Artykuł metodologiczny

Bardzo czuły pomiar przepuszczalności kłębuszków nerkowych u myszy z izotiocyjanianem fluoresceiny i polisarozą 70

DOI:

10.3791/59064

⸱

9 sierpnia 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Nephrology, Medical Faculty, Heinrich-Heine-University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół do badania przepuszczalności kłębuszków nerkowych u myszy za pomocą bardzo czułego, nieradioaktywnego znacznika. Metoda ta pozwala na powtarzalne analizy moczu przy małych objętościach moczu.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Utrata albuminy w moczu (albuminuria) przewiduje wynik sercowo-naczyniowy. W warunkach fizjologicznych niewielkie ilości albuminy są filtrowane przez kłębuszki nerkowe i ponownie wchłaniane w układzie kanalikowym aż do osiągnięcia granicy wchłaniania. Wczesne wzrosty patologicznej filtracji albuminowej mogą zatem zostać pominięte podczas analizy albuminurii. W związku z tym korzystne wydaje się stosowanie znaczników do badania permselektywności kłębuszków nerkowych. Znakowany fluorescencyjnie znacznik izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC)-polisacharozy (tj. FITC-Ficoll) może być stosowany do badania permselektywności kłębuszków nerkowych. Cząsteczki polisacharozy FITC są swobodnie filtrowane przez kłębuszki nerkowe, ale nie są ponownie wchłaniane w układzie kanalikowym. U myszy i szczurów polisacharoza FITC była badana w modelach przepuszczalności kłębuszków nerkowych przy użyciu technicznie złożonych procedur (tj. pomiary radioaktywne, wysokosprawna chromatografia cieczowa [HPLC], filtracja żelowa). Zmodyfikowaliśmy i ułatwiliśmy protokół oparty na znaczniku polisacharozy FITC, aby przetestować wczesne i niewielkie wzrosty przepuszczalności kłębuszków nerkowych do polisacharozy FITC 70 (wielkość albuminy) u myszy. Metoda ta pozwala na powtarzalne analizy moczu przy małych objętościach moczu (5 μl). Protokół ten zawiera informacje o tym, w jaki sposób znacznik FITC-polisacharoza 70 jest podawany dożylnie, a mocz jest zbierany za pomocą prostego cewnika moczowego. Mocz jest analizowany za pomocą czytnika fluorescencyjnego i normalizowany do markera stężenia moczu (kreatyniny), co pozwala uniknąć skomplikowanych technicznie procedur.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Funkcjonalne lub strukturalne defekty w obrębie kłębuszkowej bariery filtracyjnej zwiększają przepuszczalność kłębuszków nerkowych dla albuminy, co skutkuje wykryciem albuminy w moczu (albuminuria). Albuminuria przewiduje wynik sercowo-naczyniowy i jest ważnym markerem uszkodzenia kłębuszków nerkowych1. Nawet niski poziom albuminurii, leżący w normalnym zakresie, wiąże się ze zwiększonym ryzykiem sercowo-naczyniowym1.

W warunkach fizjologicznych albumina jest filtrowana przez kłębuszki nerkowy i jest prawie całkowicie ponownie wchłaniana w układzie rurkowym2,3. U myszy wykrywanie albuminy w moczu jest zwykle wykonywane za pomocą testu immunoenzymatycznego (ELISA) po 24 godzinach zbierania moczu. W przypadku użycia moczu z 24-godzinnego zbierania moczu lub moczu punktowego, niewielkie różnice w stężeniach albumin mogą zostać pominięte z powodu problemów z czułością testu. Większość badaczy używa zatem modeli zwierzęcych, w których albuminuria jest wywoływana przez silne uszkodzenie nerek spowodowane toksynami, lekami i chirurgią nerek.

Dlatego znalezienie czułej metody wykrywania małych i przejściowych zmian w przepuszczalności kłębuszków nerkowych jest bardzo ważne dla tej dziedziny. Rippe i wsp. przedstawili model szczurzy do testowania przepuszczalności kłębuszków nerkowych poprzez zastosowanie znakowanego fluorescencyjnie znacznika, a mianowicie FITC-polisacharozy 70 (tj. FITC-Ficoll 70), o wielkości albuminy4. Aplikacja znacznikowa umożliwia testowanie krótkoterminowych zmian przepuszczalności kłębuszków nerkowych (w ciągu kilku minut) i jest bardzo czuła4. W dwóch badaniach wykorzystano metodę śledzenia na myszach5,6. Pomimo swoich zalet ta metoda ma niestety wady: jest technicznie bardzo złożona, radioaktywna i inwazyjna. Dalsza analiza moczu jest wykonywana tylko przy użyciu filtracji żelowej lub wykluczenia rozmiaru HPLC5,6.

W tym artykule przedstawiamy alternatywną, czułą, nieradioaktywną i szybką metodę pomiaru przepuszczalności kłębuszków nerkowych u myszy za pomocą fluorescencyjnie znakowanej polisacharozy FITC 70. Dzięki wprowadzeniu cewnika przezcewkowego, zbieranie moczu jest mniej inwazyjne niż nakłucie pęcherza moczowego, uretrotomia i założenie cewnika nadłonowego i umożliwia pobieranie moczu co najmniej co 30 minut. Analiza moczu jest wykonywana z małych ilości (5 μL) za pomocą czytnika fluorescencyjnego. Stężenia znaczników w moczu są normalizowane do stężeń kreatyniny w moczu za pomocą enzymatycznego testu kreatyniny.

Dlatego ta nowatorska metoda oferuje czułe narzędzie do badania wczesnego uszkodzenia kłębuszków nerkowych ze zwiększoną przepuszczalnością kłębuszków nerkowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi zawartymi w Przewodniku do opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych (publikacja US National Institutes of Health nr 85-23, poprawiona w 1996 roku). Wszystkie doświadczenia na zwierzętach przeprowadzono zgodnie z odpowiednimi zezwoleniami instytucjonalnymi (rząd krajowy Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz [LANUV] numer referencyjny 84-02.04.2012.A397).

1. Przygotowanie instrumentów, roztworów i sprzętu

  1. Rozpuścić FITC-polisacharozę 70 w 0,9% sterylnym chlorku sodu (NaCl) do końcowego stężenia 10 mg/ml (tj. 100 mg w 10 ml NaCl).
  2. Dializować roztwór polisacharozy FITC-70 w celu usunięcia wolnych cząsteczek FITC przez noc w temperaturze 4 °C (odcięcie masy cząsteczkowej [MWCO] przy 10 000). Użyć 1 l 0,9% sterylnego NaCl na 10 ml polisacharozy FITC 70 pod ciągłym mieszaniem. Chronić przed światłem. Podwielokrotnić dializowaną polisacharozę FITC 70 i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  3. W przypadku polisacharozy FITC-70 bolusa dodać 4 μl 10 mg/ml roztworu polisacharozy FITC 70 do 996 μl 0,9% NaCl (końcowe stężenie polisacharozy FITC 70: 40 μg/ml).
  4. W celu uzyskania równoważącego roztworu infuzyjnego dodać 20 μl roztworu polisacharozy 70 o stężeniu 10 mg/ml do 9,98 ml 0,9% sterylnego NaCl, uzyskując końcowe stężenie 20 μg/ml.
  5. W przypadku roztworu doświadczalnego dodać leki lub substancje do roztworu do infuzji (np. dla angiotensyny II [Ang II] [100 ng/kg/min] dla myszy 25 g dodać 3 μl Ang II z 1 mM roztworu).
  6. Do operacji przygotuj jedną golarkę, dwa zaciski chirurgiczne, jedną parę nożyczek chirurgicznych, dwie pęsety, dwie cienkie pęsety, jedną parę cienkich nożyczek i waciki. Przygotuj dwie 10 cm nici jedwabne (4-0 do 6-0) do zabiegów podwiązania.
  7. Do założenia cewnika do żyły centralnej należy przygotować strzykawkę o pojemności 10 ml z igłą 21 G. Umieść końcówkę igły w cewniku o długości 30 cm (o średnicy wewnętrznej [ID] 0,58 mm). Podłącz cewnik 0,58 mm do cewnika 10 cm (o średnicy wewnętrznej 0,28 mm). Przetnij końcówkę mniejszego cewnika skośnie, aby utworzyć ostrą końcówkę, która jest wprowadzana do żyły szyjnej.
  8. Przygotuj znieczulenie (tj. znieczulenie dootrzewnowe ketamina 100 mg/kg masy ciała i ksylazyna 5 mg/kg masy ciała).
  9. Przygotuj angiocewnik o masie 22 G, odrzucając igłę i oznaczając cewnik w odległości 1 cm od końcówki. Rozgrzej poduszkę grzewczą do 37 °C.
  10. Przygotuj urządzenie do pomiaru ciśnienia krwi i w razie potrzeby wymień membranę do pomiaru ciśnienia krwi.

2. Faza przygotowawcza

  1. Cewnik moczowy
    UWAGA: Sekcja 2.1 jest zgodna z protokołem opisanym przez Reisa i wsp.7. Rysunek 1 i Rysunek uzupełniający 1 pokazują umiejscowienie cewnika moczowego u samic myszy.
    1. Znieczulić mysz ketaminą/ksylazyną (patrz krok 1.8). Użyj testu szczypania palców u stóp, aby potwierdzić prawidłowe znieczulenie. Aby utrzymać znieczulenie, należy powtórzyć znieczulenie (np. z połową dawki) po 60 minutach. Prawidłowe znieczulenie potwierdza się, jeśli próba uszczypnięcia palca u nogi nie spowoduje wycofania odruchu.
      UWAGA: W tym protokole używane są samice myszy FVB.
    2. Ustaw mysz w pozycji leżącej grzbietowej na poduszce grzewczej o temperaturze 37 °C. Zaciśnij dolną część brzucha i znajdź ujście cewki moczowej (np. pod mikroskopem).
    3. Użyj plastikowej części cewnika angiocewnika 22 G i nasmaruj go żelem ksylocainowym. Wprowadź go ostrożnie 3 mm do ujścia cewki moczowej, równolegle do dystalnej osi cewki moczowej (Rysunek 1A).
    4. Obróć górną część angiocewnika o 180°, trzymając końcówkę w ujściu cewki moczowej i utrzymując oś cewki moczowej (Rysunek 1B).
    5. Wprowadzić cewnik o 7 mm głębiej do organizmu myszy, tak aby został umieszczony w pęcherzu moczowym (Rysunek 1C). Nie wciskaj cewnika na siłę poza opór. Skoryguj położenie cewnika od początku, jeśli wyczuwalny jest opór. Należy pamiętać, że jeśli pozycja cewnika moczowego jest prawidłowa, mocz może już pojawić się w cewniku.
    6. Umieść brązową rurkę o pojemności 1,5 ml na górze cewnika naczyniowego, aby zebrać mocz. Zastosuj podskórnie 1 ml 0,9% NaCl, aby zwiększyć produkcję moczu.
  2. Cewnik do żyły centralnej
    1. Ogol szyję myszy i umieść ją w pozycji leżącej z głową skierowaną w stronę chirurga. Hyperstretch głowę myszy za pomocą taśmy.
    2. Zdezynfekuj szyję 70% izopropanolem. Wykonaj małe nacięcie skóry (5 mm) poniżej linii żuchwy za pomocą pęsety i nożyczek. Przeciąć skórę około 1 cm w kierunku mostka, aż do osiągnięcia środka mostka.
    3. Ostrożnie wypreparuj skórę po prawej stronie szyi za pomocą nożyczek. Wykonaj prostokątne nacięcie skóry po prawej stronie myszy, aby odsłonić tkankę miękką szyi. Użyj nożyczek i pęsety. Zamocuj płaty skóry za pomocą dwóch zacisków.
      UWAGA: Żyła szyjna biegnie wzdłuż lewej strony tarczycy lub jest lekko pokryta prawym płatem tarczycy. Po tym kroku użyj mikroskopu do operacji.
    4. Ostrożnie odsłoń żyłę szyjną preparatem, używając końcówki cienkiej pęsety. Unikaj uszkodzeń gałęzi żył.
      UWAGA: Może być konieczne usunięcie tkanki cienkimi nożyczkami. Zachowaj ostrożność podczas używania nożyczek do usuwania tkanki, ponieważ zwiększa to ryzyko krwawienia.
    5. Umieść i zamknij ligaturę jedwabną nicią (4-0 do 6-0) w dystalnej części widocznej żyły szyjnej (w kierunku głowy myszy). Napręż ligaturę, mocując jedwabną nić taśmą, aby zapewnić lekkie napięcie żyły szyjnej. Przygotuj ligaturę wokół bliższej części żyły szyjnej.
    6. Napełnić cewnik roztworem do infuzji równowagowej (patrz krok 1.4) i przymocować cewnik taśmą tak, aby cewnik wyrównywał żyłę szyjną. Kontroluj pęcherzyki, aby uniknąć zatoru powietrznego.
    7. Podnieś żyłę szyjną za pomocą cienkiej pęsety w miejscu wkłucia (miejsce wkłucia znajduje się 1–2 mm proksymalnie ligatury). Wyrównaj rurkę równolegle do żyły szyjnej. Nakłuć żyłę szyjną, kierując się w stronę światła, i włożyć na około 2–4 mm, równolegle do osi żyły szyjnej. Unikaj energicznych ruchów.
    8. Zamknij ligaturę, aby zamocować cewnik. Kontroluj szczelność ligatury poprzez dokładne oglądanie przez mikroskop. Umieść wilgotny wacik na miejscu operacji.
  3. Pomiar ciśnienia krwi
    1. Umieść mankiet ogonowy na dole ogona myszy, podczas gdy mysz leży w pozycji leżącej grzbietowej. Rozpocznij pomiary i powtórz je 10 razy na punkt czasowy. Zbuduj średnią z pomiarów.
    2. Dostosuj położenie mankietu tylnego, jeśli pomiary ciśnienia krwi nie wydają się prawidłowe i generowane są fałszywe dane.

3. Faza równowagi

  1. Wymień rurkę do zbierania moczu przed rozpoczęciem fazy równowagi i umieść ją na lodzie.
  2. Wprowadzić strzykawkę o pojemności 10 ml wypełnioną roztworem fazy równoważącej FITC (patrz krok 1.4) z igłą 21 G i większym cewnikiem (o średnicy wewnętrznej 0,58 mm) i umieścić ją w pompie strzykawkowej.
  3. Złóż wacik i umieść go wokół cewnika do małych naczyń (o średnicy wewnętrznej 0,28 mm), który wprowadza się do żyły szyjnej. Umieść cewnik w waciku. Umieść zacisk na waciku, aby znieść wsteczny przepływ krwi lub zator powietrzny. Podłączyć igłę 27 G ze strzykawką o pojemności 1 ml wypełnioną bolusem FITC do końca cewnika do małych naczyń.
  4. Otwórz zacisk i nałóż bolus FITC (100 μl). Ponownie zamknij zacisk i połącz większy cewnik z mniejszym cewnikiem. Uruchomić pompę strzykawkową od 0,008 ml/min (0,480 ml/h). Kontynuować infuzję przez 60 minut.

4. Faza eksperymentalna

UWAGA: W tej fazie można badać wpływ leków na permselektywność kłębuszkową.

  1. Zmień rurkę moczową (punkt czasowy 0 min) na inną brązową rurkę o pojemności 1,5 ml. Umieść wacik wokół cewnika do małych naczyń i zamknij zacisk, jak wskazano w kroku 3.3.
  2. Odłączyć duży cewnik od cewnika do małych naczyń. Zmienić strzykawki na roztwory fazy doświadczalnej (patrz krok 1.5). Pozwól pompie infuzyjnej pracować tak, aby duży cewnik został wypełniony roztworem równoważącym.
  3. Ponownie podłącz cewniki, unikając zatoru powietrznego i ponownie otwórz zacisk. Uruchomić pompę strzykawkową przy 0,008 ml/min.
  4. Kontynuować pracę pompy strzykawkowej przez 60 minut, a następnie zebrać mocz do rurki moczowej (mocz 60 minut). Umieść rurkę moczu na lodzie.
  5. Poświęć mysz przez zwichnięcie szyjki macicy podczas znieczulenia. Przed wyrzuceniem mysz jest obserwowana przez 5 minut, aby upewnić się, że jest martwa.

5. Analiza moczu

  1. Pomiar fluorescencji
    1. Rozmrozić kałużę moczową i rozcieńczyć ją w stosunku 1:10 solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS).
      UWAGA: Basen moczowy to kałuża moczu, która została zebrana od zdrowych myszy w 12-24 godzinnym zbieraniu moczu w klatce metabolicznej.
    2. Przygotuj wzorce do pomiaru fluorescencji. Weź 10 brązowych probówek o pojemności 1,5 ml i oznacz je jako ślepe (kałuża moczu rozcieńczona w stosunku 1:10) i następujące stężenia polisacharozy FITC 70 (0,625, 1,25, 2,5, 5, 10, 20, 40, 80 i 160 μg/ml).
    3. Odmierzyć pipetę 246 μl rozcieńczonego moczu do brązowej probówki o pojemności 1,5 ml i dodać 4 μl podstawowego stężenia FITC-polisacharozy 70 (patrz krok 1.1), aby uzyskać końcowe stężenie 160 μg/ml FITC-polisacharozy 70. Odpipetować 100 μl rozcieńczonego kałuży moczu do wszystkich pozostałych probówek.
    4. Rozcieńczyć w stosunku 1:2 przez pipetowanie 100 μl probówki 160 μg/ml polisacharozy 70 do probówki o stężeniu 80 μg/ml i kontynuować z innymi stężeniami. Upewnić się, że rozcieńczone stężenia są odpowiednio wymieszane (np. poprzez wirowanie probówki przed kontynuowaniem).
    5. Rozcieńczyć próbki moczu myszy (0 min, 60 min) w stosunku 1:10 rozcieńczonym zbiornikiem moczowym.
    6. Odmierzyć pipetą 5 μl każdego wzorcowego stężenia polisacharozy 70 FITC, a próbki moczu myszy w trzech egzemplarzach umieścić na czarnej płytce 384-dołkowej. Odwirować płytkę o masie 1 000 x g przez 15 sekund, aby uniknąć pęcherzyków.
    7. Przeanalizować płytkę 384-dołkową w czytniku płytek. Wykonać wzbudzenie przy 496 nm i zmierzyć fluorescencję przy 525 nm.
  2. Pomiar kreatyniny
    1. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta. Krótko mówiąc, przygotuj wzorce kreatyniny, rozcieńczając 10 μl 100 mM roztworu wzorca kreatyniny z 990 μl buforu do oznaczania kreatyniny, aby przygotować 1 mM roztwór wzorcowy.
    2. Dodaj 0, 2, 4, 6, 8 i 10 μl roztworu wzorcowego kreatyniny 1 mM do 96-dołkowej płytki, aby wygenerować odpowiednio 0, 2, 4, 6, 8 i 10 nmol/dołek. Dodać bufor do oznaczania kreatyniny do każdej studzienki, aby zwiększyć objętość do 50 μl.
    3. Przygotuj mieszaniny reakcyjne, dodając 42–44 μl buforu do oznaczania kreatyniny, 2 μl kreatynazy, 2 μl kreatyninazy, 2 μl mieszanki enzymów kreatyninowych i 2 μl sondy kreatyniny. Do ślepej próby użyj 44 μl buforu do oznaczania kreatyniny, 2 μl kreatynazy, 2 μl mieszanki enzymów kreatyninowych i 1–2 μl sondy kreatyniny.
    4. Dodać 50 μl odpowiedniej mieszaniny reakcyjnej do każdego dołka na płytce 96-dołkowej i inkubować przez 60 minut na wytrząsarce poziomej w temperaturze 37 °C. Chronić płytkę przed światłem podczas inkubacji. Zmierzyć absorbancję przy 570 nm na czytniku płytkowym.
    5. Oblicz stężenie kreatyniny, odejmując wartość ślepej próby od wszystkich odczytów. Wynik będzie miał jednostkę nanomoli / mikrolitr. Pomnóż stężenie kreatyniny przez masę cząsteczkową kreatyniny (113,12 ng / nmol), aby otrzymać jednostkę nanogramów / mikrolitr.

6. Analiza danych

  1. Obliczyć stężenie polisacharozy FITC-70 w moczu na podstawie krzywej wzorcowej.
  2. Odnieś stężenia polisacharozy FITC-70 w moczu do stężeń kreatyniny w reprezentatywnej próbce moczu.
  3. Odnieś próbki moczu z 60 minut do próbek moczu 0 min kontrolnych i leczonych myszy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jak pokazano w Rysunek 2, metoda badania przepuszczalności kłębuszków nerkowych u myszy jest budowana w trzech fazach. Pierwsza faza nazywana jest fazą przygotowania, w której umieszcza się cewnik moczowy i cewnik do żyły centralnej. Druga faza nazywana jest fazą równowagi, rozpoczynającą się od dożylnego wstrzyknięcia dożylnego polisacharozy FITC 70, a następnie ciągłego wlewu polisacharozy FITC 70 przez 60 minut. Ostatnia faza nazywana jest fazą eksperyment...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiona metoda umożliwia badaczowi bardzo czułe badanie przepuszczalności kłębuszków nerkowych u myszy za pomocą znacznika. Dzięki tej metodzie krótkotrwałe zwiększenie przepuszczalności kłębuszków nerkowych można zdiagnozować przy użyciu tylko niewielkich ilości moczu. Najważniejszymi krokami do pomyślnego opanowania tej techniki są: 1) rozwijanie wiedzy manualnej w chirurgii na myszach, zwłaszcza w kaniulacji żyły centralnej, 2) umieszczanie cewnika moczowego bez uszkadzania błony śluzowej oraz 3) ręczna wiedza s...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują Christinie Schwandt, Blanki Duvnjak i Nicoli Kuhr za wyjątkową pomoc techniczną oraz dr Dennisowi Sohnowi za pomoc przy skanowaniu fluorescencyjnym. Badania te zostały wsparte grantem Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) SFB 612 TP B18 dla L.C.R. i L.S. Grantodawca nie odgrywał żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowaniu manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Motic SMZ168 BLMikroskop MoticSMZ168BLdo chirurgii myszy
KL1500LCDMikroskopia pulchowa i Lorenza150500światło do chirurgii myszy
MicrofederschereBraun, AesculapFD100Rcienkie nożyczki
Durotip Feine ScherenBraun, AesculapBC210Rdo cięcia szyi
Anatomische PinzetteBraun, AesculapBD215Rdo zabiegów chirurgicznych 
Prä parierklemmeAesculapBJ008Rdo zabiegów chirurgicznych 
SeraflexSerag WiessnerIC108000nić jedwabna
Ketamina 10%znieczulenieMedistar
Rompun (Xylazin) 2%znieczulenieBayera
Rurka polietylenowa o drobnym otworze ID 0,28 mm OD 0,61 mmPortex800/100/100Cewnik
polietylenu o drobnym otworze ID 0,58 mm OD 0,96 mmCewnikPortex800/100/200
Aparat Harvard 11 PlusAparat Harvard70-2209pompa strzykawkowa
BD Insyte AutoguardBD381823  cewnik moczowy
Detektor wielomodowy DTX 880Czytnik płytekBeckman Coulter
384-dołkowa płytka mikromiareczkowaNunc262260384 dołkowa płytka
Zestaw do oznaczania kreatyninySigma-AldrichMAK080do pomiaru stężenia kreatyniny
96-dołkowa płytkaNunc260836do oznaczania kreatyniny 
Polisacharoza z oznaczeniem FITC 70TBD ConsultingFP70FITC-ficoll
Angiotensyna IISigma-AldrichA9525służy do badania przepuszczalności kłębuszków nerkowych
BP-98ASoftrondo pomiaru ciśnienia krwi
OTS 40.3040Medite01-4005-00do chirurgii myszy
Instillagel 6mLFarco-Pharma GmbHdo cewnika moczowego
Golarka ExactaAesculapGT415
z Płyta grzewcza

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chronic Kidney Disease Prognosis Consortium,, et al. Association of estimated glomerular filtration rate and albuminuria with all-cause and cardiovascular mortality in general population cohorts: a collaborative meta-analysis. Lancet. 375 (9731), 2073-2081 (2010).
  2. Mori, K. P., et al. Increase of Total Nephron Albumin Filtration and Reabsorption in Diabetic Nephropathy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (1), 278-289 (2017).
  3. Amsellem, S., et al. Cubilin is essential for albumin reabsorption in the renal proximal tubule. Journal of the American Society of Nephrology. 21 (11), 1859-1867 (2010).
  4. Axelsson, J., Rippe, A., Oberg, C. M., Rippe, B. Rapid, dynamic changes in glomerular permeability to macromolecules during systemic angiotensin II (ANG II) infusion in rats. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 303 (6), F790-F799 (2012).
  5. Grande, G., et al. Unaltered size selectivity of the glomerular filtration barrier in caveolin-1 knockout mice. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 297 (2), F257-F262 (2009).
  6. Jeansson, M., Haraldsson, B. Glomerular size and charge selectivity in the mouse after exposure to glucosaminoglycan-degrading enzymes. Journal of the American Society of Nephrology. 14 (7), 1756-1765 (2003).
  7. Reis, L. O., et al. Anatomical features of the urethra and urinary bladder catheterization in female mice and rats. An essential translational tool. Acta Cirurgica Brasileira. 26, 106-110 (2011).
  8. Konigshausen, E., et al. Angiotensin II increases glomerular permeability by beta-arrestin mediated nephrin endocytosis. Scientific Reports. 6, 39513(2016).
  9. Venturoli, D., Rippe, B. Ficoll and dextran vs. globular proteins as probes for testing glomerular permselectivity: effects of molecular size, shape, charge, and deformability. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 288 (4), F605-F613 (2005).
  10. Bohrer, M. P., Deen, W. M., Robertson, C. R., Troy, J. L., Brenner, B. M. Influence of molecular configuration on the passage of macromolecules across the glomerular capillary wall. The Journal of General Physiology. 74 (5), 583-593 (1979).
  11. Dolinina, J., Rippe, A., Bentzer, P., Oberg, C. M. Glomerular hyperpermeability after acute unilateral ureteral obstruction: Effects of Tempol, NOS-, RhoA- and Rac-1-inhibition. American Journal of Physiology-Renal Physiology. , (2018).
  12. Dolinina, J., Sverrisson, K., Rippe, A., Oberg, C. M., Rippe, B. Nitric oxide synthase inhibition causes acute increases in glomerular permeability in vivo, dependent upon reactive oxygen species. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 311 (5), F984-F990 (2016).
  13. Sverrisson, K., Axelsson, J., Rippe, A., Asgeirsson, D., Rippe, B. Acute reactive oxygen species (ROS)-dependent effects of IL-1beta, TNF-alpha, and IL-6 on the glomerular filtration barrier (GFB) in vivo. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 309 (9), F800-F806 (2015).
  14. Sverrisson, K., Axelsson, J., Rippe, A., Asgeirsson, D., Rippe, B. Dynamic, size-selective effects of protamine sulfate and hyaluronidase on the rat glomerular filtration barrier in vivo. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 307 (10), F1136-F1143 (2014).
  15. Sverrisson, K., et al. Extracellular fetal hemoglobin induces increases in glomerular permeability: inhibition with alpha1-microglobulin and tempol. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 306 (4), F442-F448 (2014).
  16. Axelsson, J., Mahmutovic, I., Rippe, A., Rippe, B. Loss of size selectivity of the glomerular filtration barrier in rats following laparotomy and muscle trauma. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 297 (3), F577-F582 (2009).
  17. Axelsson, J., Rippe, A., Rippe, B. Transient and sustained increases in glomerular permeability following ANP infusion in rats. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 300 (1), F24-F30 (2011).
  18. Axelsson, J., Rippe, A., Rippe, B. Acute hyperglycemia induces rapid, reversible increases in glomerular permeability in nondiabetic rats. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 298 (6), F1306-F1312 (2010).
  19. Axelsson, J., Rippe, A., Venturoli, D., Sward, P., Rippe, B. Effects of early endotoxemia and dextran-induced anaphylaxis on the size selectivity of the glomerular filtration barrier in rats. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 296 (2), F242-F248 (2009).
  20. Andersson, M., Nilsson, U., Hjalmarsson, C., Haraldsson, B., Nystrom, J. S. Mild renal ischemia-reperfusion reduces charge and size selectivity of the glomerular barrier. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (6), F1802-F1809 (2007).
  21. Dolinina, J., Rippe, A., Bentzer, P., Oberg, C. M. Glomerular hyperpermeability after acute unilateral ureteral obstruction: effects of Tempol, NOS, RhoA, and Rac-1 inhibition. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 315 (3), F445-F453 (2018).
  22. Rosengren, B. I., et al. Transvascular protein transport in mice lacking endothelial caveolae. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 291 (3), H1371-H1377 (2006).
  23. Whitesall, S. E., Hoff, J. B., Vollmer, A. P., D'Alecy, L. G. Comparison of simultaneous measurement of mouse systolic arterial blood pressure by radiotelemetry and tail-cuff methods. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286 (6), H2408-H2415 (2004).
  24. Eisner, C., et al. Major contribution of tubular secretion to creatinine clearance in mice. Kidney International. 77 (6), 519-526 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

polisukroza 70 FITCanaliza moczufluorescencyjny czytnik p ytekcewnikowanie p cherza moczowegokaniulacja y y szyjnejinfuzja pomp strzykawkownormalizacja do poziomu kreatyninystymulacja angiotensyn IIchoroba nerek u myszy

Powiązane artykuły