Artykuł metodologiczny

Synteza i biokoniugacja odczynników tiolowo-reaktywnych do tworzenia immunokoniugatów modyfikowanych selektywnie

9.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59063

⸱

6 marca 2019

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Hunter College of the City University of New York, 2Ph.D. Program in Chemistry, Graduate Center of the City University of New York, 3Department of Radiology, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 4Department of Radiology, Weill Cornell Medical College

W tym artykule

Podsumowanie

W tym protokole opiszemy syntezę PODS, odczynnika na bazie fenyoksadiazolylu metylosulfonu do selektywnego przyłączania ładunków do tioli biomolekuł, szczególnie przeciwciał. Ponadto opiszemy syntezę i charakterystykę dwufunkcyjnego chelatora nośnego POD oraz jego koniugację z modelowym przeciwciałem.

Streszczenie

Dwufunkcyjne sondy zawierające maleimid są używane od dziesięcioleci do selektywnej modyfikacji tioli w biomolekułach, zwłaszcza przeciwciał. Jednak koniugaty na bazie maleimidu wykazują ograniczoną stabilność in vivo, ponieważ wiązanie sukcynimidylowo-tioeterowe może ulegać reakcji retro-Michaela. To oczywiście może prowadzić do uwolnienia ładunku radioaktywnego lub jego wymiany z biomolekułami zawierającymi tiol w obiegu. Oba te procesy mogą powodować podwyższone stężenia aktywności w zdrowych narządach, a także zmniejszone stężenia aktywności w tkankach docelowych, co skutkuje zmniejszonym kontrastem obrazowania i niższymi wskaźnikami terapeutycznymi. W 2018 r. informowaliśmy o stworzeniu modułowego, stabilnego i łatwo dostępnego odczynnika fenyloksadiazolylosulfonu metylu — nazwanego "PODS" — jako platformy do biokoniugacji na bazie tiolu. Wyraźnie wykazaliśmy, że biokoniugacje selektywne miejscowo oparte na PODS odtwarzają i solidnie tworzą jednorodne, dobrze zdefiniowane, wysoce immunoreaktywne i wysoce stabilne radioimmunokoniugaty. Co więcej, eksperymenty przedkliniczne na mysich modelach raka jelita grubego wykazały, że te selektywnie znakowane miejscowo radioimmunokoniugaty wykazują znacznie lepszą wydajność in vivo w porównaniu z przeciwciałami znakowanymi radioaktywnie syntetyzowanymi za pomocą koniugacji na bazie maleimidu. W tym protokole opiszemy czteroetapową syntezę PODS, stworzenie dwufunkcyjnego wariantu wszechobecnego chelatora DOTA (PODS-DOTA) z PODS oraz koniugację PODS-DOTA z przeciwciałem ukierunkowanym na HER2 trastuzumabem.

Wprowadzenie

Chemicy radiofarmaceutyczni od dawna wykorzystują selektywność i swoistość przeciwciał dla biomarkerów choroby zarówno w obrazowaniu jądrowym, jak i celowanej radioterapii1. Zdecydowanie najpowszechniejsze podejście do znakowania radioizotopowego przeciwciał opiera się na bezkrytycznym przyłączaniu znakowanych radioaktywnie grup protetycznych lub chelatatorów radiometali do aminokwasów – najczęściej lizyn – w strukturze immunoglobuliny (Rysunek 1A)2. Chociaż ta strategia jest z pewnością skuteczna, jej losowy, niespecyficzny dla witryny charakter może powodować problemy. W szczególności, tradycyjne podejścia do biokoniugacji wytwarzają słabo zdefiniowane i heterogeniczne immunokoniugaty złożone z mieszanin tysięcy różnych regioizomerów, z których każdy ma swój własny zestaw właściwości biologicznych i farmakologicznych3. Co więcej, losowa biokoniugacja może utrudniać immunoreaktywność przeciwciał, jeśli ładunek zostanie przyłączony do domen wiążących antygen immunoglobuliny.

Na przestrzeni lat opracowano różne strategie biokoniugacji specyficzne dla danego miejsca i selektywne dla danego miejsca w celu rozwiązania tych problemów4,5. Najczęstsze z tych podejść opiera się na ligacji sond zawierających maleimid do grup sulfhydrylowych cystein (Rysunek 1B). Przeciwciała IgG1 naturalnie zawierają 4 międzyłańcuchowe mostki dwusiarczkowe, wiązania, które można selektywnie redukować w celu uzyskania wolnych tioli zdolnych do przechodzenia reakcji addycji Michaela z maleimidami w celu utworzenia wiązań tioeterowych sukcynimidylu. Stosowanie tioli i maleimidów jest z pewnością postępem w stosunku do tradycyjnych metod, a obecnie dostępna jest szeroka gama syntonów zawierających maleimid i dwufunkcyjnych chelatorów. Należy jednak zauważyć, że metodologia ta ma również poważne ograniczenia. Immunokoniugaty na bazie maleimidów wykazują ograniczoną stabilność in vivo, ponieważ wiązanie tioeterowe może ulegać reakcji retro-Michaela (Rysunek 2)6,7,8,9,10. To oczywiście może prowadzić do uwolnienia ładunku radioaktywnego lub jego wymiany z biomolekułami zawierającymi tiole w obiegu (np. glutationem lub albuminą surowicy). Oba te procesy mogą zwiększać stężenia aktywności w zdrowych narządach, a także zmniejszać stężenia aktywności w tkankach docelowych, co skutkuje zmniejszeniem kontrastu obrazowania i niższymi wskaźnikami terapeutycznymi. W celu obejścia tych problemów opracowano kilka alternatywnych odczynników reagujących z tiolami, w tym tosylany, bromo- i jodoacetyle oraz sulfony winylu11,12,13,14,15,16,17. Jednak wszystkie te podejścia mają ograniczenia, które utrudniają ich powszechne zastosowanie.

Około pięć lat temu, laboratorium zmarłego Carlosa Barbasa III w Instytucie Badawczym Scripps zapoczątkowało użycie sulfonów metylu fenyloksadiazolylu jako odczynników do selektywnego tworzenia wysoce stabilnych połączeń z tiolami (Rysunek 1C i Rysunek 3)18,19. Autorzy wykorzystali wariant fluoresceiny zawierający fenyloksadiazolyl metylosulfon do modyfikacji kilku przeciwciał zmodyfikowanych tak, aby zawierały wolne reszty cysteiny, ostatecznie wytwarzając immunokoniugaty o wyższej stabilności niż analogiczne konstrukty stworzone przy użyciu sond na bazie maleimidu. Widząc tę obiecującą pracę, byliśmy nieco zaskoczeni, że ta technologia była rzadko stosowana w radiochemii i nie była jeszcze w ogóle stosowana w syntezie dwufunkcyjnych chelatorów lub radioimmunokoniugatów20,21. Ten brak zastosowań szybko jednak zaczął nabierać sensu: kilka prób pozyskania odczynnika od Sigma-Aldrich zakończyło się otrzymaniem złożonych mieszanin produktów degradacji zawierających <15% pożądanego związku. Ponadto, samodzielna synteza zgłoszonego odczynnika również nie była realistyczną opcją, ponieważ opublikowana ścieżka syntezy jest nieco kłopotliwa i wymaga wyrafinowanego sprzętu do chemii organicznej, którego większość laboratoriów radiochemicznych i obrazowania molekularnego – w tym nasze – po prostu nie posiada.

W odpowiedzi na te przeszkody, postanowiliśmy stworzyć łatwo dostępny i wysoce stabilny odczynnik fenyloksadiazolylosulfonu metylu, który można uzyskać za pomocą solidnej i dość łatwej metody syntezy. Na początku tego roku informowaliśmy o stworzeniu modułowego, stabilnego i łatwo dostępnego odczynnika fenyloksadiazolylosulfonu metylu - nazwanego "PODS" - jako platformy do biokoniugacji na bazie tiolu (Rysunek 1C i Rysunek 3)22. Kluczowa różnica między PODS a odczynnikiem opisanym przez Barbas i wsp. polega na tym, że pierwszy z nich wykorzystuje pierścień anilinowy przyłączony do ugrupowania fenyloksadiazolylu metylosulfonu, podczas gdy drugi zawiera fenol w tej samej pozycji (Ryc. 4). Zmiana ta ułatwia prostszą i bardziej dostępną drogę syntezy, a także – jeśli nasze doświadczenia z dostępnym na rynku związkiem są emblematyczne – bardziej stabilny odczynnik końcowy. W tej pracy zsyntetyzowaliśmy również parę dwufunkcyjnych chelatorów zawierających PODS - PODS-DFO i PODS-CHX-A''-DTPA - aby ułatwić tworzenie odpowiednio 89radioimmunokoniugatów znakowanych Zr i 177Lu. Jak będziemy omawiać, wykazaliśmy, że biokoniugacje selektywne miejscowo oparte na PODS odtwarzają i solidnie tworzą jednorodne, dobrze zdefiniowane, wysoce immunoreaktywne i wysoce stabilne radioimmunokoniugaty. Co więcej, eksperymenty przedkliniczne na mysich modelach raka jelita grubego wykazały, że te selektywnie znakowane radioimmunokoniugaty wykazują lepszą wydajność in vivo w porównaniu z przeciwciałami znakowanymi radioaktywnie syntetyzowanymi za pomocą koniugacji na bazie maleimidu.

Nadrzędnym celem tej pracy jest ułatwienie tworzenia dobrze zdefiniowanych, jednorodnych, wysoce stabilnych i wysoce immunoreaktywnych immunokoniugatów do zastosowań in vitro i in vivo. Podejście syntetyczne jest na tyle proste, że można je przeprowadzić w prawie każdym laboratorium, a macierzysty odczynnik PODS można modyfikować za pomocą mnóstwa różnych chelatorów, fluoroforów lub ładunków. W tym protokole i towarzyszącym mu filmie opiszemy prostą, czteroetapową syntezę PODS (Rysunek 5); stworzenie wariantu DOTA, szeroko stosowanego chelatora do koordynacji 64Cu, 68Ga, 111In, 177Lu i 225Ac (Rysunek 6); oraz biokoniugacja PODS-DOTA z modelowym przeciwciałem, trastuzumabem IgG1 ukierunkowanym na HER2 (Figura 7).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Synteza 4-[5-(metylotio)-1,3,4-oksadiazol-2-ylo]-aniliny (1)

UWAGA: Ze względu na światłoczułość związku, wszystkie reakcje należy przechowywać w naczyniach pokrytych folią.

  1. W kolbie okrągłodennej o pojemności 10 ml rozpuścić 100 mg (0,517 mmol, 1 równoważnik) 5-(4-aminofenylo)-1,3,4-oksadiazolo-2-tiolu w 3 ml metanolu.
  2. Do tego roztworu dodać 360 μl diizopropyloetyloaminy (DIPEA; 2,07 mmol; 4 równoważniki; bezwodne) i małe mieszadło magnetyczne. Przykryj kolbę gumowym korkiem i mieszaj roztwór przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Za pomocą szklanej strzykawki o pojemności 1 ml przebij otwór przez gumowy korek i szybko dodaj 32 μl (0,517 mmol, 1 ekwiwalent) jodometanu do tej mieszaniny. Pozwól mieszaninie reagować przez 45 minut w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Ze względu na potencjalne szkodliwe działanie jodometanu, reakcja ta powinna być przeprowadzana w dygestoriach chemicznych.
  4. Ustawić łaźnię wodną wyparki obrotowej na 40 °C i powoli zmniejszać ciśnienie, aby usunąć rozpuszczalnik, aby uzyskać białe ciało stałe.
  5. Rozpuścić ciało stałe w 3 ml octanu etylu i przemyć co najmniej trzykrotnie 5 ml roztworu 0,1 M węglanu sodu za pomocą rozdzielacza rozdzielającego.
    UWAGA: Okresowo wykonuj testy punktowe fazy wodnej pod lampą UV; Gdy nic nie widać pod lampą, możesz przerwać pranie.
  6. Zebrać fazę organiczną do rozdzielacza i przemyć ją wodą, aż pH fazy wodnej osiągnie 6,8-7,0 (przy użyciu bibuły do pH).
  7. Zbierz fazę organiczną i dodaj siarczan magnezu, aby usunąć wszelkie ślady wody.
    UWAGA: Siarczan magnezu należy dodać małą szpatułką, po czym roztwór należy zamieszać. Jeśli drobne cząstki środka suszącego są nadal widoczne, roztwór jest suchy. Jeśli nie, dodaj niewielkie ilości siarczanu magnezu, aż będą widoczne drobne cząsteczki.
  8. Przefiltrować mieszaninę za pomocą średniej fryty szklanej lub bibuły filtracyjnej.
  9. Odparować substancje lotne za pomocą wyparki obrotowej, w procesie, który powinien wytworzyć pożądany produkt w postaci białych igieł.

2. Synteza tert-butylo[18-({4-[5-(metylotio)-1,3,4-oksadiazol-2-yl]fenylo}amino)-15,18-diokso-4,7,10-trioksa-14-azaoktadecylo] karbaminianu (2)

UWAGA: Ze względu na światłoczułość związku, wszystkie reakcje należy przechowywać w naczyniach pokrytych folią.

  1. W kolbie okrągłodennej o pojemności 25 ml rozpuścić 387 mg (0,92 mmol, odpowiednik 1,0) NBoc-N′-sukcynylo-4,7,10-trioksa-1,13-tridekanodiaminy w 10 ml dichlorometanu.
  2. Do tego roztworu dodać 480 μl (2,76 mmol, 3 równoważniki) DIPEA, 264 mg (1,38 mmol; 1,5 równoważnika) chlorowodorku N-etylo-N′-[3-(dimetyloamino)propylo]karbodimidu (EDCI) i 200 mg (0,97 mmol, równoważnik 1,1) 1. Zamknij naczynie szklanym korkiem i pozwól reakcji mieszać przez 5 dni w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Należy pamiętać o parowaniu dichlorometanu. W razie potrzeby dodawaj więcej w ciągu tygodnia.
  3. Przemyć mieszaninę w rozdzielaczu roztworem 1 M kwasu solnego (3 x 5 ml).
  4. Zebrać fazę organiczną i kontynuować mycie jej w rozdzielaczu, najpierw roztworem 1 M Na2CO3 (2 x 5 ml), a następnie wodą (3 x 5 ml).
  5. Zbierz fazę organiczną i dodaj siarczan magnezu, aby usunąć wszelkie ślady wody (patrz krok 1.7). Przefiltrować mieszaninę za pomocą średniej fryty szklanej lub bibuły filtracyjnej.
  6. Za pomocą wyparki obrotowej usuń lotne rozpuszczalniki pod zmniejszonym ciśnieniem, aby uzyskać ciało stałe o białawym odcieniu.
  7. Ponownie rozpuścić tę substancję stałą w 10 ml octanu etylu i wytrącić produkt poprzez stopniowe (np. 2 ml na raz) dodawanie 30 ml cykloheksanu.
  8. Przefiltrować roztwór za pomocą bibuły filtracyjnej lub średniej fryty szklanej, aby otrzymać produkt w postaci białego proszku.

3. Synteza karbaminianu tert-butylu (18-({4-[5-(metylosulfonylo)-1,3,4-oksadiazol-2-yl]fenylo}amino)-15,18-diokso-4,7,10-trioksa-14-azaoctadecylo] karbaminianu (3)

UWAGA: Ze względu na światłoczułość związku, wszystkie reakcje należy przechowywać w naczyniach pokrytych folią.

  1. W kolbie okrągłodennej o pojemności 10 ml rozpuścić 30 mg (0,05 mmol; odpowiednik 1 równoważnika) w proporcjach 2 na 4 ml dichlorometanu.
  2. Powoli dodać 49 mg (0,2 mmol; 4 równoważniki) 70% kwasu m-chloroperbenzoesowego do tej mieszaniny i przykryć naczynie reakcyjne szklanym korkiem. Mieszaj roztwór przez noc w temperaturze pokojowej, ostatecznie uzyskując żółtą mieszaninę.
  3. Żółtą mieszaninę przemyć w rozdzielaczu, najpierw 0,1 M roztworem NaOH (3 x 5 ml), a następnie wodą (3 x 5 ml).
  4. Wysuszyć fazę organiczną siarczanem magnezu i przefiltrować mieszaninę za pomocą średniej fryty szklanej lub bibuły filtracyjnej.
  5. Za pomocą wyparki obrotowej usuń rozpuszczalniki pod zmniejszonym ciśnieniem, aby uzyskać produkt w postaci bladego ciała stałego.

4. Synteza sukcynamidu N1-(3-{2-[2-(3-aminopropoksy)etoksy]-etoksy}propylo)-N4-{4-[5-(metylosulfonylo)-1,3,4-oksadiazol-2-ylo]fenylo} sukcynamidu (PODS)

  1. W kolbie okrągłodennej o pojemności 25 ml rozpuścić 30 mg 3 w 2,0 ml dichlorometanu.
  2. Dodać 400 μl kwasu trifluorooctowego i zamknąć kolbę szklanym korkiem.
  3. Mieszaj mieszaninę reakcyjną w temperaturze pokojowej przez 3 godziny.
  4. Za pomocą wyparki obrotowej usuń substancje lotne pod obniżonym ciśnieniem w temperaturze pokojowej, pozostawiając oleistą pozostałość.
  5. Rozpuścić oleistą pozostałość w 7 ml wody i za pomocą rozdzielacza przemyć octanem etylu (3 x 4 ml). Zachowaj warstwę wodną.
  6. Liofilizuj warstwę wodną, aby uzyskać STRĄKI w postaci białego proszku.
    UWAGA: Współczynniki absorpcji molowej dla PODS przy 280 i 298 nm wynoszą odpowiednio 9 900 i 12 400 cm-1 M-1.

5. Synteza PODS-DOTA

  1. W probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml rozpuścić 10 mg PODS w 300 μl dimetylosulfotlenku (0,018 mmol; odpowiednik 1 roztworu) i dodać 26 μl N,N-diizopropyloetyloaminy (0,15 mmol; 8 równoważników).
  2. Rozpuścić 15,2 mg DOTA-Bn-NCS (0,02 mmol; 1,2 równoważnika) w 100 μl dimetylosulfotlenku i połączyć ten roztwór z roztworem z kroku 5.1. Uszczelnij probówkę mikrowirówki.
  3. Pozostawić reakcję do inkubacji przez noc w temperaturze pokojowej.
  4. Oczyścić produkt za pomocą chromatografii HPLC z odwróconymi fazami C18 w celu usunięcia wszelkich nieprzereagowanych DOTA-Bn-NCS.
    UWAGA: Czasy retencji są oczywiście w dużym stopniu zależne od sprzętu HPLC każdego laboratorium (pompy, kolumny, rurki itp.), a przed oczyszczaniem należy przeprowadzić odpowiednie kontrole. Jednakże, aby przedstawić przykład, jeśli stosuje się gradient od 5:95 MeCN/H2O (oba z 0,1% TFA) do 70:30 MeCN/H2O (oba z 0,1% TFA) w ciągu 30 minut, stosuje się półpreparatywną kolumnę C18 19 x 250 mm i natężenie przepływu 6 ml/min, PODS, p-SCN-Bn-DOTA i PODS-DOTA będą miały czasy retencji około 14,4, Odpowiednio 18,8 i 19,6 min. Wszystkie trzy związki mogą być monitorowane przy długości fali 254 nm.

6. Biokoniugacja PODS-DOTA do trastuzumabu

UWAGA: Na tym etapie zaczęliśmy od podstawowego roztworu trastuzumabu o stężeniu 16,4 mg/ml.

  1. W probówce mikrowirówkowej o niskiej zawartości wiązania z białkami rozcieńczyć 61 μl roztworu podstawowego trastuzumabu (1 mg; 6,67 nmol, 1 równoważnik) 859 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (pH 7,4).
  2. Do tej mieszaniny dodać 6,7 μl świeżo przygotowanego 10 mM roztworu TCEP w H2O (66,7 nmol, 10 równoważników).
  3. Przygotować 1 mg/ml roztwór PODS-DOTA w DMSO i dodać 73 μl tego roztworu PODS-DOTA do mieszaniny reakcyjnej (66,67 nmol, 10 równoważników).
  4. Zamknąć probówkę do mikrowirówki i inkubować roztwór przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
  5. Po 2 godzinach oczyścić immunokoniugat za pomocą wstępnie zapakowanej jednorazowej kolumny odsalającej.
    1. Po pierwsze, należy zrównoważyć kolumnę wykluczającą rozmiar zgodnie z opisem dostawcy, aby usunąć wszelkie konserwanty obecne w kolumnie podczas przechowywania. Typowa procedura polega na 5-krotnym przemyciu kolumny objętością PBS odpowiadającą objętości kolumny: 5 x 2,5 ml PBS.
    2. Następnie dodaj mieszaninę reakcyjną do kolumny wykluczania wielkości, zwracając uwagę na objętość mieszaniny reakcyjnej.
    3. Po wprowadzeniu mieszaniny reakcyjnej do kolumny dodać odpowiednią ilość PBS, aby całkowita objętość roztworu dodanego do kolumny wynosiła 2,5 ml. Na przykład, jeśli reakcja koniugacji dała całkowitą objętość 1,3 ml, do kolumny należałoby dodać 1,2 ml dodatkowego PBS.
    4. Na koniec zebrać produkt, używając 2 ml PBS jako eluentu.
  6. Zagęścić końcowy immunokoniugat za pomocą odśrodkowych jednostek filtracyjnych z punktem odcięcia masy cząsteczkowej 50 kDa.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Pierwsze cztery kroki tego protokołu — synteza PODS — zostały zaprojektowane tak, aby były stabilne i niezawodne. Deprotonowanie i podstawienie 5-(4-aminofenyl)-1,3,4-oksadiazolu-2-tiolu w celu otrzymania pożądanego produktu tioeterowego pozwala na uzyskanie tioeteru z wydajnością >99% w ciągu zaledwie 45 minut. Następnie ligację między 1 a N-Boc-N'-succynylo-4,7,10-trioksa-1,13-tridekanodiaminą przeprowadzono za pomocą standardowej procedury sprzęgania...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W niniejszym raporcie zdecydowaliśmy się nie uwzględniać żadnych protokołów dotyczących znakowania radioizotopem ani eksperymentów in vivo. Nasze powody są proste. W odniesieniu do tych pierwszych, znakowanie radioaktywne immunokoniugatu opartego na PODS nie różni się w ogóle od tego w przypadku immunokoniugatu syntetyzowanego przy użyciu innych strategii biokoniugacji, a procedury te zostały kompleksowo przeanalizowane w innym miejscu2. W odniesieniu do tych ostatnich, specyfika przedklinicznych ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują dr Sai Kiran Sharma za pomocne rozmowy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
5-(4-aminofenylo)-1,3,4-oksadiazol-2-tiolSigma-Aldrich675024
1,5 ml Mikrorurka odśrodkowa LoBindEppendorf925000090
1,5 ml Rurka mikroodśrodkowaFisherbrand05-408-129
AcetonitrylFisher ScientificA998-4
Filtr odśrodkowy Amicon Ultra-2 EMDMillipore
CykloheksanFisher ScientificC556-4
DichlorometanFisher ScientificAC383780010
DiizopropyloetyloaminaMP Biomedicals, LLC150915
DimetylosulfotlenekFisher Scientific31-727-5100ML
Octan etyluFisher ScientificE145 4
Kwas solnyFisher ScientificA144-500
JodometanSigma-Aldrich289566-100G
Siarczan magnezuAcros Organics413485000
kwas m-chloroperbenzoesowySigma-Aldrich273031
MetanolFisher ScientificA412 1
NBoc-N′- sukcynylo-4,7,10-trioksa-1,13-tridekanodiaminaSigma-Aldrich671401Przechowywać w temperaturze -80 & stopni; C
N-etylo-N′-[3- (dimetyloamino)propylo]karbodimidowy chlorowodorekSigma-Aldrich3450
Sól fizjologiczna buforowana fosforanemSigma-AldrichP549310 razy; Stężenie
p-SCN-Bn-DOTAMakrocykleB-205Przechowywać w temperaturze -80 & deg; C
Sephadex G-25 w kolumnach odsalających PD-10GE Healthcare17085101
Węglan soduSigma-AldrichS7795
Wodorotlenek soduFisher ScientificS318-1
TCEPThermoFischer Scientific20490
TrietyloaminaFisher ScientificAC157911000
Kwas trifluorooctowyFisher ScientificA116-50
EN300000141G

Bibliografia

  1. Wu, A. M. Antibodies and antimatter: The resurgence of immuno-PET. Journal of Nuclear Medicine. 50 (1), 2-5 (2009).
  2. Zeglis, B. M., Lewis, J. S. A practical guide to the construction of radiometallated bioconjugates for positron emission tomography. Dalton Transactions. 40 (23), 6168-6195 (2011).
  3. Agarwal, P., Bertozzi, C. R. Site-specific antibody-drug conjugates: the nexus of bioorthogonal chemistry, protein engineering, and drug development. Bioconjugate Chemistry. 26 (2), 176-192 (2015).
  4. Adumeau, P., Sharma, S. K., Brent, C., Zeglis, B. M. Site-specifically labeled immunoconjugates for molecular imaging-part 1: Cysteine residues and glycans. Molecular Imaging and Biology. 18 (1), 1-17 (2016).
  5. Adumeau, P., Sharma, S. K., Brent, C., Zeglis, B. M. Site-specifically labeled immunoconjugates for molecular imaging-part 2: Peptide tags and unnatural amino acids. Molecular Imaging and Biology. 18 (1), 153-165 (2016).
  6. Alley, S. C., et al. Contribution of linker stability to the activities of anticancer immunoconjugates. Bioconjugate Chemistry. 19 (3), 759-765 (2008).
  7. Baldwin, A. D., Kiick, K. L. Tunable degradation of maleimide-thiol adducts in reducing environments. Bioconjugate Chemistry. 22 (10), 1946-1953 (2011).
  8. Shen, B. -Q., et al. Conjugation site modulates the in vivo stability and therapeutic activity of antibody-drug conjugates. Nature Biotechnology. 30 (2), 184-189 (2012).
  9. Jackson, D., et al. In vitro and in vivo evaluation of cysteine and site specific conjugated herceptin antibody-drug conjugates. Plos One. 9 (1), (2014).
  10. Ponte, J. F., et al. Understanding how the stability of the thiol-maleimide linkage impacts the pharmacokinetics of lysine-linked antibody-maytansinoid conjugates. Bioconjugate Chemistry. 27 (7), 1588-1598 (2016).
  11. Stimmel, J. B., et al. Site-specific conjugation on serine -> cysteine variant monoclonal antibodies. Journal of Biological Chemistry. 275 (39), 30445-30450 (2000).
  12. Li, L., et al. Reduction of kidney uptake in radiometal labeled peptide linkers conjugated to recombinant antibody fragments. site-specific conjugation of DOTA-peptides to a cys-diabody. Bioconjugate Chemistry. 13 (5), 985-995 (2002).
  13. Li, J., Wang, X. H., Wang, X. M., Chen, Z. L. Site-specific conjugation of bifunctional chelator BAT to mouse IgG(1) Fab' fragment. Acta Pharmacologica Sinica. 27 (2), 237-241 (2006).
  14. Tinianow, J. N., et al. Site-specifically Zr-89-labeled monoclonal antibodies for ImmunoPET. Nuclear Medicine and Biology. 37 (3), 289-297 (2010).
  15. Li, L., et al. Site-specific conjugation of monodispersed DOTA-PEGn to a thiolated diabody reveals the effect of increasing PEG size on kidney clearance and tumor uptake with improved 64-copper PET imaging. Bioconjugate Chemistry. 22 (4), 709-716 (2011).
  16. Khalili, H., Godwin, A., Choi, J. -w, Lever, R., Brocchini, S. Comparative binding of disulfide-bridged PEG-Fabs. Bioconjugate Chemistry. 23 (11), 2262-2277 (2012).
  17. Koniev, O., Wagner, A. Developments and recent advancements in the field of endogenous amino acid selective bond forming reactions for bioconjugation. Chemical Society Reviews. 44 (15), 5495-5551 (2015).
  18. Patterson, J. T., Asano, S., Li, X., Rader, C., Barbas, C. F. Improving the serum stability of site-specific antibody conjugates with sulfone linkers. Bioconjugate Chemistry. 25 (8), 1402-1407 (2014).
  19. Toda, N., Asano, S., Barbas, C. F. III Rapid, stable, chemoselective labeling of thiols with Julia-Kocienski-like reagents: A serum-stable alternative to maleimide-based protein conjugation. Angewandte Chemie-International Edition. 52 (48), 12592-12596 (2013).
  20. Zhang, Q., et al. Last-step enzymatic F-18-fluorination of cysteine-tethered RGD peptides using modified Barbas linkers. Chemistry-a European Journal. 22 (31), 10998-11004 (2016).
  21. Chiotellis, A., et al. Novel chemoselective F-18-radiolabeling of thiol-containing biomolecules under mild aqueous conditions. Chemical Communications. 52 (36), 6083-6086 (2016).
  22. Adumeau, P., Davydova, M., Zeglis, B. M. Thiol-reactive bifunctional chelators for the creation of site-selectively modified radioimmunoconjugates with improved stability. Bioconjugate Chemistry. 29, 1364-1372 (2018).
  23. Sakamoto, J., Kojima, H., Kato, J., Hamashima, H., Suzuki, H. Organ-specific expression of the intestinal epithelium-related antigen A33, a cell surface target for antibody-based imaging and treatment in gastrointestinal cancer. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 46, S27-S32 (2000).
  24. Sakamoto, J., et al. A phase I radioimmunolocalization trial of humanized monoclonal antibody huA33 in patients with gastric carcinoma. Cancer Science. 97 (11), 1248-1254 (2006).
  25. Junutula, J. R., et al. Site-specific conjugation of a cytotoxic drug to an antibody improves the therapeutic index. Nature Biotechnology. 26 (8), 925-932 (2008).
  26. Pillow, T. H., et al. Site-specific trastuzumab maytansinoid antibody-drug conjugates with improved therapeutic activity through linker and antibody engineering. Journal of Medicinal Chemistry. 57 (19), 7890-7899 (2014).
  27. Boswell, C. A., et al. Enhanced tumor retention of a radiohalogen label for site-specific modification of antibodies. Journal of Medicinal Chemistry. 56 (23), 9418-9426 (2013).
  28. Boswell, C. A., et al. Impact of drug conjugation on pharmacokinetics and tissue distribution of anti-STEAP1 antibody-drug conjugates in rats. Bioconjugate Chemistry. 22 (10), 1994-2004 (2011).
  29. Alvarez, V. L., et al. Site-specifically modified 111In labelled antibodies give low liver backgrounds and improved radioimmunoscintigraphy. Nuclear Medicine and Biology. 13 (4), 347-352 (1986).
  30. Strop, P., et al. Location matters: SIte of conjugation modulates stability and pharmacokinetics of antibody drug conjugates. Chemistry, Biology. 20 (2), 161-167 (2013).
  31. Hallam, T. J., Wold, E., Wahl, A., Smider, V. V. Antibody conjugates with unnatural amino acids. Molecular Pharmaceutics. 12 (6), 1848-1862 (2015).
  32. Axup, J. Y., et al. Synthesis of site-specific antibody-drug conjugates using unnatural amino acids. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (40), 16101-16106 (2012).
  33. Lang, K., Chin, J. W. Cellular incorporation of unnatural amino acids and bioorthogonal labeling of proteins. Chemical Reviews. 114 (9), 4764-4806 (2014).
  34. Yamasaki, R. B., Osuga, D. T., Feeney, R. E. Periodate oxidation of methionine in proteines. Analytical Biochemistry. 126 (1), 183-189 (1982).
  35. Wang, W., et al. Impact of methionine oxidation in human IgG1 Fc on serum half-life of monoclonal antibodies. Molecular Immunology. 48 (6-7), 860-866 (2011).
  36. O'Shannessy, D. J., Dobersen, M. J., Quarles, R. H. A novel procedure for labeling immunoglobulins by conjugation to oligosaccharide moieties. Immunology Letters. 8 (5), 273-277 (1984).
  37. Panowski, S., Bhakta, S., Raab, H., Polakis, P., Junutula, J. R. Site-specific antibody drug conjugates for cancer therapy. Mabs. 6 (1), 34-45 (2014).
  38. Hu, M. D., et al. Site-specific conjugation of HIV-1 tat peptides to IgG: a potential route to construct radioimmunoconjugates for targeting intracellular and nuclear epitopes in cancer. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 33 (3), 301-310 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Synteza PODSbiokoniugacja tiolowamodyfikacja selektywna wzgl dem miejscatworzenie immunokoniugat wchelatowanie DOTAkoniugacja z trastuzumabemalternatywa dla maleimidustabilno radioimmunokoniugatucelowanie w HER2ocena przedkliniczna

Powiązane artykuły