Ten protokół demonstruje zdolność do wykorzystania reaktywnego druku atramentowego do drukowania samoruchomych, biokompatybilnych i przyjaznych dla środowiska mikromieszadeł do użytku w zastosowaniach biomedycznych i środowiskowych.
Artykuł metodologiczny
Reaktywny druk atramentowy i analiza napędu samobieżnych mikromieszadeł na bazie jedwabiu
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
W tym badaniu opisano protokół użycia reaktywnego druku atramentowego do produkcji enzymatycznie napędzanych jedwabnych pływaków o dobrze zdefiniowanych kształtach. Powstałe w ten sposób urządzenia są przykładem samonapędzających się obiektów zdolnych do generowania ruchu bez zewnętrznego uruchamiania i mają potencjalne zastosowania w medycynie i naukach o środowisku do różnych celów, począwszy od mikromieszania, poprzez ukierunkowane dostarczanie terapeutyczne, aż po remediację wody (np. usuwanie wycieków oleju). Metoda ta wykorzystuje reaktywny druk atramentowy do generowania dobrze zdefiniowanych struktur stałego jedwabiu na małą skalę poprzez przekształcanie rozpuszczalnej w wodzie regenerowanej fibroiny jedwabiu (jedwab I) w nierozpuszczalną fibroinę jedwabiu (jedwab II). Struktury te są również selektywnie domieszkowane w określonych regionach enzymem katalazą w celu wytworzenia ruchu poprzez wytwarzanie pęcherzyków i odłączanie. Liczba drukowanych warstw determinuje trójwymiarową (3D) strukturę urządzenia, a stąd w tym miejscu raportowany jest wpływ tego parametru na trajektorie napędu. Wyniki pokazują zdolność do dostrojenia ruchu poprzez zmianę wymiarów drukowanych struktur.
Wprowadzenie
Sztuczne mikromieszadła samobieżne (SPMS) wykorzystują różne mechanizmy napędowe do wytwarzania ruchu, które można sklasyfikować jako napęd chemiczny1,2,3,4,5,6 lub fizyczny napęd zewnętrzny. Powszechnym mechanizmem napędu chemicznego jest wykorzystanie aktywności katalitycznej lub enzymatycznej do generowania gradientów wytwarzających ruch lub generowania pęcherzyków, które nadają pęd obiektowi po odłączeniu. Poprzednie badania dotyczyły kilku katalitycznych i chemicznych SPMS, w tym kulek polistyrenowych z nanocząstkami platyny i chromem zaadsorbowanym na powierzchni1, złoto-platynowe bimetaliczne nano-pręty Janusa2, mikromieszadła magnezowe Janus3, mikromieszadła wykonane z rdzenia magnezowego i powłoki z dwutlenku tytanu z osadzonymi nanocząstkami złota4oraz mikrorakiety Janus z fibroiny jedwabnej z katalazą osadzoną w rusztowaniu5. Fizyczne mechanizmy napędowe obejmują systemy napędowe magneticic7,8, optical9 i ultrasonic10, wszystkie kontrolowane przez zewnętrzne źródło fizyczne. W zależności od zamierzonego zastosowania, rozmiar SPMS może wynosić od kilku nanometrów do kilkuset mikrometrów. Przykładami potencjalnych zastosowań tych i innych SPMS są medyczna diagnostyka chorób za pomocą urządzeń lab-on-a-chip11, ładowanie i ukierunkowane dostarczanie leków in vivo12, remediacja środowiska3 (np. czyszczenie wycieków oleju) oraz fotokatalityczna degradacja chemicznych i biologicznych środków bojowych, takich jak Bacillus anthracis i czynniki nerwowe4. W zależności od zastosowania docelowego, pożądana jest zatem możliwość produkcji SPMS, które przechodzą określone trajektorie, takie jak długie trajektorie liniowe w przypadku wyzwań związanych z transportem lub trajektorie obrotowe w zastosowaniach mikromieszania. Nacisk kładziony jest tutaj na ruch obrotowy w zastosowaniach mieszających.
Nie ma jednej ustalonej metody wytwarzania SPMS, ale do zastosowań medycznych i środowiskowych niezbędne jest użycie materiału, który jest biokompatybilny, biodegradowalny, przyjazny dla środowiska, łatwo dostępny, tani i pozwala na łatwe wytwarzanie skomplikowanych SPMS bez konieczności stosowania zaawansowanego sprzętu. Fibroina z regenerowanego jedwabiu (RSF) jest jednym z takich materiałów, który spełnia wszystkie te parametry, a także jest zatwierdzony przez Agencję ds. Żywności i Leków (FDA).
Jedwab to ogólny termin używany dla kilku naturalnie występujących białek włóknistych, z których najbardziej znanym jest to wytwarzane przez larwy jedwabnej, Bombyx mori, przed jej przepoczwarzeniem. Te kokony są zbudowane z fibroiny, włóknistego białka, sklejonego z innym białkiem zwanym serycyną. Stwierdzono, że fibroina jedwabiu (SF) ma doskonałe właściwości mechaniczne, biokompatybilność i biodegradowalność13, co czyni ją idealnym wyborem do produkcji SPMS. SF występuje w trzech formach polimorficznych, a mianowicie jedwabiu I, II i III. Jedwab I jest rozpuszczalną w wodzie metastabilną formą zawierającą głównie helisy i losowe zwoje; jedwab II jest nierozpuszczalną w wodzie formą zawierającą głównie antyrównoległe arkusze β skrystalizowanego jedwabiu; a jedwab III jest potrójną spiralną strukturą poliglicyny II, która występuje na granicy faz woda-powietrze roztworu jedwabiu. Podobnie jak inne białka włókniste, SF ma powtarzające się jednostki sekwencji aminokwasowych. Naturalnie występujący SF kokonu składa się z trzech głównych domen heksapeptydowych takich powtarzających się jednostek (GAGAGX), podczas gdy X może być A, S lub Y. Poprzez wiązanie wodorem, motywy (GA)n z antyrównoległych struktur arkuszowych β dalej kumulują się przez siły van der Waalsa i tworzą hydrofobowe nanokrystalizacje14,15.
Biokompatybilność może być jeszcze bardziej poprawiona, starając się napędzać napęd za pomocą naturalnie występujących enzymów do generowania gradientu stężeń lub pęcherzyków gazu w ciekłym medium (paliwie). W związku z tym w tym badaniu enzym katalaza jest używany jako "silnik" do generowania napędu, a nadtlenek wodoru jest używany jako wodne medium paliwowe. Katalaza jest enzymem występującym w prawie wszystkich organizmach żywych. Katalizuje rozkład nadtlenku wodoru (H2O2) na wodę i tlen16. Uwolnienie pęcherzyków tlenu z miejsc enzymatycznych SPMS generuje siłę działającą na obiekt, powodując jego napęd w kierunku przeciwnym do uwolnienia pęcherzyka5 (Rysunek 1).
W trybie SPMS napędzanym katalitycznie różne umiejscowienie miejsca katalitycznego skutkuje odmiennym zachowaniem i trajektoriami napędu1. W dążeniu do uzyskania wydajnych mikromieszadeł konieczne jest zatem wytwarzanie mieszadeł o dobrze zdefiniowanych kształtach geometrycznych i pozycjach silnika oraz porównywanie różnych mocy silnika. Tutaj, aby ułatwić te badania, opisano, w jaki sposób regenerowane fibroiny jedwabiu są wytwarzane w skali milimetrowej przy użyciu technologii reaktywnego druku atramentowego (RIJ). Druk atramentowy to bezkontaktowa metoda osadzania materiałów. To sprawia, że wytwarzanie małych, złożonych struktur z dużą precyzją w generowaniu różnych kształtów jest proste. RIJ ma miejsce, gdy dwa lub więcej różnych reagujących materiałów jest osadzanych i reaguje na podłożu, tworząc pożądany materiał produktu. W związku z tym SPMS drukowane z jednym mieszadłem katalitycznym poza środkiem nadaje obiektowi asymetrię, która powoduje ruch obrotowy. Takie podejście ułatwia również produkcję mikromieszadeł w różnych kształtach i konfiguracjach projektowych zdefiniowanych przez projektowanie wspomagane komputerowo (CAD), umożliwiając w ten sposób łatwiejszą i dokładniejszą kontrolę pożądanego ruchu podczas praktycznych zastosowań. Na koniec wykazano zdolność urządzeń drukujących o różnej grubości, które wykazują różne właściwości napędowe.
To badanie dostarcza planu produkcji SPMS z RSF w skali od mikrometra do milimetra. Zastosowanie technologii RIJ do produkcji mikromieszadeł RSF otwiera drzwi do wysoce wszechstronnej produkcji mikromieszadeł z materiałów takich jak rusztowania produkowane in situ lub hydrożele, które w inny sposób nie mogłyby zostać zdeponowane lub wytworzone za pomocą innych środków, takich jak odparowanie. Po odpowiedniej dalszej funkcjonalizacji (np. enzymów), te SPMS mogą być odpowiednie do remediacji środowiska3, takich jak czyszczenie toksyn biologicznych, zanieczyszczeń organicznych oraz chemicznych i biologicznych środków bojowych4.
Protokół
OSTRZEŻENIE: Przed użyciem nadtlenku wodoru, węglanu sodu, etanolu, chlorku wapnia i metanolu należy zapoznać się z odpowiednimi kartami charakterystyki materiałów. Podczas pracy z odczynnikami chemicznymi wykorzystanymi w tym protokole należy stosować wszelkie odpowiednie środki ochrony osobistej, w tym zabezpieczenia techniczne.
1. Ekstrakcja fibroiny
- Za pomocą nożyczek potnij 5 g oczyszczonych kokonów jedwabnika na małe kawałki o wielkości ok. 1 cm2.
- Zagotuj 2 L wody dejonizowanej (DI) w zlewce o pojemności 2 L na magnetycznej płycie grzejnej pod dygestorium.
- Stopniowo i powoli dodawaj 4,24 g węglanu sodu do wrzącej wody, aby zapobiec wykipieniu, i pozostaw do rozpuszczenia przy użyciu magnetycznego mieszadła.
- Odczekaj, aż roztwór ponownie zawrze, a następnie dodaj do niego potniete kawałki kokonów. Upewnij się, że cały jedwab jest zanurzony w roztworze i utrzymuj wrzenie przy ciągłym mieszaniu przez 90 min. Przykryj zlewkę lekko folią aluminiową i regularnie uzupełniaj poziom wstępnie podgrzaną wodą DI, aby zrekompensować ubytki wody wynikające z odparowania.
2. Suszenie fibroiny
- Wyjąć wyekstrahowane włókna fibroiny z roztworu węglanu sodu za pomocą szklanej rurki lub szpatułki i przemyć 3x w 1 L podgrzanej wody DI podczas każdego płukania, stopniowo obniżając temperaturę w każdym kolejnym etapie (około 60 °C, 40 °C oraz temperatura pokojowa, 25 °C).
- Rozłożyć włókna fibroiny w borokrzemianowej szalce krystalizacyjnej o pojemności 750 mL, umieścić ją w suszarce w temperaturze 60 °C pod ciśnieniem atmosferycznym i pozostawić do wyschnięcia na noc. Po wysuszeniu przechowywać fibroinę w szczelnym pojemniku w temperaturze pokojowej.
3. Rozpuszczanie fibroiny
- Przygotować roztwór trójskładnikowy (odczynnik Ajisawy) zawierający 4,8 g wody DI, 3,7 g etanolu oraz 3,1 g chlorku wapnia17.
- Dwuszyjkową kolbę okrągłodenną (100 mL) umieścić w łaźni wodnej, przygotowanej poprzez napełnienie 600 mL wody DI w borokrzemianowym naczyniu krystalizacyjnym o pojemności 750 mL, ustawionej na magnetycznej płycie grzejnej. Do kolby wlać roztwór trójskładnikowy.
- W jednej z szyjek umieścić termometr, aby dokładnie monitorować temperaturę roztworu. Drugą szyjkę przykryć folią aluminiową, aby zapobiec wysychaniu roztworu wskutek odparowania (lub zastosować chłodzony wodą chłodnik zwrotny). Podgrzać roztwór do 80 °C.
UWAGA: Należy upewnić się, że zbiorniczek termometru znajduje się w roztworze. - Po ustabilizowaniu się temperatury roztworu na poziomie 80 °C, usunąć folię aluminiową i dodać do roztworu 1 g wysuszonej fibroiny. Dodać niewielki magnetyczny mieszadło, aby zapewnić dokładne mieszanie roztworu podczas procesu rozpuszczania. Ponownie przykryć drugą szyjkę folią aluminiową, aby zminimalizować odparowanie, pozostawiając jednak układ otwarty. Pozostawić do rozpuszczenia na 90 min.
4. Dializa roztworu fibroiny
- Po 90 min rozpuszczania pozostawić roztwór fibroiny na 10 min, aby ostygł do temperatury pokojowej.
- Wziąć jedną rurkę dializacyjną o długości 15 cm (próg odcięcia masy cząsteczkowej 12 000−14 000 kDa) i zawiązać węzeł na jednym z dwóch końców. Płukać ją przez kilka minut bieżącą wodą DI z kranu.
- Otworzyć drugi koniec i wlać do środka roztwór fibroiny. Za pomocą metalnego zacisku zamknąć drugi koniec rurki dializacyjnej, upewniając się, że jest ona zamknięta tak szczelnie, jak to możliwe. Przymocować jeden z końców rurki dializacyjnej za pomocą zakrętki do pustej plastikowej fiolki o pojemności 30 mL, aby rurka dializacyjna mogła unosić się w wodzie.
- Napełnić zlewkę o pojemności 2 L ilością 2 L wody DI i umieścić w niej rurkę dializacyjną. Wymieniać wodę w regularnych odstępach czasu. Przy każdej wymianie sprawdzać przewodność wody, aby monitorować proces dializy. Etap dializy kończy się, gdy przewodność wody spadnie poniżej 10 µS/cm.
UWAGA: Proces ten trwa zazwyczaj od 24 do 36 h przy 5 wymianach wody. - Po zakończeniu dializy odciąć jeden koniec rurki dializacyjnej nożyczkami i przelać roztwór do serii probówek 1,5 mL. Następnie wirować przez 5 min przy 16 000 x g, aby usunąć wszelkie cząstki z roztworu fibroiny. Zebrać nadsącz do plastikowej fiolki 30 mL i przechowywać w temperaturze 4 °C.
5. Oznaczanie stężenia roztworu RSF
- Zważ czyste szkiełko przedmiotowe (W1). Dodaj 200 µL roztworu jedwabiu (V1).
- Pozostaw szkiełko w piekarniku w temperaturze 60 °C przez 2 h.
- Zważ ponownie szkiełko przedmiotowe (W2).
- Oblicz stężenie roztworu jedwabiu (w/v), korzystając z poniższego wzoru:
6. Przygotowanie tuszów do druku
- Przygotuj tusz A (objętość końcowa 1,5 mL), mieszając roztwór fibroiny (40 mg/mL), glikol polietylenowy 400 (PEG400; 14 mg/mL) oraz wodę dejonizowaną w celu wydrukowania głównego korpusu SPMSs.
- Aby wydrukować silnik katalityczny SPMSs, zmieszaj fibroinę (40 mg/mL), PEG400 (12 mg/mL), katalazę (6 mg/mL o aktywności katalitycznej >20 000 jednostek/mg) oraz wodę dejonizowaną, aby otrzymać 1,5 mL tuszu B.
- Przygotuj 1,5 mL tuszu C poprzez rozpuszczenie Coomassie brilliant blue (0,05 mg/mL) w metanolu.
UWAGA: Metanol jest stosowany w celu przekształcenia przypadkowych zwojów fibroiny w sztywne harmonijki beta poprzez wydrukowanie tuszu C na wierzchu tuszu A lub tuszu B. Coomassie brilliant blue służy do nadania SPMSs kontrastowego koloru, co ułatwia automatyczne śledzenie SPMSs podczas napędu.
7. Reaktywny druk 3D metodą atramentową
UWAGA: Drukarka atramentowa użyta w tych eksperymentach opiera się na urządzeniach do wyrzutu kropli z napędem piezoelektrycznym z dyszami szklanymi. Dostępnych jest na rynku kilka komercyjnych drukarek atramentowych do celów badawczych, które mogą powtórzyć te funkcje.
- Do drukowania tuszów na podłożu krzemowym umieszczonym na stole, przy odległości roboczej między dyszą a podłożem z wafla Si wynoszącej około 5 mm, należy użyć urządzeń do nanoszenia kropel (jetting devices) z dyszą o średnicy 80 μm. Kształty geometryczne SPMS są definiowane cyfrowo jako seria punktów współrzędnych X-Y w pliku arkusza kalkulacyjnego.
UWAGA: Drukarka odczytuje współrzędne szeregowo i pracuje zgodnie z nimi. Każdy punkt współrzędnych powoduje jednorazowe wyrzucenie kropli przez urządzenie do nanoszenia. Oddzielne pliki arkusza kalkulacyjnego są tworzone dla tuszów A i B (patrz Supplemental Files [SPMS Main Body.xlsx oraz SPMS Engine.xlsx]). - Należy wprowadzić trzy tusze (A, B i C) do trzech zbiorników (po 1,5 mL każdy), a następnie wyregulować ciśnienie wsteczne za pomocą zaworu ciśnienia wstecznego dla każdego osobnego kanału, aby upewnić się, że tusz nie wycieka z urządzeń do nanoszenia.
UWAGA: Wymagane są trzy urządzenia do nanoszenia na niezależnych kanałach. - Należy dostosować parametry nanoszenia (rise time 1, dwell time, fall time, eco time, rise time 2, idle voltage, dwell voltage, echo voltage) dla każdego kanału, aby zapewnić prawidłowe i stabilne formowanie kropel każdego tuszu (Rycina 2).
UWAGA: Parametry te zależą od urządzenia do nanoszenia oraz rodzaju tuszu i muszą być odpowiednio dostosowane. - Należy drukować warstwowo tusz z fibroiny jedwabnej, naprzemiennie z metanolem, na czystych, polerowanych podłożach z wafli Si: etap 1: drukowanie tuszu A (główny korpus); etap 2: drukowanie tuszu C (tusz utwardzający); etap 3: drukowanie tuszu B (tusz katalityczny dla miejsc silnika); etap 4: drukowanie tuszu C (tusz utwardzający); etap 5: powtórzenie etapów 1-4 dla wymaganej liczby warstw (np. 100).
UWAGA: W Supplemental Files zawarto dwa przykładowe projekty dla tych 4 etapów; plik SPMS Main Body.xlsx jest używany do etapu 1 i etapu 2, a plik SPMS Engine.xlsx do etapu 3 i etapu 4. - Należy wydrukować dwie serie fibroinowych SPMS o grubości odpowiednio 200 warstw i 100 warstw.
UWAGA: Silnik katalazowy znajduje się z boku jednego z końców każdego mieszadła. Zatem mieszadła posiadają jeden silnik katalityczny (patrz Rycina 1, obszar czerwony). - Aby zdjąć próbki z wafli Si, należy zanurzyć je w wodzie DI i delikatnie wstrząsać do momentu ich oddzielenia.
8. Pozyskiwanie/śledzenie danych i analiza trajektorii samobieżnych mieszadeł
- Oczyścić szklaną szalkę Petriego (o średnicy 9 cm) wodą dejonizowaną (DI), upewniając się, że powierzchnia jest wolna od kurzu.
- Po oczyszczeniu i osuszeniu, wlać do szalki Petriego 10 mL przefiltrowanego (0,45 μm) 5% w/v H2O2 i pozostawić do ustabilizowania. Oświetlić dno szalki Petriego zimnym białym źródłem światła diodowego (LED) i użyć kamery wysokiej prędkości z obiektywem makro, aby zarejestrować ruch z góry. Zapisywać filmy w formacie .avi.
UWAGA: Szczegóły dotyczące użytego sprzętu znajdują się w Tabeli materiałów. - Przemyć wydrukowane jedwabne mieszadła przez 10 min, zanurzając je w wodzie DI w celu usunięcia niezwiązanego PEG400. Ostrożnie pobrać jedno przemyte mieszadło końcówką sterylnej igły strzykawki i umieścić je w centrum szalki Petriego. W momencie, gdy przemyte mieszadło dotknie paliwa H2O2, wokół silnika zaczną tworzyć się pęcherzyki, a zaobserwowany zostanie ruch obrotowy mieszadła. Gdy system wyda się stabilny (zazwyczaj po 10−30 s), nacisnąć record w oprogramowaniu do rejestracji, aby rozpocząć nagrywanie wideo.
- Przeprowadzić śledzenie mikromieszadeł klatka po klatce, śledząc każdy koniec mieszadeł, zgodnie z punktami A i B wskazanymi na Rysunku 3.
UWAGA: Można to wykonać ręcznie lub przy użyciu oprogramowania do śledzenia. - Z uzyskanych danych śledzenia obliczyć prędkość chwilową między dwiema kolejnymi klatkami (np. 1 i 2), korzystając z poniższego równania, a następnie wyciągnąć średnią z uzyskanych prędkości z całej sekwencji, aby otrzymać średnią prędkość chwilową.
- Następnie obliczyć kąt orientacji φ. Potem wykorzystać szybkość zmiany φ do wyznaczenia prędkości obrotowej (Rysunek 3).
UWAGA: Przy obliczaniu prędkości chwilowych z danych obrazowych śledzenia ważne jest wykonanie wstępnego zdjęcia obiektu o znanych wymiarach, aby móc obliczyć prawidłowe wartości przelicznika pikseli na mikrometry. Wartości te będą zależeć od zastosowanej kamery, obiektywu i odległości. W zależności od rodzaju wydrukowanej cząstki, do obliczenia prędkości należy wybrać różne punkty śledzenia. Na przykład tutaj punkty śledzenia A, B i C (środek masy) są wszystkie wykorzystywane do wyznaczania prędkości chwilowych (Rysunek 3).
9. Charakterystyka SPMS za pomocą SEM
- Usunąć niewykorzystane i zużyte SPMS z wafla krzemowego lub roztworu objętościowego i przenieść je na 10 mm szerokie węglowe podkładki lepkie zamocowane na aluminiowych uchwytach do skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM). Przesuszyć próbki w suszarce przez 10 min w temperaturze 60 °C.
- Umieścić uchwyty z próbkami na stole napylacza. Napylić (plazma argonowa przy 0,05 Torr) 50–100 nm złota na próbki, zapewniając jednorodne pokrycie powierzchni próbki złotem.
- Wyjąć uchwyty z próbkami z napylacza i obrazować w SEM w próżni przy napięciu 5,0 kV.
UWAGA: Bardzo wysokie napięcia przyspieszające mogą przypalić jedwab i doprowadzić do powstania artefaktów.
Wyniki
Po zagotowaniu jedwabiu oczekuje się, że wysuszone włókna będą o około jedną trzecią lżejsze niż wcześniej, co wskazuje na skuteczne usunięcie serycyny. Podczas rozpuszczania jedwabiu w odczynniku Ajisawy włókna powinny zostać całkowicie rozpuszczone, a w wyniku procesu powinna zostać otrzymana żółta, lepka ciecz. Po dializie roztwór jedwabiu powinien być mniej lepki, lecz nadal wykazywać lekko żółty kolor. Jeśli jedwab zamienił się w żel, oznacza to, że rozpuszczanie nie przebiegło pomyślnie.
Stabilne krople tworzone przez urządzenia strumieniowe umożliwią uzyskanie wyższej rozdzielczości drukowanych próbek. Rysunek 2 przedstawia przykład stabilnej pojedynczej kropli, która zapewnia dobre wyniki drukowania, takie jak wydrukowane mieszadła jedwabne pokazane na Rysunku 4. W zależności od lepkości tuszu, rozprzestrzenianie się kropli na podłożu jest zjawiskiem normalnym.
W zależności od użytych drukarek atramentowych i wielkości kropli, odległość między poszczególnymi wydrukowanymi kroplami musi zostać dostosowana w taki sposób, aby nakładały się one na siebie, tworząc ciągłe linie. Jeśli krople będą zbyt oddalone, wydrukowana struktura ulegnie przerwaniu. Ponadto, jeśli wydrukuje się zbyt mało warstw, istnieje ryzyko pęknięcia mikromieszadeł po umieszczeniu ich w roztworze paliwa. Po zdjęciu mieszadeł z podłoża i ich przemyciu, umieszczenie ich w roztworze paliwa z nadtlenku wodoru powinno natychmiast spowodować powstawanie pęcherzyków. Skuteczność uwalniania pęcherzyków zależy w dużej mierze od aktywności enzymu; niska aktywność enzymu spowoduje powstanie mniejszej liczby pęcherzyków, co doprowadzi do słabych wyników napędu. Rysunek 5 pokazuje, jak morfologia powierzchni mieszadeł ulega zmianie w wyniku uwalniania pęcherzyków z wewnętrznych struktur, co prowadzi do powstania małych porów. Prawidłowo wykonany mikromieszadło będzie wyglądać podobnie do tych przedstawionych na Rysunku 6 oraz w dwóch Filmach Uzupełniających S1 i S2.
Rysunek 6 przedstawia klatki z nagrań wideo dwóch reprezentatywnych mikromieszadeł posiadających 100 warstw (Rysunek 6A) i 200 warstw (Rysunek 6B) w paliwie 5% H2O2. Linie czerwone i zielone wskazują śledzone trajektorie (patrz Filmy uzupełniające S1 i S2). Prędkość obrotową można wyznaczyć na podstawie szybkości zmiany orientacji (ɸ, Rysunek 3), jak pokazano na Rysunku 7. Porównanie mikromieszadeł domieszkowanych katalazą o strukturze 100 i 200 warstw wykazuje wyraźny wzrost prędkości obrotowej około 0,6-krotnie, z 60 ± 6 rpm do 100 ± 10 rpm (Rysunek 7).
Rycina 1: Schematyczna ilustracja katalitycznego rozkładu nadtlenku wodoru do wody i tlenu przez katalazę osadzoną w rusztowaniu mieszadła w wybranych miejscach (zaznaczonych na czerwono). Powstałe pęcherzyki tlenu zapewniają napęd niezbędny do poruszania mieszadłem. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 2: Obrazy z odstępami czasowymi przedstawiające tworzenie się kropli RSF z urządzenia wtryskowego (średnica dyszy 80 µm). Liczby poniżej obrazów reprezentują czas, który upłynął w mikrosekundach (µs), od momentu rozpoczęcia wtrysku kropli tuszu jedwabnego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 3: Schematyczne przedstawienie śledzenia cząsteczki w dwóch kolejnych klatkach. A i B oznaczają punkty śledzenia, a C oznacza środek masy. φ oznacza kąt orientacji. Kierunek trajektorii SPMS jest wskazany przez zakrzywioną czarną strzałkę. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 4: Mikrofotografia świetlna świeżo wydrukowanego metodą RIJ mikromieszadła (100 warstw) przed myciem. Czerwona ramka oznacza obszar domieszkowany katalazą (obszar silnika). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 5: Obrazy SEM głównego korpusu oraz części silnika katalazowego SPMS po utworzeniu się porów w wyniku uwalniania pęcherzyków. Na obrazach SEM SPMS wyraźnie widoczne są pory na powierzchni silnika powstałe w wyniku uwalniania pęcherzyków tlenu. (A) Jedwabne mikromieszadła przed ekspozycją na 5% w/v roztwór paliwa H2O2. (B) Jedwabne SPMS po ekspozycji na 5% w/v roztwór paliwa H2O2. Obrazy po prawej stronie stanowią powiększenia obszarów zaznaczonych na czerwono. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 6: Klatki wideo dwóch mikromieszadeł w 5% roztworze paliwa ukazujące trajektorię w czasie. (A) Mikromieszadła 100-warstwowe. (B) Mikromieszadła 200-warstwowe. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 7: Porównanie kąta orientacji (φ) dla mikromieszadeł 100-warstwowych (60 ± 6 rpm) i 200-warstwowych (100 ± 10 rpm). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Film uzupełniający S1: Reprezentatywny 100-warstwowy samoporuszający się mikromieszadło w 5% w/v H2O2 podczas napędu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Wideo uzupełniające S2: Reprezentatywny 200-warstwowy samoporuszający się mikromieszadło w 5% w/v H2O2 podczas napędu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Dyskusja
Kluczową cechą SPMS wytwarzanych w tym protokole jest zdolność do szybkiego i łatwego projektowania różnych kształtów i struktur za pomocą RIJ jedwabiu domieszkowanego enzymami, takimi jak katalaza, oraz osiągania ruchu napędzanego chemicznie za pomocą napędu pęcherzykowego5. To, w połączeniu z wysoką biokompatybilnością18 tych mieszadeł, sprawia, że są one bardzo pożądane w przyszłych zastosowaniach zarówno w wyzwaniach związanych z remediacją wody, jak i w zastosowaniach lab-on-a-chip w medycznych urządzeniach diagnostycznych.
W tym przypadku zdolność napędowa jest demonstrowana poprzez wykorzystanie prostej konstrukcji liniowej z częścią silnika wydrukowaną z boku, jak pokazano na rysunku 1. Czerwone kropki reprezentują katalitycznie aktywne części silnika domieszkowane katalazą, a niebieskie kropki reprezentują części nieaktywne. Aby móc generować kształty 3D za pomocą RIJ, konieczne jest wydrukowanie wielu warstw w celu wygenerowania wysokości osi z. W tym przypadku liczba warstw osadzonych na płytce krzemowej wynosiła 100 i 200. Zmieniając liczbę warstw, można uzyskać różnicę w prędkości/rotacji napędu porównywalną do osadzania podwójnej ilości materiału. Aby uzyskać dobrze zdefiniowane struktury podczas drukowania atramentowego, ważne jest, aby wybrać odpowiednie parametry natryskiwania w celu uzyskania dobrze zdefiniowanej kropli, jak pokazano na rysunku 2. Parametry te będą się różnić w zależności od użytego atramentu i urządzeń natryskowych. Jeśli atrament nie wytwarza stabilnych kropel, najprawdopodobniej nie nadaje się już do drukowania i najprawdopodobniej zaczyna zamieniać się w żel. Ważne jest, aby pamiętać, że limit rozdzielczości silnie zależy od rozmiaru użytej dyszy, a mniejsze dysze pozwalają na drukowanie wyższych rozdzielczości i mniejszych struktur/cząstek.
Przykład mieszadła jedwabnego drukowanego przez RIJ pokazano na rysunku 4, gdzie część silnika z domieszką katalazy (oznaczona czerwonym obszarem) jest przymocowana z boku korpusu głównego (szczegóły można również zobaczyć na schemacie na rysunku 1). Drukowane rusztowanie jedwabne jest materiałem, który pozwala na dyfuzję roztworu paliwowego po całej strukturze 3D, a co za tym idzie, podczas rozkładu nadtlenku wodoru za pomocą katalazy powstają pęcherzyki tlenu. Uwalniane pęcherzyki tlenu wytwarzają pory w skali mikronowej w strukturze rusztowania jedwabnego, co można zobaczyć, porównując mikrofotografie SEM przed ekspozycją na paliwo H2O2 (Rysunek 5A) i po ekspozycji na H2O2 (Rysunek 5B). W celu zapewnienia, że ruch jest spowodowany rozkładem paliwaH2O2, ale nie napięciem powierzchniowym napędzanym przez zwolnienie PEG 400, ważne jest, aby mieszadła były początkowo zanurzone w wodzie na okres co najmniej 10 minut i badane w wodzie demineralizowanej pod kątem ruchu napięcia powierzchniowego przed uruchomieniem w roztworze paliwowym.
Zastosowanie PEG400 pozwala na lepsze uwalnianie pęcherzyków z powierzchni jedwabiu19 , jak wcześniej wyjaśnili Gregory i wsp.5 , ale może również powodować powstanie napędu napędzanego napięciem powierzchniowym, co może być pożądane w zależności od zastosowania, jak opisano wcześniej20. Ten drugi mechanizm daje również możliwość wytwarzania SPMS z dwoma mechanizmami, które są zależne od czasu i mogą być korzystne dla niektórych zastosowań, które na przykład oczekują początkowego energicznego mieszania na początku, a następnie wolniejszego dalszego mieszania przez dłuższy czas20.
Podsumowując, wykorzystując RIJ do produkcji autonomicznych urządzeń samojezdnych, można łatwo zaprojektować i wydrukować szeroką gamę kształtów i rozmiarów. Jedwab jako materiał bazowy dla urządzeń daje możliwości łatwego hermetyzowania enzymów i innych ugrupowań w strukturach, dając możliwość dodawania funkcji do tych urządzeń.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy chcieliby podziękować za wsparcie ze strony EPSRC poprzez nagrody X. Zhao's reactive inkjet printing of silk materials awards (EP/N007174/1 i EP/N023579/1), S. J. Ebbens Career Acceleration Fellowship oraz Healthcare Technology Impact Fellowship (EP/J002402/1 i EP/N033736/1). Autorzy dziękują również dr Qingyou Xia z Państwowego Kluczowego Laboratorium Biologii Genomu Jedwabników na Uniwersytecie Południowo-Zachodnim w Chinach za dostarczenie jedwabnych kokonów.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Węglan sodu | Alfa Aesar | 11552 | bezwodny, 99,5%, granulowany |
| Chlorek wapnia | Fluka Analytical | C1016 | bezwodny, >93%, granulowany |
| Etanol | Fisher Scientific | 10542382 | klasa HPLC |
| PEG-400 | Aldrich Chemistry | 202398 | średnia Mn 400, tetramer mol wt ~250 kDa |
| Jednostki Catalase | Sigma Life Science | E3289 | >20K |
| Metanol | Acros Organics | 268280025 | |
| Nadtlenek wodoru | Sigma Aldrich | 31642 | 30% (w/w) |
| Silk | Southwest University, Chiny | NA | Surowo oczyszczone kokony jedwabne, rurki |
| do dializy | Sigma Aldrich | D9777 | Celuloza, średnia, szerokość płaska 25 mm, Typowa granica masy cząsteczkowej = 14000 |
| Fisherbrand Hoffman Clips | Fisher Scientific | 12744396 | Klipsy używane do zamykania końcówek rurek dializacyjnych |
| Si-Wafer | Sigma Aldrich | 647535 | Używany jako podłoże drukarskie |
| Balance | OHAUS Pioneer | PA214C | Waga analityczna |
| Miernik przewodności | Mettler Toledo | FG3 | Przenośny miernik przewodności Mettler Toledo FiveGo |
| Wirówka Thermo | Scientific | 10355052 | Fresk Heraeus Biofuge sprzedawany przez Thermo Scientific |
| Płyta grzewcza | Stuart | US152 | Stuart US152 Mieszadło magnetyczne Stuart US152 |
| PixeLink | PL-D732CU-T | Szybki kolorowy | |
| obiektyw | do kameryNavitar | Navitar 1-60135 | |
| Urządzenia do natryskiwania | Zoom Microfab Technologies Inc. | MJ-AT-01-40-8MX | Średnica dyszy 80um Urządzenie natryskowe |
| MJ-AT-01-80-8MX | Średnica dyszy 80um Urządzenie | ||
| Lightpad | AGPTEK | UN-HL0245-EUUN | Światło do eksperymentu pływackiego |
| Pipety | Eppendorf | 3123000063 | jednokanałowe, zmienne, 100 – 1 000 &mikro; L, niebieski |
| 3123000055 | jednokanałowy, zmienny, 20 – 200 &mikro; L, żółty | ||
| Mikroskop | Nikon | LV100ND | Ręczny, pionowy mikroskop |
| SEM | Fei | F50 | Używany do skaningowych mikrofotografii elektronowych |
Bibliografia
- Gregory, D. A., Campbell, A. I., Ebbens, S. J. Effect of Catalyst Distribution on Spherical Bubble Swimmer Trajectories. The Journal of Physical Chemistry C. 119 (27), 15339-15348 (2015).
- Paxton, W. F., et al. Catalytic Nanomotors: Autonomous Movement of Striped Nanorods. Journal of the American Chemical Society. 126 (41), 13424-13431 (2004).
- Gao, W., et al. Seawater-driven magnesium based Janus micromotors for environmental remediation. Nanoscale. 5 (11), 4696-4700 (2013).
- Li, J., et al. Water-Driven Micromotors for Rapid Photocatalytic Degradation of Biological and Chemical Warfare Agents. ACS Nano. 8 (11), 11118-11125 (2014).
- Gregory, D. A., Zhang, Y., Smith, P. J., Zhao, X., Ebbens, S. J. Reactive Inkjet Printing of Biocompatible Enzyme Powered Silk Micro-Rockets. Small. 12 (30), 4048-4055 (2016).
- Ismagilov, R. F., Schwartz, A., Bowden, N., Whitesides, G. M. Autonomous movement and self-assembly. Angewandte Chemie-International Edition. 41 (4), 652-654 (2002).
- Li, T., et al. Highly Efficient Freestyle Magnetic Nanoswimmer. Nano Letters. 17 (8), 5092-5098 (2017).
- Barbot, A., Decanini, D., Hwang, G. Controllable Roll-to-Swim motion transition of helical Nanoswimmers. 2014 IEEE/RSJ International Conference on Intelligent Robots and Systems. , 4662-4667 (2014).
- Xuan, M., et al. Near Infrared Light-Powered Janus Mesoporous Silica Nanoparticle Motors. Journal of the American Chemical Society. 138 (20), 6492-6497 (2016).
- Garcia-Gradilla, V., et al. Functionalized ultrasound-propelled magnetically guided nanomotors: toward practical biomedical applications. ACS Nano. 7 (10), 9232-9240 (2013).
- Baraban, L., et al. Catalytic Janus Motors on Microfluidic Chip: Deterministic Motion for Targeted Cargo Delivery. ACS Nano. 6 (4), 3383-3389 (2012).
- Ghalanbor, Z., Marashi, S. -A., Ranjbar, B. Nanotechnology helps medicine: Nanoscale swimmers and their future applications. Medical Hypotheses. 65 (1), 198-199 (2005).
- Lu, Q., et al. Water-Insoluble Silk Films with Silk I Structure. Acta Biomaterialia. 6 (4), 1380-1387 (2010).
- Wilson, D., Valluzzi, R., Kaplan, D. Conformational Transitions in Model Silk Peptides. Biophysical Journal. 78 (5), 2690-2701 (2000).
- Fink, T. D., Zha, R. H. Silk and Silk-Like Supramolecular Materials. Macromolecular Rapid Communications. 0 (0), 1700834(2018).
- Chelikani, P., Fita, I., Loewen, P. C. Diversity of structures and properties among catalases. Cellular and Molecular Life Sciences CMLS. 61 (2), 192-208 (2004).
- Ajisawa, A. Dissolution of silk fibroin with calciumchloride/ethanol aqueous solution. Journal of Sericultural Science of Japan. 67 (2), 91-94 (1998).
- Zhang, Y., Gregory, D. A., Smith, P. J., Zhao, X. Regenerated silk fibroin as an inkjet printable biomaterial. Printing For Fabrication (NIP). , Society for Imaging Science and Technology. Manchester. 406-409 (2016).
- Gregory, D. A., Zhang, Y., Smith, P. J., Ebbens, S. J., Zhao, X. Altering the Bubble Release of Reactive Inkjet Printed Silk Micro-rockets. Printing For Fabrication (NIP). , Society for Imaging Science and Technology. Manchester. 452-456 (2016).
- Zhang, Y., et al. Reactive Inkjet Printing of Functional Silk Stirrers for Enhanced Mixing and Sensing. Small. , e1804213(2018).
Przedruki i uprawnienia
