Artykuł metodologiczny

Drożdże jako podwozie do opracowywania testów funkcjonalnych do badania ludzkiego p53

DOI:

10.3791/59071

⸱

4 sierpnia 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Mutagenesis and Cancer Prevention Unit, Ospedale Policlinico San Martino, 2Department CIBIO, University of Trento, 3LAQV/REQUIMTE, Laboratory of Microbiology, Faculty of Pharmacy, University of Porto

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawione są tutaj cztery protokoły do konstruowania i wykorzystywania szczepów reporterowych drożdży Saccharomyces cerevisiae do badania potencjału transaktywacji ludzkiego P53, wpływu różnych mutacji związanych z rakiem, współekspresji białek oddziałujących oraz efektów określonych małych cząsteczek.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Odkrycie, że dobrze znane białko P53 ssaków może działać jako czynnik transkrypcyjny (TF) u drożdży S. cerevisiae, pozwoliło na opracowanie różnych testów funkcjonalnych w celu zbadania wpływu 1) wariantów sekwencji miejsca wiązania [tj. elementu odpowiedzi (RE)] na specyficzność transaktywacji P53 lub 2) TP53 mutacje, kofaktory ulegające koekspresji lub małe cząsteczki o aktywności transaktywacyjnej P53. Opracowano różne podstawowe i translacyjne aplikacje badawcze. Eksperymentalnie podejścia te wykorzystują dwie główne zalety modelu drożdży. Z jednej strony łatwość edycji genomu umożliwia szybką budowę jakościowych lub ilościowych systemów reporterowych poprzez wykorzystanie szczepów izogenicznych, które różnią się tylko na poziomie określonego P53-RE, w celu zbadania swoistości sekwencyjnej transaktywacji zależnej od P53. Z drugiej strony, dostępność regulowanych systemów do ektopowej ekspresji P53 pozwala na ocenę transaktywacji w szerokim zakresie ekspresji białek. W niniejszym raporcie omówiono szeroko stosowane systemy oparte na genach reporterowych kolorów, lucyferazie i wzroście drożdży, aby zilustrować ich główne kroki metodologiczne i krytycznie ocenić ich moc predykcyjną. Co więcej, ekstremalna wszechstronność tych podejść może być łatwo wykorzystana do badania różnych TF, w tym P63 i P73, które są innymi członkami rodziny genów TP53.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transkrypcja to niezwykle złożony proces obejmujący dynamiczną, przestrzenną i czasową organizację czynników transkrypcyjnych (TF) i kofaktorów do rekrutacji i modulacji polimeraz RNA na regionach chromatyny w odpowiedzi na określone bodźce1. Większość TF, w tym ludzki supresor guza P53, rozpoznaje specyficzne elementy działające na cis w postaci sekwencji DNA zwanych elementami odpowiedzi (RE), które składają się z pojedynczych (lub wielu) unikalnych motywów o długości ~ 6-10 nukleotydów. W obrębie tych motywów poszczególne pozycje mogą wykazywać różne stopnie zmienności2, zwykle podsumowane za pomocą matryc wag pozycji (PWM) lub logos3,4.

Drożdże S. cerevisiae to odpowiedni system modelowy do badania różnych aspektów ludzkich białek poprzez testy komplementacji, ekspresji ektopowej i testów funkcjonalnych, nawet gdy nie występuje ortologicznego genu drożdży5,6,7. Ze względu na ewolucyjną konserwację podstawowych składników systemu transkrypcyjnego8, wiele ludzkich TF (gdy ektopowo eksprymowane w komórkach drożdży) może modulować ekspresję genu reporterowego, działając poprzez promotory zaprojektowane tak, aby zawierały odpowiednie RE. Przedstawiony tutaj system modelu transkrypcji dla ludzkiego P53 charakteryzuje się trzema głównymi zmiennymi, których efekty można modulować: 1) modalność ekspresji i typ P53, 2) sekwencja RE kontrolująca transkrypcję zależną od P53 oraz 3) typ genu reporterowego (Figura 1A).

Jeśli chodzi o modalność wyrażenia P53, S. cerevisiae pozwala na wybór indukowalnych, represyjnych lub konstytutywnych promotorów9,10,11. W szczególności indukowalny promotor GAL1 umożliwia podstawową (przy użyciu rafinozy jako źródła węgla) lub zmienną (poprzez zmianę ilości galaktozy w pożywce) ekspresję TF w drożdżach. W rzeczywistości precyzyjnie przestrajalne wyrażenie stanowi kluczowe osiągnięcie w badaniu nie tylko samego P53, ale także innych białek rodziny P5312,13.

Jeśli chodzi o rodzaj RE kontrolujących ekspresję zależną od P53, S. cerevisiae pozwala na konstruowanie różnych szczepów reporterowych posiadających unikalne różnice w interesującym RE na tle izogenicznym. Cel ten został osiągnięty dzięki adaptacji szczególnie wszechstronnego podejścia do edycji genomu opracowanego u S. cerevisiae, zwanego delitto perfetto12,14,15,16.

Ponadto, różne geny reporterowe (tj. URA3, HIS3 i ADE2) mogą być używane do jakościowej i ilościowej oceny aktywności transkrypcyjnej ludzkich TF u S. cerevisiae, z których każdy ma specyficzne cechy, które można dostosować do potrzeb eksperymentalnych17,18,19,20,21. Ekspresja tych genów reporterowych nadaje odpowiednio prototrofię uracylu, histydyny i adeniny. Reporter URA3 nie pozwala również na wzrost komórek w obecności 5-FOA, a zatem może być kontrselekcjonowany. System reporterowy ADE2 ma tę zaletę, że oprócz selekcji żywieniowej umożliwia identyfikację komórek drożdży, które wyrażają P53 typu dzikiego (tj. funkcjonalnego na ADE2) lub zmutowanego (tj. niefunkcjonalnego na ADE2) P53 z koloru kolonii.

Na przykład, komórki drożdży wyrażające gen ADE2 generują białe kolonie normalnej wielkości na płytkach zawierających ograniczające ilości adeniny (2,5-5,0 mg/L), podczas gdy te, które słabo lub nie transkrybują jej, pojawiają się na tej samej płytce co mniejsze czerwone (lub różowe) kolonie. Wynika to z akumulacji produktu pośredniego w szlaku biosyntezy adeniny (tj. P-rybozyloamino-imidazolu, który wcześniej nazywano rybotydem amino-imidazolu lub AIR), który jest przekształcany w czerwony pigment. Jakościowy gen reporterowy ADE2 oparty na kolorze został od tego czasu zastąpiony ilościowym Firefly Photinus pyralis (LUC1)12,22. Niedawno reporter ADE2 został połączony z reporterem lacZ w łatwym do oceny, półilościowym, podwójnym teście reporterowym, który można wykorzystać do podklasyfikacji mutantów P53 zgodnie z ich resztkowym poziomem funkcjonalności23.

Fluorescencyjne reportery, takie jak EGFP (wzmocnione białko zielonej fluorescencji) lub DsRed (czerwone białko fluorescencyjne Discosoma sp.) zostały również użyte do ilościowej oceny aktywności transaktywacji związanej ze wszystkimi możliwymi mutacjami typu missense w sekwencji kodującej TP5324. Wreszcie, szansa na połączenie przestrajalnych promotorów ekspresji allelu P53 z izogenicznymi szczepami drożdży różniącymi się genem RE i/lub reporterowym doprowadziła do opracowania matrycy danych, która generuje wyrafinowaną klasyfikację alleli P53 związanych z rakiem i zmutowanych w linii zarodkowej25,26,27.

Opisane powyżej podejścia są używane do pomiaru aktywności transkrypcyjnej białka P53. Jednak ekspresja P53 typu dzikiego u drożdży S. cerevisiae28 i Schizosaccharomyces pombe29 może powodować opóźnienie wzrostu, które jest związane z zatrzymaniem cyklu komórkowego28,30 lub śmierć komórki31. W obu przypadkach zahamowanie wzrostu drożdży jest wywoływane przez wysoką ekspresję P53 i jest skorelowane z potencjalną modulacją transkrypcji endogennych genów drożdży zaangażowanych we wzrost komórek. Potwierdzając tę hipotezę, mutant P53 R273H nie zakłócał wzrostu komórek drożdży, gdy był wyrażany na podobnych poziomach jak P5332. I odwrotnie, ekspresja w drożdżach toksycznego mutanta P53 V122A (znanego z wyższej aktywności transkrypcyjnej w porównaniu z P53 typu dzikiego) spowodowała silniejszy efekt hamujący wzrost niż typ dziki P5332.

Dodatkowo, wykazano, że ludzki MDM2 był w stanie hamować ludzką aktywność transkrypcyjną P53 u drożdży, sprzyjając ich ubikwitynacji i późniejszej degradacji33. W związku z tym wykazano zdolność ludzkich MDM2 i MDMX do hamowania indukowanego przez P53 wzrostu drożdży32,34. W dodatkowym badaniu ustalono korelację między aktywnością transkrypcyjną P53 a poziomem ekspresji aktyny, z identyfikacją przypuszczalnego RE P53 przed genem ACT1 w drożdżach32. Konsekwentnie, ekspresja aktyny była zwiększana przez P53 typu dzikiego, a jeszcze bardziej przez P53 V122A, ale nie przez zmutowany P53 R273H. I odwrotnie, ekspresja aktyny przez P53 zmniejszyła się przy jednoczesnej obecności inhibitorów P53 MDM2, MDMX lub pifitryny-α (małocząsteczkowego inhibitora aktywności transkrypcyjnej P53), zgodnie z wynikami opartymi na teście wzrostu drożdży. Co ważne, wyniki te ustaliły korelację między indukowanym przez P53 hamowaniem wzrostu a stopniem jego aktywności u drożdży, co zostało również wykorzystane do identyfikacji i badania małych cząsteczek modulujących funkcje P5328,34,35.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Budowa szczepów drożdży reporterowych ADE2 lub LUC1 zawierających specyficzny RE (yAFM-RE lub yLFM-RE)

  1. Smuga szczepu yAFM-ICORE lub yLFM-ICORE 12,14 (ICORE = I, endonukleaza ISce-I pod promotorem GAL1; CO = licznik wybierany URA3; RE = reporter KanMX4 nadający oporność na kanamycynę; Tabela 1) z 15% glicerolu przechowywanego w temperaturze -80 °C na płytce z agarem YPDA (Tabela 2). Pozwól mu rosnąć przez 2-3 dni w temperaturze 30 °C.
  2. Wziąć jedną kolonię drożdży ze świeżej płytki (nie starszej niż 3 tygodnie) i umieścić ją w małej kolbie zawierającej 5 ml YPDA (Tabela 2). Inkubować w temperaturze 30 °C przez noc, wstrząsając z prędkością 150-200 obr./min.
  3. Następnego dnia, aby usunąć wszelkie ślady dekstrozy, należy granulować komórki przez 2 minuty w temperaturze 3000 x g i wyrzucić supernatant przez odwrócenie probówki.
    UWAGA: Wszystkie wirowania zgodnie z tym protokołem należy wykonywać w temperaturze pokojowej (RT).
  4. Zawiesić osad komórkowy w 30-50 ml wstępnie podgrzanego CM (kompletnego podłoża) zawierającego galaktozę (Tabela 2) i inkubować przez 4 godziny w temperaturze 30 °C, wytrząsając z prędkością 150-200 obr./min (niezbędne do indukcji I-SceI).
  5. Odwirować komórki przez 2 minuty przy 3 000 x g i odrzucić supernatant przez odwrócenie probówki.
  6. Zawiesić osad komórkowy w 30-50 ml sterylnej wody. Powtórz krok 1.5.
  7. Zawiesić osad komórkowy w 10 ml sterylnej wody. Powtórz krok 1.5.
  8. Zawiesić osad komórkowy w 5 ml sterylnego LiAcTE (Tabela 3), roztworu jonowego, który sprzyja wychwytowi DNA. Powtórz krok 1.5.
  9. Zawiesić osad komórkowy w 250 μl sterylnego LiAcTE i przenieść komórki do probówki o pojemności 1,5 ml. Powtórz krok 1,5 i ponownie zawieś osad komórek w 300-500 μl sterylnego LiAcTE.
  10. Podczas płukania denaturować roztwór 10 mg/ml nośnika DNA plemników łososia przez 10 minut w temperaturze 100 °C i natychmiast schłodzić na lodzie, aby utrzymać go jako jednoniciowy DNA.
  11. W osobnej probówce o pojemności 1,5 ml dodaj 500 pikomoli pożądanego oligonukleotydu (Tabela 3), 5 μl DNA nośnika nasienia łososia gotowanego, 300 μl sterylnego LiAcTE PEG (Tabela 3) i 50 μl zawiesiny komórek drożdży (z kroku 1.9).
  12. Wirować probówki przez 10 sekund, aby wymieszać i inkubować przez 30 minut w temperaturze 30 °C, wstrząsając z prędkością 150-200 obr./min. Umieść probówki o pojemności 1,5 ml z boku, aby ułatwić potrząsanie.
  13. Szok termiczny komórek drożdży przez 15 minut w temperaturze 42 °C w bloku grzewczym, a następnie odwirowywanie komórek przez 20 s przy 10 000 x g. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 ml sterylnej wody.
  14. Rozprowadzić 100 μl zawiesiny komórkowej na płytce agarowej YPDA i inkubować (do góry nogami) przez 1 dzień w temperaturze 30 °C. Aby zapewnić uzyskanie dobrze oddzielonych kolonii, należy również rozprowadzić 100 μl rozcieńczenia 1:10.
  15. Następnego dnia replikować płytkę przy użyciu sterylnych aksamitów na płytce agarowej CM zawierającej dekstrozę i 5-FOA (Tabela 2). Rozważ drugą replikę płytki na nowej płytce, jeśli przeniesiono wiele komórek (tj. pewien wzrost komórek URA3).
  16. Trzy dni później replika płytki na nieselektywnych płytkach agarowych YPDA i YPDA zawierających G418 (antybiotyk aminoglikozydowy podobny do kanamycyny) (Tabela 2), oznaczając każdą płytkę w celu ułatwienia ich późniejszego porównania. Inkubować płytki przez noc w temperaturze 30 °C.
  17. Następnego dnia zidentyfikuj kandydujące szczepy reporterowe z kolonii, które są wrażliwe na G418, ale rosną na płytkach YPDA (np. kolonie yLFM- lub yAFM-RE). Umieść zidentyfikowane kolonie (3-6 kolonii) na nowej płytce YPDA, aby uzyskać pojedyncze izolaty kolonii i pozwól im rosnąć przez 2 dni w temperaturze 30 °C.
  18. Umieść pojedyncze kolonie drożdży na płytce YPDA, aby wyizolować kolonie do dalszych analiz. Po 24 godzinach w temperaturze 30 °C należy je przetestować, replikując posiew na płytce agarowej YPGA (tabela 2), która zapobiega rozwojowi drobnych mutantów (tj. mutantów z niedoborem układu oddechowego). W tym samym czasie replika płytki na nowej płytce agarowej YPDA.
  19. Przetestuj odpowiednie plastry (tj. wzrost na płytkach agarowych YPDA i YPGA; 1-3 kolonie) z kroku 1.18 pod kątem obecności prawidłowej integracji oligonukleotydów metodą PCR kolonii. Zebrać mieszaninę reakcyjną, dodając 5 μl 10x buforu PCR (1,5 mM MgCl2), 2 μl 10 pikoboli/μl starterów (Tabela 3), 4 μl 2,5 mM dNTP, 0,25 μL 5 U/μL polimerazy Taq i wodę do końcowej objętości 50 μL. Pomnóż mieszaninę reakcyjną przez liczbę kolonii drożdży, które należy przesiać, i podwielokrotność 50 μL do każdej probówki PCR. Za pomocą pipety dodaj bardzo małą ilość komórek drożdży z płytki agarowej YPDA do pojedynczej mieszaniny reakcyjnej PCR.
  20. Przeprowadzić reakcję PCR w następującym programie: 94 °C przez 8 minut, następnie 35 cykli denaturacji przez 1 minutę w temperaturze 94 °C, wyżarzanie starterów przez 1 minutę w temperaturze 55 °C i przedłużenie przez 2 minuty w temperaturze 72 °C.
  21. Po zakończeniu reakcji załaduj porcję reakcji PCR (około jednej dziesiątej objętości) na żel agarozowy, aby sprawdzić prawidłowy rozmiar (~500 pz) .
  22. Sekwencjonować produkt PCR po oczyszczeniu za pomocą zestawu komercyjnego, aby potwierdzić integrację pożądanej sekwencji RE przy użyciu tych samych starterów co w kroku 1.19.
  23. Po walidacji prawidłowej sekwencji należy przygotować 15% zapas glicerolu z kultury szczepu yAFM-RE lub yLFM-RE (w YPDA) i przechowywać go w temperaturze -80 °C.

2. Ocena zdolności transaktywacji białka P53 przy użyciu jakościowego testu drożdży ADE2 opartego na kolorze

  1. Powtórz kroki 1.1 i 1.2 przy użyciu szczepu yAFM-RE (Tabela 1).
  2. Następnego dnia rozcieńczyć kulturę komórkową (1:10) w 30-50 ml wstępnie podgrzanego YPDA i kontynuować inkubację w temperaturze 30 °C przez wstrząsanie, aż OD600 nm osiągnie 0,8-1,0 (~ 2 h).
  3. Powtórz kroki 1.5-1.10.
  4. W oddzielnej probówce o pojemności 1,5 ml dodaj 300-500 ng wektora ekspresyjnego drożdży P53 (lub kontrolnego) (Tabela 4), 5 μl nośnika DNA ugotowanego nasienia łososia, 300 μl sterylnego LiAcTE PEG i 50 μl zawiesiny komórek drożdży.
  5. Powtórz kroki 1.12 i 1.13, ale ponownie zawieś osad komórek w 300 μl sterylnej wody.
  6. Rozprowadzić 100 μl zawiesiny komórkowej na syntetycznych selektywnych (dla ekspresji P53 lub wektora kontrolnego) płytkach zawierających dekstrozę jako źródło węgla i dużą ilość adeniny (Tabela 2), a następnie inkubować (do góry nogami) w temperaturze 30 °C przez 2-3 dni.
  7. Umieść pojedyncze kolonie transformantów drożdży (2-6 smug na płytkę) na nowej selektywnej płytce i pozwól im rosnąć przez noc w temperaturze 30 °C.
  8. Dzień później, przy użyciu sterylnych aksamitnych replik płytki na nowych selektywnych płytkach, które pozwalają na ocenę fenotypu barwy (tj. Płytki zawierające dekstrozę jako źródło węgla, ale ograniczające ilość adeniny; Tabela 2). Inkubować płytki do góry nogami w temperaturze 30 °C przez 3 dni. Opcjonalnie, aby ocenić wrażliwość termiczną białka P53, inkubować w trzech różnych temperaturach przez 3 dni: 24 °C, 30 °C i 37 °C.
    UWAGA: Ta sama seria może być wielokrotnie platerowana powłoką.
  9. Aby ocenić zdolność transaktywacji białka P53, sprawdź fenotyp oparty na kolorze kolonii drożdży i porównaj fenotyp białka P53 w odniesieniu do fenotypów P53 typu dzikiego i pustych wektorów.

3. Ocena zdolności transaktywacji białka P53 przy użyciu ilościowego testu drożdży LUC1 opartego na luminescencji

  1. Przekształć komórki drożdży za pomocą wektorów ekspresyjnych P53 (lub kontrolnych) (Tabela 4) przy użyciu metody opartej na LiAc opisanej w protokole 2. Użyj szczepu yLFM-RE (Tabela 1).
  2. Na nową, selektywną płytkę należy umieścić pojedyncze transformanty z dużą ilością adeniny zawierającej glukozę jako źródłem węgla i pozostawić je do wzrostu w temperaturze 30 °C przez noc. Dla każdego typu transformacji wykonaj 5-7 różnych łatek.
  3. Po nocnym wzroście ponownie zawiesić niewielką ilość komórek drożdży za pomocą sterylnej wykałaczki lub końcówki pipety z płytki w syntetycznym selektywnym podłożu zawierającym dekstrozę lub rafinozę jako źródło węgla (200 μl końcowej objętości na przezroczystej 96-dołkowej płytce, z okrągłym lub płaskim dnem). Jeśli eksperyment wymaga indukowalnej ekspresji P53, dodaj galaktozę do pożywki rafinozowej, aby modulować poziom indukcji (Tabela 2).
    UWAGA: Te zawiesiny komórek powinny mieć OD600 nm około 0,4 i nie więcej niż 1.
  4. Zmierzyć absorbancję każdej studzienki przy średnicy zewnętrznej600 nm po indukowanym ekspresji P53 (4-8 godzin w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem 150-200 obr./min) za pomocą czytnika płytek z wieloma etykietami. Upewnij się, że zawiesiny komórek są jednorodne, mieszając każdą studzienkę za pomocą pipety wielokanałowej.
  5. Przenieść 10-20 μl zawiesiny komórek z przezroczystej płytki 96-dołkowej do białej płytki 384 (lub 96) dołkowej i wymieszać z równą objętością (10-20 μl) buforu do lizy. Inkubować przez 10-15 minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce (150-200 obr./min), aby uzyskać przepuszczalność komórki do substratu lucyferazy.
  6. Dodać 10-20 μl substratu lucyferazy świetlika i zmierzyć jednostki świetlne (LU) za pomocą czytnika płytek z wieloma etykietami.
  7. Aby określić zdolność transaktywacji białka P53, znormalizuj jednostki LU każdej studzienki do odpowiadającego im OD600 nm (względna jednostka światła, RLU). Oblicz średnią RLU i odchylenie standardowe z 3-4 płatów kolonii transformatorów drożdży.
  8. Porównaj dane dotyczące transaktywacji białka P53 w odniesieniu do wektora dzikiego i pustego typu P53, odejmując wartości uzyskane za pomocą pustego wektora lub dzieląc przez wartości uzyskane za pomocą pustego wektora (tj. obliczeniowego zagięcia indukcji).
    UWAGA: Aktywność transaktywacji P53 można również ocenić przy użyciu tego samego zestawu eksperymentalnego w obecności białek oddziałujących z P53 (tj. MDM2 i MDMX) i/lub z uwzględnieniem leczenia farmakologicznego.

4. Ocena zahamowania wzrostu białka P53 za pomocą testu fenotypowego drożdży

  1. Przekształć komórki drożdży za pomocą wektorów ekspresyjnych P53 / MDM2 / MDMX (lub kontrolnych) (Tabela 4) przy użyciu metody opartej na LiAc opisanej w sekcji 2. Użyj szczepu CG379 (Tabela 1) i rozprowadź transformanty drożdżowe na minimalnie selektywnych płytkach (Tabela 2).
  2. Hoduj przekształcone komórki w minimalnym selektywnym pożywce (Tabela 2) do około 1 OD600 nm.
  3. Rozcieńczyć komórki drożdży do 0,05 OD600 nm w selektywnej pożywce indukcyjnej (Tabela 2) i opcjonalnie dodać wybraną małą cząsteczkę do odpowiedniego stężenia (lub tylko rozpuszczalnika), aby przetestować jej skuteczność w reaktywacji zmutowanego P53 lub w hamowaniu interakcji MDM2-/MDMX-P53.
  4. Inkubować komórki w temperaturze 30 °C pod ciągłym wytrząsaniem orbitalnym (200 obr./min) przez około 42 godziny (czas wymagany przez drożdże kontroli ujemnej, aby osiągnąć fazę mid-log, około 0,45 OD600 nm).
  5. Umieścić 100 μl podwielokrotności kultur komórkowych drożdży na minimalnie selektywnych płytkach (Tabela 2).
  6. Inkubować przez 2 dni w temperaturze 30 °C.
  7. Zmierz wzrost drożdży, licząc liczbę kolonii uzyskanych w 100 μl kropli kulturowych (jednostka tworząca kolonię, liczba CFU). Na przykład oblicz efekt reaktywacji zmutowanych związków, biorąc pod uwagę wzrost drożdży wykazujących ekspresję P53 typu dzikiego jako maksymalny możliwy efekt (ustawiony na 100%), podczas gdy wzrost komórek wykazujących ekspresję zmutowanego P53 (ale wystawionych na kontrolę rozpuszczalnika) reprezentuje zerowy poziom reaktywacji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Budowa szczepów drożdży reporterowych ADE2 lub LUC1

delitto perfettoapproach12,14,15,16 został przystosowany do budowy szczepów drożdży reporterowych P53 (Rysunek 1B

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Testy na bazie drożdży okazały się przydatne do badania różnych aspektów funkcji białka P53. Testy te są szczególnie czułe do oceny potencjału transaktywacji P53 w stosunku do wariantów miejsc docelowych RE, w tym do oceny funkcjonalnych polimorfizmów. Zastosowanie kolorowych reporterów, a także miniaturyzacja testu lucyferazy skutkują opłacalnymi i stosunkowo skalowalnymi testami. Ponadto test zahamowania wzrostu może być potencjalnie stosowany w badaniach przesiewowych bibliotek chemicznych, automatyzując kwantyfikację...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Unii Europejskiej (fundusze FEDER POCI/01/0145/FEDER/007728 poprzez Programa Operacional Factores de Competitividade - COMPETE) oraz Funduszom Narodowym (FCT/MEC, Fundação para a Ciência e Tecnologia i Ministério da Educação e Ciência) na mocy Umowy Partnerstwa PT2020 UID/QUI/50006/2019 oraz projektom (3599-PPCDT) PTDC/DTP-FTO/1981/2014 - POCI-01-0145-FEDER-016581. Stypendia FCT: SFRH/BD/96189/2013 (S. Gomes). Prace te były wspierane przez Compagnia S. Paolo z Turynu we Włoszech (projekt 2017.0526) oraz Ministerstwo Zdrowia (projekt 5x1000, 2015 i 2016; bieżące badania z 2016 r.). Serdecznie dziękujemy dr Teresie López-Arias Montenegro (Uniwersytet w Trydencie, laboratoria dydaktyczne nauk eksperymentalnych) za pomoc w nagrywaniu filmów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kwas L-asparaginowySIGMA11189
QIAquick Zestaw do oczyszczania PCRQIAGEN28104
L-fenyloalaninaSIGMA78019
PeptonBD Bacto211677
Drożdże ex+A2:C26tractBD Bacto212750
Drożdże Difco Zasada azotu bez aminokwasów i siarczanu amonuBDTM233520
Dihydrat octanu lituSIGMA517992
Agar bakteriologiczny typu ABiokar DiagnosticsA1010 HA
G418 Sól dwusiarczanowaSIGMAA1720
Siarczan amonuSIGMAA2939
Monochlorowodorek L-argininySIGMAA5131
Sól hemissiarczanu adeninySIGMAA9126
Pasywny bufor do lizy 5xPROMEGAE1941
System oznaczania lucyferazy Bright-Glo PROMEGAE2620
5-FOAZymo ResearchF9001
D-(+)-galaktozaSIGMAG0750
Kwas L-glutaminowySIGMAG1251
Dekstroza SIGMAG7021
L-histydynaSIGMAH8125
L-IzoleucynaSIGMAI2752
L-LizynaSIGMAL1262
L-LeucynaSIGMAL8000
L-MetioninaSIGMAM2893
PEGSIGMAP3640
D-(+)-rafinoza PentahydratSIGMAR0250
L-serynaSIGMAS4500
L-TryptofanSIGMAT0271
L-TreoninaSIGMAT8625
UracylSIGMAU0750
L-WalinaSIGMAV0500

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Spitz, F., Furlong, E. E. Transcription factors: from enhancer binding to developmental control. Nature Reviews Genetics. 13 (9), 613-626 (2012).
  2. Pan, Y., Tsai, C. J., Ma, B., Nussinov, R. Mechanisms of transcription factor selectivity. Trends in Genetics. 26 (2), 75-83 (2010).
  3. Das, M. K., Dai, H. K. A survey of DNA motif finding algorithms. BMC Bioinformatics. 8 Suppl 7, S21(2007).
  4. Sebastian, A., Contreras-Moreira, B. The twilight zone of cis element alignments. Nucleic Acids Resesarch. 41 (3), 1438-1449 (2013).
  5. Iggo, R., et al. Validation of a yeast functional assay for p53 mutations using clonal sequencing. Journal of Pathology. 231 (4), 441-448 (2013).
  6. Kaeberlein, M., Burtner, C. R., Kennedy, B. K. Recent developments in yeast aging. PLoS Genetics. 3 (5), e84(2007).
  7. Scharer, E., Iggo, R. Mammalian p53 can function as a transcription factor in yeast. Nucleic Acids Research. 20 (7), 1539-1545 (1992).
  8. Kennedy, B. K. Mammalian transcription factors in yeast: strangers in a familiar land. Nature Reviews Molecular Cellular Biology. 3 (1), 41-49 (2002).
  9. Belli, G., Gari, E., Piedrafita, L., Aldea, M., Herrero, E. An activator/repressor dual system allows tight tetracycline-regulated gene expression in budding yeast. Nucleic Acids Research. 26 (4), 942-947 (1998).
  10. Mumberg, D., Muller, R., Funk, M. Regulatable promoters of Saccharomyces cerevisiae: comparison of transcriptional activity and their use for heterologous expression. Nucleic Acids Research. 22 (25), 5767-5768 (1994).
  11. Weinhandl, K., Winkler, M., Glieder, A., Camattari, A. Carbon source dependent promoters in yeasts. Microbial Cell Factories. 13, 5(2014).
  12. Inga, A., Storici, F., Darden, T. A., Resnick, M. A. Differential transactivation by the p53 transcription factor is highly dependent on p53 level and promoter target sequence. Molelcular and Cellular Biology. 22 (24), 8612-8625 (2002).
  13. Resnick, M. A., Inga, A. Functional mutants of the sequence-specific transcription factor p53 and implications for master genes of diversity. Proceeding of the National Academy of Science USA. 100 (17), 9934-9939 (2003).
  14. Tomso, D. J., et al. Functionally distinct polymorphic sequences in the human genome that are targets for p53 transactivation. Proceeding of the National Academy of Science USA. 102 (18), 6431-6436 (2005).
  15. Storici, F., Lewis, L. K., Resnick, M. A. In vivo site-directed mutagenesis using oligonucleotides. Nature Biotechnology. 19 (8), 773-776 (2001).
  16. Storici, F., Resnick, M. A. The delitto perfetto approach to in vivo site-directed mutagenesis and chromosome rearrangements with synthetic oligonucleotides in yeast. Methods in Enzymology. 409, 329-345 (2006).
  17. Campomenosi, P., et al. p53 mutants can often transactivate promoters containing a p21 but not Bax or PIG3 responsive elements. Oncogene. 20 (27), 3573-3579 (2001).
  18. Flaman, J. M., et al. A simple p53 functional assay for screening cell lines, blood, and tumors. Proceedings of the National Academy of Science USA. 92 (9), 3963-3967 (1995).
  19. Kovvali, G. K., Mehta, B., Epstein, C. B., Lutzker, S. G. Identification of partial loss of function p53 gene mutations utilizing a yeast-based functional assay. Nucleic Acids Research. 29 (5), E28(2001).
  20. Shimada, A., et al. The transcriptional activities of p53 and its homologue p51/p63: similarities and differences. Cancer Research. 59 (12), 2781-2786 (1999).
  21. Sunahara, M., et al. Mutational analysis of p51A/TAp63gamma, a p53 homolog, in non-small cell lung cancer and breast. Oncogene. 18 (25), 3761-3765 (1999).
  22. Andreotti, V., et al. p53 transactivation and the impact of mutations, cofactors and small molecules using a simplified yeast-based screening system. PLoS ONE. 6 (6), e20643(2011).
  23. Hekmat-Scafe, D. S., et al. Using yeast to determine the functional consequences of mutations in the human p53 tumor suppressor gene: An introductory course-based undergraduate research experience in molecular and cell biology. Biochemistry Molecular Biology Educaction. 45 (2), 161-178 (2017).
  24. Kato, S., et al. Understanding the function-structure and function-mutation relationships of p53 tumor suppressor protein by high-resolution missense mutation analysis. Proceedings of the National Academy of Science USA. 100 (14), 8424-8429 (2003).
  25. Monti, P., et al. Transcriptional functionality of germ line p53 mutants influences cancer phenotype. Clinical Cancer Research. 13 (13), 3789-3795 (2007).
  26. Monti, P., et al. Dominant-negative features of mutant TP53 in germline carriers have limited impact on cancer outcomes. Molecular Cancer Research. 9 (3), 271-279 (2011).
  27. Leroy, B., et al. The TP53 website: an integrative resource centre for the TP53 mutation database and TP53 mutant analysis. Nucleic Acids Research. 41 (Database issue), D962-D969 (2013).
  28. Nigro, J. M., Sikorski, R., Reed, S. I., Vogelstein, B. Human p53 and CDC2Hs genes combine to inhibit the proliferation of Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 12 (3), 1357-1365 (1992).
  29. Bureik, M., Jungbluth, A., Drescher, R., Wagner, P. Human p53 restores DNA synthesis control in fission yeast. Biological Chemistry. 378 (11), 1361-1371 (1997).
  30. Leao, M., et al. Alpha-mangostin and gambogic acid as potential inhibitors of the p53-MDM2 interaction revealed by a yeast approach. Journal of Natural Products. 76 (4), 774-778 (2013).
  31. Hadj Amor, I. Y., et al. Human p53 induces cell death and downregulates thioredoxin expression in Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Research. 8 (8), 1254-1262 (2008).
  32. Leao, M., et al. Novel simplified yeast-based assays of regulators of p53-MDMX interaction and p53 transcriptional activity. FEBS J. 280 (24), 6498-6507 (2013).
  33. Di Ventura, B., Funaya, C., Antony, C., Knop, M., Serrano, L. Reconstitution of Mdm2-dependent post-translational modifications of p53 in yeast. PLoS ONE. 3 (1), e1507(2008).
  34. Leao, M., et al. Discovery of a new small-molecule inhibitor of p53-MDM2 interaction using a yeast-based approach. Biochemichal Pharmacology. 85 (9), 1234-1245 (2013).
  35. Billant, O., Blondel, M., Voisset, C. p53, p63 and p73 in the wonderland of S. cerevisiae. Oncotarget. 8 (34), 57855-57869 (2017).
  36. Cho, Y., Gorina, S., Jeffrey, P. D., Pavletich, N. P. Crystal structure of a p53 tumor suppressor-DNA complex: understanding tumorigenic mutations. Science. 265 (5170), 346-355 (1994).
  37. Muller, P. A., Vousden, K. H., Norman, J. C. p53 and its mutants in tumor cell migration and invasion. Journal of Cellular Biology. 192 (2), 209-218 (2011).
  38. Oren, M., Rotter, V. Mutant p53 gain-of-function in cancer. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (2), a001107(2010).
  39. Walerych, D., Napoli, M., Collavin, L., Del Sal, G. The rebel angel: mutant p53 as the driving oncogene in breast cancer. Carcinogenesis. 33 (11), 2007-2017 (2012).
  40. Ciribilli, Y., et al. The coordinated p53 and estrogen receptor cis-regulation at an FLT1 promoter SNP is specific to genotoxic stress and estrogenic compound. PLoS ONE. 5 (4), e10236(2010).
  41. Menendez, D., Inga, A., Resnick, M. A. Potentiating the p53 network. Discovery Medicine. 10 (50), 94-100 (2010).
  42. Monti, P., et al. Characterization of the p53 mutants ability to inhibit p73 beta transactivation using a yeast-based functional assay. Oncogene. 22 (34), 5252-5260 (2003).
  43. Monti, P., et al. Tumour p53 mutations exhibit promoter selective dominance over wild-type p53. Oncogene. 21 (11), 1641-1648 (2002).
  44. Shiraishi, K., et al. Isolation of temperature-sensitive p53 mutations from a comprehensive missense mutation library. Journal of Biological Chemistry. 279 (1), 348-355 (2004).
  45. Soussi, T. TP53 mutations in human cancer: database reassessment and prospects for the next decade. Advances in Cancer Research. 110, 107-139 (2011).
  46. Malkin, D. Li-Fraumeni Syndrome. Genes and Cancer. 2, 474-484 (2001).
  47. el-Deiry, W. S., Kern, S. E., Pietenpol, J. A., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. Definition of a consensus binding site for p53. Nature Genetics. 1 (1), 45-49 (1992).
  48. Menendez, D., Inga, A., Resnick, M. A. The expanding universe of p53 targets. Nature Reviews in Cancer. 9, 724-737 (2009).
  49. Ciribilli, Y., et al. Transactivation specificity is conserved among p53 family proteins and depends on a response element sequence code. Nucleic Acids Research. 41 (18), 8637-8653 (2013).
  50. Smeenk, L., et al. Characterization of genome-wide p53-binding sites upon stress response. Nucleic Acids Research. 36, 3639-3654 (2008).
  51. Vyas, P., et al. Diverse p53/DNA binding modes expand the repertoire of p53 response elements. Proceeding of the National Academy of Science USA. 114 (40), 10624-10629 (2017).
  52. Tebaldi, T., et al. Whole-genome cartography of p53 response elements ranked on transactivation potential. BMC Genomics. 16, 464(2015).
  53. Wang, T., et al. Species-specific endogenous retroviruses shape the transcriptional network of the human tumor suppressor protein p53. Proceedings of the National Academy of Science USA. 104, 18613-18618 (2007).
  54. Bond, G. L., et al. A single nucleotide polymorphism in the MDM2 promoter attenuates the p53 tumor suppressor pathway and accelerates tumor formation in humans. Cell. 119 (5), 591-602 (2004).
  55. Zeron-Medina, J., et al. A polymorphic p53 response element in KIT ligand influences cancer risk and has undergone natural selection. Cell. 155 (2), 410-422 (2013).
  56. Lion, M., et al. Evolution of p53 transactivation specificity through the lens of a yeast-based functional assay. PLoS ONE. 10 (2), e0116177(2015).
  57. Schumacher, B., et al. C. elegans ced-13 can promote apoptosis and is induced in response to DNA damage. Cell Death and Differentiation. 12 (2), 153-161 (2005).
  58. Jordan, J. J., et al. Low-level p53 expression changes transactivation rules and reveals superactivating sequences. Proceeding of the National Academy of Science USA. 109 (36), 14387-14392 (2012).
  59. Soares, J., et al. Oxazoloisoindolinones with in vitro antitumor activity selectively activate a p53-pathway through potential inhibition of the p53-MDM2 interaction. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 66, 138-147 (2015).
  60. Leao, M., et al. Enhanced cytotoxicity of prenylated chalcone against tumour cells via disruption of the p53-MDM2 interaction. Life Sciences. 142, 60-65 (2015).
  61. Soares, J., et al. A tryptophanol-derived oxazolopiperidone lactam is cytotoxic against tumors via inhibition of p53 interaction with murine double minute proteins. Pharmacol Research. 95-96, 42-52 (2015).
  62. Soares, J., et al. DIMP53-1: a novel small-molecule dual inhibitor of p53-MDM2/X interactions with multifunctional p53-dependent anticancer properties. Molecular Oncology. 11 (6), 612-627 (2017).
  63. Soares, J., et al. Reactivation of wild-type and mutant p53 by tryptophanolderived oxazoloisoindolinone SLMP53-1, a novel anticancer small-molecule. Oncotarget. 7 (4), 4326-4343 (2016).
  64. Sharma, V., Monti, P., Fronza, G., Inga, A. Human transcription factors in yeast: the fruitful examples of P53 and NF-small ka, CyrillicB. FEMS Yeast Research. 16 (7), (2016).
  65. Stepanov, A., Nitiss, K. C., Neale, G., Nitiss, J. L. Enhancing drug accumulation in Saccharomyces cerevisiae by repression of pleiotropic drug resistance genes with chimeric transcription repressors. Molecular Pharmacology. 74 (2), 423-431 (2008).
  66. Sharma, V., et al. Quantitative Analysis of NF-kappaB Transactivation Specificity Using a Yeast-Based Functional Assay. PLoS ONE. 10 (7), e0130170(2015).
  67. Epinat, J. C., et al. Reconstitution of the NF-kappa B system in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 13 (7), 599-612 (1997).
  68. Inga, A., Reamon-Buettner, S. M., Borlak, J., Resnick, M. A. Functional dissection of sequence-specific NKX2-5 DNA binding domain mutations associated with human heart septation defects using a yeast-based system. Human Molecular Genetics. 14 (14), 1965-1975 (2005).
  69. Reamon-Buettner, S. M., Ciribilli, Y., Inga, A., Borlak, J. A loss-of-function mutation in the binding domain of HAND1 predicts hypoplasia of the human hearts. Human Molecular Genetics. 17 (10), 1397-1405 (2008).
  70. Balmelli-Gallacchi, P., et al. A yeast-based bioassay for the determination of functional and non-functional estrogen receptors. Nucleic Acids Research. 27 (8), 1875-1881 (1999).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Analizy p53 w dro d achtransaktywacja p53reporterowe szczepy dro d ytest lucyferazykolorymetryczny gen reporterowyhamowanie wzrostu dro d yelement odpowiedzi p53transformacja octanem lituanaliza mutant w p53badanie czynnik w transkrypcyjnych

Powiązane artykuły