Tutaj prezentujemy protokół do badania przepuszczalności kłębuszków nerkowych u myszy za pomocą bardzo czułego, nieradioaktywnego znacznika. Metoda ta pozwala na powtarzalne analizy moczu przy małych objętościach moczu.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Bardzo czuły pomiar przepuszczalności kłębuszków nerkowych u myszy z izotiocyjanianem fluoresceiny i polisarozą 70
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Utrata albuminy w moczu (albuminuria) przewiduje wynik sercowo-naczyniowy. W warunkach fizjologicznych niewielkie ilości albuminy są filtrowane przez kłębuszki nerkowe i ponownie wchłaniane w układzie kanalikowym aż do osiągnięcia granicy wchłaniania. Wczesne wzrosty patologicznej filtracji albuminowej mogą zatem zostać pominięte podczas analizy albuminurii. W związku z tym korzystne wydaje się stosowanie znaczników do badania permselektywności kłębuszków nerkowych. Znakowany fluorescencyjnie znacznik izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC)-polisacharozy (tj. FITC-Ficoll) może być stosowany do badania permselektywności kłębuszków nerkowych. Cząsteczki polisacharozy FITC są swobodnie filtrowane przez kłębuszki nerkowe, ale nie są ponownie wchłaniane w układzie kanalikowym. U myszy i szczurów polisacharoza FITC była badana w modelach przepuszczalności kłębuszków nerkowych przy użyciu technicznie złożonych procedur (tj. pomiary radioaktywne, wysokosprawna chromatografia cieczowa [HPLC], filtracja żelowa). Zmodyfikowaliśmy i ułatwiliśmy protokół oparty na znaczniku polisacharozy FITC, aby przetestować wczesne i niewielkie wzrosty przepuszczalności kłębuszków nerkowych do polisacharozy FITC 70 (wielkość albuminy) u myszy. Metoda ta pozwala na powtarzalne analizy moczu przy małych objętościach moczu (5 μl). Protokół ten zawiera informacje o tym, w jaki sposób znacznik FITC-polisacharoza 70 jest podawany dożylnie, a mocz jest zbierany za pomocą prostego cewnika moczowego. Mocz jest analizowany za pomocą czytnika fluorescencyjnego i normalizowany do markera stężenia moczu (kreatyniny), co pozwala uniknąć skomplikowanych technicznie procedur.
Wprowadzenie
Funkcjonalne lub strukturalne defekty w obrębie kłębuszkowej bariery filtracyjnej zwiększają przepuszczalność kłębuszków nerkowych dla albuminy, co skutkuje wykryciem albuminy w moczu (albuminuria). Albuminuria przewiduje wynik sercowo-naczyniowy i jest ważnym markerem uszkodzenia kłębuszków nerkowych1. Nawet niski poziom albuminurii, leżący w normalnym zakresie, wiąże się ze zwiększonym ryzykiem sercowo-naczyniowym1.
W warunkach fizjologicznych albumina jest filtrowana przez kłębuszki nerkowy i jest prawie całkowicie ponownie wchłaniana w układzie rurkowym2,....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Badania zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi zawartymi w Przewodniku do opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych (publikacja US National Institutes of Health nr 85-23, poprawiona w 1996 roku). Wszystkie doświadczenia na zwierzętach przeprowadzono zgodnie z odpowiednimi zezwoleniami instytucjonalnymi (rząd krajowy Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz [LANUV] numer referencyjny 84-02.04.2012.A397).
1. Przygotowanie instrumentów, roztworów i sprzętu
- Rozpuścić FITC-polisacharozę 70 w 0,9% sterylnym chlorku sodu (NaCl) do końcowego stężenia 10 mg/ml (tj. 100 mg w 10 ml NaCl).
- Dializować roztwór poli....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Jak przedstawiono na Rysunku 2, metoda badania przepuszczalności kłębuszkowej u myszy składa się z trzech faz. Pierwsza faza to faza przygotowawcza, podczas której umieszcza się cewnik moczowy oraz cewnik żylny centralny. Druga faza to faza równoważenia, która rozpoczyna się od dożylnego wstrzyknięcia bolusa FITC-polisacharydu 70, a następnie kontynuowana jest ciągłą infuzją FITC-polisacharydu 70 przez 60 min. Ostatnia faza to faza eksperymentalna. W tej fazi.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Przedstawiona metoda umożliwia badaczowi bardzo czułe badanie przepuszczalności kłębuszków nerkowych u myszy za pomocą znacznika. Dzięki tej metodzie krótkotrwałe zwiększenie przepuszczalności kłębuszków nerkowych można zdiagnozować przy użyciu tylko niewielkich ilości moczu. Najważniejszymi krokami do pomyślnego opanowania tej techniki są: 1) rozwijanie wiedzy manualnej w chirurgii na myszach, zwłaszcza w kaniulacji żyły centralnej, 2) umieszczanie cewnika moczowego bez uszkadzania błony śluzowej oraz 3) ręczna wiedza s.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy dziękują Christinie Schwandt, Blanki Duvnjak i Nicoli Kuhr za wyjątkową pomoc techniczną oraz dr Dennisowi Sohnowi za pomoc przy skanowaniu fluorescencyjnym. Badania te zostały wsparte grantem Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) SFB 612 TP B18 dla L.C.R. i L.S. Grantodawca nie odgrywał żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowaniu manuskryptu.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Motic SMZ168 BL | Mikroskop Motic | SMZ168BL | do chirurgii myszy |
| KL1500LCD | Mikroskopia pulchowa i Lorenza | 150500 | światło do chirurgii myszy |
| Microfederschere | Braun, Aesculap | FD100R | cienkie nożyczki |
| Durotip Feine Scheren | Braun, Aesculap | BC210R | do cięcia szyi |
| Anatomische Pinzette | Braun, Aesculap | BD215R | do zabiegów chirurgicznych |
| Prä parierklemme | Aesculap | BJ008R | do zabiegów chirurgicznych |
| Seraflex | Serag Wiessner | IC108000 | nić jedwabna |
| Ketamina 10% | znieczulenie | Medistar | |
| Rompun (Xylazin) 2% | znieczulenie | Bayera | |
| Rurka polietylenowa o drobnym otworze ID 0,28 mm OD 0,61 mm | Portex | 800/100/100 | Cewnik |
| polietylenu o drobnym otworze ID 0,58 mm OD 0,96 mm | Cewnik | Portex | 800/100/200 |
| Aparat Harvard 11 Plus | Aparat Harvard | 70-2209 | pompa strzykawkowa |
| BD Insyte Autoguard | BD | 381823 | cewnik moczowy |
| Detektor wielomodowy DTX 880 | Czytnik płytek | Beckman Coulter | |
| 384-dołkowa płytka mikromiareczkowa | Nunc | 262260 | 384 dołkowa płytka |
| Zestaw do oznaczania kreatyniny | Sigma-Aldrich | MAK080 | do pomiaru stężenia kreatyniny |
| 96-dołkowa płytka | Nunc | 260836 | do oznaczania kreatyniny |
| Polisacharoza z oznaczeniem FITC 70 | TBD Consulting | FP70 | FITC-ficoll |
| Angiotensyna II | Sigma-Aldrich | A9525 | służy do badania przepuszczalności kłębuszków nerkowych |
| BP-98A | Softron | do pomiaru ciśnienia krwi | |
| OTS 40.3040 | Medite | 01-4005-00 | do chirurgii myszy |
| Instillagel 6mL | Farco-Pharma GmbH | do cewnika moczowego | |
| Golarka Exacta | Aesculap | GT415 |
Bibliografia
- Chronic Kidney Disease Prognosis Consortium,, et al. Association of estimated glomerular filtration rate and albuminuria with all-cause and cardiovascular mortality in general population cohorts: a collaborative meta-analysis. Lancet. 375 (9731), 2073-2081 (2010).
- Mori, K. P., et al.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
