Zastosowanie zaawansowanej technologii hodowli in vitro do badania mikrobioty jelitowej człowieka

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół hodowli mikrobioty jelitowej jelita grubego in vitro, przy użyciu szeregu bioreaktorów, które symulują warunki fizjologiczne przewodu pokarmowego.

Streszczenie

Mikrobiota jelitowa człowieka odgrywa istotną rolę zarówno w zdrowiu, jak i chorobie. Badanie mikrobioty jelitowej przy użyciu modelu in vivo jest trudne ze względu na jej złożony charakter i różnorodne powiązania z komponentami ssaków. Celem tego protokołu jest hodowla mikrobioty jelitowej in vitro, co pozwala na badanie dynamiki mikrobioty jelitowej bez konieczności uwzględniania wkładu środowiska ssaków. Korzystając z technologii hodowli in vitro, symulowane są warunki fizjologiczne przewodu pokarmowego, w tym parametry takie jak pH, temperatura, anaerobioza i czas pasażu. Powierzchnia jelita grubego jest symulowana przez dodanie nośników pokrytych mucyną, utworzenie fazy śluzówkowej i dodanie dalszego wymiaru. Mikrobiota jelitowa jest wprowadzana poprzez inokulację ludzkim materiałem kałowym. Po zaszczepieniu tą złożoną mieszaniną bakterii, określone drobnoustroje są wzbogacane w różnych podłużnych (wstępujących, poprzecznych i zstępujących okrężnicach) i poprzecznych (luminalnych i śluzówkowych) środowiskach modelu in vitro. Kluczowe znaczenie ma umożliwienie systemowi osiągnięcia stanu stacjonarnego, w którym społeczność i wytwarzane metabolity pozostają stabilne. Wyniki eksperymentalne zawarte w tym manuskrypcie pokazują, w jaki sposób zaszczepiona społeczność mikrobioty jelitowej przekształca się z czasem w stabilną społeczność. Po osiągnięciu stanu ustalonego system może być wykorzystywany do analizy interakcji bakterii i funkcji społeczności lub do testowania wpływu wszelkich dodatków na mikrobiotę jelitową, takich jak żywność, składniki żywności lub farmaceutyki.

Wprowadzenie

Mikrobiota jelitowa to społeczność mikroorganizmów rezydujących w ludzkim przewodzie pokarmowym (GIT). Społeczność ta osiąga maksymalne stężenie w okrężnicy, która według szacunków zawiera 10^{13-10 14} bakterii, z 500-1000 gatunków, które żyją w symbiozie ze środowiskiem okrężnicy^1,2. Skład i funkcjonalność mikrobioty jelitowej zmieniają się przestrzennie wzdłuż przewodu pokarmowego, tworząc społeczności specyficzne dla regionu, przy czym największą różnorodność stwierdzono dystalnie^2,3,4,5. Dla każdego regionu anatomicznego w świetle i na błonie śluzowej znajdują się odrębne zbiorowiska drobnoustrojów⁶. Społeczność lumenów ma bardziej bezpośredni dostęp do składników odżywczych, ponieważ substraty przemieszczają się przez przedział luminalny⁷. Mimo to niektóre bakterie znajdują się preferencyjnie w warstwie śluzu, wykorzystując mucynę wytwarzaną przez komórki jelita grubego jako źródło energii^1,5,8. Różnica w mikrośrodowiskach między fazą światła i błony śluzowej powoduje dywergencję i rozwój zbiorowisk specyficznych dla fazy. Razem społeczności te zapewniają funkcje metaboliczne, takie jak metabolizm składników odżywczych i produkcja witamin, oraz funkcje immunologiczne, takie jak zapobieganie kolonizacji ludzkich patogenów^1,3,9. Mikrobiota jelitowa działa również funkcjonalnie w połączeniu z ludzkimi komórkami jelita grubego³.

Jako ważna część ludzkiego przewodu pokarmowego, nie jest zaskakujące, że mikrobiota jelitowa jest znana z tego, że przyczynia się zarówno do zdrowia gospodarza, jak i statusu choroby^3,9^,10,11,12. Zmiana w populacji drobnoustrojów jelitowych wiąże się z wieloma chorobami u ludzi, w tym zaburzeniami przewodu pokarmowego, takimi jak choroba jelit (IBD) i zespół jelit (IBS), ale także z innymi chorobami, takimi jak otyłość, choroby krążenia i autyzm^3,9,10,11,12. Metabolity wytwarzane przez mikrobiotę jelitową mają działanie globalne, docierając do miejsc oddalonych od jelita^12,13. Na przykład oś jelitowo-mózgowa jest związana z zaburzeniami psychicznymi, takimi jak lęk i depresja¹⁴. Dlatego badanie mikrobioty jelitowej jest ważne dla wielu dziedzin badań i ma zastosowanie w przypadku wielu chorób, nawet tych, które często nie są związane z przewodem pokarmowym.

Chociaż powszechnie uznaje się, że badanie mikrobioty jelitowej jest ważne, jest to skomplikowane przedsięwzięcie. Dostępnych jest wiele modeli zwierzęcych, od małych zwierząt, takich jak danio pręgowany, szczury i myszy, po większe, takie jak małpy i świnie^{w wieku 15-19} lat. Jednak zastosowanie tych zwierząt w odniesieniu do ludzkiej mikrobioty jelitowej nie jest proste, ponieważ zwierzęta te mają unikalną społeczność bakteryjną, która wyewoluowała w oparciu o środowisko i dietę, i anatomicznie różnią się od ludzi^20,21. Wykorzystanie ludzi usuwa pytanie o istotność, ale wprowadza kolejny zestaw wyzwań. Badania na ludziach są kosztowne, czasochłonne i etycznie ograniczone¹¹. Co więcej, czynniki zakłócające wpływają na mikrobiotę jelitową w badaniach na ludziach, w tym wiek lub etap rozwoju, środowisko, dieta, leki i czynniki genetyczne^2,4,22. Istnieją również ograniczenia dotyczące tego, co można badać na ludziach i jaki rodzaj próbek można pobierać w jakim czasie⁴.

Jedną z krytycznych wad korzystania z systemu in vivo do badania mikrobioty jelitowej jest obecność składników pochodzących od ssaków. Mikrobiota jelitowa i komórki ludzkie oddziałują na siebie, a w warunkach in vivo niemożliwe jest ich rozróżnienie. Metabolity wytwarzane przez mikrobiotę jelitową są wychwytywane przez komórki jelita grubego, więc pomiary nie mogą być obliczone z precyzją. W związku z tym wszelkie badania mechanistyczne muszą być ograniczone do pomiarów punktu końcowego¹¹. Inną poważną wadą badań in vivo jest brak możliwości pobrania próbek z różnych regionów przewodu pokarmowego longitudinally²³. Nie pozwala to na ocenę zmian, które mogą wystąpić w mikrośrodowisku jelita grubego w czasie¹². Wiele badań in vivo, w tym badania na ludziach, opiera się na analizie próbek kału w celu wykrycia zmian w mikrobiocie jelitowej¹². Chociaż jest to pouczające, nie dostarcza danych na temat mikrobioty jelitowej w całym przewodzie pokarmowym i nie rozróżnia społeczności luminalnych i śluzówkowych^5,6,7,8.

Dla mikrobioty jelitowej wymagane jest zastosowanie metody in vitro do badania dynamiki społeczności bakteryjnej, bez ingerencji ze strony składników ssaków. Zastosowanie metody in vitro pozwala na ścisłą kontrolę warunków środowiskowych¹⁰, testowanie wielu parametrów jednocześnie oraz możliwość pobierania próbek wzdłużnie i w dużych ilościach¹¹. Ponieważ metoda in vitro wykorzystuje urządzenie mechaniczne, a nie gospodarza, nie trzeba brać pod uwagę wieku, środowiska, diety ani tła genetycznego. Systemy te mogą być wykorzystywane do badania całej społeczności mikrobioty jelitowej, tylko wybranych organizmów, a nawet pojedynczych szczepów. Co ważne, wyniki in vitro są powtarzalne, a jednocześnie zachowują poziom różnorodności porównywalny z badaniami in vivo^11,22.

W zależności od hipotezy, o której mowa, iin vitro, badania in vitro mogą być prowadzone na wiele sposobów. Mogą wykorzystywać systemy jednonaczyniowe i proste metody, takie jak inkubacja próbek z homogenatem kału²⁴ lub przeprowadzanie hodowli pojedynczej partii w ciągu 24-48 h²⁵. Można je również osiągnąć za pomocą systemów jednonaczyniowych i bardziej złożonych metod, takich jak użycie systemu chemostatu do wytworzenia stabilnej społeczności mikroorganizmów jelitowych¹¹. Jednak użycie pojedynczego reaktora może nadmiernie uprościć mikrobiotę¹², ponieważ reprezentuje on tylko jedną część jelita grubego, mimo że okrężnica składa się z obszarów wstępujących, poprzecznych i zstępujących.

W celu zbadania społeczności mikrobioty jelitowej, która rozwija się w różnych regionach jelita grubego (regiony wstępujące, poprzeczne i zstępujące), można zastosować złożony, wieloetapowy system. W tych systemach wiele naczyń jest ustawionych tak, aby naśladować różne regiony okrężnicy, więc mikrobiota jelitowa regionów wstępujących, poprzecznych i zstępujących jest hodowana niezależnie. Naczynia te są połączone za pomocą pomp do sekwencyjnego przemieszczania substratów z obszarów wstępujących do poprzecznych i zstępujących, naśladując przepływ składników odżywczych przez przewód pokarmowy.

Celem tego badania było pokazanie, w jaki sposób 5-etapowy system hodowli in vitro (patrz Tabela materiałów) może być wykorzystany do hodowli społeczności mikrobioty jelitowej, oraz zademonstrowanie dynamiki społeczności pod względem stabilności i składu. W tym systemie jedno naczynie reprezentuje żołądek, a drugie jelito cienkie. Dwukropek jest podzielony na trzy regiony (rosnący, poprzeczny, malejący), z jednym naczyniem reprezentującym każdy region²⁶. W tej eksperymentalnej konfiguracji dwa kompletne systemy prowadzono równolegle, przy czym jednostka 1 zawierała nośniki mucyny reprezentujące powierzchnię błony śluzowej, a jednostka 2 nie zawierała nośników mucyny. Społeczności, które rozwinęły się w fazie świetlnej i śluzówkowej każdego regionu, porównano ze sobą i z inokulum kałowym w czasie za pomocą sekwencjonowania genu 16S rRNA i analizy SCFA. Przedstawione wyniki pokazują rodzaj zbiorowiska, zarówno pod względem składu, jak i funkcjonalności, które można wytworzyć z tego typu systemu in vitro.

Protokół

1. Materiały i preparaty

UWAGA: Zdefiniowane podłoże jest kupowane jako proszek (zobacz Tabelę Materiałów). Skład zdefiniowanej pożywki w g/l jest następujący: arabinogalaktan (1.2), pektyna (2.0), ksylan (0.5), glukoza (0.4), ekstrakt drożdżowy (3.0), specjalny pepton (1.0), mucyna (2.0), L-cysteina-HCl (0.2).

1. Przygotować zdefiniowane podłoże
   1. Napełnij 4-litrową kolbę 2 litrami podwójnie destylowanej wody dejonizowanej.
   2. Dodać 29,2 g określonego podłoża w proszku do wody i wymieszać jednostkę całkowicie homogenizowaną.
   3. Dodaj mieszadło magnetyczne i luźno przykręć pokrywkę.
   4. Autoklaw w temperaturze 121 °C przez 30 min.
   5. Po schłodzeniu przygotować określoną pożywkę przechowywać w lodówce w temperaturze 4 °C przy stałym mieszaniu (mieszadło magnetyczne).
2. Przygotuj sok trzustkowy
   1. Autoklaw 2L destylowanej, dejonizowanej wody w 5-litrowym naczyniu z dodatkiem mieszadła, w temperaturze 121 °C przez 30 minut.
   2. Po sterylizacji w autoklawie pozwól wodzie ostygnąć do temperatury pokojowej.
   3. Dodać 12,5 g NaHCO₃, 6 g żółci i 0,9 g pankreatyny. Umieścić na mieszadle magnetycznym do wymieszania.
      nuta: Sok trzustkowy należy przygotowywać na świeżo co 2-3 dni i po przygotowaniu przechowywać w lodówce z mieszaniem.
3. Bufor fosforanowy
   1. Umieścić kolbę o pojemności 1 l zawierającą mieszadło magnetyczne na mieszadle magnetycznym. Dodaj 0,5 l destylowanej, dejonizowanej wody i włącz mieszanie.
   2. Następnie dodać 6,8 g KH₂PO₄, 8,8 g K₂HPO₄ i 0,1 g tioglikolanu sodu. Uzupełnić wodą do końcowej objętości 1 l.
   3. Po całkowitym rozpuszczeniu składników dostosuj pH do 7,0 za pomocą NaOH.
   4. Wlać bufor do 2-litrowego naczynia z zakrętką i sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 30 minut. Upewnij się, że pokrywka jest luźno przykręcona i nie jest szczelnie zamknięta.
   5. Po wyjęciu z autoklawu pozwól roztworowi ostygnąć do temperatury pokojowej. Bufor należy przechowywać w temperaturze pokojowej do 2 tygodni.
4. Przygotuj nośniki agaru Mucyna
   1. Autoklaw plastikowe nośniki mucyny (patrz tabela materiałów), kleszcze, siatka z tworzywa sztucznego (kształt rurki) i opaski zaciskowe w temperaturze 131 °C przez 30 min.
   2. Autoklaw 300 ml podwójnie destylowanej, dejonizowanej wody o temperaturze 131 °C przez 30 minut. Przechowywać w temperaturze pokojowej do momentu użycia.
   3. W komorze bezpieczeństwa biologicznego z przepływem laminarnym napełnij sterylne szalki Petriego plastikowymi nośnikami mucyny za pomocą sterylnych kleszczy.
      nuta: Nośniki mucyny to puste plastikowe kręgi, które są wypełnione agarem mucyny. Po napełnieniu pokrywkę można położyć na wierzchu i odłożyć na bok.
   4. Aby przygotować agar mucynowy, dodaj 3 g agaru bakteryjnego i 15 g mucyny wieprzowej do 300 ml autoklawowanej wody.
   5. W dygestorium zagotuj ten roztwór, a następnie wyjmij go ze źródła ciepła i pozostaw do ostygnięcia na 1 minutę. Powtórz gotowanie i chłodzenie w sumie 3 razy.
   6. Gdy szklane naczynie zawierające roztwór agaru mucyny ostygnie na tyle, aby można go było dotknąć, przenieś je do komory bezpieczeństwa biologicznego z przepływem laminarnym.
   7. W komorze bezpieczeństwa biologicznego z przepływem laminarnym wylej płynny agar mucynowy na plastikowe nośniki mucyny, które zostały umieszczone na szalce Petriego. Upewnij się, że wszystkie nośniki są całkowicie wypełnione agarem mucyny.
   8. Umieść pokrywkę z powrotem na szalce Petriego i pozwól jej ostygnąć pod wpływem przepływu laminarnego.
   9. Aby zmontować nośniki mucyny, należy wziąć autoklawowaną siatkę z tworzywa sztucznego i włożyć nośniki mucyny zawierające zestalony agar mucynowy z szalki Petriego za pomocą sterylnych kleszczy.
   10. Użyj opasek zaciskowych, aby zamknąć końce siatki. W ten sposób sieć funkcjonuje tak, aby zawierać nośniki mucyny wypełnione agarem mucyny. Przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu użycia.

2. Konfiguracja, szczepienie i uruchamianie systemu

1. Uruchomienie systemu hodowli
   UWAGA: Do tego badania wykorzystano Twin Simulator of the Human Intestinal Microbiologal Ecosystem.
   1. Umieść 10 bioreaktorów zawierających mieszadła na mieszadłach magnetycznych i włącz mieszanie.
      nuta: Każda jednostka będzie składać się z 5 bioreaktorów, więc 2 jednostki będą wymagały 10 bioreaktorów.
   2. Połącz ze sobą 5 bioreaktorów za pomocą rurek silikonowych w kolejności za pomocą pompy perystaltycznej (Rysunek 1). Użyj pomp, aby przeciąć zawartość płynu z jednego bioreaktora do drugiego.
   3. Oznacz bioreaktory w następującej kolejności: Żołądek, jelito cienkie, okrężnica wstępująca, okrężnica poprzeczna, okrężnica zstępująca, aby reprezentować kolejność przewodu pokarmowego.
      nuta: Wszystkie bioreaktory mogą być identyczne lub bioreaktory żołądka i jelita cienkiego mogą być mniejsze w porównaniu z bioreaktorami jelita grubego, ponieważ będą miały mniejszą objętość. Ustawienie bioreaktorów w ten sposób oznacza, że wstępujący obszar okrężnicy otrzymuje składniki odżywcze z jelita cienkiego, poprzeczny obszar okrężnicy otrzymuje składniki odżywcze z wstępującego obszaru okrężnicy, a zstępujący obszar okrężnicy otrzymuje składniki odżywcze z obszaru poprzecznego. W ten sposób system naśladuje sekwencyjny ruch składników odżywczych w przewodzie pokarmowym.
   4. Umieścić oznaczoną pożywkę i sok trzustkowy w lodówce w temperaturze 4 °C, stale mieszając za pomocą mieszadeł magnetycznych. Za pomocą rurki silikonowej podłączyć zdefiniowane medium do bioreaktora żołądkowego za pomocą pompy perystaltycznej i połączyć sok trzustkowy z jelitem cienkim za pomocą pompy perystaltycznej.
   5. Dodaj środek zestalający do worka do drenażu moczu. Połączyć okrężnicę zstępującą z workiem drenażowym moczu za pomocą pompy perystaltycznej. Zestalone odpady należy usunąć jako odpady biologiczne podczas eksperymentu.
   6. Za pomocą silikonowych rurek połącz płaszcz wodny każdego naczynia w kolejności i podłącz każdy koniec do łaźni wodnej obiegowej. Napełnić łaźnię z wodą obiegową wodą destylowaną (ilość ta będzie się różnić w zależności od rodzaju używanej kąpieli z wodą obiegową) i ustawić na 37 °C.
   7. Za pomocą silikonowych rurek podłącz kwas i zasadę do pokrywy każdego naczynia za pomocą pomp perystaltycznych. Zalecane stężenia to 0,5M HCl i 0,5M NaOH.
   8. Włóż sondy pH do każdego naczynia przez wyznaczony port w pokrywie. Ten port jest przeznaczony do przytrzymywania sondy pH i wkręcania jej w pokrywę (Rysunek 1). Ustaw pH dla każdego regionu w następujący sposób: Żołądek, pH = 2; Jelito cienkie, pH = 6,7-6,9; Okrężnica wstępująca, pH = 5,6-5,9; Okrężnica poprzeczna, pH = 6,15-6,4; Okrężnica zstępująca, pH = 6,6-6,9,
      nuta: W początkowej fazie społeczność będzie różnicować się na podstawie różnicy w wartościach pH regionu. Jednak gdy rozpoczną się cykle żywieniowe, społeczności będą dalej dojrzewać w oparciu o różnice w dopływie składników odżywczych.
   9. Podłącz przewód azotowy za pomocą silikonowej rurki do pokrywy każdego naczynia za pomocą wyznaczonego portu. Linia azotu powinna płynąć w następującej kolejności: żołądek, jelito cienkie, okrężnica wstępująca, okrężnica poprzeczna, okrężnica zstępująca. Upewnij się, że każde urządzenie ma własne spłukiwanie, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego.
      nuta: Azot służy do usuwania tlenu z układu i utrzymuje beztlenowość podczas eksperymentu.
   10. Włóż metalową probówkę na próbkę przez pokrywę każdego bioreaktora za pomocą wyznaczonego portu. Metalowa rurka rozciąga się w dół do bioreaktora i służy do pobierania próbek płynów.
   11. Dodaj mały kawałek silikonowej rurki do górnego końca probówki z próbką i podłącz Luer Lock, aby umożliwić użycie strzykawki podczas pobierania próbek.
2. Inokulacja systemu
   1. Wypełnij obszary okrężnicy zdefiniowanym podłożem, używając następujących objętości: 500 ml w okrężnicy wstępującej, 800 ml w okrężnicy poprzecznej i 600 ml w okrężnicy zstępującej.
   2. Dodać nośniki agaru mucynowego do okolic okrężnicy, w ilości proporcjonalnej do objętości reaktora. W tym eksperymencie użyto 60 nośników na reaktor
   .
   3. Usunąć nadmiar zdefiniowanego podłoża za pomocą probówki z próbką i strzykawki, ponieważ dodanie nośników podnosi poziom płynu w bioreaktorze.
   4. Włącz sondy pH, aby wyregulować pH w każdym reaktorze za pomocą komputera.
   5. Włączyć płukanie azotem na 20 min.
      nuta: Homogenat kałowy używany do inokulacji jest kupowany jako 10% kał homogenizowany w 10% roztworze glicerolu (patrz tabela materiałów). Próbka kału jest losowo wybierana z puli dawców według następujących kryteriów: Amerykanin spożywający typową zachodnią dietę (nie wegańską ani wegetariańską), w wieku 21-45 lat, wolny od antybiotyków przez co najmniej 1 rok, ze średnim wskaźnikiem masy ciała (18,5-24,9). W przypadku tego protokołu używany jest tylko jeden dawca. Można to jednak zmienić ze względu na projekt eksperymentalny.
   6. Przed inokulacją rozmrozić homogenat kału zgodnie z wytycznymi producenta.
   7. Zaszczepić każdy reaktor okrężnicy, dodając homogenat kału w ilości równej 5% objętości reaktora przez port próbki, za pomocą strzykawki o pojemności 60 ml (25 ml dla okrężnicy wstępującej, 40 ml dla okrężnicy poprzecznej, 30 ml dla okrężnicy zstępującej).
   8. Hoduj kultury w bioreaktorach przez noc z kontrolą pH.
   9. Po nocnym wzroście należy pobrać próbki płynu świetlnego z każdego obszaru okrężnicy, jak opisano poniżej w sekcji 3. Po zakończeniu pobierania próbek włącz program komputerowy, aby rozpocząć karmienie.
3. Codzienne cykle karmienia
   UWAGA: Codzienne cykle karmienia są zautomatyzowane komputerowo.
   1. Trzy razy dziennie pompować 140 ml zdefiniowanej pożywki do bioreaktora żołądkowego i pozostawić do inkubacji przez 1 godzinę.
   2. Po 1 godzinie inkubacji przepompować zawartość żołądka do jelita cienkiego. W tym samym czasie wpompuj 60 ml soku trzustkowego do jelita cienkiego.
   3. W jelicie cienkim włącz regulację pH do pH 6,7-6,9 i pozostaw mieszaninę do inkubacji przez 90 minut. Podczas inkubacji włącz płukanie azotem dla każdego systemu na łącznie 10 minut.
   4. Po 90 minutach inkubacji należy jednocześnie włączyć pompy od jelita cienkiego do okrężnicy wstępującej, okrężnicy wstępującej do okrężnicy poprzecznej, okrężnicy poprzecznej do okrężnicy zstępującej i okrężnicy zstępującej do odpadów.
4. Eksperymentalna oś czasu
   UWAGA: Zastosowany tutaj system in vitro jest eksploatowany w sposób ciągły przez około 8 tygodni. Poniżej znajduje się zalecany harmonogram eksperymentu, jednak może on ulec zmianie w zależności od wymagań i celu eksperymentu.
   1. Skonfiguruj system, wykonując czynności wymienione w kroku 2.1.
   2. Pobieraj próbki z nocnego wzrostu zgodnie z poniższym protokołem. Rozpocznij codzienne cykle, karmiąc trzy razy dziennie zgodnie z powyższym protokołem.
   3. Eksperyment należy przeprowadzić w sumie przez 2 tygodnie, aby bakterie mogły się ustabilizować.
      nuta: Uruchomienie systemu oznacza, że pH jest utrzymywane, codzienne cykle karmienia są przestrzegane trzy razy dziennie, a nośniki błony śluzowej są zmieniane 2-3 razy w tygodniu.
   4. Po ustabilizowaniu eksperyment należy przeprowadzić przez 2 tygodnie jako okres kontrolny.
   5. Po okresie kontrolnym użyj systemu do przetestowania różnych składników lub zmiennych, znanych jako okres leczenia.
   6. Po okresie leczenia przestań dodawać składniki lub zmienne i przywróć warunki do normy. Jest on uważany za okres wypłukiwania i służy do określenia, czy zmiany w społeczności są trwałe.

3. Pobieranie próbek z systemu

UWAGA: Podczas eksperymentu, próbki mogą być pobierane z fazy świetlnej lub śluzówkowej dowolnego regionu w dowolnym momencie, zgodnie z poniższymi wytycznymi.

1. Pobieranie próbek światła
   1. Pobrać próbki płynu luminalnego przez port próbki, który rozciąga się do środka cieczy hodowlanej. Zacznij od oczyszczenia Luer Lock w porcie próbki 70% etanolem lub małym wacikiem nasączonym alkoholem i pozostaw do wyschnięcia.
   2. Upewnij się, że całe powietrze zostało usunięte ze strzykawki o pojemności 30 ml i podłącz ją do portu próbki. Pobieraj i opuszczaj 3-5 razy, aby zapewnić prawidłowe wymieszanie składników naczynia. Następnie narysuj w sumie 30 ml kultury.
   3. W razie potrzeby próbki światła należy przelać do sterylnych probówek sokoła i przechowywać na lodzie. Po zakończeniu pobierania próbek przenieść je do zamrażarki o temperaturze -80 °C.
   4. Do analizy SCFA 15 ml próbki światła wiruje się w temperaturze 4 °C, 5 000 x g przez 10 minut. Supernatant jest filtrowany strzykawką przy użyciu filtra PES 0,2 μM. Przefiltrowany supernatant przechowywać w temperaturze -80 °C.
      1. Do analizy DNA odwirować 1 ml płynu luminalnego w temperaturze 4 °C, 5 000 x g przez 10 minut. Odrzucić supernatant i przechowywać osad w temperaturze -80 °C.
      2. Jako kopię zapasową przechowuj 10 ml płynu luminalnego w temperaturze -80 °C dla większości eksperymentów.
2. Pobieranie próbek błony śluzowej
   UWAGA: Zmieniaj nosicieli błony śluzowej co 2-3 dni.
   1. Wyjmij i wyjmij przygotowane nośniki mucyny z lodówki.
   2. Włącz płukanie azotem i szybko otwórz pokrywę reaktora. Usuń 50% nośników mucyny i dodaj nowe.
   3. Szybko uszczelnij pokrywę i utrzymuj azot na płukaniu przez kolejne 20 minut.
   4. Do ekstrakcji DNA należy przelać 0,25-0,5 g agaru do probówki o pojemności 2 ml i przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu, gdy będzie potrzebny.

4. Ekstrakcja, sekwencjonowanie i analiza DNA

UWAGA: DNA jest ekstrahowane metodą ekstrakcji DNA metodą CTAB z fizyczną homogenizacją w dygestoriociągu²⁹. Po ekstrakcji spektrofotometr służy do ilościowego określenia ilości DNA w każdej próbce.

1. Przygotowanie bufora CTAB
   1. Rozpuścić 4,2 g_K2HPO4 i 4,09 g NaCl w 200 ml dejonizowanej wody destylowanej, a następnie w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 30 min.
   2. Pozostawić roztwór do ostygnięcia do temperatury pokojowej.
   3. Dodać 10 g bromku heksadecylotrimetyloamoniowego (CTAB) i podgrzać do temperatury 60 °C z mieszaniem.
   4. Po rozpuszczeniu całego CTAB usuń roztwór z ognia i ostudź do temperatury pokojowej.
2. Przygotowanie roztworu PEG-6000
   1. Rozpuścić 300 g glikolu polietylenowego 6 000 i 93,5 g NaCl w 1 l dejonizowanej wody destylowanej.
   2. Po rozpuszczeniu wszystkich cząstek należy sterylizować roztwór w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 30 minut.
   3. Po sterylizacji w autoklawie przed użyciem schłodzić roztwór do temperatury pokojowej.
3. Wykonaj ekstrakcję DNA
   1. Dodać 500 μl buforu CTAB i 500 μl alkoholu fenolowo-chloroformowo-izoamylowego do probówki z próbką o pojemności 2 ml i odwirować w celu homogenizacji.
   2. Przenieść całą zawartość probówki z próbką do fizycznej probówki homogenizującej o średnicy 0,1 mm (patrz tabela materiałów).
   3. Homogenizować probówki przez 20 s przy najwyższym ustawieniu dwa razy, z 20-sekundową przerwą pomiędzy nimi, używając fizycznego homogenizatora (patrz Tabela materiałów).
   4. Odwirować homogenizowane probówki o stężeniu 3 000 x g przez 5 minut.
   5. Przenieść 300 μl supernatantu do czystej probówki o pojemności 1,7 ml i dodać 500 μl buforu CTAB do oryginalnej probówki.
   6. Ponownie homogenizować tę probówkę, stosując metody opisane w krokach 4.3.2-4.3.3 i odwirowywać przy 3 000 x g przez 5 minut.
   7. Po odwirowaniu przenieść kolejne 300 μl supernatantu do nowej probówki, która zawiera teraz 600 μl.
   8. Dodać łącznie 600 μl alkoholu chloroformowo-izoamylowego do probówki zawierającej 600 μl supernatantu.
   9. Odwróć probówki do wymieszania, a następnie krótko odwiruj. Przenieść 500 μl górnej fazy do czystej probówki o pojemności 1,7 ml. Upewnij się, że bierzesz tylko górną fazę.
   10. Następnie dodać 1000 μl roztworu Peg-6000, odwrócić probówki do wymieszania, a następnie inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.
   11. Po inkubacji odwirować probówki w temperaturze 18 200 x g, 4 °C, przez 10 minut.
   12. Odrzucić supernatant i oczyścić osad lodowatym 70% etanolem.
   13. Ponownie odwirować probówki w temperaturze 18 200 x g, 4 °C, przez 10 minut. Wyrzucić supernatant i pozostawić osad do wyschnięcia w komorze bezpieczeństwa biologicznego przy przepływie laminarnym.
   14. Po wyschnięciu osadu dodaj do każdej probówki 75 μl sterylnej wody wolnej od RNAzy, DNA
   i DNA.
   15. Określ ilościowo zawieszone DNA za pomocą spektrofotometru, a następnie wyślij je do sekwencjonowania genu 16S rRNA.

5. Wykrywanie i analiza krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych (SCFA)

1. Zamrożone próbki należy rozmrażać w temperaturze 40°C przez 30 minut i ekstrahować krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe za pomocą eteru dietylowego w stosunku 2:1 (v:v).
2. Przenieść fazę organiczną do GC/MS (patrz tabela materiałów) wyposażonej w kolumnę, 30 m, 0,25 mm ID, 0,25 μm (patrz tabela materiałów), gdzie wstrzykuje się 10 μl.
3. Ustawić temperaturę portu wtryskowego i temperaturę początkową kolumny odpowiednio na 260 °C i 125 °C. Utrzymuj temperaturę początkową przez 1 minutę, a następnie zwiększ ją do 250 °C przez 11,5 minuty przy natężeniu przepływu w kolumnie 1 ml/min.
   nuta: Temperatura MS dla źródła jonów wynosi 220°C, a dla granicy faz 250°C.
4. Określić ilościowo ilość każdego SCFA, używając krzywych wzorcowych i kwasu 2-metyloheksanowego jako wzorca wewnętrznego.

Wyniki

Powyższy protokół opisuje przygotowanie, szczepienie i prowadzenie 5-etapowego systemu in vitro do badania mikroflory jelitowej jelita grubego. Aby wygenerować dane przedstawione poniżej, po ekstrakcji DNA, sekwencjonowanie DNA genu markera 16S rRNA regionu V1V2 przeprowadzono przy użyciu sekwencjonowania o wysokiej przepustowości (np. platformy MiSeq Illumina) przez Centrum Mikrobiomu w Szpitalu Dziecięcym w Filadelfii²⁷. QIIME (Quantitative Insight into ...

Dyskusja

Systemy hodowli in vitro zostały opracowane w celu badania mikrobioty jelitowej jelita grubego. Używają aparatury zaprojektowanej do symulacji warunków fizjologicznych przewodu pokarmowego, promując wzrost dojrzałej społeczności drobnoustrojów jelitowych dla każdego regionu okrężnicy³³. Chociaż koncepcja ta jest logiczna i zrozumiała, samo prowadzenie systemów hodowli in vitro w celu badania mikrobioty jelitowej wymaga precyzji i zrozumienia, co jest wymagane i oczekiwane, aby uzyskać wiarygodne w...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
TWINSHIME	Prodigest	NA
Zdefiniowane podłoże (dorosły M-SHIME pożywka wzrostowa ze skrobią)	Prodigest	NA
Rurki Masterflex	cole Parmer	NA
Worek drenażowy moczu	Bard	NA
Labsorb	Sigma-Aldrich	NA
Próbka kału	Openbiome	NA
Strzykawki	Becton Dickson	NA
Zdefiniowane podłoże	Prodigest	NA
Oxgall Bile	Becton Dickson	NA
Pancreatin	Sigma-Aldrich	NA
Wyroby szklane	Ace Glass	NA
Mucyna	Sigma-Aldrich	NA
Agor bakteriologiczny	Sigma-Aldrich	NA
Woreczki do sterylizacji	VWR	NA
BeadBug	Benchmark Scientific	NA
Potrójnie czysty cyrkon wysokoudarowy 0,1 mm Rurka do ubijania koralików	Benchmark Scientific	NA
Bez RNAza, bez DNA, sterylna woda	Roche	NA
Shimadzu QP2010 Ultra GC/MS	Shimadzu	NA
Kolumna Stabilwax-DA, 30 m, średnica wewnętrzna 0,25 mm, 0,25 &mikro; m	Restek	NA
plastikowe nośniki mucyny	Prodigest	NA