Artykuł metodologiczny

Oparta na fluorescencji metoda badania regulacji genów bakteryjnych w zakażonych tkankach

DOI:

10.3791/59055

⸱

19 lutego 2019

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Georgetown University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisana tutaj jest metoda analizy ekspresji genów bakteryjnych w tkankach zwierzęcych na poziomie komórkowym. Metoda ta stanowi źródło do badania różnorodności fenotypowej występującej w populacji bakterii w odpowiedzi na środowisko tkankowe podczas infekcji.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Geny zjadliwości bakterii są często regulowane na poziomie transkrypcji przez wiele czynników, które reagują na różne sygnały środowiskowe. Niektóre czynniki działają bezpośrednio na geny wirulencji; Inne kontrolują patogenezę, dostosowując ekspresję dalszych regulatorów lub akumulację sygnałów, które wpływają na aktywność regulatora. Chociaż regulacja była szeroko badana podczas wzrostu in vitro, stosunkowo niewiele wiadomo na temat tego, jak ekspresja genów jest dostosowywana podczas infekcji. Taka informacja jest ważna, gdy dany produkt genowy jest kandydatem do interwencji terapeutycznej. Podejścia transkrypcyjne, takie jak ilościowe, RT-PCR w czasie rzeczywistym i sekwencjonowanie RNA, są skutecznymi sposobami badania ekspresji genów na poziomie globalnym, ale borykają się z wieloma wyzwaniami technicznymi, w tym niską obfitością bakteryjnego RNA w porównaniu z RNA gospodarza i degradacją próbki przez RNazy. Ocena regulacji za pomocą reporterów fluorescencyjnych jest stosunkowo łatwa i może być multipleksowana za pomocą białek fluorescencyjnych o unikalnych właściwościach spektralnych. Metoda pozwala na jednokomórkową, czasoprzestrzenną analizę ekspresji genów w tkankach, które wykazują złożoną trójwymiarową architekturę i gradienty fizykochemiczne wpływające na bakteryjne sieci regulacyjne. Takie informacje są tracone, gdy dane są uśredniane w populacji większościowej. W niniejszym artykule opisano metodę ilościowego określania ekspresji genów w patogenach bakteryjnych in situ. Metoda opiera się na prostym przetwarzaniu tkanek i bezpośredniej obserwacji fluorescencji białek reporterowych. Wykazujemy użyteczność tego systemu, badając ekspresję termonukleazy Staphylococcus aureus (nuc), której produkt genu jest niezbędny do unikania odporności i pełnej zjadliwości ex vivo i in vivo. Pokazujemy, że nuc-gfp ulega silnej ekspresji w ropniach nerek i ujawniamy niejednorodną ekspresję genów częściowo ze względu na pozorną regulację przestrzenną aktywności promotora nuc w ropniach w pełni zaangażowanych w odpowiedź immunologiczną. Metodę tę można zastosować do każdej bakterii z manipulacyjnym systemem genetycznym i dowolnym modelem infekcji, dostarczając cennych informacji do badań przedklinicznych i opracowywania leków.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bakterie reagują na zmieniające się warunki fizjologiczne i zmiany w stanie odżywienia swojego środowiska poprzez różnicową ekspresję genów niezbędnych do adaptacji i przetrwania. Na przykład oportunistyczne patogeny kolonizują powierzchnie ciała o stosunkowo niskiej gęstości i często są nieszkodliwe. Jednak gdy bakteria przeniknie przez bariery fizyczne i chemiczne, musi zmagać się z przeciwobroną komórek odpornościowych gospodarza i ograniczoną dostępnością składników odżywczych1. Na przykład Staphylococcus aureus kolonizuje około jednej trzeciej populacji bezobjawowo, ale jest również przyczyną wyniszczających infekcji skóry i tkanek miękkich, zapalenia kości i szpiku, zapalenia wsierdzia i bakteriemii2. Sukces S. aureus jako patogenu jest często przypisywany jego elastyczności metabolicznej, a także arsenałowi czynników wirulencji związanych z powierzchnią i wydzielanych, które umożliwiają bakterii ucieczkę z krwiobiegu i replikację w tkankach obwodowych3,4,5. Ponieważ śmierć gospodarza z powodu choroby gronkowcowej jest ewolucyjnym ślepym zaułkiem i ogranicza transmisję na nowych gospodarzy6, zaangażowanie w produkcję czynników wirulencji musi być dokładnie kontrolowane.

Złożona sieć regulacyjna białek i niekodujących RNA reaguje na różne bodźce środowiskowe, w tym gęstość komórek, fazę wzrostu, czynniki związane z neutrofilami i dostępność składników odżywczych, aby zapewnić, że geny wirulencji są wyrażane w dokładnym czasie i miejscu w tkankach gospodarza7,8,9,10,11,12,13. Na przykład dwuskładnikowy system SaeR/S (TCS) reguluje ekspresję kilku czynników wirulencji za pośrednictwem kinazy czujnikowej (SaeS) i regulatora odpowiedzi (SaeR)14. SaeS ulega autofosforylacji na konserwatywnej reszcie histydyny w odpowiedzi na sygnały gospodarza (np. ludzkie peptydy neutrofilowe [HNP], kalprotektyna)8,15,16. Grupa fosforylowa jest następnie przenoszona do reszty asparaginianu na SaeR, aktywując ją jako białko wiążące DNA (SaeR ~ P) 17. SaeR/S TCS reguluje ponad 20 genów, które przyczyniają się do patogenezy, w tym białka wiążące fibronektynę (FnBP), leukocydyny i koagulazę14,18,19,20. Cele można podzielić na cele genów o wysokim i niskim powinowactwie, które prawdopodobnie są indukowane, gdy poziom SaeR~P wzrasta pod wpływem jego sygnałów21. Aktywność SaeR/S jest kontrolowana przez inne regulatory ekspresji genów, takie jak system wykrywania kworum agr, białko represora toksyn (Rot) i alternatywny czynnik sigma B (SigB)22,23,24.

nuc jest zależnym od Sae genem wirulencji w Staphylococcus aureus i koduje termonukleazę (Nuc), która jest niezbędna do ucieczki z neutrofilnych extracellular traps (NETs) i do rozprzestrzeniania się w trakcie infekcji25,26. Ekspresja nuc jest również silnie pośrednio tłumiona przez CodY w obecności aminokwasów rozgałęzionych i GTP27, a bezpośrednio tłumiona przez gronkowcowe białko regulatora akcesoryjnego SarA28,29, na którego aktywność wpływa tlen (stan redoks) i pH30. Biorąc pod uwagę, że mutanty sae i nuc są atenuowane w mysich modelach infekcji, istnieje zainteresowanie opracowaniem interwencji chemicznych, które hamują ich odpowiadające im aktywności26,31. Mimo to nie ma informacji na temat ich regulacji podczas infekcji.

Fluorescencyjne reportery zostały użyte do monitorowania i ilościowego określania ekspresji genów na poziomie pojedynczej komórki. W niniejszym artykule przedstawiono metodę ilościowego oznaczania S. Ekspresja genu złocistego podczas infekcji, która w połączeniu z analizą transkryptomu in vitro i potężnymi technikami obrazowania, takimi jak rezonans magnetyczny (MRI) i spektroskopia rezonansu magnetycznego (MRS), może ujawnić, w jaki sposób fizjologia bakterii jest regulowana in vivo i względną obfitość składników odżywczych w niektórych niszach. Metodę można zastosować do każdego patogenu bakteryjnego z podatnym systemem genetycznym.

Przegląd wektora integrującego genom.

Wektor integrujący genom pRB4 zawiera po 500 par zasad z regionów górnego i dolnego pseudogenu S. aureus USA300 SAUSA300_0087, aby ułatwić rekombinację homologiczną. pRB4 pochodzi z wrażliwego na temperaturę szkieletu wektora pMAD zawierającego kasetę oporności na erytromycynę (ermC) i termostabilny gen beta-galaktozydazy bgaB do niebieskiego/białego badania przesiewowego rekombinantów32. Zmodyfikowany konstrukt reporterowy zawiera również marker oporności na chloramfenikol (cat) do selekcji po integracji genomu i eliminacji plazmidu, a także miejsca EcoRI i SmaI do fuzji regionu regulatorowego będącego przedmiotem zainteresowania z superfolderem białka zielonej fluorescencji (sGFP) (Figura 1). Wiadomo, że wybór miejsca wiązania rybosomów (RBS) wpływa na aktywność reportera i często wymaga empirycznej optymalizacji33. W związku z tym RBS nie jest dostarczany. W tym przypadku wykorzystuje się natywne miejsce wiązania rybosomów, aby zapewnić bardziej naturalny wzorzec ekspresji genów, ale można użyć innych miejsc.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania (IACUC) Uniwersytetu Georgetown.

1. Generacja fluorescencyjnego szczepu reporterowego

  1. Sekwencyjnie trawić integrujący genom wektor pRB4 za pomocą enzymów restrykcyjnych EcoRI i SmaI. Postępując zgodnie z protokołem producenta, należy przeprowadzić roztwarzanie przez noc za pomocą SmaI przy użyciu 1 μg pRB4 w temperaturze 25 °C, a następnie kontynuować drugie trawienie przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C, dodając EcoRI do mieszaniny reakcyjnej. Dezaktywować enzymy przez inkubację w temperaturze 65 °C przez 20 minut.
  2. PCR amplifikuje region regulatorowy będący przedmiotem zainteresowania z genomowego DNA (w tym przypadku fragment DNA o parach zasad ~ 350 zawierający region promotora termonukleazy [nuc]), zawierający miejsce restrykcyjne 5' EcoRI i miejsce restrykcyjne 3' SmaI. Sekwencja rozpoznawania SmaI musi znajdować się w ramce z translacyjnym kodonem start. W tym badaniu PCR przeprowadzono przy użyciu polimerazy DNA o wysokiej wierności zgodnie z zaleceniami producenta z starterem do przodu oRB015 (5'-atcattgaattccaaagtaaattataagttatac-3') i starterem odwrotnym oRB016 (5'-gggcataactaacacctctttctttttag-3'). Temperatura wyżarzania wynosiła 53 °C. Powstały fragment należy oczyścić za pomocą zestawu do czyszczenia PCR zgodnie z instrukcjami producenta.
  3. Trawić otrzymany produkt PCR za pomocą EcoRI i SmaI, jak wykonano w kroku 1.1, i ligować strawiony fragment DNA do tych samych miejsc pRB4 przy użyciu ligazy DNA T4 zgodnie z zaleceniami producenta w celu wytworzenia konstruktu integracyjnego. Wprowadzić mieszaninę ligacji do E. coli i potwierdzić sekwencję konstruktu.
  4. Elektropomuluj konstrukt do szczepu S. aureus RN4220, jak wcześniej opisano34. Krótko mówiąc, użyj 1 μg plazmidu z 70 μl elektrokompetentnych ogniw (100 Ω, 25 μF i 2,3 kV) w bulionie B2 (1% [w/v] hydrolizat kazeiny, 2,5% [w/v] ekstrakt drożdżowy, 2,5% [w/v] NaCl, 0,1% [w/v] K2PO4, 0,5% [w/v] Glukoza). Wybrać odporność na erytromycynę (Emr) w temperaturze dopuszczalnej (30 °C) na tryptycznym agarze sojowym (TSA) uzupełnionym erytromycyną (5 μg mL-1) i 5-bromo-4-chloro-3-indolilo-β-D-galaktopiranozydem (X-Gal; 80 μg mL-1). Powstałe transformanty są niebieskie ze względu na aktywność β-galaktozydazy kodowanej przez plazmid.
    nuta: Transfer DNA do izolatów klinicznych jest niezwykle trudny ze względu na silną barierę restrykcyjno-modyfikacyjną35. Tak więc S. aureus RN4220 został użyty jako pośredni biorca konstruktu fuzyjnego, ponieważ ma niedobór ograniczeń i jest wysoce transformowalny.
  5. Przenieś plazmid do szczepu S. aureus USA300 będącego przedmiotem zainteresowania za pomocą elektroporacji lub transdukcji za pośrednictwem fagów36 w temperaturze dopuszczalnej. Krótko mówiąc, rozpropaguj cząsteczki bakteriofaga Φ11 na szczepie dawcy za pomocą płytek TSA zawierających 5 mM CaCl2 przez noc w temperaturze 30 °C, a następnie sterylizuj przez filtrację przez filtr strzykawkowy z octanu celulozy 0,45 μM. Użyj lizatów do transdukcji szczepu S. aureus LAC do Emr.
    nuta: LAC jest szeroko stosowanym izolatem klinicznym, który wcześniej był wrażliwy na Em poprzez szeregowe przejście w pożywce TSB w celu wyleczenia szczepu natywnego plazmidu pUSA03, który nadaje Emr 37,38.
  6. Zintegruj konstrukt za pomocą dwóch, następujących po sobie zdarzeń rekombinacji homologicznej z chromosomem, jak opisano wcześniej32. Rekombinanty są odporne na chloramfenikol (Cmr) na płytkach TSA zawierających 5 μg mL-1 chloramfenikolu, wrażliwego na erytromycynę (Erms) i już nie niebieskiego.
    UWAGA: Jeśli to możliwe, ponownie wprowadź oznaczoną fuzję do USA300 poprzez transdukcję za pośrednictwem faga, aby uniknąć akumulacji mutacji związanych z pasażem szczepu in vitro39 i zmianami temperatury.

2. Zakażenie zwierząt: przygotowanie inokulum, zakażenie ogólnoustrojowe i przetwarzanie tkanek

  1. Przygotowanie inokulum bakteryjnego
    1. Szczepy Streak S. aureus będące przedmiotem zainteresowania do izolacji na płytkach z agarem z krwi z zamrożonego bulionu glicerynowego. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 16–24 godziny w celu potwierdzenia fenotypów hemolitycznych na podstawie ich zdolności do lizy czerwonych krwinek (RBC) i tworzenia przezroczystych stref.
    2. Zainicjuj nocne hodowle, zaszczepiając pojedyncze kolonie każdego szczepu do 4 ml tryptycznego bulionu sojowego (TSB) w sterylnych szklanych probówkach. Obracaj rury w temperaturze 37 °C przez 16–24 godzin w rolce rurowej ustawionej pod kątem około 70° i 70 obrotów na minutę [RPM].
    3. Użyć spektrofotometru do zmierzenia gęstości optycznej kultur z kroku 2.1.2 przy długości fali 600 nm (OD600). Użyj sterylnego podłoża jako odniesienia optycznego (ślepego namiaru). Rozcieńczyć te komórki do OD600 0,05 w 25 ml sterylnego tryptycznego bulionu sojowego (TSB) w oddzielnych 125 ml kolbach DeLonga (stosunek kolby 5:1 do objętości) i inkubować kultury w łaźni wodnej (dla prawidłowego przenoszenia ciepła do kultur), wytrząsając z prędkością 280 obr./min i ustawiając na 37 °C.
      UWAGA: Wzrost inokulum może być przeprowadzony na różne sposoby; Przedstawiono jedną z metod hodowli komórek do fazy wykładniczej. Niezależnie od tego, ważne jest, aby konsekwentnie stosować tę samą metodę do przygotowania komórek do zaszczepienia.
    4. Przy OD600 ~1 ponownie rozcieńczyć komórki na świeżej pożywce do początkowego OD600 0,05, aby upewnić się, że komórki osiągną fazę wykładniczą i że czynniki, które gromadzą się podczas inkubacji przez noc, zostały zredukowane do poziomów fazy wykładniczej.
    5. Zbierz komórki w fazie wykładniczej (OD600 ~ 0,6–0,8), wirując przy 3,000 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    6. Przemyć granulki dwukrotnie w równoważnej objętości sterylnego 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS; pH 7,4).
    7. Zawiesić komórki w 1x PBS (pH 7,4) do stężenia 1 x 108 jednostek tworzących kolonie (CFU) mL-1 lub odpowiednio do pożądanego eksperymentu.
      UWAGA: ważne jest, aby określić związek między OD600 a CFU mL-1 dla każdego szczepu będącego przedmiotem zainteresowania, ponieważ zależne od szczepu zmiany wielkości i kształtu komórek mogą wpływać na właściwości rozpraszania światła, a ostatecznie na dawkę infekcji.
  2. Przygotowanie zwierząt i infekcja bakteryjna
    1. Aklimatyzuj myszy przez 7 dni na oczyszczonej diecie AIN-93. Dieta została opracowana tak, aby zapewnić odpowiednie odżywianie przy jednoczesnym zmniejszeniu autofluorescencji tkanek związanej ze spożyciem składników roślinnych stosowanych w standardowej klasie chow40.
      nuta: Wykorzystuje się tutaj samice myszy C57/BL6 (w wieku 6-8 tygodni), ale szczep myszy i płeć będą zależeć od badania.
    2. Przed infekcją rozszerz żyły ogona myszy letnią wodą.
    3. Zakażone zwierzęta należy wprowadzić w postaci wstrzyknięcia 100 μl inokulum bakteryjnego przez żyły ogonowe w celu wywołania infekcji ogólnoustrojowej. W przypadku wykonywania cytometrii przepływowej należy zachować podwielokrotność początkowego inokulum (patrz punkt 4).
    4. Codziennie monitoruj zwierzęta i oceniaj ich stan zdrowia za pomocą systemu monitorowania sprawdzonego i zatwierdzonego przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Wykorzystania.
    5. Pozwól, aby infekcja postępowała przez pożądany czas. W tym przypadku eksperymenty są przerywane 3 dni po infekcji.
      nuta: W tych warunkach ropnie składają się ze społeczności bakterii z ropniem gronkowcowym, otoczonej złogami fibryny i otoczonej koncentrycznymi warstwami komórek odpornościowych5,41.
  3. Pobieranie narządów i przetwarzanie tkanek
    1. Eutanazja zwierząt przez wdychanie CO2 i zwichnięcie szyjki macicy jako metoda wtórna i przeprowadzenie sekcji zwłok.
    2. Pobrać nerkę (po prawej) i inne ważne narządy (serce, wątrobę, płuca, śledzionę) i przenieść do 15 ml probówek polipropylenowych zawierających 10% buforowaną formalinę. Przejdź do kroku 2.3.4 poniżej.
    3. Przenieś lewą nerkę do sterylnej, odpornej na uderzenia probówki o pojemności 2 ml zawierającej ~500 μl kulek krzemionkowych o średnicy 2 mm i 1 ml sterylnego 1x PBS (pH 7,4). Przejdź do kroku 4.2 z tym narządem.
    4. Pozwól narządom z kroku 2.3.2 utrwalić się w ciemności w temperaturze pokojowej, delikatnie potrząsając lub obracając, przez co najmniej 24 godziny, ale nie dłużej niż 48 godzin.
    5. Osadzać narządy w klarownym podłożu do zamrażania tkanek i przechowywać je w temperaturze -80 °C.
    6. Za pomocą kriostatu pokrój tkankę na plastry o grubości 10 μm.
    7. Wysuszyć skrawki na wstępnie oczyszczonym, naładowanym szkiełku podstawowym przez 20 minut w ciemności, nałożyć twarde podłoże mocujące z barwnikiem 4',6-diamidino-2-fenyloindolowym (DAPI) i nałożyć szkiełko nakrywkowe. Zamontowane szkiełka utwardzić w temperaturze pokojowej przez noc i przenieść do temperatury 4 °C w celu długotrwałego przechowywania.

3. Laserowa skaningowa mikroskopia konfokalna i przetwarzanie obrazów

  1. Zbadaj zamontowane szkiełka, aby zlokalizować zmiany chorobowe za pomocą laserów odpowiednich dla używanego reportera fluorescencyjnego. W tym przypadku używane są sygnały fluorescencyjne zielony (GFP), czerwony (tdTomato) i niebieski (DAPI).
  2. Uzyskaj obraz za pomocą odpowiedniego obiektywu do wizualizacji pojedynczych komórek (np. zwykle używane są obiektywy 20x lub 40x).
  3. Zmierz natężenie fluorescencji w obrazach konfokalnych.
    1. Otwórz obraz konfokalny na obrazie J i dostosuj jasność/kontrast, aby prawidłowo zobrazować sygnał fluorescencyjny zmiany.
    2. Zdefiniuj obszar zainteresowania i korzystając z opcji Thresholding, ustaw dolną i górną granicę fluorescencji zgodnie z potrzebami.
    3. Zdefiniuj środek ciężkości, wybierając opcję Obszar → Średnia wartość szarości → Środek ciężkości → Ogranicz do progu na karcie Analizuj na obrazie J.
    4. Ekstrahować wartość intensywności fluorescencji środka ciężkości lub mierzyć średnią intensywność fluorescencji w danej zmianie na jednostkę powierzchni (średnia intensywność fluorescencji, MFI) dla GFP i tdTomato. W tym przypadku użyto powierzchni o wielkości jednegoμm2.
      nuta: Druga analiza z zaślepioną próbą minimalizuje błąd systematyczny, gdy znana jest tożsamość próbki.
    5. Wykreśl dane i wykonaj odpowiednie analizy statystyczne dla każdego porównania.

4. Analiza cytometrii przepływowej

  1. (Opcjonalnie) Określić aktywność fuzyjną inokulum w dniu zakażenia (z sekcji 2.2.3)
    1. Do 899 μL 1x sterylnego PBS (pH 7,4) dodaj 100 μL każdego inokulum i 1 μL barwnika kwasu nukleinowego przenikanego przez błonę (patrz tabela materiałów). Jako kontrolę należy dołączyć próbkę pozbawioną barwienia kwasem nukleinowym.
    2. Wykonać cytometrię przepływową na wszystkich próbkach.
      nuta: W pierwszym eksperymencie przydatne jest uwzględnienie tylko sterowania wektorowego dla fuzji będącej przedmiotem zainteresowania, aby określić właściwe napięcie do użycia. Wyraźna separacja między próbkami dodatnimi i ujemnymi jest niezbędna do analizy danych, co wskazuje, że osoba zgłaszająca znajduje się znacznie powyżej sygnału tła.
    3. Aby zidentyfikować populację bakterii, wykreśl zdarzenia za pomocą barwienia kwasem nukleinowym (oś y) i rozproszenia do przodu (oś x).
    4. Narysuj bramkę inkluzji wokół zdarzeń, które są zarówno dodatnie pod względem barwienia kwasem nukleinowym, jak i mają prawidłowy rozmiar bakterii na podstawie rozproszenia do przodu (od 0,5 do 2,0 μm dla S. aureus).
      nuta: Bądź rygorystyczny podczas identyfikowania tej populacji, ponieważ bardzo ważne jest uwzględnienie zdarzeń, które wyraźnie mieszczą się w tych parametrach. Należy upewnić się, że bramka ta wyklucza wszystkie zdarzenia dotyczące kontroli ujemnych w innych warunkach. W tym badaniu około 70% populacji komórek spełniło te wymagania w analizie.
  2. Analiza próbek tkanek po uśmierceniu:
    1. Poddać zwierzęta eutanazji, pobrać lewe nerki (patrz krok 2.3) i przenieść do probówek do ubijania kulek zawierających 1 ml 1x sterylnego PBS (pH 7,4) i 250 μl 2 mm kulek borokrzemianowych.
    2. Rozbijaj tkanki, aby uwolnić komórki bakteryjne. W przypadku nerek użyj homogenizatora, aby rozbić komórki. W tym przypadku zastosowano trzy 30-sekundowe serie przy 6800 obr./min z 1-minutowymi okresami chłodzenia na mokrym lodzie między cyklami, aby zminimalizować nagrzewanie się próbek.
    3. Większe resztki tkanki należy rozdrabniać przez odwirowywanie przy 250 x g przez 3 minuty w mikrowirówce stołowej schłodzonej do temperatury 4 °C.
      nuta: Zazwyczaj na dnie rurki znajduje się granulka komórki, a na górze warstwa pływających zanieczyszczeń. Środkowa warstwa wodna zawiera komórki bakteryjne.
    4. Przenieść 10 μl z warstwy wodnej do czystej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml zawierającej 1 μl barwienia kwasem nukleinowym w 989 μl PBS (całkowita objętość 1 ml).
    5. Przeprowadzić cytometrię przepływową przy użyciu tych samych parametrów pozyskiwania danych i bramkowania, jak w przypadku początkowej inokulacji.
      nuta: Liczba komórek bakteryjnych będzie bardzo niska, ponieważ próbka zawiera głównie szczątki tkanek. Opcja "Bramka na żywo" może być również używana, jeśli komórki są dodatnie pod względem barwienia kwasami nukleinowymi i bramkowane rozmiarem, gdy dane są ładowane do aplikacji. Pomoże to również przeanalizować więcej zdarzeń docelowych i zmniejszyć rozmiar pliku. Zlicza się prawie milion zdarzeń na próbkę, ale może być konieczne zwiększenie liczby zdarzeń w zależności od ciężkości infekcji i wielkości analizowanej tkanki.
    6. Analiza danych: Określić średnią intensywność fluorescencji (MFI) dla każdego fluoroforu w danej próbce, korzystając z bramek inkluzyjnych określonych w sekcji 4.1.4. Normalizacja próbek w oprogramowaniu do analizy przepływu w celu uzyskania liczby zdarzeń. W analizie zwykle wystarcza 10 000 zliczeń.
      nuta: Nierzadko zdarza się, że próbki zawierają mniej niż tę liczbę zdarzeń, ponieważ zależy to od powstawania ropni i ciężkości infekcji. Stosując to podejście, w zakażonej tkance zwykle znajduje się 500-40 000 zdarzeń.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opracowaliśmy plazmid pochodzący z pMAD32, który może dostarczyć dowolny konstrukt fuzji reporterowej do chromosomu poprzez podwójną krzyżową rekombinację homologiczną (Rysunek 1). Konstrukt ten pozwala na analizę ilościową dowolnego regionu regulatorowego, który wspiera produkcję białka GFP i sygnału fluorescencyjnego powyżej tła. Plazmid nadaje oporność na ampicylinę (Apr) do utrzymania i namnażania w E. coli oraz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bakteryjne choroby zakaźne stanowią coraz większy problem zdrowotny na całym świecie ze względu na nabywanie determinantów oporności na antybiotyki46. Ponieważ adaptacja do środowiska gospodarza jest niezbędna do wzrostu i przetrwania podczas infekcji, strategie ukierunkowane na programy ekspresji genów, które zwiększają zdolność patogenów, mogą okazać się przydatne terapeutycznie. Jednym z takich programów jest zestaw genów kontrolowanych przez dwuskładnikowy system SaeR/S (TCS), który jak wykaza...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Alexandrowi Horswillowi za dar fuzji PsarAP1-tdTomato oraz Karen Creswell za pomoc w analizie cytometrii przepływowej. Dziękujemy również Alyssie King za porady dotyczące analizy statystycznej. Praca ta została częściowo sfinansowana przez NIH Exploratory/Developmental Research Award (grant AI123708) oraz fundusze na rozpoczęcie pracy przez wydział dla SRB. Grantodawcy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i interpretacji danych ani w podejmowaniu decyzji o przesłaniu pracy do publikacji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
5% krwi owczejHardy Diagnostics (Santa Maria, Kalifornia)A10
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galaktopiranozyd (X-Gal)ThermoScientificR0402
AmpicylinaFisher ScientificBP1760-25
C57Bl/6 MyszyCharles RiverNA
ChloramfenikolSigma-AldrichC-0378
konfokalny laserowy mikroskop skaningowyZeissNA
kriostat mikrotomThermo ScientificNA
Culture, CapVWR International2005-02512
D+2:25NA OligoIntegrated DNA Technologies (Coralville, Iowa)NA
DNA LigazaNew England BiolabsM0202S
ErytromycynaSigma-AldrichE5389
Analizator przepływuKoraliki szklane Becton DickinsonNA
SigmaZ273627
Miniprep, plazmidPromegaA1220
orbitalna kąpiel wodna wstrząsającaNowy Brunszwik InnovaNA
Oczyszczanie PCRQIagen28106
Bufor fosforanowy Saline (PBS)Cellgrow46-013-CM
Czytnik płytekTecanNA
Homogenizator Precellys 24Bertin LaboratoriesNA
pUC57-KanGenScript (Piscataway, NJ)NA
Q5 Taq DNA Polimeraza NewEngland Biolabs (Ipswich, MA)M0491S
Enzymy restrykcyjneNowość England Biolabs (Ipswich, MA)R0150S (PvuI), R3136S (BamHI), R0144S (BglII), R3131S (NheI), R0101S (EcoRI), R0141S (SmaI).
Odwrotna transkryptazaNew England BioLabsE6300L
Sanger SekwencjonowanieGenewiz (Germantown, MD)NA
Sub Xero przezroczyste medium do zamrażania tkanekMercedes Medical
Superfrost Plus FisherScientific12-550-15
superloopGE Lifesciences18111382
Strzykawka, filtrVWR International28145-481
Syto 40Thermo Fisher ScientificS11351Membrana przepuszczalna barwnik kwasu nukleinowego
TetracyklinaSigma-AldrichT7660
Tryptyczny bulion sojowyVWR90000-376
SpektrofotometrBeckman Coulter-DU350NA
Vectashield Antifade Medium montażowe z DAPIVector LaboratoriesH-1500
Szkiełka mikroskopowe MER5000 UV

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hood, M. I., Skaar, E. P. Nutritional immunity: transition metals at the pathogen-host interface. Nature Reviews Microbiology. 10 (8), 525-537 (2012).
  2. Lowy, F. Staphylococcus aureus infections. The New England Journal of Medicine. 339 (8), 520-532 (1998).
  3. Grosser, M. R., et al. Genetic requirements for Staphylococcus aureus nitric oxide resistance and virulence. PLoS Pathogen. 14 (3), 1006907(2018).
  4. Valentino, M., et al. Genes contributing to Staphylococcus aureus fitness in abscess- and infection-related ecologies. MBio. 5 (5), 01714-01729 (2014).
  5. Cheng, A., et al. Genetic requirements for Staphylococcus aureus abscess formation and persistence in host tissues. FASEB Journal. 23 (10), 3393-3404 (2009).
  6. Meyers, L. A., Levin, B. R., Richardson, A. R., Stojiljkovic, I. Epidemiology, hypermutation, within-host evolution and the virulence of Neisseria meningitidis. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 270 (1525), 1667-1677 (2003).
  7. Balasubramanian, D., et al. Staphylococcus aureus Coordinates Leukocidin Expression and Pathogenesis by Sensing Metabolic Fluxes via RpiRc. MBio. 7 (3), 00818(2016).
  8. Geiger, T., Goerke, C., Mainiero, M., Kraus, D., Wolz, C. The virulence regulator Sae of Staphylococcus aureus.: promoter activities and response to phagocytosis-related signals. Journal of Bacteriology. 190 (10), 3419-3428 (2008).
  9. Weiss, A., Broach, W. H., Shaw, L. N. Characterizing the transcriptional adaptation of Staphylococcus aureus. to stationary phase growth. Pathogens and Disease. 74 (5), (2016).
  10. Balaban, N., Novick, R. P. Autocrine regulation of toxin synthesis by Staphylococcus aureus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (5), 1619-1623 (1995).
  11. Pohl, K., et al. CodY in Staphylococcus aureus: a regulatory link between metabolism and virulence gene expression. Journal of Bacteriology. 191 (9), 2953-2963 (2009).
  12. Majerczyk, C. D., et al. Staphylococcus aureus CodY negatively regulates virulence gene expression. Journal of Bacteriology. 190 (7), 2257-2265 (2008).
  13. McNamara, P. J., Milligan-Monroe, K. C., Khalili, S., Proctor, R. A. Identification, cloning, and initial characterization of rot, a locus encoding a regulator of virulence factor expression in Staphylococcus aureus. Journal of Bacteriology. 182 (11), 3197-3203 (2000).
  14. Liu, Q., Yeo, W. S., Bae, T. The SaeRS Two-Component System of Staphylococcus aureus. Genes (Basel). 7 (10), 81(2016).
  15. Giraudo, A., Calzolari, A., Cataldi, A., Bogni, C., Nagel, R. The sae locus of Staphylococcus aureus encodes a two-component regulatory system. FEMS Microbiology Letters. 177 (1), 15-22 (1999).
  16. Cho, H., et al. Calprotectin Increases the Activity of the SaeRS Two Component System and Murine Mortality during Staphylococcus aureus Infections. PLoS Pathogen. 11 (7), 1005026(2015).
  17. Sun, F., et al. In the Staphylococcus aureus two-component system sae, the response regulator SaeR binds to a direct repeat sequence and DNA binding requires phosphorylation by the sensor kinase SaeS. Journal of Bacteriology. 192 (8), 2111-2127 (2010).
  18. Liang, X., et al. Inactivation of a two-component signal transduction system, SaeRS, eliminates adherence and attenuates virulence of Staphylococcus aureus. Infection and Immunity. 74 (8), 4655-4665 (2006).
  19. Giraudo, A. T., Cheung, A. L., Nagel, R. The sae locus of Staphylococcus aureus controls exoprotein synthesis at the transcriptional level. Archives of Microbiology. 168 (1), 53-58 (1997).
  20. Flack, C. E., et al. Differential regulation of staphylococcal virulence by the sensor kinase SaeS in response to neutrophil-derived stimuli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (19), 2037-2045 (2014).
  21. Mainiero, M., et al. Differential target gene activation by the Staphylococcus aureus two-component system saeRS. Journal of Bacteriology. 192 (3), 613-623 (2010).
  22. Li, D., Cheung, A. Repression of hla by rot is dependent on sae in Staphylococcus aureus. Infection and Immunity. 76 (3), 1068-1075 (2008).
  23. Bischoff, M., et al. Microarray-based analysis of the Staphylococcus aureus sigmaB regulon. Journal of Bacteriology. 186 (13), 4085-4099 (2004).
  24. Novick, R., Jiang, D. The staphylococcal saeRS system coordinates environmental signals with agr quorum sensing. Microbiology. 149, Pt 10 2709-2717 (2003).
  25. Olson, M. E., et al. Staphylococcus aureus nuclease is an SaeRS-dependent virulence factor. Infection and Immunity. 81 (4), 1316-1324 (2013).
  26. Berends, E., et al. Nuclease expression by Staphylococcus aureus facilitates escape from neutrophil extracellular traps. Journal of Innate Immunity. 2 (6), 576-587 (2010).
  27. Waters, N. R., et al. A spectrum of CodY activities drives metabolic reorganization and virulence gene expression in Staphylococcus aureus. Molecular Microbiology. 101 (3), 495-514 (2016).
  28. Cassat, J., et al. Transcriptional profiling of a Staphylococcus aureus clinical isolate and its isogenic agr and sarA mutants reveals global differences in comparison to the laboratory strain RN6390. Microbiology. 152, Pt 10 3075-3090 (2006).
  29. Kiedrowski, M., et al. Nuclease modulates biofilm formation in community-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus. PLoS One. 6 (11), 26714(2011).
  30. Fujimoto, D. F., et al. Staphylococcus aureus SarA is a regulatory protein responsive to redox and pH that can support bacteriophage lambda integrase-mediated excision/recombination. Molecular Microbiology. 74 (6), 1445-1458 (2009).
  31. Yeo, W. S., et al. The FDA-approved anti-cancer drugs, streptozotocin and floxuridine, reduce the virulence of Staphylococcus aureus. Scientific Reports. 8 (1), 2521(2018).
  32. Arnaud, M., Chastanet, A., Débarbouillé, M. New vector for efficient allelic replacement in naturally nontransformable, low-GC-content, Gram-positive bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 70 (11), 6887-6891 (2004).
  33. Malone, C. L., et al. Fluorescent reporters for Staphylococcus aureus. Journal of Microbiological Methods. 77 (3), 251-260 (2009).
  34. Schenk, S., Laddaga, R. A. Improved method for electroporation of Staphylococcus aureus. FEMS Microbiology Letters. 73 (1-2), 133-138 (1992).
  35. Monk, I. R., Foster, T. J. Genetic manipulation of Staphylococci-breaking through the barrier. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 2, 49(2012).
  36. Novick, R. P. Genetic systems in staphylococci. Methods in Enzymology. 204, 587-636 (1991).
  37. Diep, B. A., et al. Complete genome sequence of USA300, an epidemic clone of community-acquired meticillin-resistant Staphylococcus aureus. Lancet. 367 (9512), 731-739 (2006).
  38. Boles, B. R., Thoendel, M., Roth, A. J., Horswill, A. R. Identification of genes involved in polysaccharide-independent Staphylococcus aureus biofilm formation. PLoS One. 5 (4), 10146(2010).
  39. Villaruz, A. E., et al. A point mutation in the agr locus rather than expression of the Panton-Valentine leukocidin caused previously reported phenotypes in Staphylococcus aureus pneumonia and gene regulation. Journal of Infect Diseases. 200 (5), 724-734 (2009).
  40. Reeves, P. G., Nielsen, F. H., Fahey, G. C. J. AIN-93 purified diets for laboratory rodents: final report of the American Institute of Nutrition ad hoc writing committee on the reformulation of the AIN-76A rodent diet. Journal of Nutrition. 123 (11), 1939-1951 (1993).
  41. Thomer, L., Schneewind, O., Missiakas, D. Pathogenesis of Staphylococcus aureus Bloodstream Infections. Annual Review of Pathology. 11, 343-364 (2016).
  42. Olson, M., et al. Staphylococcus aureus nuclease is an SaeRS-dependent virulence factor. Infection and Immunity. 81 (4), 1316-1324 (2013).
  43. Thammavongsa, V., Missiakas, D., Schneewind, O. Staphylococcus aureus degrades neutrophil extracellular traps to promote immune cell death. Science. 342 (6160), 863-866 (2013).
  44. Cheung, A. L., Nast, C. C., Bayer, A. S. Selective activation of sar promoters with the use of green fluorescent protein transcriptional fusions as the detection system in the rabbit endocarditis model. Infection and Immunity. 66 (12), 5988-5993 (1998).
  45. Pilsczek, F. H., et al. A novel mechanism of rapid nuclear neutrophil extracellular trap formation in response to Staphylococcus aureus. Journal of Immunology. 185 (12), 7413-7425 (2010).
  46. Uhlemann, A. C., Otto, M., Lowy, F. D., DeLeo, F. R. Evolution of community- and healthcare-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Infection, Genetics and Evolution. 21, 563-574 (2014).
  47. Voyich, J. M., et al. The SaeR/S gene regulatory system is essential for innate immune evasion by Staphylococcus aureus. Journal of Infectious Diseases. 199 (11), 1698-1706 (2009).
  48. Cheng, A., DeDent, A., Schneewind, O., Missiakas, D. A play in four acts: Staphylococcus aureus. abscess formation. Trends in Microbiology. 19 (5), 225-232 (2011).
  49. Balasubramanian, D., Harper, L., Shopsin, B., Torres, V. J. Staphylococcus aureus pathogenesis in diverse host environments. Pathogens and Disease. 75 (1), (2017).
  50. Vitko, N. P., Grosser, M. R., Khatri, D., Thurlow, L. R., Richardson, A. R. Expanded Glucose Import Capability Affords Staphylococcus aureus Optimized Glycolytic Flux during Infection. MBio. 7 (3), 00296(2016).
  51. Landete, J. M., et al. Use of anaerobic green fluorescent protein versus green fluorescent protein as reporter in lactic acid bacteria. Applied Microbiology and Biotechnol. 99 (16), 6865-6877 (2015).
  52. Buckley, A. M., et al. Lighting Up Clostridium Difficile: Reporting Gene Expression Using Fluorescent Lov Domains. Scientific Reports. 6, 23463(2016).
  53. Bose, J. L. Genetic manipulation of staphylococci. Methods in Molecular Biology. 1106, 101-111 (2014).
  54. Krute, C. N., et al. Generation of a stable plasmid for in vitro and in vivo studies of Staphylococcus. Applied and Environmental Microbiology. , 02370(2016).
  55. Cassat, J. E., et al. Integrated molecular imaging reveals tissue heterogeneity driving host-pathogen interactions. Science Translational Medicine. 10 (432), 6361(2018).
  56. Handlogten, M. E., Hong, S. P., Westhoff, C. M., Weiner, I. D. Apical ammonia transport by the mouse inner medullary collecting duct cell (mIMCD-3). American Journal of Physiology-Renal Physiology. 289 (2), 347-358 (2005).
  57. Hijmans, B. S., Grefhorst, A., Oosterveer, M. H., Groen, A. K. Zonation of glucose and fatty acid metabolism in the liver: mechanism and metabolic consequences. Biochimie Journal. 96, 121-129 (2014).
  58. Davis, K. M., Mohammadi, S., Isberg, R. R. Community behavior and spatial regulation within a bacterial microcolony in deep tissue sites serves to protect against host attack. Cell Host & Microbe. 17 (1), 21-31 (2015).
  59. Stenman, J. M., et al. Canonical Wnt signaling regulates organ-specific assembly and differentiation of CNS vasculature. Science. 322 (5905), 1247-1250 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Bacterial Gene RegulationFluorescent Reporter AssayConfocal MicroscopyFlow CytometryStaphylococcus aureusTissue SectioningFluorescence Intensity MeasurementSpatial Gene ExpressionIn Situ AnalysisGFP Fusion Protein

Powiązane artykuły