Method Article

Identyfikacja nowych substratów kinazy CK2 przy użyciu wszechstronnego podejścia biochemicznego

DOI:

10.3791/59037

⸱

February 21st, 2019

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Drexel University College of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem tego protokołu jest etykietowanie, wzbogacanie i identyfikowanie substratów kinazy białkowej CK2 ze złożonej próbki biologicznej, takiej jak lizat komórkowy lub homogenat tkankowy. W tym celu metoda ta wykorzystuje unikalne aspekty biologii CK2

.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie relacji kinaza-substrat jest niezbędne do pełnego zrozumienia funkcji tych enzymów i ich dalszych celów zarówno w stanach fizjologicznych, jak i patologicznych. CK2 jest ewolucyjnie konserwatywną kinazą serynowo-treoninową z rosnącą listą setek substratów zaangażowanych w wiele procesów komórkowych. Ze względu na jego właściwości plejotropowe, identyfikacja i scharakteryzowanie kompleksowego zestawu substratów CK2 było szczególnie trudne i pozostaje przeszkodą w badaniach nad tym ważnym enzymem. Aby sprostać temu wyzwaniu, opracowaliśmy wszechstronną strategię eksperymentalną, która umożliwia ukierunkowane wzbogacenie i identyfikację przypuszczalnych substratów CK2. Protokół ten wykorzystuje unikalną specyficzność CK2 dla podwójnego kosubstratu, co pozwala na specyficzną tiofosforylację jego substratów w lizacie komórkowym lub tkankowym. Te białka substratowe są następnie alkilowane, immunoprecypitowane i identyfikowane za pomocą chromatografii cieczowej/tandemowej spektrometrii mas (LC-MS/MS). Wcześniej stosowaliśmy to podejście, aby z powodzeniem zidentyfikować substraty CK2 z jajników Drosophila, a tutaj rozszerzamy zastosowanie tego protokołu do ludzkich komórek glejaka, ilustrując zdolność adaptacyjną tej metody do badania biologicznych ról tej kinazy w różnych organizmach modelowych i systemach eksperymentalnych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kinazy białkowe są kluczowymi składnikami kaskad transdukcji sygnału. Fosforylacja białek substratowych przez te enzymy wywołuje reakcje biologiczne, które regulują krytyczne zdarzenia kontrolujące między innymi podział, metabolizm i różnicowanie komórek. CK2 to wszechobecna, kwasofilna kinaza serynowo-treoninowa, która jest konserwowana od drożdży do ludzi i która odgrywa ważną rolę w wielu procesach komórkowych, od regulacji transkrypcji po progresję cyklu komórkowego do apoptozy1,2,3. Enzym jest heterotetramerem złożonym z dwóch katalitycznych podjednostek α (lub α') i dwóch podjednostek regulatorowych β4. Oprócz tego, że jest wysoce plejotropowy, CK2 wykazuje dwie inne niezwykłe cechy, które komplikują jego analizę, a mianowicie aktywność konstytutywną5 i specyficzność podwójnego kosubstratu6. Ta ostatnia właściwość nadaje CK2 zdolność do wykorzystywania GTP, a także ATP do fosforylacji białek substratowych.

Genetyczna delecja podjednostek katalitycznych lub regulatorowych CK2 u myszy powoduje śmiertelność embrionalną, co wskazuje, że odgrywa ona kluczową rolę podczas rozwoju i organogenezy7,8. CK2 ulega również nadekspresji w kilku typach raka, a zatem stanowi obiecujący cel terapeutyczny9,10,11. Rzeczywiście, specyficzne inhibitory, które celują w aktywność kinazy CK2, są obecnie badane w tym celu12,13,14. Chociaż hamowanie CK2 jest realną opcją, biorąc pod uwagę jego plejotropowy charakter, alternatywnym i być może bardziej racjonalnym podejściem byłoby celowanie w krytyczne substraty CK2, które leżą u podstaw progresji niektórych nowotworów. W związku z tym kompleksowa identyfikacja i charakterystyka białek substratowych CK2 byłaby istotna dla wyjaśnienia specyficznych funkcji tej kinazy w określonej tkance lub typie nowotworu.

Tutaj opisujemy wszechstronną metodę biochemiczną do identyfikacji substratów CK2 ze złożonej próbki biologicznej, takiej jak lizat komórkowy lub tkankowy. Protokół ten wykorzystuje swoistość CK2 dla podwójnego kosubstratu przy użyciu analogu GTP GTPγS (5'-[γ-tio]trifosforanu guanozyny), którego inne kinazy endogenne nie mogą wykorzystać. To skutecznie pozwala kinazie "oznaczyć" swoje substraty w tej próbce w celu późniejszej izolacji i identyfikacji.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Upewnij się, że wymagane materiały są dostępne i odpowiednio przygotowane (patrz Tabela materiałów).

1. Przygotowanie

  1. Mechanicznie lizować próbkę tkanki (1-2 mg tkanki w 100 μl buforu do lizy, tabela 1) lub hodowane komórki (10 cm płytka, która w 80-90% zlewa się w 350 μl buforu do lizy), w celu zebrania łącznie 900 μl próbki do eksperymentu. Zauważ, że ta objętość jest nieznacznie większa niż wymagana do eksperymentu opisanego poniżej.
  2. Odwirować próbki przez odwirowanie w temperaturze 17 500 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C. Po zakończeniu przenieść 270 μl supernatantu do każdej z trzech nowych probówek mikrowirówek o pojemności 1,7 ml. Pozostanie około 90 μL. Usunąć 40 μl, które mają być użyte jako "kontrola wejściowa" i umieścić w nowej probówce. Umieść wszystkie próbki na lodzie.

2. Test kinazy: tiofosforylacja i alkilacja

  1. Oznaczyć trzy probówki zawierające 270 μl każda w następujący sposób: "kinaza rxn", "tylko GTPγS" i "tylko PNBM (p-nitrobezyl mezylan)". Przygotuj reakcje kinazy.
    1. Do probówki "kinaza rxn" dodaj 2,7 μl (co odpowiada 1,350 U) CK2, a następnie dodaj 2,7 μl 2,5 mM GTPγS.
    2. Do probówki "Tylko GTPγS" dodaj 2,7 μl z 2,5 mM GTPγS, a następnie dodaj 2,7 μl buforu do lizy.
    3. Do probówki "Tylko PNBM" dodać 5,4 μl buforu do lizy. Przesuń wszystkie probówki, aby się wymieszać, a następnie natychmiast umieść na lodzie.
  2. Inkubować wszystkie trzy probówki przez 1 minutę w łaźni wodnej o temperaturze 30 °C. Po inkubacji dodać 13,5 μl 12 mg/ml PNBM do wszystkich trzech probówek. Odwróć, aby wymieszać próbki. Próbki te należy inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
  3. Po rozpoczęciu inkubacji w kroku 2.2 należy jak najszybciej przygotować kolumny odsalające, ponieważ proces ten trwa około 45 minut.

3. Przygotowanie kolumn odsalających

  1. Początkowo przygotuj kolumny (3 w tym przykładowym eksperymencie), odwracając każdą kolumnę kilka razy, aby ponownie zawiesić żywicę Sephadex G-25 w buforze pamięci. Pozwól, aby żywica osiadła, mocując każdą kolumnę do clamp stand i pozwól jej siedzieć w spokoju przez około 5 minut.
  2. Po osadzeniu się żywicy Sephadex G-25 należy zdjąć zaślepki zarówno z góry, jak i z dołu kolumny, aby umożliwić grawitacyjne opróżnienie bufora magazynowego i umieścić rurkę poniżej dolnego otworu, aby zebrać przepływ w celu wyrzucenia.
  3. Po wyczerpaniu buforu do przechowywania dodać około 2,7 ml buforu do lizy w celu zrównoważenia kolumn. Zebrać przepływ i wyrzucić. Powtórz 3 razy. Po końcowej równoważności kolumny są gotowe do kroku 4.1.

4. Usunięcie PNBM

  1. Po zakończeniu 1 godzinnej inkubacji (etap 2.2) i przygotowania kolumny (etap 3) należy nałożyć próbki do kolumn. Oznacz każdą kolumnę w następujący sposób: "kinaza rxn", "tylko GTPγS" i "tylko PNBM". Załaduj całą każdą próbkę do odpowiedniej kolumny. Zbierz i wyrzuć przepływ.
  2. Przepłukać próbki, dodając 420 μl buforu do lizy do każdej kolumny. Pozwolić, aby bufor do lizy przefiltrował się przez kolumnę i zebrał przepływ w celu odrzucenia. Po tym etapie mycia umieść probówki w odpowiednim miejscu do pobrania próbek.
  3. Eluować próbki, dodając 500 μl buforu do lizy do każdej kolumny. Zbierz przepływ, który teraz zawiera tiofosforylowane i alkilowane substraty CK2.

5. Immunoprecypitacja: Część I

  1. Przygotować próbki do immunoprecypitacji, usuwając najpierw 80 μl próbki "kontrolnej wejścia elucji" z każdej z odpowiednich elucji ("kinaza rxn", "tylko GTPγS" i "tylko PNBM") zebranych w kroku 4.3. Po usunięciu 80 μl z każdej próbki, pozostanie około 420 μl na próbkę.
    1. Podzielić każdą próbkę na 2 probówki zawierające 200 μl każda. Oznacz każdą odpowiednią probówkę: "ester antytiofosforanowy kinazy rxn", "kinaza rxn IgG", "ester antytiofosforanowy GTPγS", "GTPγS IgG", "ester antytiofosforanowy PNBM" i "PNBM IgG".
  2. Dodać 2,8 μg przeciwciała antytiofosforanowego estru do każdej z probówek znakowanych estrami antytiofosforanowymi i 2,8 μg przeciwciała kontrolnego izotypu do każdej z probówek znakowanych IgG. Umieścić probówki na rotatorze w temperaturze 4 °C na 2 godziny.
  3. Przygotowanie kulki białkowej A/G należy rozpocząć w ciągu ostatnich 15 minut 2-godzinnej inkubacji w kroku 5.2.

6. Białko A/G preparat kulek agarozy

    Krótko przekręć
  1. rurkę do przechowywania, aby upewnić się, że koraliki są całkowicie ponownie zawieszone. Odetnij koniec końcówki pipety P200 za pomocą czystej żyletki, aby zwiększyć rozmiar miernika. Odpipetować 100 μl zawiesiny perełkowej na immunoprecypitację do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,7 ml. W tym przykładzie potrzebnych jest łącznie 6 rurek.
  2. Odwirować probówki o sile 17 500 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i wyrzucić. Ponownie zawiesić kulki w 200 μl buforu do lizy i krótko zawirować. Powtórz kroki wirowania i prania 3 razy.
  3. Po ostatnim umyciu umieść koraliki na lodzie, aż inkubacja w kroku 5.2 zostanie zakończona.

7. Immunoprecypitacja: Część II

  1. Po 2 godzinach inkubacji od etapu 5.2 odwirowywać próbki w temperaturze 17 500 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C. Po odwirowaniu dodać 200 μl z każdej próbki do probówek z przemytymi kulkami. Umieścić probówki na rotatorze w temperaturze 4 °C na 1 godzinę.
  2. Po 1 godzinnej inkubacji odwirować probówki o stężeniu 17 500 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C. Następnie usuń 40 μl supernatantu z każdej próbki i zachowaj jako "kontrolę zubożenia" (łącznie 6 probówek). Usunąć pozostałą część supernatantu i wyrzucić. Uważaj, aby nie naruszyć koralików.
  3. Przemyć próbki, dodając 200 μl buforu do lizy i krótko wirując. Następnie odwirować przy 17 500 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i wyrzucić. Powtórz kroki prania i wirowania 3 razy. Uważaj, aby nie przeszkadzać koralikom podczas tych czynności.
  4. Po zakończeniu etapów płukania dodać 50 μl 2x buforu do każdej próbki zawierającej kulki. Dla wszystkich innych próbek dodać 8 μl 6-krotnego buforu próbki: "kontrola wejściowa", "kontrola wejścia elucji" i "kontrola zubożenia".
  5. Po dodaniu buforu do probówek, pipetować w górę i w dół, aby wymieszać, a następnie podgrzewać wszystkie próbki w temperaturze 95 °C przez 5 minut przed przystąpieniem do SDS-PAGE.

8. Analiza/Walidacja wyników

  1. Walidacja udanej tiofosforylacji i alkilacji zależnej od CK2.
    1. Aby określić skuteczność tiofosforylacji za pośrednictwem CK2 w kroku 2.2, należy przeprowadzić SDS-PAGE i Western blot, uruchamiając 15-20 μl "kontrolnych danych wejściowych elucji" zebranych w kroku 5.1 na 12,5% żelu poliakrylamidowym.
    2. Membrany sondy z następującymi przeciwciałami: ester antytiofosforanowy, anty-CK2α i anty-GAPDH (lub inna odpowiednia kontrola obciążenia). Jeśli ten krok się powiódł, wzmocniony sygnał estru antytiofosforanowego powinien być widoczny na torze "kinazy rxn" w porównaniu z pozostałymi dwoma pasami (Rysunek 2).
  2. Wizualizacja wzbogaconych przypuszczalnych substratów CK2 i określenie tożsamości białka.
    1. Aby ocenić, czy etapy immunoprecypitacji zakończyły się sukcesem, należy przeprowadzić 25-30 μl próbek eluowanych z kulek w kroku 7.4 na oddzielnym 12,5% żelu poliakrylowym. Upewnij się, że cały sprzęt jest czysty i przez cały czas noś rękawice, aby zminimalizować zanieczyszczenie.
    2. Zabarwić żel kolorem Coomassie na niebiesko, aby uwidocznić wzbogacone białka z różnych etapów protokołu eksperymentalnego (Rysunek 3). Używając nowych żyletek, ostrożnie wyciąć unikalne prążki obecne na pasie "kinazy rxn anty-tiofosforan ester IP", zwracając uwagę na ich przybliżoną masę cząsteczkową.
    3. Prześlij te pasma do identyfikacji białek za pomocą chromatografii cieczowej/tandemowej spektrometrii mas (LC-MS/MS) (Rysunek 4). Jeśli dostępne są przeciwciała skierowane przeciwko zidentyfikowanym białkom, potwierdź wyniki spektrometrii mas za pomocą SDS-PAGE i immunoblottingu frakcji wejściowych, zubożonych i IP pobranych w trakcie trwania protokołu (Rysunek 4).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Schemat procedury eksperymentalnej znajduje się w Rysunek 1. Podstawą tej techniki jest niezwykła zdolność CK2 do wykorzystania GTP do przenoszenia grup fosforylowych. Dodanie egzogennego holoenzymu CK2 wraz z analogiem GTP, GTPγS, do lizatu komórkowego powoduje tiofosforylację endogennych substratów CK2. Późniejsze traktowanie lizatu odczynnikiem alkilującym mezylan p-nitrobenzylu (PNBM) generuje ugrupowanie estru tiofosforanowego na tych specyficzn...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym miejscu opisujemy stosunkowo prostą metodę biochemiczną identyfikacji substratów kinazy białkowej CK2 ze złożonej próbki biologicznej. Krytyczne etapy tego protokołu opierają się na niezwykłych właściwościach enzymatycznych CK2 i obejmują zależną od CK2 tiofosforylację specyficznych białek substratowych przy użyciu GTPγS oraz ich późniejszą immunoprecypitację i identyfikację. Dzięki tym wynikom wykazaliśmy użyteczność i wszechstronność tego podejścia, ponieważ teraz zastosowaliśmy tę strategię zarówno w lu...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była częściowo wspierana przez grant Commonwealth Universal Research Enhancement z Departamentu Zdrowia Pensylwanii dla T.I.S.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
12 mg/ml PNBMAbcamab13891040,5 &mikro; L
2,5 mM GTPγ SSigma-AldrichG8634-1MG5.4 i mikro; L
Anty-CK2 i alfa; (E-7) mysie przeciwciało monoklonalneSanta Cruz Biotechnologysc-3738941:1000 dla
mysiego przeciwciała monoklonalnego Western blotting Anti-GAPDH (6C5)Santa Cruz Biotechnologysc-322331:1000 dla Western blot
Przeciwciało poliklonalne królika antynukleolinyAbcamab227581:1000 dla Western blotting
Ester antytiofosforanowy [51-8] Przeciwciałomonoklonalne królikaAbcamab92570Zmienia się (stężenie końcowe 2,8 &mikro; g dla każdej próbki)
Wirówka wstępnie ustawiona na 4º CThermoScientificSorvall Legend Micro 21R Cat# 75-772-436 
cOmplete Mini Inhibitor Proteazy Wolny od EDTARoche11836170001
Bufor do lizyZobacz przepis poniżejZobacz przepis poniżej 30ml
Normalne królicze przeciwciało IgG (kontrola izotypu)Technologia sygnalizacji komórkowej2729S Waha się (stężenie końcowe 2,8 &mikro; g dla każdej próbki)
PD MiniTrap KolumnaGE Healthcare28-9180-103 kolumny
Białko A/G Plus Koraliki agarozoweSanta Cruz Biotechnologysc-2003600 µ L
Rekombinowany ludzki holoenzym CK2New England BiolabsP6010S2,7 i mikro; L
RotatorLabnet: Mini LabrollerMini Labroller SKU# H5500
T98G ludzkie komórki glejakaATCCCRL-1690
Łaźnia wodna wstępnie ustawiona na 30º CShel LabH20 Seria wanien Model# SWB15

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Litchfield, D. W. Protein kinase CK2: structure, regulation and role in cellular decisions of life and death. Biochemical Journal. 369 (Pt 1), 1-15 (2003).
  2. Ahmed, K., Gerber, D. A., Cochet, C. Joining the cell survival squad: an emerging role for protein kinase CK2). Trends in Cell Biology. 12 (5), 226-230 (2002).
  3. Meggio, F., Pinna, L. A. One-thousand-and-one substrates of protein kinase CK2. The FASEB Journal. 17 (3), 349-368 (2003).
  4. Niefind, K., Guerra, B., Ermakowa, I., Issinger, O. G. Crystal structure of human protein kinase CK2: insights into basic properties of the CK2 holoenzyme. The EMBO Journal. 20 (19), 5320-5331 (2001).
  5. Sarno, S., Ghisellini, P., Pinna, L. A. Unique activation mechanism of protein kinase CK2. The N-terminal segment is essential for constitutive activity of the catalytic subunit but not of the holoenzyme. Journal of Biological Chemistry. 277 (25), 22509-22514 (2002).
  6. Niefind, K., Putter, M., Guerra, B., Issinger, O. G., Schomburg, D. GTP plus water mimic ATP in the active site of protein kinase CK2. Nature Structural & Molecular Biology. 6 (12), 1100-1103 (1999).
  7. Lou, D. Y., et al. The alpha catalytic subunit of protein kinase CK2 is required for mouse embryonic development. Molecular and Cellular Biology. 28 (1), 131-139 (2008).
  8. Buchou, T., et al. Disruption of the regulatory beta subunit of protein kinase CK2 in mice leads to a cell-autonomous defect and early embryonic lethality. Molecular and Cellular Biology. 23 (3), 908-915 (2003).
  9. Chua, M. M., et al. CK2 in Cancer: Cellular and Biochemical Mechanisms and Potential Therapeutic Target. Pharmaceuticals (Basel). 10 (1), (2017).
  10. Tawfic, S., et al. Protein kinase CK2 signal in neoplasia. Histology and Histopathology. 16 (2), 573-582 (2001).
  11. Hanif, I. M., Hanif, I. M., Shazib, M. A., Ahmad, K. A., Pervaiz, S. Casein Kinase II: an attractive target for anti-cancer drug design. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 42 (10), 1602-1605 (2010).
  12. Siddiqui-Jain, A., et al. CX-4945, an orally bioavailable selective inhibitor of protein kinase CK2, inhibits prosurvival and angiogenic signaling and exhibits antitumor efficacy. Cancer Research. 70 (24), 10288-10298 (2010).
  13. Chon, H. J., Bae, K. J., Lee, Y., Kim, J. The casein kinase 2 inhibitor, CX-4945, as an anti-cancer drug in treatment of human hematological malignancies. Frontiers in Pharmacology. 6, 70(2015).
  14. Perea, S. E., et al. CIGB-300, a novel proapoptotic peptide that impairs the CK2 phosphorylation and exhibits anticancer properties both in vitro and in vivo. Molecular and Cellular Biochemistry. (1-2), 163-167 (2008).
  15. Xiao, S., et al. Induced expression of nucleolin phosphorylation-deficient mutant confers dominant-negative effect on cell proliferation. PLoS One. 9 (10), e109858(2014).
  16. Shi, Y., Brown, E. D., Walsh, C. T. Expression of recombinant human casein kinase II and recombinant heat shock protein 90 in Escherichia coli and characterization of their interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (7), 2767-2771 (1994).
  17. Mollapour, M., Tsutsumi, S., Kim, Y. S., Trepel, J., Neckers, L. Casein kinase 2 phosphorylation of Hsp90 threonine 22 modulates chaperone function and drug sensitivity. Oncotarget. 2 (5), 407-417 (2011).
  18. McMillan, E. A., et al. The protein kinase CK2 substrate Jabba modulates lipid metabolism during Drosophila oogenesis. Journal of Biological Chemistry. 293 (8), 2990-3002 (2018).
  19. Turowec, J. P., et al. Protein kinase CK2 is a constitutively active enzyme that promotes cell survival: strategies to identify CK2 substrates and manipulate its activity in mammalian cells. Methods in Enzymology. , 471-493 (2010).
  20. Rusin, S. F., Adamo, M. E., Kettenbach, A. N. Identification of Candidate Casein Kinase 2 Substrates in Mitosis by Quantitative Phosphoproteomics. Frontiers in Cell and Developmental Biologyl. 5, 97(2017).
  21. Bian, Y., et al. Global screening of CK2 kinase substrates by an integrated phosphoproteomics workflow. Scientific Reports. 3, 3460(2013).
  22. Franchin, C., et al. Quantitative analysis of a phosphoproteome readily altered by the protein kinase CK2 inhibitor quinalizarin in HEK-293T cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1854 (6), 609-623 (2015).
  23. Franchin, C., et al. Re-evaluation of protein kinase CK2 pleiotropy: new insights provided by a phosphoproteomics analysis of CK2 knockout cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (11), 2011-2026 (2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

CK2 SubstratesKinase AssayThiophosphorylationLC MS MSImmunoprecipitationGTPgammaS LabelingSephadex G 25Anti Thiophosphate EsterProtein IdentificationWestern Blot

Related Articles