Artykuł metodologiczny

Analiza wskaźnika zużycia tlenu w pierwotnych kardiomiocytach noworodków myszy z hodowlą pierwotną przy użyciu analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego

DOI:

10.3791/59052

⸱

13 lutego 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Cardiology, Department of Medicine, University of California San Diego, 2Department of Pharmacology, University of California San Diego, 3Cardiology Section, Department of Medicine, Veterans Administration Healthcare, San Diego

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem tego protokołu jest zilustrowanie, jak używać mysich noworodków kardiomiocytów jako systemu modelowego do badania, jak różne czynniki mogą wpływać na zużycie tlenu w sercu.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitochondria i metabolizm oksydacyjny są kluczowe dla utrzymania funkcji mięśnia sercowego. Badania wykazały, że dysfunkcja mitochondriów jest ważnym czynnikiem przyczyniającym się do upośledzenia funkcji serca w niewydolności serca. Natomiast przywrócenie wadliwej funkcji mitochondriów może mieć korzystny wpływ na poprawę funkcji serca w niewydolności serca. W związku z tym badanie mechanizmów regulacyjnych i zidentyfikowanie nowych regulatorów funkcji mitochondriów może dostarczyć informacji, które można wykorzystać do opracowania nowych celów terapeutycznych w leczeniu chorób serca. W tym przypadku oddychanie mitochondrialne miocytów serca jest analizowane przy użyciu unikalnego systemu hodowli komórkowych. Po pierwsze, zoptymalizowano protokół umożliwiający szybką izolację i hodowlę kardiomiocytów noworodków myszy o wysokiej żywotności. Następnie stosuje się 96-dołkowy analizator strumienia zewnątrzkomórkowego do oceny wskaźnika zużycia tlenu przez te kardiomiocyty. W przypadku tego protokołu zoptymalizowaliśmy warunki wysiewu i wykazaliśmy, że tempo zużycia tlenu przez kardiomiocyty noworodków myszy można łatwo ocenić w analizatorze strumienia zewnątrzkomórkowego. Na koniec zauważamy, że nasz protokół można zastosować do większego rozmiaru hodowli i innych badań, takich jak sygnalizacja wewnątrzkomórkowa i analiza funkcji skurczu.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby utrzymać ciągłą funkcję skurczu serca, kardiomiocyty muszą utrzymywać stały dopływ energii komórkowej, głównie w formie ATP1. W sercu około 95% ATP jest generowane przez mitochondria, głównie poprzez fosforylację oksydacyjną, co pokazuje, że mitochondria odgrywają kluczową rolę bioenergetyczną w funkcjonowaniu serca2,3. Za tym poglądem przemawia fakt, że rozregulowanie funkcji mitochondriów może prowadzić do kardiomiopatii i niewydolności serca4,5. I odwrotnie, wykazano, że przywrócenie funkcji mitochondriów poprawia czynność serca w niewydolności serca6,7. Dlatego badanie mechanizmu bioenergetyki mitochondrialnej i identyfikacja nowych regulatorów funkcji mitochondriów w kardiomiocytach nie tylko ujawni mechanistyczne spostrzeżenia na temat produkcji energii sercowej, ale także może dostarczyć informacji, które doprowadzą do opracowania nowych celów terapeutycznych w leczeniu chorób serca6,8.

W porównaniu do całego serca, które zawiera mieszaninę miocytów i nie-miocytów9, kultury kardiomiocytów są niezwykle czyste, z minimalnym zanieczyszczeniem nie-miocytów z serca, takich jak fibroblasty i komórki śródbłonka10. Ponadto izolowanie kardiomiocytów od nowonarodzonych szczeniąt umożliwia wyhodowanie dużej liczby komórek w krótkim czasie, w porównaniu z izolacją komórek z dorosłych serc10,11. Co najważniejsze, kardiomiocyty dorosłych myszy z hodowlą pierwotną mają krótki czas przeżycia (np. 24 godziny), a w dłuższych punktach czasowych ulegają odróżnicowaniu. Kardiomiocyty nowonarodzonych myszy mogą przetrwać i być manipulowane przez ponad 7 dni w hodowli, co czyni je idealnymi do testowania wpływu związków leków i manipulacji genami na funkcję mitochondriów w kardiomiocytach10. Oczywiście istnieją znaczne różnice biologiczne między komórkami dorosłego i noworodka, ale dłuższy czas trwania hodowli komórek noworodkowych sprawia, że są one odpowiednie dla wielu różnych rodzajów badań, w tym badań nad funkcją mitochondriów.

Do tej pory, kardiomiocyty noworodków z pierwotnych hodowli myszy i szczurów były używane jako modele do badania bioenergetyki serca12,13. W ostatnich latach w badaniach wykorzystano analizator strumienia zewnątrzkomórkowego do pomiaru wskaźnika zużycia tlenu (OCR) i oceny zdolności oksydacyjnych w kardiomiocytach noworodków myszy i szczurów14,15. W porównaniu ze szczurami, żywotność komórek kardiomiocytów noworodków myszy jest niższa i ma większą zmienność16. Również możliwość badania komórek z genetycznie modyfikowanych modeli myszy sprawia, że model komórki myszy jest bardzo ważny. Biorąc pod uwagę, że badania OCR są tak wrażliwe na liczbę komórek i gęstość wysiewu, konieczne jest opracowanie powtarzalnego, niezawodnego i prostego protokołu w celu osiągnięcia stałej wydajności i żywotności komórek.

Tutaj przedstawiamy zoptymalizowany protokół, który został opracowany, a który wykorzystuje hodowane kardiomiocyty noworodków myszy wraz z analizatorem strumienia zewnątrzkomórkowego w formacie 96 do analizy OCR. Protokół ten znacznie zwiększa odtwarzalność testu. Ponadto protokół nie tylko zapewnia nowatorską i powtarzalną metodę analizy OCR, ale może być również dostosowany do hodowli o większym rozmiarze do innych celów eksperymentalnych, takich jak te, które mogą być potrzebne do badania funkcji miofibrylarnych i wewnątrzkomórkowych szlaków sygnałowych.

W szczególności, ten protokół opisuje jednodniową procedurę izolacji i hodowli kardiomiocytów noworodków myszy na 96-dołkowej płytce do hodowli komórkowej. Ponadto opisano procedurę pomiaru zużycia tlenu za pomocą analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego. Wszystkie stosowane roztwory są sterylne lub sterylnie filtrowane. Wszystkie narzędzia są sterylizowane 75% etanolem. Zapewniamy tabelę materiałów dla różnych części procedury. W przypadku hodowli kardiomiocytów wszystkie procedury i etapy są wykonywane w standardowym kapturze do hodowli komórkowych. Protokół ten został opracowany do izolacji nowonarodzonych serc myszy z jednego miotu (około 8-10 młodych). Jednak protokół można również dostosować do izolowania kardiomiocytów z wielu miotów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Do pracy z noworodkami myszy proszę zapoznać się z lokalnymi wytycznymi uniwersytetu/instytutu określonymi w programach opieki nad zwierzętami i przestrzegać swoich instytucjonalnych i innych odpowiednich przepisów. Wszystkie metody opisane w tym protokole zostały zatwierdzone przez UC San Diego Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) i są zgodne z przepisami federalnymi i stanowymi.

1. Przygotowanie odczynników

  1. Przygotuj 25 ml roztworu do wstępnego wytrawiania: HBSS (bez Ca2+ i Mg2+) uzupełnionego trypsyną (0,5 mg/ml). Wysterylizuj roztwór za pomocą filtra 0,22 μm i trzymaj na lodzie do momentu użycia. Przygotuj roztwór do wstępnego trawienia w dniu eksperymentu.
    nuta: Bardzo ważne jest, aby stosować HBSS bez Ca2+ i Mg2 +, ponieważ Ca2 + i Mg2 + spowodują skurcz miocytów, a następnie śmierć komórki podczas izolacji.
  2. Przygotować 30 ml buforu do trawienia kolagenazy: kolagenaza (0,8 mg/ml, około 350 j./ml) rozpuszczona w buforze HBSS (bez Ca2+ i Mg2+). Wysterylizuj roztwór za pomocą filtra 0,22 μm i trzymaj na lodzie do momentu użycia. Przygotuj roztwór do trawienia kolagenazy w dniu eksperymentu.
  3. Przygotuj 500 ml pożywki hodowlanej kardiomiocytów (pożywki wzrostowej): Wymieszaj 375 ml DMEM, 125 ml M-199, 25 ml surowicy końskiej i 12,5 ml FBS. Suplement z 1% roztworem penicyliny i 1% streptomycyny.
  4. Przygotuj mitochondrialną pożywkę do testów wysiłkowych: Przygotuj 200 ml pożywki do testów warunków skrajnych na bazie DMEM (DMEM bez NaHCO3, patrz tabela materiałów) uzupełnionej 1 mM pirogronianu sodu, 2 mM L-glutaminy i 10 mM glukozy oraz 2 mM Hepes.
    nuta: Przygotować 1 l pożywki z DMEM bez pirogronianu sodu, L-glutaminy, glukozy i Hepes, wypełnić sterylnie i przechowywać w temperaturze 4 °C. Przygotować pożywkę do prób warunków skrajnych w dniu testu, dodając inne odczynniki. Używanie podłoża DMEM bez NaHCO3 ma kluczowe znaczenie.
  5. Dostosuj pH pożywki do mitochondrialnych testów wysiłkowych do 7,4 w dniu stosowania. Przed użyciem podgrzać podłoże do temperatury 37 °C.
  6. Przygotowanie oligomycyny: Przygotować 5 ml 5 ml roztworu podstawowego o stężeniu 5 mM w DMSO, przygotować 250 μl porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  7. Przygotowanie FCCP: Przygotować 5 ml 5 mM roztworu podstawowego w DMSO, przygotować 250 μl porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  8. Przygotować antymycynę A: Przygotować 5 ml 5 ml roztworu podstawowego o stężeniu 5 mM w DMSO, przygotować 250 μl porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  9. Przygotowanie rotenonu: Przygotować 5 ml 5 ml roztworu podstawowego o stężeniu 5 mM w DMSO, przygotować 250 μl porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C.
    nuta: Wszystkie odczynniki i roztwory użyte w tym protokole są wymienione w Tabeli 1.

2. Zbieranie i wstępne trawienie serc od nowonarodzonych myszy (Dzień 1)

  1. Nożyczki do autoklawu, kleszcze i łyżka Moria do sterylizacji.
  2. Wykonaj wszystkie czynności w kapturze do hodowli komórkowej, aby uzyskać sterylność.
  3. Podać 5 ml HBSS (bez Ca2+, Mg2+) do każdego dołka na 6-dołkowej płytce do hodowli komórkowej; umieścić na lodzie. Porcję 10 ml HBSS umieścić w 10-centymetrowym naczyniu do hodowli komórkowych.
  4. Przygotuj 20 ml roztworu trypsyny do wstępnego wytrawiania w sterylnej stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Trzymaj wszystkie roztwory na lodzie.
  5. Szybko zanurz nowonarodzone myszy (dzień 0) w 70% roztworze etanolu w celu sterylizacji.
  6. Odetnij głowę szczeniętom za pomocą sterylnych nożyczek (prostych) bez znieczulenia, a następnie otwórz klatkę piersiową wzdłuż mostka, aby umożliwić dostęp do jamy klatki piersiowej i serca. (Rysunek 1A)
    UWAGA: 1) Bardzo ważne jest, aby używać myszy nowonarodzonych P0 w celu osiągnięcia wysokiej żywotności komórek. 2) Ta metoda eutanazji jest dozwolona dla noworodków zgodnie z wytycznymi NIH i Amerykańskiego Towarzystwa Medycyny Weterynaryjnej 17.
  7. Wyjmij serca z ciała cienkimi nożyczkami i natychmiast przenieś do sterylnego naczynia do hodowli komórek zawierającego HBSS (bez Ca2+, Mg2+) (Ryc. 1B).
  8. Usunąć resztki tkanki płucnej, większe naczynia itp. (i przedsionki, jeśli to konieczne). Umyj serca w roztworze HBSS, delikatnie mieszając.
  9. Pokrój każde serce cienkimi nożyczkami na 8 kawałków i przenieś całą tkankę serca za pomocą kleszczy do jednego dołka 6-dołkowej płytki do hodowli komórkowej z HBSS (Rysunek 1C i 1D).
  10. Umyj serca, przenosząc je ze studzienki do studzienki na 6-dołkowej płytce wypełnionej HBSS, używając łyżki Moria (Rysunek 1D).
    nuta: Przeniesienie serc ze studni do studni wystarczy, aby wypłukać krew. Ponieważ krew zakłóca trawienie enzymatyczne, ważne jest, aby umyć serca HBSS i usunąć krew.
  11. Przenieś serca łyżką Moria do stożkowej probówki zawierającej 20 ml trypsyny (0,5 mg/ml) i inkubuj z delikatnym mieszaniem w temperaturze 4°C przez 4 godziny (Rysunek 1E).

3. Przygotuj 96-dołkową płytkę hodowlaną (Dzień 1)

  1. Przygotować 5 ml roztworu powlekającego: PBS zawierającego 0,5% żelatyny (autoklaw przed użyciem) i 1% roztworu fibronektyny. (np. 5 ml roztworu żelatyny plus 50 μl roztworu fibronektyny)
  2. Porcję 50 μl roztworu powlekającego do każdego dołka 96-dołkowej płytki do hodowli komórkowej (patrz tabela materiałów). Jeśli pęcherzyki są obecne, usuń je za pomocą pipety o pojemności 20 μl, aby odessać bąbelki.
    nuta: Ważne jest, aby pokryć całą powierzchnię każdej studzienki roztworem powłokowym.
  3. Inkubować płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę lub dłużej, aby umożliwić wysuszenie powłoki matrycy.
  4. Odessać resztki roztworu powlekającego przed wysiewem kardiomiocytów.

4. Trawienie enzymatyczne i powlekanie komórek (Dzień 1)

  1. Wstępnie podgrzany roztwór do wytrawiania kolagenazy w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
    nuta: Jest to krok ważny dla osiągnięcia wydajnego trawienia enzymatycznego.
  2. Przenieść stożkową probówkę zawierającą serca i roztwór do wstępnego wytrawiania z temperatury 4 °C do okapu do hodowli komórkowych. (Rysunek 1F)
  3. Pozwól sercom opaść na dno probówki i usuń roztwór do wstępnego wytrawiania za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml (w probówce może pozostać od 1 do 2 ml pożywki izolacyjnej).
  4. Dodać 10 ml HBSS do probówki. Ponownie zawiesić serca za pomocą HBSS 2-3 razy, aby wypłukać trypsynę za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml. Odessać HBSS (w probówce może pozostać od 1 do 2 ml).
  5. Dodaj 10 ml podgrzanego roztworu do trawienia kolagenazy do probówki z sercami. (Rysunek 1G)
  6. Inkubować probówkę z sercami w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 10 minut bez mieszania (pierwsze trawienie).
  7. Po pierwszym wytrawieniu przenieś probówkę do kaptura do hodowli komórkowych. Delikatnie rozcierać serca, delikatnie zawieszając je w probówce 10 razy za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml. Umożliwi to rozproszenie serc i uwolnienie komórek z tkanki serca. (Rysunek 1H)
    nuta: Ponieważ kardiomiocyty są delikatne, delikatne rozcieranie jest ważne dla osiągnięcia wysokiej żywotności.
  8. Pozwól, aby niestrawiona tkanka opadła, przenieś strawiony roztwór wzbogacony w kardiomiocyty (około 9 - 10 ml) do nowej stożkowej probówki i natychmiast dodaj równą ilość pożywki do hodowli komórkowych, aby zatrzymać trawienie kolagenazy.
  9. Dodać 10 ml roztworu do trawienia kolagenazy do probówki zawierającej pozostałą niestrawioną tkankę serca.
  10. Inkubować probówkę z tkanką serca w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 10 minut (drugie trawienie).
  11. Powtórzyć procedurę 4.7 i 4.8.
    nuta: Jeśli nadal jest dużo niestrawionej tkanki, powtórz trawienie jeszcze raz. Jednak w większości przypadków wystarczą dwa trawienia, aby rozproszyć większość komórek z tkanki serca.
  12. Umieść sterylne sitko do komórek (siatka nylonowa 100 μm) w nowej sterylnej stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Wstępnie zwilż sitko komórkowe 2-3 ml pożywki do hodowli komórkowych i przepuść komórki przez sitko komórkowe. Przepłucz sitko komórkowe 2-3 ml pożywki do hodowli komórkowych. (Rysunek 1I)
  13. Stożkowa probówka wirówkowa zawierająca kardiomiocyty przez 5 minut przy 180 x g (Rysunek 1J). Odessać supernatant (Rysunek 1K), który będzie zawierał resztki tkanki komórkowej i ponownie zawiesić osad komórkowy w 10 ml pożywki do hodowli komórkowych (Rysunek 1L).
  14. Delikatnie zawiesić komórki i komórki płytki na 10-centymetrowym naczyniu do hodowli komórkowych (plastik bez żadnej powłoki) i inkubować przez 1 godzinę w inkubatorze do hodowli komórkowych (pierwsze wstępne posiewanie) (Rysunek 1M). Ten etap wstępnego powlekania umożliwia niekardiomiocytom, takim jak fibroblasty i komórki śródbłonka, przyleganie do niepowlekanego naczynia do hodowli komórkowych.
    nuta: W tym momencie kardiomiocyty mają zazwyczaj okrągły kształt i wydają się błyszczące pod mikroskopem. (Rysunek 1N).
  15. Po 1 godzinnej inkubacji delikatnie wymieszać płytkę, przemyć nieprzylegające komórki (wzbogacone w kardiomiocyty) z 10-centymetrowego naczynia hodowlanego i ponownie zawiesić komórki, wielokrotnie pipetując pożywkę do hodowli komórkowych na szalce za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml. Następnie przenieś nieprzylegające komórki (wzbogacone w kardiomiocyty) do nowego 10 cm naczynia do hodowli komórkowej (plastik bez żadnej powłoki) i inkubuj przez dodatkową 1 godzinę w inkubatorze do hodowli komórkowych (2. posiew wstępny).
    nuta: Komórki, które przyczepiają się do niepowlekanej płytki, to głównie niekardiomiocyty: fibroblasty i komórki śródbłonka, które można uwidocznić pod mikroskopem (Rysunek 1O).
  16. Po 2. wstępnym posiewie delikatnie poruszyć płytkę, umyć nieprzylegające komórki (kardiomiocyty) z naczynia hodowlanego o średnicy 10 cm, a następnie przenieść kardiomiocyty do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml.

5. Liczenie komórek i posiewanie komórek na 96-dołkowej płytce do hodowli komórkowej (Dzień 1)

  1. Policz komórki za pomocą hemocytometru.
  2. Umieść komórki na 96-dołkowej płytce do hodowli komórkowej pokrytej macierzą zewnątrzkomórkową o gęstości między 10-30 x 103 komórki / dołek za pomocą pipety wielokanałowej w końcowej objętości 200 μL (Rysunek 1P). Użyj studzienek A1, A12, H1 i H12 jako tła: dodaj 200 μl pożywki hodowlanej jak inne studzienki w tych studzienkach (bez komórek). Inkubować płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C.
    nuta: W tym badaniu zużycie tlenu testowano przy użyciu różnych gęstości komórek, takich jak 10 x 103, 20 x 103 lub 30 x 103 komórki / studzienkę. (Rysunek 2A). Ponadto, jak powyżej, kardiomiocyty bezpośrednio po izolacji mają zazwyczaj okrągły kształt i wydają się błyszczące pod mikroskopem. Żywe komórki spłaszczają się w ciągu 16-24 godzin hodowli.

6. Test zużycia tlenu przy użyciu 96-dołkowego analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego (Dzień 2)

UWAGA: Test zużycia tlenu może być przeprowadzony dzień po posiewie komórek lub później. Kardiomiocyty noworodków hodowane przy użyciu tego protokołu mogą przetrwać do 7 dni po izolacji.

  1. Uwodnić wkład czujnika analizatora strumienia (patrz tabela materiałów) przez co najmniej 3 godziny, ale najlepiej przez cały dzień, przed badaniem. Dodać 200 μl roztworu Calibrant (patrz Tabela Materiałów) do każdego dołka płytki użytkowej, umieścić wkład czujnika z powrotem na płytce użytkowej i inkubować w inkubatorze o temperaturze 37°C bez suplementacji CO2 lubO2 .
  2. Zmień pożywkę do hodowli komórkowych na pożywkę do testów wysiłkowych mitochondriów na godzinę przed testem. Kardiomiocyty są delikatne. Dlatego delikatnie usuń pożywkę do hodowli komórkowych za pomocą wielokanałowej pipety i dwukrotnie umyj komórki 200 μl wstępnie podgrzanej pożywki do testów wysiłkowych mitochondriów. Po drugim myciu dodać 175 μl wstępnie podgrzanej pożywki do testów wysiłkowych mitochondriów i hodować komórki w inkubatorze o temperaturze 37°C bez suplementacji CO2 lubO2 .
  3. Przygotować skoncentrowane związki do badań. Do testu wysiłkowego mitochondriów przygotuj po 3,0 ml 16 μM oligomycyny, 9 μM FCCP i mieszaniny 20 μM rotenonu i 20 μM antymycyny A, wszystko w mitochondrialnym podłożu do testów wysiłkowych.
    nuta: Każdy związek w opisanym stężeniu został przebadany. Konieczne jest jednak miareczkowanie stężenia każdego związku we własnym laboratorium.
  4. Załaduj 25 μl każdego związku do portów wtryskiwacza wkładu czujnika za pomocą pipety wielokanałowej (Rysunek 1Q). Objętość i końcowe stężenie opisano w tabeli 2.
  5. Skonfiguruj protokół testu strumienia zewnątrzkomórkowego. Program jest opisany w Tabeli 3.
  6. Uruchom program. Najpierw włóż wkład czujnika do urządzenia w celu kalibracji ( Rysunek 1R). Wymień kaliber płytki testowej po zakończeniu etapu kalibracji.
    nuta: Korzystając z oprogramowania dostarczonego przez producenta, wskaż grupy studni oraz każdy związek i port.
  7. W razie potrzeby, po wykonaniu testu, ostrożnie wyrzuć całą pożywkę testową za pomocą pipety wielokanałowej i przechowuj mikropłytkę do hodowli komórkowej w temperaturze -20 °C w celu przyszłej normalizacji komórek za pomocą testu białkowego.
  8. Zmierz zawartość białka. Dodać 50 μl wzorcowego roztworu do lizy komórek RIPA (patrz tabela materiałów). Inkubować płytkę na lodzie przez 30 minut, aby w pełni zlizować komórki. Przenieść cały materiał na nową, przezroczystą płytkę do badania 96-dołkowego z płaskim dnem.
  9. Zmierz stężenie białka za pomocą testu BCA zgodnie z protokołem producenta.
    nuta: Pokrycie studzienki macierzą zewnątrzkomórkową powoduje wysokie stężenie białka w każdym dołku. Dlatego odejmij ilość studzienki (studzienek) tła (brak komórek), aby uzyskać rzeczywiste stężenie białka komórkowego. Stężenie białka pochodzącego z komórek jest niskie w 96-dołkowej płytce hodowlanej. Ponadto stężenie białka może wahać się od dobrego do dobrego ze względu na powłokę macierzy zewnątrzkomórkowej. Dlatego sugeruje się użycie numeru komórki do normalizacji OCR.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z opisanego protokołu, wyizolowano serca od nowonarodzonych szczeniąt dnia 0. Uzyskano 5 x 105 komórek/pup, a kardiomiocyty wysiewano w gęstości 10 x 103, 20 x 103 lub 30 x 103 komórek/dołek, na 96 płytkach dołkowych (Rysunek 2A). Po całonocnej hodowli stwierdzono, że kardiomiocyty są dobrze przyczepione do powlekanej powierzchni z tworzywa sztucznego i było bardzo mało nieprzyłączonych komórek (nieprzyłączone kom...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym badaniu ustaliliśmy prosty protokół izolacji i hodowli kardiomiocytów noworodków myszy. Korzystając z tych kardiomiocytów, zoptymalizowaliśmy również warunki do pomiaru wskaźnika zużycia tlenu za pomocą systemu analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego. Protokół pozwala na wykorzystanie mysich kardiomiocytów noworodków jako systemu modelowego do zbadania, w jaki sposób różne czynniki mogą zmieniać zużycie tlenu w głównych pracujących komórkach serca, podobnie jak w przypadku nienaruszonego narządu. Nasz protokół r...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować wszystkim członkom laboratorium Ross i Murphy. Ta praca jest wspierana przez American Heart Association (14SDG17790005) do Y.C. NIH (HL115933, HL127806) i VA Merit (BX003260) do RSR.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Antymycyna ASIGMAA8674Hamuje kompleks III mitochondriów
Sitko komórkowe 100 μ m poryFALCON352360Do wychwytywania niestrawionej tkanki
Kolagenaza typu IIWorthingtonLS004176Do wytwarzania roztworu do trawienia kolagenazy
D-GlukozaSIGMA75351Do wytwarzania pożywki do testów wysiłkowych mitochodnrial
DMEM o wysokiej zawartości glukozyTechnologie życia11965-092Aby zrobić pożywkę
do hodowli komórkowychDMEM bez NaHCO3, glukozy, pirogronianu, glukaniny i HepesSIGMAD5030-10X1LDo produkcji mitochodnrialnej pożywki do testów wysiłkowych
FCCP (4-(trifluorometoksy)fenylohydrazon cyjanku karbonylu)SIGMAC2920Odsprzęga oddychanie mitochondrialne
Surowica bydlęca płodu (FBS)Technologie życia26140-079Aby zrobić pożywkę do hodowli komórkowej
Fibronektyna z osocze bydlęceSIGMAF1141-5MGDo wytwarzania roztworu powlekającego do płytek do hodowli tkankowych
Cienkie nożyczkiNarzędzia do nauk pięknych14060-10Do preparowania serc
Żelatyna ze skóry świniSIGMAG-1890Do wytwarzania roztworu powlekającego do płytek do hodowli tkankowych
HBSS (zrównoważony roztwór soli Hanka, bez Ca2+, Mg2+)Cellgro21-022-CVDo mycia serc i przygotowania roztworu do wstępnego trawienia i trawienia kolagenazy
HEPES (1 M)Fisher 15630080 naukowyAby zrobić mitochodnrial test wysiłkowy
Serum dla koniTechnologie życiowe26050-088Aby zrobić pożywkę do hodowli komórkowych
L-GlutaminaSIGMAG-3126Aby zrobić mitochodnrial test wysiłkowy
M-199Cellgro10-060-CVDo produkcji pożywki do hodowli komórkowych
Łyżka MoriaFisher scientificNC9190356Do mycia serc 
OligomycynaSIGMA75351-5MGHamuje mitochondrialną syntazę ATP
Bufor RIPAFisher scientific89900Do lizy komórek do oznaczania białek
RotenonSIGMAR8875Hamuje kompleks I mitochondriów
Seahorse XFe96 Extracellular Flux
Analyzer		AgilentUrządzenie służące do analizy zużycia tlenu
Seahorse XFe96 FluxPakAgilent102601-100Pakiet płytek hodowlanych analizatora topnika, wkładów czujników i kalibru
pirogronianu soduSIGMAP2256Do wykonania pożywki do testów wysiłkowych Mitochodniny
Nożyczki prosteNarzędzia do nauk pięknych91401-12Do preparowania serc
Filtr strzykawkowy 0,2 i mu; rozmiarDo sterylnej filtracji pożywki wytrawiającej
TrypsinUSB Corporation22715 25GMDo przygotowania roztworu do wstępnego trawienia
m

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Stanley, W. C., Recchia, F. A., Lopaschuk, G. D. Myocardial substrate metabolism in the normal and failing heart. Physiological Reviews. 85 (3), 1093-1129 (2005).
  2. Wang, K., et al. Mitochondria regulate cardiac contraction through ATP-dependent and independent mechanisms. Free Radical Research. , 1-10 (2018).
  3. Kolwicz, S. C. Jr, Purohit, S., Tian, R. Cardiac metabolism and its interactions with contraction, growth, and survival of cardiomyocytes. Circulation Research. 113 (5), 603-616 (2013).
  4. Rosca, M. G., Hoppel, C. L. Mitochondrial dysfunction in heart failure. Heart Failure Reviews. 18 (5), 607-622 (2013).
  5. Wai, T., et al. Imbalanced OPA1 processing and mitochondrial fragmentation cause heart failure in mice. Science. 350 (6265), aad0116(2015).
  6. Bayeva, M., Gheorghiade, M., Ardehali, H. Mitochondria as a therapeutic target in heart failure. Journal of American College Cardiololgy. 61 (6), 599-610 (2013).
  7. Camara, A. K., Bienengraeber, M., Stowe, D. F. Mitochondrial approaches to protect against cardiac ischemia and reperfusion injury. Frontiers in Physiology. 2, 13(2011).
  8. Brown, D. A., et al. Expert consensus document: Mitochondrial function as a therapeutic target in heart failure. Nature Reviews Cardiology. 14 (4), 238-250 (2017).
  9. Zhou, P., Pu, W. T. Recounting Cardiac Cellular Composition. Circulation Research. 118 (3), 368-370 (2016).
  10. Parameswaran, S., Kumar, S., Verma, R. S., Sharma, R. K. Cardiomyocyte culture - an update on the in vitro cardiovascular model and future challenges. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 91 (12), 985-998 (2013).
  11. Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes. Journal of Vissualized Experiments. 10 (114), (2016).
  12. Gibbs, C. L., Loiselle, D. S. Cardiac basal metabolism. Japanese Journal of Physiology. 51 (4), 399-426 (2001).
  13. Mdaki, K. S., Larsen, T. D., Weaver, L. J., Baack, M. L. Age Related Bioenergetics Profiles in Isolated Rat Cardiomyocytes Using Extracellular Flux Analyses. PLoS One. 11 (2), e0149002(2016).
  14. Neary, M. T., et al. Hypoxia signaling controls postnatal changes in cardiac mitochondrial morphology and function. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 74, 340-352 (2014).
  15. Hill, B. G., Dranka, B. P., Zou, L., Chatham, J. C., Darley-Usmar, V. M. Importance of the bioenergetic reserve capacity in response to cardiomyocyte stress induced by 4-hydroxynonenal. Biochemical Journal. 424 (1), 99-107 (2009).
  16. Sreejit, P., Kumar, S., Verma, R. S. An improved protocol for primary culture of cardiomyocyte from neonatal mice. In vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 44 (3-4), 45-50 (2008).
  17. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition. , Available from: https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf (2013).
  18. Manso, A. M., et al. Talin1 has unique expression versus talin 2 in the heart and modifies the hypertrophic response to pressure overload. Journal of Biological Chemistry. 288 (6), 4252-4264 (2013).
  19. Wang, G. W., Kang, Y. J. Inhibition of doxorubicin toxicity in cultured neonatal mouse cardiomyocytes with elevated metallothionein levels. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 288 (3), 938-944 (1999).
  20. Divakaruni, A. S., et al. Thiazolidinediones are acute, specific inhibitors of the mitochondrial pyruvate carrier. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5422-5427 (2013).
  21. Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PLoS One. 6 (7), e21746(2011).
  22. Sansbury, B. E., Jones, S. P., Riggs, D. W., Darley-Usmar, V. M., Hill, B. G. Bioenergetic function in cardiovascular cells: the importance of the reserve capacity and its biological regulation. Chemico-Biological Interactions. 191 (1-3), 288-295 (2011).
  23. Sharp, W. W., et al. Dynamin-related protein 1 (Drp1)-mediated diastolic dysfunction in myocardial ischemia-reperfusion injury: therapeutic benefits of Drp1 inhibition to reduce mitochondrial fission. FASEB Journal. 28 (1), 316-326 (2014).
  24. Tigchelaar, W., et al. Hypertrophy induced KIF5B controls mitochondrial localization and function in neonatal rat cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 97, 70-81 (2016).
  25. Graham, B. H., et al. A mouse model for mitochondrial myopathy and cardiomyopathy resulting from a deficiency in the heart/muscle isoform of the adenine nucleotide translocator. Nature Genetics. 16 (3), 226-234 (1997).
  26. Zhao, Y. Y., et al. Defects in caveolin-1 cause dilated cardiomyopathy and pulmonary hypertension in knockout mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (17), 11375-11380 (2002).
  27. Vander Heiden, M. G., et al. Growth factors can influence cell growth and survival through effects on glucose metabolism. Molecular and Cellular Biology. 21 (17), 5899-5912 (2001).
  28. Detillieux, K. A., Sheikh, F., Kardami, E., Cattini, P. A. Biological activities of fibroblast growth factor-2 in the adult myocardium. Cardiovascular Research. 57 (1), 8-19 (2003).
  29. Wang, R., et al. The acute extracellular flux (XF) assay to assess compound effects on mitochondrial function. Journal of Biomolecular Screening. 20 (3), 422-429 (2015).
  30. Dai, D. F., et al. Age-dependent cardiomyopathy in mitochondrial mutator mice is attenuated by overexpression of catalase targeted to mitochondria. Aging Cell. 9 (4), 536-544 (2010).
  31. Ritterhoff, J., Tian, R. Metabolism in cardiomyopathy: every substrate matters. Cardiovascular Research. 113 (4), 411-421 (2017).
  32. Uosaki, H., Taguchi, Y. H. Comparative Gene Expression Analysis of Mouse and Human Cardiac Maturation. Genomics, Proteomics & Bioinformatics. 14 (4), 207-215 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Oddychanie mitochondrialneizolacja kom rekp ytka 96 do kowatrawienie kolagenazliczenie w komorze countingowejtest stresu mitochondrialnegoodsprz gacz FCCP

Powiązane artykuły