Artykuł metodologiczny

Montaż molekularnych wahadłowców zasilanych przez odwracalnie przyłączone kinezyny

DOI:

10.3791/59068

⸱

26 stycznia 2019

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Columbia University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentujemy protokół budowy molekularnych wahadłowców, gdzie przylegające do powierzchni białka motoryczne kinezyny napędzają mikrotubule znakowane barwnikiem. Słabe oddziaływania kinezyn z powierzchnią umożliwiają ich odwracalne przywiązanie do niej. W ten sposób powstaje system w nanoskali, który wykazuje dynamiczny montaż i demontaż swoich elementów przy zachowaniu swojej funkcjonalności.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje, jak tworzyć molekularne czółenka napędzane kinezyną ze słabym i odwracalnym przyczepieniem kinezyny do powierzchni. W przeciwieństwie do poprzednich protokołów, w tym systemie mikrotubule rekrutują białka motoryczne kinezyny z roztworu i umieszczają je na powierzchni. Kinezyny z kolei ułatwią ślizganie się mikrotubul po powierzchni przed desorpcją, z powrotem do roztworu masowego, dzięki czemu będą dostępne do ponownej rekrutacji. Ten ciągły montaż i demontaż prowadzi do uderzającego dynamicznego zachowania systemu, takiego jak tworzenie tymczasowych śladów kinezyny przez ślizgające się mikrotubule.

Kilka metod eksperymentalnych zostanie opisanych w tym eksperymencie: spektrofotometria UV-Vis zostanie użyta do określenia stężenia roztworów podstawowych odczynników, szkiełka nakrywkowe zostaną najpierw poddane działaniu ozonu i ultrafioletu (UV), a następnie silanizowane przed zamontowaniem w komórkach przepływowych, a mikroskopia całkowitej fluorescencji wewnętrznego odbicia (TIRF) zostanie użyta do jednoczesnego obrazowania silników kinezynowych i włókien mikrotubul.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Interakcje rządzące zachowaniem aktywnych nanosystemów zawsze charakteryzowały długotrwałe, prawie nieodwracalne wiązania1,2,3,4,5,6,7,8. Dobrze zbadanym przykładem jest system mikrotubula-kinezyna, w którym ślizgające się mikrotubule są napędzane przez nieodwracalnie związane powierzchniowo silniki kinezynowe1,2,3,4,5. Systemy, w których komponenty są ze sobą odwracalnie połączone, zostały przebadane teoretycznie9,10 i osiągnięte w makroskali11,12, ale skalowanie tych systemów do nanoskali było wyzwaniem. Jedną z głównych przyczyn takiego stanu rzeczy jest to, że zerwanie i odtworzenie wiązań między komponentami często wymaga dużej zmiany warunków środowiskowych. Mimo że takie zmiany zostały wprowadzone w przeszłości13,14,15, polegałyby one na modyfikacji samego systemu, a nie na dostosowywaniu go do otoczenia. Projektowanie systemów w skali molekularnej, w których komponenty nieustannie łączą się i reorganizują w struktury bez zakłócania ogólnego środowiska, w którym odbywają się eksperymenty, otworzy drzwi do eksploracji szerokiego zakresu dynamicznych zachowań16,17.

Tutaj opisujemy i demonstrujemy szczegółowy protokół tworzenia dynamicznego systemu montażu i demontażu działającego w nanoskali. System i jego ogólne zachowanie zostało przedstawione wcześniej18: włókna mikrotubul są napędzane przez ścieżki odwracalnie związanych powierzchniowo silników kinezyny-1. Te białka motoryczne kinezyny są rekrutowane z roztworu, aby pomóc w napędzaniu mikrotubul do przodu, zanim wkrótce potem ponownie się zdesorbują. Po powrocie do roztworu można je ponownie zrekrutować w celu napędzania nowej mikrotubuli. W przeszłości13,14,15, zerwanie i reforma więzi wymagały modyfikacji środowiska; W przeciwieństwie do tego, środowisko naszej komory przepływowej pozostaje niezmienione, podczas gdy silniki kinezynowe oddziałują z powierzchnią.

Ten protokół pomoże zainteresowanym badaczom (1) zwizualizować wszystkie kroki protokołu i (2) pomóc w rozwiązywaniu problemów z tego typu testem. Wywodzi się z procedur opisanych w Howard et al. 199319.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie roztworu

UWAGA: Trzy z odczynników używanych w tym protokole (toluen, dimetylodichlorosilan i ditiotreitol) są wysoce toksyczne. Przed użyciem należy zapoznać się z odpowiednimi kartami charakterystyki substancji niebezpiecznej (MSDS). Ponadto części tego protokołu muszą być wykonywane przy wyższym poziomie ochrony, przy użyciu okularów ochronnych i dwóch zestawów rękawic ochronnych, jak wskazano. O ile nie zalecono inaczej, eksperymenty można przeprowadzać na stołach laboratoryjnych przy użyciu wszystkich odpowiednich środków ochrony osobistej (okulary ochronne, rękawice, fartuch laboratoryjny, długie spodnie i buty z zakrytymi palcami).

UWAGA: Stężenia ATP, kinezyny i mikrotubul, które są używane w tym protokole, mogą być modyfikowane w zależności od potrzeb każdego eksperymentu. Jeśli jednak są modyfikowane, należy upewnić się, że końcowe stężenia innych odczynników pozostają takie same, jak podano poniżej. Wszystkie eksperymenty przeprowadzono w temperaturze pokojowej (~25 °C).

  1. Przygotowanie roztworów podstawowych
    UWAGA: Wcześniej przygotuj i podziel na porcje następujące roztwory. Wszystkie porcje można przygotować w temperaturze pokojowej (~25 °C).
    1. BRB80 bufor
      UWAGA: Bufor dla większości rozwiązań używanych w tym protokole to BRB80. BRB80 można przygotowywać w dużych ilościach i przechowywać w zamrażarce w temperaturze -20 °C.
      1. Rozpuścić 24,2 g piperazyno-N,N′-bis(kwasu 2-etanosulfonowego) (PIPES) i 3,1 g wodorotlenku potasu (KOH) w 800 ml w wodzie dejonizowanej, aby uzyskać 800 ml 100 mM RUR. Dodać 100 ml 10 mM chlorku magnezu (MgCl2) i 100 ml 10 mM kwasu tetraoctowego glikolu etylenowego (EGTA), aby uzyskać końcową objętość 1 l. Podniesienie pH do 8 za pomocą wodorotlenku potasu (KOH) może pomóc w rozpuszczeniu PIPES i EGTA.
        UWAGA: Końcowe stężenia chemikaliów w buforze BRB80 wynoszą 80 mM PIPES, 1 mM MgCl2 i 1 mM EGTA.
      2. Dostosować pH buforu do 6,9 za pomocą KOH i kwasu solnego (HCl).
    2. Atp
      1. Przygotuj 1 ml roztworu 100 mM ATP w ultraczystej wodzie. Odpipetować roztwór do 10 μl porcji. Porcje należy przechowywać w zamrażarce w temperaturze -80 °C.
    3. GTP (GTP)
      1. Przygotuj 500 μl roztworu 25 mM GTP w ultraczystej wodzie. Odpipetować roztwór do porcji o objętości 5 μl. Porcje należy przechowywać w zamrażarce w temperaturze -80 °C.
    4. MgCl2
      1. Przygotować 1 ml roztworu 100 mM MgCl2 w ultraczystej wodzie. Odpipetować roztwór do 10 μl porcji. Porcje należy przechowywać w zamrażarce w temperaturze -20 °C.
    5. kazeina
      1. Odważyć 1 g suchej kazeiny i przenieść ją do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Dodaj 35 ml buforu BRB80 do probówki, aby rozpuścić kazeinę w proszku.
      2. Umieść roztwór w kubku w chłodnym pomieszczeniu do rozpuszczenia przez noc. W tym momencie roztwór będzie wyglądał na gęsty i lepki.
      3. Pozostaw probówkę pionowo w lodówce o temperaturze 4 °C, aby wszelkie duże, nierozpuszczone grudki mogły się osadzić. Przenieść supernatant do nowej probówki.
      4. Zakręć probówką w wirówce o sile 1,000 x g, aby uzyskać więcej osadów. Ponownie przenieść supernatant do nowej probówki.
      5. Kilkakrotnie przefiltrować roztwór za pomocą filtrów 0,2 μm (maksymalne ciśnienie 7 barów). Ponieważ roztwór jest gęsty, wiele filtrów zostanie zatkanych, więc powtarzaj ten krok, aż filtr będzie czysty i odblokowany.
      6. Oznaczyć stężenie kazeiny w otrzymanym roztworze za pomocą spektrofotometrii UV/Vis, stosując współczynnik ekstynkcji kazeiny wynoszący 19 mM-1∙cm-1 przy 280 nm20. Przyjmując masę cząsteczkową kazeiny 23 kDa, rozcieńczyć roztwór do stężenia 20 mg∙mL-1 w BRB80.
      7. Odpipetować roztwór do 20 μl porcji i przechowywać podwielokrotności w zamrażarce o temperaturze -20 °C.
    6. D-glukoza
      1. Przygotuj 1 ml roztworu 2 M D-glukozy w ultraczystej wodzie. Odpipetować roztwór do 10 μl porcji. Porcje należy przechowywać w zamrażarce w temperaturze -20 °C.
    7. Oksydaza glukozowa
      1. Przygotuj 1 ml roztworu 20 mg∙mL-1 oksydazy glukozowej w BRB80. Odpipetować roztwór do 10 μl porcji. Porcje należy przechowywać w zamrażarce w temperaturze -20 °C.
    8. Katalazy
      1. Przygotować 1 ml roztworu katalazy 0,8 mg∙mL-1 w BRB80. Odpipetować roztwór do 10 μl porcji. Porcje należy przechowywać w zamrażarce w temperaturze -20 °C.
    9. Ditiotreitol (DTT)
      UWAGA: Ponieważ naziemna telewizja cyfrowa jest lekko lotna i toksyczna, należy wykonać następujące czynności pod wyciągiem.
      1. Przygotować 1 ml roztworu 1 M naziemnej telewizji cyfrowej rozcieńczonego w wodzie ultraczystej. Odpipetować roztwór do 10 μl porcji. Porcje należy przechowywać w zamrażarce w temperaturze -20 °C.
    10. Paklitaksel
      1. Przygotować 1 ml roztworu 1 mM paklitakselu rozcieńczonego w DMSO. Odpipetować roztwór do 10 μl porcji. Porcje należy przechowywać w zamrażarce w temperaturze -20 °C.
    11. Dimetylosulfotlenek (DMSO)
      UWAGA: DMSO używane w tych eksperymentach jest czyste.
      1. Odmierzyć pipetę 1 ml czystego DMSO do 10 μl porcji. Porcje należy przechowywać w zamrażarce w temperaturze -20 °C.
    12. Fosforan kreatyny
      1. Przygotuj 1 ml roztworu 0,2 M fosforanu kreatyny w ultraczystej wodzie. Odpipetować roztwór do 10 μl porcji. Porcje należy przechowywać w zamrażarce w temperaturze -20 °C.
    13. Fosfokinaza kreatynowa
      1. Przygotuj 1 ml roztworu 200 jednostek·L-1 fosfokinazy kreatynowej w ultraczystej wodzie. Odpipetować roztwór do 10 μl porcji. Porcje należy przechowywać w zamrażarce w temperaturze -20 °C.
    14. Siarczan niklu (II)
      1. Przygotować 500 ml roztworu 50 mM siarczanu niklu (II) w ultraczystej wodzie. Roztwór przechowywać w temperaturze pokojowej (~25 °C).
    15. Roztwór poli(glikolu etylenowego)-blok-poli(glikol propylenowy)-blok-poli(glikol etylenowy) (PEG-PPG-PEG)
      1. Odważyć 2 mg proszku PEG-PPG-PEG (średnia masa cząsteczkowa: 14 600 g∙mol-1)-NTA na bibułce wagowej. PEG-PPG-PEG-NTA jest kopolimerem triblokowym funkcjonalizowanym grupą kwasu nitrylotrioctowego (NTA). Zapoznaj się z tabelą materiałów, aby uzyskać więcej informacji na temat PEG-PPG-PEG-NTA.
      2. Przenieść proszek do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Dodać 1 ml podstawowego roztworu siarczanu niklu (II) do probówki. Wirować, aż proszek się rozpuści i nie pozostaną żadne widoczne grudki.
      3. Przechowywać do miesiąca w temperaturze pokojowej.
  2. Przed rozpoczęciem eksperymentu
    1. Napełnij wiadro lodem.
    2. Pobrać po jednej porcji z każdego z 13 odczynników opisanych w sekcjach 1.1.1-1.1.13 powyżej i dodać je do wiadra, utrzymując je w ten sposób na lodzie. Rozmrozić każdy z odczynników przed użyciem.
  3. Preparat mikrotubul
    UWAGA: Mikrotubule polimeryzowano z 20 μg podwielokrotności liofilizowanej tubuliny znakowanej barwnikiem. Długość fali wzbudzenia barwnika wynosi 647 nm.
    1. Przygotowanie bufora do wzrostu mikrotubul
      1. Odmierzyć pipetę 21,8 μl buforu BRB80 do małej (0,6 ml) probówki do mikrowirówki. Dodać 1 μl roztworu podstawowego MgCl2, 1 μl roztworu podstawowego GTP i 1,2 μl roztworu podstawowego DMSO.
        UWAGA: Zatem końcowe stężenia odczynników w buforze BRB80 wynoszą 4 mM MgCl2, 1 mM GTP i 5% (v/v) dimetylosulfotlenku.
    2. Polimeryzacja mikrotubul
      1. Dodać 6,25 μl buforu wzrostu mikrotubul bezpośrednio do 20 μg podwielokrotności znakowanej liofilizowanej tubuliny. Wirować podwielokrotność przez 5 s przy 30 obr./s.
      2. Schłodzić podwielokrotność na lodzie przez 5 minut, a następnie inkubować w temperaturze 37 °C przez 45 minut i przejść do sekcji 1.3.3.
    3. Stabilizacja mikrotubul
      1. Dodać 5 μl roztworu paklitakselu do 490 μl buforu BRB80. Wiruj roztwór przez 10 s przy 30 obr./s.
      2. Po upływie 45 minut inkubacji mikrotubul dodać 5 μl spolimeryzowanego roztworu mikrotubul do roztworu BRB80/paklitaksel.
        UWAGA: Ten 100-krotnie rozcieńczony, stabilizowany roztwór mikrotubul będzie dalej określany jako MT100. Może być stosowany do 5 dni i może być rozcieńczany w celu uzyskania pożądanej gęstości mikrotubul dla każdego eksperymentu.
  4. Rozwiązanie dotyczące ruchliwości
    1. Enzymatyczny środek przeciw blaknięciu, system regenerujący ATP i ATP
      1. Dodać 9,0 μl roztworu kazeiny do 291 μl buforu BRB80.
      2. Jeśli pożądane stężenie ATP w doświadczeniu jest niższe niż 1 mM, odpipetuj 83 μl roztworu BRB80/kazeiny do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 0,6 ml. W przeciwnym razie odpipetować 85 μl tego roztworu do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 0,6 ml.
      3. Do tej probówki dodać 1 μl D-glukozy, 1 μl oksydazy glukozowej, 1 μl katalazy i 1 μl DTT.
        UWAGA: Te chemikalia stanowią enzymatyczny koktajl zapobiegający blaknięciu21, który zmniejszy fotowybielanie, usuwając rozpuszczony tlen i gasząc reaktywne rodniki. Zmniejsza to fotowybielanie i rozpad mikrotubul spowodowany oświetleniem wzbudzenia podczas obrazowania fluorescencyjnego22,23.
      4. W przypadku doświadczeń, w których stężenie ATP jest znacznie niższe niż 1 mM, należy dodać następujące odczynniki do roztworu, aby stworzyć system regenerujący ATP: 1 μl roztworu fosforanu kreatyny i 1 μl roztworu fosfokinazy kreatynowej w podzielonym.
      5. Dodać 1 μl podstawowego roztworu ATP do roztworu ruchliwości. Przesuń lub zwiruj podwielokrotność, aby równomiernie rozprowadzić chemikalia.
        UWAGA: Zatem końcowe stężenie substancji chemicznych w roztworze to 10 μM paklitaksel, 0,5 mg·mL−1 kazeina, 20 mM D-glukozy, 200 μg·mL−1 oksydaza glukozowa, 8 μg·mL−1 katalaza, 10 mM ditiotreitol, 2 mM fosforan kreatyny (jeśli dodano), 2 jednostki ·L−1 fosfokinaza kreatyny (jeśli została dodana), i 1 mM ATP. To rozwiązanie będzie odtąd określane jako rozwiązanie ruchliwości.
    2. Kinesin
      UWAGA: Podstawowy roztwór kinezyny używany w tych eksperymentach jest przygotowany przez G. Bachanda z Center for Integrated Nanotechnologies w Sandia National Laboratories i udostępniany w ramach umowy użytkownika (https://cint.lanl.gov/becoming-user/call-for-proposals.php). Zastosowany tutaj bufor składa się z 40 mM imidazolu, 300 mM NaCl, 0,76 g·L-1 EGTA, 37,2 mg·L-1 EDTA, 50 g·L-1 sacharozy, 0,2 mM TCEP i 50 μM Mg-ATP. W tej serii eksperymentów wykorzystano konstrukt kinezyny rkin430eGFP. Jest to kinezyna składająca się z pierwszych 430 aminokwasów ciężkiego łańcucha kinezyny szczura połączonego z eGFP i C-końcowym znacznikiem Hisa w domenie ogonowej24. Wyrażano go w Escherichia coli i oczyszczano za pomocą kolumny Ni-NTA. Stężenie roztworu podstawowego GFP-kinezyna wynosiło 1,8 ± 0,3 μM, zgodnie z ustaleniami za pomocą spektrofotometrii UV/Vis, przy zastosowaniu współczynnika ekstynkcji dla GFP wynoszącego 55 mM-1·cm-1 przy 489 nm25 i biorąc pod uwagę, że kinezyna jest dimerem.
      1. Określ pożądane stężenie kinezyny lub gęstość powierzchni do eksperymentu. Dla typowych testów stężenie to wynosi 20 nM. Jeśli stężenie kinezyny musi być rozcieńczone więcej niż stukrotnie, rozcieńczyć je w roztworze BRB80 zawierającym 0,5 mg·mL-1 kazeiny.
      2. Dodać 1 μl roztworu kinezyny do roztworu ruchliwości, aby uzyskać końcowe stężenie około 20 nM.
    3. Mikrotubule
      1. Dodać 10 μl roztworu MT100 przygotowanego w sekcji 1.3 do roztworu do pomiaru ruchliwości.
        UWAGA: Ten roztwór ruchliwości może być używany do 3 godzin. Po tym czasie system antifade traci swoją skuteczność, ponieważ glukoza w roztworze jest wyczerpywana przez reakcję enzymatyczną.

2. Montaż komórek przepływowych

  1. Mycie szkiełek nakrywkowych
    1. W przypadku komór przepływowych należy użyć dużego szkiełka nakrywkowego (wymiary: 60 mm x 25 mm) i małego (wymiary: 22 mm x 22 mm)19.
    2. Spłucz wszystkie szkiełka nakrywkowe dwukrotnie etanolem i dwukrotnie wodą ultraczystą. Sonikować szkiełka nakrywkowe w ultraczystej wodzie przez 5 minut. Wysuszyć je w piekarniku w temperaturze 50–75 °C.
    3. Za pomocą środka czyszczącego UV/ozonowego (patrz tabela materiałów i instrukcje producenta) należy czyścić jedną stronę każdego szkiełka nakrywkowego przez 15 minut. Wykonać ten krok w temperaturze pokojowej (~25 °C) i w normalnych warunkach atmosferycznych (ciśnienie 1 atm).
    4. Ostrożnie przekręć każde szkiełko nakrywkowe na drugą stronę (za pomocą pęsety) i potraktuj UV/ozon również tę stronę.
    5. Szkiełka nakrywkowe należy ponownie poddać sonifikacji w ultraczystej wodzie przez 5 minut, a następnie ponownie wysuszyć je w piecu w temperaturze 50–75 °C.
  2. Obróbka szkiełek nakrywkowych w celu umożliwienia powlekania PEG-PPG-PEG
    UWAGA: Dimetylodichlorosilan i toluen użyte w tej części protokołu są wysoce toksyczne, należy wykonać następujące czynności pod wyciągiem, zachowując następujące środki ostrożności: nosić dwa zestawy rękawic ochronnych i koszulę z długimi rękawami pod fartuchem laboratoryjnym. Wsuń krawędzie rękawic do rękawów koszulki, tak aby żadna skóra z przedramion nie była bezpośrednio narażona na działanie chemikaliów w przypadku rozlania. Nosić okulary ochronne.
    1. Rozcieńczyć 25 ml czystego dimetylodichlorosilanu w 475 ml toluenu. Zanurz każde szkiełko nakrywkowe w roztworze dimetylodichlorosilanu i toluenu na 15 sekund.
    2. Szkiełka nakrywkowe umyć dwa razy w toluenie i trzy razy w metanolu. Wysuszyć szkiełka nakrywkowe za pomocą azotu pod ciśnieniem.
  3. Montaż szkiełek nakrywkowych w komory przepływowe
    1. Po wyschnięciu szkiełek nakrywkowych wytnij pionowo kawałek taśmy dwustronnej o wymiarach 2 cm x 2,5 cm na dwa paski o wymiarach 1 cm x 2,5 cm.
    2. Połóż duże szkiełko nakrywkowe na delikatnej wycieraczce roboczej i przyklej paski taśmy wzdłuż krawędzi szkiełka nakrywkowego, aby utworzyć obszar o wymiarach 1 cm x 2,5 cm między kawałkami taśmy.
    3. Przyklej małe szkiełko nakrywkowe na paskach taśmy, aby zakończyć montaż komory przepływowej.

3. Przepływ roztworów do komórki przepływowej

  1. Przelać około 20 μl roztworu PEG-PPG-PEG do zmontowanej celi przepływowej. Objętość, która jest przesyłana do komórki, musi być wystarczająco duża, aby wypełnić komorę. W kolejnych krokach użyj tego samego woluminu podczas wymiany roztworów.
  2. Pozostawić roztwór PEG-PPG-PEG do wchłonięcia się na powierzchni przez 5 minut. Wymień roztwór PEG-PPG-PEG z buforem BRB80 3 razy, wlewając bufor. Przelać roztwór ruchliwości do komory przepływowej.
  3. Uszczelnij krawędzie komory przepływowej smarem, aby zapobiec parowaniu, jeśli planowany eksperyment jest dłuższy niż godzina.
    UWAGA: Komórka przepływowa jest teraz gotowa do obrazowania.

4. Obrazowanie komórki przepływowej

  1. Wykonaj obrazowanie przy użyciu obiektywnej konfiguracji całkowitego wewnętrznego odbicia fluorescencji (TIRF) zarówno dla mikrotubul, jak i silników kinezynowych (patrz Tabela materiałów).
    UWAGA: W tym przypadku użyliśmy mikroskopu z soczewką obiektywową o aperturze numerycznej 100x/1,49, wykorzystując dwa lasery, jeden o długości fali 642 nm i maksymalnej mocy 140 mW, a drugi o długości fali 488 nm i maksymalnej mocy 150 mW.
  2. Umieść kroplę olejku immersyjnego na obiektywie.
  3. Umieść kuwetę przepływową na platformie mikroskopu i podnieś obiektyw do góry, aż dojdzie do kontaktu między olejem na obiektywie a komorą przepływową.
  4. Użyj systemu osłon blokujących mikroskopu, aby zablokować ucieczkę całego światła laserowego.
  5. Włącz laser i skup się na dolnej powierzchni komory przepływowej. Mikrotubule są znakowane fluorescencyjnie i wzbudzane przy długości fali 647 nm. Będą one obrazowane za pomocą lasera o długości fali 642 nm, podczas gdy laser o długości fali 488 nm jest używany w silnikach GFP-kinesin.
  6. Nagraj interesujące obrazy lub filmy. Zazwyczaj moc lasera wynosi około 30 mW, a czas naświetlania 50 ms dla obu kanałów laserowych. Obrazy mogą być rejestrowane tak długo, jak długo istnieje ruchliwość w komórce przepływowej.
    UWAGA: Oświetlenie laserowe jest szkodliwe dla gołego oka i może spowodować nieodwracalne uszkodzenia. Upewnij się, że oświetlony obszar jest całkowicie zakryty nieprzezroczystą pokrywą.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tych eksperymentach użyliśmy 1000-krotnego rozcieńczenia mikrotubul przygotowanych w sekcji 1.3.2. Stężenie kinezyny wynosiło 20 nM, a stężenie ATP 1 mM. Obrazowanie wykonano przy użyciu mikroskopii TIRF. Ślizgające się mikrotubule były obrazowane oddzielnie od silników kinezynowych: mikrotubule były widoczne po wzbudzeniu laserem o długości fali 647 nm (Rysunek 1, czerwony), a kinezyna GFP była widoczna po wzbudzeniu laserem o długości fali 488 nm ( Rysunek 1, zielony). Czas pomiędzy wzbudzeniem światłem czerwonym i zielonym wynosił mniej niż 1 s. Czas między klatkami wynosił 10 s. Mikrotubule wykazywały stabilny poślizg. Średnia prędkość ślizgu mikrotubul wynosiła około 800 nm/s. Gęstość powierzchni mikrotubul wynosiła 400 mm-2. Ślady kinezyny (zielonej) wydawały się wychodzić poza końcowy koniec mikrotubul (czerwony) na kilka mikrometrów.

figure-results-1
Rysunek 1: Ślizgające się mikrotubule napędzane przez słabo związane z powierzchnią silniki kinezynowe. Gdy mikrotubule poruszają się do przodu, gromadzą silniki kinezynowe z roztworu. Silniki te przechodzą naprzemiennie między dwoma stanami: pojedynczym związanym z mikrotubulą i podwójnie związanym zarówno z mikrotubulą, jak i powierzchnią. Kiedy silnik z podwójnym wiązaniem dociera do końca mikrotubuli, silnik pozostaje w tyle i powoli desorbuje się z powierzchni z szybkością około 0,1 s-1. W rezultacie, za mikrotubulami pozostają ślady silników kinezynowych. Górny rząd: kanał czerwony (mikrotubule). Środkowy rząd: kanał zielony (kinezyna). Dolny rząd: połączony kanał czerwony (mikrotubula) i zielony (GFP-kinezyna). Podziałka skali: 20 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W niniejszej pracy prezentujemy aktywny system w nanoskali, który sam składa słabo wiążące bloki budulcowe, aby skonstruować własną ścieżkę. Jak pokazano na rysunku 1, ślizgające się mikrotubule gromadzą silniki kinezynowe z roztworu i osadzają je na powierzchni. Silniki kinezynowe pozostają w śladzie mikrotubuli przez krótki okres czasu, zanim powrócą do roztworu. Tak więc w tym eksperymencie silniki kinezynowe zmieniają się między 3 stanami:

(1) Stan pojedynczego wiązania mikrotubul: jest to sytuacja, w której kinezyna po raz pierwszy wiąże się z mikrotubulą. Istnieje w równowadze ze stanem (2).

(2) Stan podwójnego wiązania: w tym przypadku kinezyna pojedynczo związana mikrotubulą również wiąże się z powierzchnią za pośrednictwem swojego znacznika His. Ten stan podwójnego wiązania pozwala na napęd mikrotubul.

(3) Pojedynczy stan związany z powierzchnią: podwójnie związana kinezyna, która odeszła od końca mikrotubuli i jeszcze nie zdesorbowała się z powierzchni, znajduje się w tym stanie. Silniki te można zaobserwować na rysunku 1 (kanały kombinowane i zielone): rozciągają się one za ogonem mikrotubuli na kilka mikrometrów i tworzą jego zmniejszający się ślad.

Najbardziej krytycznym etapem tego protokołu jest uformowanie hydrofobowej powierzchni na szkiełku. Nie tylko wykorzystuje niebezpieczne chemikalia, ale także pozwala PEG-PPG-PEG funkcjonalizowanemu z grupą NTA pokryć powierzchnię, co następnie pozwala kinezynie na odwracalne związanie się z powierzchnią. Kolejnym ważnym krokiem jest uszczelnienie komory przepływowej smarem. Pozwala to na długotrwałe obrazowanie bez parowania cieczy w komorze przepływowej.

Podstawowe modyfikacje tej techniki polegają na zmianie stężenia mikrotubul, stężenia kinezyny i stężenia ATP. Zmiana stężenia mikrotubul zmieni liczbę mikrotubul ślizgających się po powierzchni. Zmiana stężenia kinezyny zmieni liczbę cząsteczek kinezyny, które mogą wiązać się z mikrotubulą. Jednak zwiększenie stężenia kinezyny powyżej ilości już zdefiniowanych w tym eksperymencie może zwiększyć fluorescencję tła, utrudniając dostrzeżenie śladów kinezyny pozostawionych przez ślizgające się mikrotubule. Tymczasem obniżenie stężenia ATP poniżej 10 μM znacznie zmniejszy prędkość ślizgania się mikrotubul. Jeśli efekt ten jest pożądany, konieczne jest wykorzystanie systemu regenerującego ATP składającego się z fosfatazy kreatynowej i fosfokinazy.

Możliwym ograniczeniem tej techniki jest to, że ze względu na dużą zawartość aktywnej kinezyny w systemie, ATP może być szybko zużyte, a eksperymenty mogą trwać krócej niż godzinę w określonych warunkach. Miałoby to miejsce na przykład w przypadku, gdyby zastosowano dwukrotnie wyższe stężenie kinezyny i pięciokrotnie wyższe stężenie mikrotubul niż to, co przedstawiono w tym protokole.

W naszej poprzedniej pracy18 badaliśmy rozkład przestrzenny silników kinezynowych wzdłuż mikrotubul, udowadniając, że ślizgające się mikrotubule gromadzą silniki kinezynowe z roztworu, co skutkuje wzrostem gęstości silników na całej długości mikrotubul. Odkryliśmy również, że stabilność ślizgowa mikrotubul wykazała nieliniową zależność od stężenia kinezyny roztworu i prędkości mikrotubul.

Przedstawiony protokół toruje drogę do bardziej efektywnego wykorzystania silników białkowych w systemach inżynieryjnych w nanoskali oraz do dalszych badań nad projektowaniem aktywnych nanosystemów, które znajdują się w równowadze dynamicznej. Co więcej, dynamiczna natura tego systemu pozwala mu służyć jako system modelowy do badania samonaprawy i dynamicznej wymiany składników molekularnych, wypełniając część luki między strukturami inżynieryjnymi a naturalnymi.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują za wsparcie finansowe w ramach grantu NSF NSF-DMR 1807514. Autorzy dziękują G. Bachandowi i V. Vandelinderowi za dostarczenie białka GFP-kinezyny. Prace te zostały częściowo wykonane w Center for Integrated Nanotechnologies, Office of Science User Facility obsługiwanym przez Los Alamos National Laboratory dla Biura Naukowego Departamentu Energii Stanów Zjednoczonych (DOE) (kontrakt nr 1). DE- AC52-06NA25396) i Sandia National Laboratories (umowa nr 97 DE-AC04-94AL85000). Autorzy dziękują dr Jennifer Neff i AllVivo Vascular za dar PEG-PPG-PEG funkcjonalizowanego NTA.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Laser 488 nmOmicron LaserageLuxX 488-150
Laser 642 nmOmicron LaserageLuxX  642
KazeinaSigmaC7078-500G
Katalaza z wątroby bydlęcejSigmaC40-500MG
Fosforan kreatynySigmaP-7936
Fosfokinaza kreatynowaSigmaC3755-500UN
D-GlukozaSigmaG2133-50KU
Roztwór dichlorodimetylosilanuSigma40140-25MLToksyczny
dimetylosulfotlenekSigma34869-100ML
DitiothreitolSigmaD0632-5GToksyczne
zaćmienie TINikon Instruments
eGFP rkin430Dostarczone przez George'a Bachandra
EGTA SigmaE4378-25G
Falcon 50 ml stożkowe probówki wirówkoweFisher Scientific14-959-49A
Oksydaza glukozowaSigmaG0543-10KU
Trifosforan guanozynySigmaG8877-10MG
Kimwipes Delikatne wycieraczkido zadań Sigma Pharmaceuticals8089
Chlorek magnezuSigmaM1028-100ML
MetanolFisher ChemicalA412toksyczny
System oczyszczania wody Milli-Q MilliporeCorporation
Siarczan nikluSigma656895-50G
PAKLITAKSELSigmaT1912-5MG
RURYSigmaP-6757
Pluronic F108-NTADostarczone przez Jennifer Neff i AllVivo VascularPEG-PPG-PEG-NTA
Pluronic  F-108Sigma542342-250GPEG-PPG-PEG
Thermo Scientific Snap Cap Probówki do mikrowirówek o niskiej retencjiFisher Scientific21-403-190
ToluenFisher ChemicalT324Toksyczna
tubulina, cytoszkielet z oznaczeniem HiLyte647, Inc.TL670M
UV Ozone ProcleanerBioForce NanosciencesPC440
Whatman  Filtry strzykawkowe PuradiscSigmaWHA67840402
Zyla 4.2 Kamera sCMOSi technologiasCMOS 4.2

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vale, R. D., Reese, T. S., Sheetz, M. P. Identification of a Novel Force-Generating Protein, Kinesin, Involved in Microtubule-Based Motility. Cell. 42, 39-50 (1985).
  2. Ray, S., Meyhofer, E., Milligan, R. A., Howard, J. Kinesin Follows the Microtubule's Protofilament Axis. Journal of Cell Biology. 121, 1083-1093 (1993).
  3. Dennis, J. R., Howard, J., Vogel, V. Molecular shuttles: directed motion of microtubules along nanoscale kinesin tracks. Nanotechnology. 10, 232-236 (1999).
  4. Kawamura, R., Kakugo, A., Osada, Y., Gong, J. P. Microtubule bundle formation driven by ATP: the effect of concentrations of kinesin, streptavidin and microtubules. Nanotechnology. 21, 145603(2010).
  5. Korten, T., Chaudhuri, S., Tavkin, E., Braun, M., Diez, S. Kinesin-1 Expressed in Insect Cells Improves Microtubule in Vitro Gliding Performance, Long-Term Stability and Guiding Efficiency in Nanostructures. IEEE Transactions on Nanobioscience. 15, 62-69 (2016).
  6. Whitesides, G. M., Grzybowski, B. Self-assembly at all scales. Science. 295, 2418-2421 (2002).
  7. Ringler, P., Schulz, G. E. Self-assembly of proteins into designed networks. Science. 302, 106-109 (2003).
  8. Boncheva, M., et al. Magnetic self-assembly of three-dimensional surfaces from planar sheets. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 3924-3929 (2005).
  9. England, J. L. Dissipative adaptation in driven self-assembly. Nature Nanotechnology. 10, 919(2015).
  10. Fialkowski, M., et al. Principles and Implementations of Dissipative (Dynamic) Self-Assembly. The Journal of Physical Chemistry B. 110, 2482-2496 (2006).
  11. Boncheva, M., Whitesides, G. M. Self-healing systems having a design stimulated by the vertebrate spine. Angewandte Chemie-International Edition. 42, 2644-2647 (2003).
  12. Rubenstein, M., Cornejo, A., Nagpal, R. Programmable self-assembly in a thousand-robot swarm. Science. 345, 795-799 (2014).
  13. Plaisted, T. A., Vakil Amirkhizi, A., Arbelaez, D., Nemat-Nasser, S. C., Nemat-Nasser, S. Self-healing structural composites with electromagnetic functionality. Proceedings of the Society of Photo-Optical Instrumentation Engineers. 5054, 372-381 (2003).
  14. Ghosh, S. K. Self-Healing Materials. Ghosh, S. K. , Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. Weinheim. 1-28 (2009).
  15. Burnworth, M., et al. Optically healable supramolecular polymers. Nature. 472, (2011).
  16. Bachand, G. D., Spoerke, E. D., Stevens, M. J. Microtubule-Based Nanomaterials: Exploiting Nature's Dynamic Biopolymers. Biotechnology and Bioengineering. 112, 1065-1073 (2015).
  17. Gao, Y. W., Lei, F. M. Small scale effects on the mechanical behaviors of protein microtubules based on the nonlocal elasticity theory. Biochemical and Biophysical Research Communications. 387, 467-471 (2009).
  18. Lam, A. T. -C., Tsitkov, S., Zhang, Y., Hess, H. Reversibly Bound Kinesin-1 Motor Proteins Propelling Microtubules Demonstrate Dynamic Recruitment of Active Building Blocks. Nano Letters. 18, 1530-1534 (2018).
  19. Howard, J., Hunt, A. J., Baek, S. Assay of microtubule movement driven by single kinesin molecules. Methods in Cell Biology. 39, 137-147 (1993).
  20. Huppertz, T., Fox, P. F., Kelly, A. L. Proteins in Food Processing (Second Edition). Yada, R. Y. , Woodhead Publishing. Sawston, Cambridge. 49-92 (2018).
  21. Wettermark, G., Borglund, E., Brolin, S. E. A regenerating system for studies of phosphoryl transfer from ATP. Analytical Biochemistry. 22, 211-218 (1968).
  22. Vigers, G. P. A., Coue, M., McIntosh, J. R. Fluorescent Microtubules Break Up Under Illumination. Journal of Cell Biology. 107, 1011-1024 (1988).
  23. Brunner, C., Hess, H., Ernst, K. -H., Vogel, V. Lifetime of biomolecules in hybrid nanodevices. Nanotechnology. 15, S540-S548 (2004).
  24. Rogers, K. R., et al. KIF1D is a fast non-processive kinesin that demonstrates novel K-loop-dependent mechanochemistry. EMBO Journal. 20, 5101-5113 (2001).
  25. Patterson, G. H., Knobel, S. M., Sharif, W. D., Kain, S. R., Piston, D. W. Use of the green fluorescent protein and its mutants in quantitative fluorescence microscopy. Biophysical Journal. 73, 2782-2790 (1997).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Molekularne wahad a nap dzane kinezynodwracalne przy czenie kinezynytest po lizgu mikrotubulfluorescencja ca kowitego wewn trznego odbiciatraktowanie ozonem UVmonta komory przep ywowejpolimeryzacja mikrotubulobrazowanie kinezyny GFPprzygotowanie roztworu do bada motylo cisilanizacja szkie ek nakrywkowych

Powiązane artykuły