukować silnik katalityczny SPMS, wymieszaj fibroinę (40 mg / ml), PEG400 (12 mg / ml), katalazę (6 mg / ml o aktywności katalitycznej >20 000 jednostek / mg) i wodę dejonizowaną, aby uzyskać 1,5 ml atramentu B.
  3. Przygotuj 1,5 ml tuszu C, rozpuszczając błękit brylantowy Coomassie (0,05 mg/ml) w metanolu.
    UWAGA: Metanol jest używany do przekształcania losowych cewek fibroiny w sztywne arkusze beta poprzez drukowanie tuszu C na tuszu A lub tuszu B. Błękit brylantowy Coomassie służy do zapewnienia kontrastowego koloru SPMS, aby wspomóc automatyczne śledzenie SPMS podczas napędu.

7. Reaktywny druk 3D w druku atramentowym

UWAGA: Drukarka atramentowa używana w tych eksperymentach jest oparta na urządzeniach do natryskiwania uruchamianych piezoelektrycznie ze szklanymi dyszami. Istnieje kilka dostępnych na rynku drukarek atramentowych do badań, które mogą powielać te funkcje.

  1. Do drukowania farb na podłożu silikonowym umieszczonym na stoliku w odległości roboczej między dyszą a podłożem waflowym krzemu należy używać urządzeń natryskowych o średnicy 80 μm. Kształty geometryczne SPMS są cyfrowo definiowane jako seria punktów o współrzędnych X-Y w pliku arkusza kalkulacyjnego.
    UWAGA: Drukarka odczytuje współrzędne szeregowo i odpowiednio uruchamia drukarkę. Każdy punkt współrzędnych sprawia, że drukarka przechodzi przez urządzenie natryskiwające. Dla farb A i B tworzone są osobne pliki arkuszy kalkulacyjnych (patrz Pliki uzupełniające [Body.xlsx główny SPMS i Engine.xlsx SPMS]).
  2. Załaduj trzy atramenty (A, B i C) do trzech zbiorników (każdy o pojemności 1,5 ml), a następnie wyreguluj ciśnienie zwrotne za pomocą zaworu zwrotnego dla każdego kanału, aby upewnić się, że atrament nie kapie z urządzeń natryskowych.
    UWAGA: Potrzebne są trzy urządzenia natryskowe na niezależnych kanałach.
  3. Dostosuj parametry natryskiwania (czas narastania 1, czas przebywania, czas opadania, czas narastania 2, napięcie bezczynności, napięcie przebywania, napięcie echa) dla każdego kanału, aby upewnić się, że każdy atrament zapewnia dobre, stabilne tworzenie kropel (Rysunek 2).
    UWAGA: Te parametry są zależne od urządzenia do natryskiwania i atramentu i będą musiały zostać odpowiednio dostosowane.
  4. Drukuj jedwabny atrament fibroinowy warstwa po warstwie na przemian z metanolem na czystych, polerowanych podłożach waflowych Si: etap 1, drukowanie tuszu A (korpus główny); etap 2: drukowanie tuszu C (tusz utwardzający); etap 3: drukowanie tuszu B (tusz katalityczny do miejsc silnika); etap 4: drukowanie tuszu C (tusz utwardzający); etap 5: powtórz etapy 1-4 dla wymaganych żądanych warstw (np. 100).
    UWAGA: Dwa przykładowe projekty dla 4 etapów są zawarte w plikach uzupełniających; SPMS Main Body.xlsx jest używany dla etapu 1 i etapu 2, a SPMS Engine.xlsx jest używany dla etapu 3 i etapu 4.
  5. Wydrukuj dwie partie fibroinowych SPMS o grubości odpowiednio 200 warstw i 100 warstw.
    UWAGA: Silnik katalazy znajduje się z boku jednego końca każdego mieszadła. Tak więc mieszadła mają jeden silnik katalityczny (patrz Rysunek 1 czerwony obszar).
  6. Aby usunąć próbki z płytek Si, zanurz próbki w wodzie demineralizowanej i delikatnie mieszaj, aż do momentu oderwania.

8. Akwizycja/śledzenie danych i analiza trajektorii mieszadeł samojezdnych

  1. Wyczyść szklaną szalkę Petriego (o średnicy 9 cm) wodą DI, upewniając się, że powierzchnia jest wolna od kurzu.
  2. Po oczyszczeniu i wyschnięciu dodaj 10 ml wstępnie przefiltrowanego (0,45 μm) 5% w/v H2O2 do szalki Petriego i pozostaw do osiadania. Rozświetl spód szalki Petriego chłodnym białym źródłem światła z diodą elektroluminescencyjną (LED) i użyj szybkiej kamery z obiektywem makro, aby uchwycić ruch z góry. Zapisywanie filmów jako plików .avi.
    UWAGA: Szczegółowe informacje na temat używanego sprzętu można znaleźć w Tabeli materiałów.
  3. Myj drukowane jedwabne mieszadełka przez 10 minut, zanurzając je w wodzie DI, aby usunąć niezwiązany PEG400. Ostrożnie weź jedno umyte mieszadło z końcówką sterylnej igły strzykawkowej i umieść je na środku szalki Petriego. Gdy umyte mieszadło dotknie paliwaH2O2, wokół silnika zaczynają tworzyć się pęcherzyki i obserwuje się okrężny ruch mieszadła. Gdy system wydaje się stabilny (zwykle 10-30 s później), naciśnij przycisk nagrywania w oprogramowaniu do nagrywania, aby rozpocząć przechwytywanie wideo.
  4. Wykonaj śledzenie mikromieszadeł klatka po klatce, śledząc każdy koniec mieszadeł, jak wskazano w punktach A i B w Rysunek 3.
    UWAGA: Można to zrobić ręcznie lub za pomocą oprogramowania śledzącego.
  5. Na podstawie uzyskanych danych śledzenia oblicz prędkość chwilową między dwiema kolejnymi ramkami (np. 1 i 2) za pomocą poniższego równania i uśrednij wynikowe prędkości z całej sekwencji, aby uzyskać średnią prędkość chwilową.
  6. Ponadto oblicz kąt orientacji φ. Następnie użyj szybkości zmiany φ, aby określić prędkość obrotową (Rysunek 3).
    figure-protocol-2
    UWAGA: Podczas obliczania prędkości chwilowych na podstawie śledzonych danych obrazu ważne jest, aby wziąć początkowy obraz obiektu o znanych wymiarach, aby móc obliczyć prawidłowe wartości pikseli na mikrometry. Wartości te będą zależeć od używanego aparatu, obiektywu i odległości. W zależności od rodzaju drukowanej cząstki wybierz różne punkty śledzenia do obliczenia prędkości. Na przykład tutaj punkty śledzenia A, B i C (środek masy) są używane do wyznaczania prędkości chwilowych (Rysunek 3).

9. Charakterystyka SPMS przez SEM

  1. Usunąć nieużywane i zużyte SPMS z płytki krzemowej lub roztworu luzem i przenieść je na lepkie podkładki węglowe o szerokości 10 mm zamontowane na aluminiowych króćcach mikroskopii elektronowej (SEM). Suszyć próbki w piecu suszącym przez 10 minut w temperaturze 60 °C.
  2. Załaduj kikuty próbki na stolik napylarki. Napyl (plazma argonowa o temperaturze 0,05 Torr) na próbki o długości 50–100 nm złota, zapewniając jednorodne pokrycie próbki złotem.
  3. Usunąć kikuty próbki z napylarki i zobrazować w SEM w próżni pod napięciem 5,0 kV.
    UWAGA: Bardzo wysokie napięcia przyspieszenia mogą spalić jedwab i spowodować powstanie fałszywych cech.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Po ugotowaniu jedwabiu, oczekuje się, że wysuszone włókna będą o około jedną trzecią jaśniejsze niż wcześniej, co wskazuje na pomyślne usunięcie serycyny. Podczas rozpuszczania jedwabiu w odczynniku Ajisawa włókna powinny zostać całkowicie rozpuszczone i należy odzyskać żółtą lepką ciecz. Po dializie roztwór jedwabiu powinien być mniej lepki, ale nadal mieć lekko żółty kolor. Jeśli jedwab zamienił się w żel, oznacza to, że rozpuszczenie nie zostało przeprowadzone pomyślnie.

Stabilne kropelki utworzone z urządzeń do natryskiwania umożliwią wyższą rozdzielczość drukowanych próbek. Rysunek 2 pokazuje przykład stabilnej pojedynczej kropli, która daje dobre wyniki drukowania, jak to są drukowane mieszadełka do jedwabiu pokazane w Rysunek 4. To normalne, że w zależności od tego, jak lepki jest atrament, rozprowadzanie następuje na podłożu.

W zależności od używanych drukarek atramentowych i wielkości kropli, odległość między każdą drukowaną kroplą musi być dostosowana w taki sposób, aby nakładały się na siebie, aby generować połączone linie. Jeśli kropelki są zbyt daleko od siebie, wydrukowana struktura rozpadnie się. Ponadto, jeśli nie zostanie wydrukowana wystarczająca liczba warstw, istnieje ryzyko pęknięcia mikromieszadeł po umieszczeniu w roztworze paliwowym. Po wyjęciu mieszadeł z podłoża i umyciu, umieszczenie ich w roztworze paliwa z nadtlenkiem wodoru powinno natychmiast spowodować powstanie pęcherzyków. Wskaźnik powodzenia dobrego uwalniania pęcherzyków zależy w dużym stopniu od aktywności enzymu; Jeśli aktywność enzymu jest niska, utworzy się mniej pęcherzyków, co prowadzi do słabych wyników napędu. Rysunek 5 pokazuje, jak zmienia się morfologia powierzchni mieszadeł w wyniku uwalniania pęcherzyków z wewnętrznych struktur, które generują małe pory. Udane mikromieszadło będzie wyglądało podobnie do tych, które można zobaczyć na Rysunek 6 i dwa dodatkowe filmy odpowiednio S1 i S2.

Rysunek 6 pokazuje nieruchome klatki wideo dwóch reprezentatywnych, 100-warstwowych (Rysunek 6A) i 200-warstwowych (Rysunek 6B) mieszadeł w paliwie 5% H2O 2. Czerwone i zielone linie wskazują śledzone trajektorie (patrz filmy uzupełniające S1 i S2). Prędkość obrotową można określić na podstawie szybkości zmiany orientacji (ɸ, Rysunek 3), jak pokazano na Rysunek 7. Porównanie 100-warstwowych i 200-warstwowych mikromieszadeł domieszkowanych katalazą pokazuje charakterystyczny wzrost prędkości obrotowej o ~0,6 razy z 60 ± 6 obr./min do 100 ± 10 obr./min (Rysunek 7).

figure-results-1
Rysunek 1: Schematyczna ilustracja katalitycznego rozkładu nadtlenku wodoru na wodę i tlen przez katalazę osadzoną w rusztowaniu mieszadła w żądanych miejscach (pokazanych na czerwono). Pęcherzyki tlenu w produkcie zapewniają niezbędny napęd do poruszania mieszadłem. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Zdjęcia poklatkowe przedstawiające tworzenie się kropel RSF z urządzenia natryskowego (średnica dyszy 80 μm). Liczby pod obrazami reprezentują czas, jaki upłynął w mikrosekundach (μs) od rozpoczęcia natryskiwania kropli atramentu jedwabnego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Schematyczne przedstawienie śledzenia cząstek w dwóch kolejnych klatkach. A i B wskazują punkty śledzenia, a C oznacza środek masy. φ oznacza kąt orientacji. Kierunek trajektorii SPMS jest wskazywany przez zakrzywioną czarną strzałkę. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Mikrofotografia świeżo wydrukowanego mikromieszadła z nadrukiem RIJ (100 warstw) przed praniem. Czerwona ramka oznacza obszar domieszkowany katalazą (obszar silnika). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Ryc. 5: Obrazy SEM głównego korpusu i części silnika katalazy SPMS po utworzeniu porów w wyniku uwolnienia pęcherzyków. Pory są wyraźnie widoczne na powierzchni silnika na obrazach SEM SPMS pochodzących z uwalniania pęcherzyków tlenu. (A) Mikromieszadła jedwabne przed wystawieniem na działanie 5% m/v roztworu paliwa H2O2 . (B) Silk SPMS po wystawieniu na działanie 5% m/v roztworu paliwa H2O2. Obrazy po prawej stronie to powiększenia czerwonych obszarów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 6: Klatki wideo przedstawiające dwa mikromieszadła w 5% roztworze paliwa, przedstawiające trajektorię w czasie. (A) 100-warstwowe mikromieszadła. (B) 200-warstwowe mikromieszadła. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-7
Rysunek 7: Porównanie kąta orientacji (φ) dla mikromieszadeł 100-warstwowych (60 ± 6 obr./min) i 200-warstwowych (100 ± 10 obr./min). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dodatkowe wideo S1: Reprezentatywne 100-warstwowe, samoruchome mikromieszadło w 5% w/v H2O2 poddawane napędowi. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dodatkowe wideo S2: Reprezentatywne 200-warstwowe, samoruchome mikromieszadło w 5% w/v H2O2 poddawane napędowi. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kluczową cechą SPMS wytwarzanych w tym protokole jest zdolność do szybkiego i łatwego projektowania różnych kształtów i struktur za pomocą RIJ jedwabiu domieszkowanego enzymami, takimi jak katalaza, oraz osiągania ruchu napędzanego chemicznie za pomocą napędu pęcherzykowego5. To, w połączeniu z wysoką biokompatybilnością18 tych mieszadeł, sprawia, że są one bardzo pożądane w przyszłych zastosowaniach zarówno w wyzwaniach związanych z remediacją wody, jak i w zastosowaniach lab-on-a-chip w medycznych urządzeniach diagnostycznych.

W tym przypadku zdolność napędowa jest demonstrowana poprzez wykorzystanie prostej konstrukcji liniowej z częścią silnika wydrukowaną z boku, jak pokazano na rysunku 1. Czerwone kropki reprezentują katalitycznie aktywne części silnika domieszkowane katalazą, a niebieskie kropki reprezentują części nieaktywne. Aby móc generować kształty 3D za pomocą RIJ, konieczne jest wydrukowanie wielu warstw w celu wygenerowania wysokości osi z. W tym przypadku liczba warstw osadzonych na płytce krzemowej wynosiła 100 i 200. Zmieniając liczbę warstw, można uzyskać różnicę w prędkości/rotacji napędu porównywalną do osadzania podwójnej ilości materiału. Aby uzyskać dobrze zdefiniowane struktury podczas drukowania atramentowego, ważne jest, aby wybrać odpowiednie parametry natryskiwania w celu uzyskania dobrze zdefiniowanej kropli, jak pokazano na rysunku 2. Parametry te będą się różnić w zależności od użytego atramentu i urządzeń natryskowych. Jeśli atrament nie wytwarza stabilnych kropel, najprawdopodobniej nie nadaje się już do drukowania i najprawdopodobniej zaczyna zamieniać się w żel. Ważne jest, aby pamiętać, że limit rozdzielczości silnie zależy od rozmiaru użytej dyszy, a mniejsze dysze pozwalają na drukowanie wyższych rozdzielczości i mniejszych struktur/cząstek.

Przykład mieszadła jedwabnego drukowanego przez RIJ pokazano na rysunku 4, gdzie część silnika z domieszką katalazy (oznaczona czerwonym obszarem) jest przymocowana z boku korpusu głównego (szczegóły można również zobaczyć na schemacie na rysunku 1). Drukowane rusztowanie jedwabne jest materiałem, który pozwala na dyfuzję roztworu paliwowego po całej strukturze 3D, a co za tym idzie, podczas rozkładu nadtlenku wodoru za pomocą katalazy powstają pęcherzyki tlenu. Uwalniane pęcherzyki tlenu wytwarzają pory w skali mikronowej w strukturze rusztowania jedwabnego, co można zobaczyć, porównując mikrofotografie SEM przed ekspozycją na paliwo H2O2 (Rysunek 5A) i po ekspozycji na H2O2 (Rysunek 5B). W celu zapewnienia, że ruch jest spowodowany rozkładem paliwaH2O2, ale nie napięciem powierzchniowym napędzanym przez zwolnienie PEG 400, ważne jest, aby mieszadła były początkowo zanurzone w wodzie na okres co najmniej 10 minut i badane w wodzie demineralizowanej pod kątem ruchu napięcia powierzchniowego przed uruchomieniem w roztworze paliwowym.

Zastosowanie PEG400 pozwala na lepsze uwalnianie pęcherzyków z powierzchni jedwabiu19 , jak wcześniej wyjaśnili Gregory i wsp.5 , ale może również powodować powstanie napędu napędzanego napięciem powierzchniowym, co może być pożądane w zależności od zastosowania, jak opisano wcześniej20. Ten drugi mechanizm daje również możliwość wytwarzania SPMS z dwoma mechanizmami, które są zależne od czasu i mogą być korzystne dla niektórych zastosowań, które na przykład oczekują początkowego energicznego mieszania na początku, a następnie wolniejszego dalszego mieszania przez dłuższy czas20.

Podsumowując, wykorzystując RIJ do produkcji autonomicznych urządzeń samojezdnych, można łatwo zaprojektować i wydrukować szeroką gamę kształtów i rozmiarów. Jedwab jako materiał bazowy dla urządzeń daje możliwości łatwego hermetyzowania enzymów i innych ugrupowań w strukturach, dając możliwość dodawania funkcji do tych urządzeń.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować za wsparcie ze strony EPSRC poprzez nagrody X. Zhao's reactive inkjet printing of silk materials awards (EP/N007174/1 i EP/N023579/1), S. J. Ebbens Career Acceleration Fellowship oraz Healthcare Technology Impact Fellowship (EP/J002402/1 i EP/N033736/1). Autorzy dziękują również dr Qingyou Xia z Państwowego Kluczowego Laboratorium Biologii Genomu Jedwabników na Uniwersytecie Południowo-Zachodnim w Chinach za dostarczenie jedwabnych kokonów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Węglan soduAlfa Aesar11552bezwodny, 99,5%, granulowany
Chlorek wapniaFluka AnalyticalC1016bezwodny, >93%, granulowany
EtanolFisher Scientific10542382klasa HPLC
PEG-400Aldrich Chemistry202398średnia Mn 400, tetramer mol wt ~250 kDa 
Jednostki CatalaseSigma Life ScienceE3289>20K
MetanolAcros Organics268280025
Nadtlenek wodoruSigma Aldrich3164230% (w/w)
SilkSouthwest University, ChinyNASurowo oczyszczone kokony jedwabne, rurki
do dializySigma AldrichD9777Celuloza, średnia, szerokość płaska 25 mm, Typowa granica masy cząsteczkowej = 14000
Fisherbrand Hoffman Clips Fisher Scientific12744396Klipsy używane do zamykania końcówek rurek dializacyjnych
Si-WaferSigma Aldrich647535Używany jako podłoże drukarskie
BalanceOHAUS Pioneer PA214C Waga analityczna
Miernik przewodnościMettler ToledoFG3Przenośny miernik przewodności Mettler Toledo FiveGo
Wirówka ThermoScientific10355052Fresk Heraeus Biofuge sprzedawany przez Thermo Scientific
Płyta grzewczaStuartUS152Stuart US152 Mieszadło magnetyczne Stuart US152
PixeLinkPL-D732CU-TSzybki kolorowy
obiektywdo kameryNavitarNavitar 1-60135
Urządzenia do natryskiwaniaZoom Microfab Technologies Inc.MJ-AT-01-40-8MXŚrednica dyszy 80um Urządzenie natryskowe
MJ-AT-01-80-8MXŚrednica dyszy 80um Urządzenie
LightpadAGPTEKUN-HL0245-EUUNŚwiatło do eksperymentu pływackiego
PipetyEppendorf3123000063jednokanałowe, zmienne,   100  –   1 000  &mikro; L, niebieski
3123000055jednokanałowy, zmienny, 20  –   200  &mikro; L, żółty
MikroskopNikonLV100NDRęczny, pionowy mikroskop
SEMFeiF50Używany do skaningowych mikrofotografii elektronowych
klasy HPLC Bombox Mori obiektywów makro natryskowe

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gregory, D. A., Campbell, A. I., Ebbens, S. J. Effect of Catalyst Distribution on Spherical Bubble Swimmer Trajectories. The Journal of Physical Chemistry C. 119 (27), 15339-15348 (2015).
  2. Paxton, W. F., et al. Catalytic Nanomotors: Autonomous Movement of Striped Nanorods. Journal of the American Chemical Society. 126 (41), 13424-13431 (2004).
  3. Gao, W., et al. Seawater-driven magnesium based Janus micromotors for environmental remediation. Nanoscale. 5 (11), 4696-4700 (2013).
  4. Li, J., et al. Water-Driven Micromotors for Rapid Photocatalytic Degradation of Biological and Chemical Warfare Agents. ACS Nano. 8 (11), 11118-11125 (2014).
  5. Gregory, D. A., Zhang, Y., Smith, P. J., Zhao, X., Ebbens, S. J. Reactive Inkjet Printing of Biocompatible Enzyme Powered Silk Micro-Rockets. Small. 12 (30), 4048-4055 (2016).
  6. Ismagilov, R. F., Schwartz, A., Bowden, N., Whitesides, G. M. Autonomous movement and self-assembly. Angewandte Chemie-International Edition. 41 (4), 652-654 (2002).
  7. Li, T., et al. Highly Efficient Freestyle Magnetic Nanoswimmer. Nano Letters. 17 (8), 5092-5098 (2017).
  8. Barbot, A., Decanini, D., Hwang, G. Controllable Roll-to-Swim motion transition of helical Nanoswimmers. 2014 IEEE/RSJ International Conference on Intelligent Robots and Systems. , 4662-4667 (2014).
  9. Xuan, M., et al. Near Infrared Light-Powered Janus Mesoporous Silica Nanoparticle Motors. Journal of the American Chemical Society. 138 (20), 6492-6497 (2016).
  10. Garcia-Gradilla, V., et al. Functionalized ultrasound-propelled magnetically guided nanomotors: toward practical biomedical applications. ACS Nano. 7 (10), 9232-9240 (2013).
  11. Baraban, L., et al. Catalytic Janus Motors on Microfluidic Chip: Deterministic Motion for Targeted Cargo Delivery. ACS Nano. 6 (4), 3383-3389 (2012).
  12. Ghalanbor, Z., Marashi, S. -A., Ranjbar, B. Nanotechnology helps medicine: Nanoscale swimmers and their future applications. Medical Hypotheses. 65 (1), 198-199 (2005).
  13. Lu, Q., et al. Water-Insoluble Silk Films with Silk I Structure. Acta Biomaterialia. 6 (4), 1380-1387 (2010).
  14. Wilson, D., Valluzzi, R., Kaplan, D. Conformational Transitions in Model Silk Peptides. Biophysical Journal. 78 (5), 2690-2701 (2000).
  15. Fink, T. D., Zha, R. H. Silk and Silk-Like Supramolecular Materials. Macromolecular Rapid Communications. 0 (0), 1700834(2018).
  16. Chelikani, P., Fita, I., Loewen, P. C. Diversity of structures and properties among catalases. Cellular and Molecular Life Sciences CMLS. 61 (2), 192-208 (2004).
  17. Ajisawa, A. Dissolution of silk fibroin with calciumchloride/ethanol aqueous solution. Journal of Sericultural Science of Japan. 67 (2), 91-94 (1998).
  18. Zhang, Y., Gregory, D. A., Smith, P. J., Zhao, X. Regenerated silk fibroin as an inkjet printable biomaterial. Printing For Fabrication (NIP). , Society for Imaging Science and Technology. Manchester. 406-409 (2016).
  19. Gregory, D. A., Zhang, Y., Smith, P. J., Ebbens, S. J., Zhao, X. Altering the Bubble Release of Reactive Inkjet Printed Silk Micro-rockets. Printing For Fabrication (NIP). , Society for Imaging Science and Technology. Manchester. 452-456 (2016).
  20. Zhang, Y., et al. Reactive Inkjet Printing of Functional Silk Stirrers for Enhanced Mixing and Sensing. Small. , e1804213(2018).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Jedwabne mikromieszad anap d enzymatycznydomieszkowane katalazpaliwo z nadtlenku wodoruzastosowania w mikromieszaniuurz dzenia biokompatybilnedostrajanie struktury 3Dledzenie za pomoc kamery wysokiej pr dko cianaliza pr dko ci obrotowej

Powiązane artykuły