Artykuł metodologiczny

Obserwacja w czasie rzeczywistym reakcji wymiany nici DNA, w której pośredniczy Rad51

9.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59073

⸱

13 lutego 2019

 ,  ,  , 
1Cell Biology Center, Institute of Innovative Research, Tokyo Institute of Technology

W tym artykule

Podsumowanie

Opracowano systemy obserwacji w czasie rzeczywistym oparte na transferze energii rezonansu fluorescencji reakcji wymiany nici DNA, w której pośredniczy Rad51. Korzystając z przedstawionych tutaj protokołów, jesteśmy w stanie wykryć powstawanie produktów pośrednich reakcji i ich przekształcanie w produkty, jednocześnie analizując kinetykę enzymatyczną reakcji.

Streszczenie

Reakcja wymiany nici DNA, w której pośredniczy Rad51, jest krytycznym etapem rekombinacji homologicznej. W tej reakcji Rad51 tworzy włókno nukleoproteinowe na jednoniciowym DNA (ssDNA) i wychwytuje dwuniciowe DNA (dsDNA) niespecyficznie, aby przesłuchać je pod kątem sekwencji homologicznej. Po napotkaniu homologii, Rad51 katalizuje wymianę nici DNA, pośrednicząc w parowaniu ssDNA z komplementarną nicią dsDNA. Reakcja ta jest silnie regulowana przez liczne białka pomocnicze in vivo. Chociaż konwencjonalne testy biochemiczne zostały z powodzeniem zastosowane do zbadania roli takiego białka pomocniczego in vitro, analiza kinetyczna tworzenia pośredniego i jego progresji do produktu końcowego okazała się wyzwaniem ze względu na niestabilny i przejściowy charakter produktów pośrednich. Aby obserwować te etapy reakcji bezpośrednio w roztworze, stworzono systemy obserwacji tej reakcji oparte na rezonansie fluorescencyjnym (FRET). Analiza kinetyczna obserwacji w czasie rzeczywistym pokazuje, że reakcja wymiany nici DNA, w której pośredniczy Rad51, jest zgodna z trzyetapowym modelem reakcji obejmującym tworzenie trójniciowego produktu pośredniego, dojrzewanie tego produktu pośredniego i uwalnianie ssDNA z dojrzałego produktu pośredniego. Kompleks Swi5-Sfr1, białko pomocnicze konserwatywne u eukariontów, silnie wzmacnia drugi i trzeci etap tej reakcji. Przedstawione tutaj testy oparte na FRET pozwalają nam odkryć mechanizmy molekularne, za pomocą których białka dostępowe do rekombinacji stymulują aktywność wymiany nici DNA Rad51. Podstawowym celem tego protokołu jest poszerzenie repertuaru technik dostępnych dla badaczy w dziedzinie rekombinacji homologicznej, w szczególności tych pracujących z białkami z gatunków innych niż Schizosaccharomyces pombe, tak aby można było określić ewolucyjne zachowanie przedstawionych tu wyników.

Wprowadzenie

Rekombinacja homologiczna (HR) ułatwia przenoszenie informacji genetycznej między dwiema różnymi cząsteczkami DNA. HR jest niezbędny dla dwóch podstawowych zjawisk biologicznych: generowania różnorodności genetycznej podczas gametogenezy1 oraz naprawy pęknięć podwójnej nici DNA (DSBs)2 podczas mitozy. DSB są najcięższą formą uszkodzenia DNA i stanowią pęknięcie chromosomu. Nieprawidłowa naprawa DSB może powodować rozległe rearanżacje chromosomów i niestabilność genomu, które są cechami charakterystycznymi raka3.

Reakcja wymiany nici DNA jest centralną fazą HR. Białko Rad51, które należy do wysoce konserwatywnej rodziny rekombinaz typu RecA, jest kluczowym białkiem, które katalizuje tę reakcję u eukariontów4,5. W tej reakcji Rad51 wiąże się z jednoniciowym DNA (ssDNA) generowanym przez przetwarzanie nukleolityczne końca DSB i tworzy spiralny kompleks nukleoproteinowy zwany włóknem presynaptycznym. To włókno wyłapuje nienaruszone dwuniciowe DNA (dsDNA) niespecyficznie w poszukiwaniu sekwencji homologicznej. Gdy włókno znajdzie sekwencję homologiczną, powstaje półprodukt reakcji zawierający trójniciowy DNA, a włókno Rad51 pośredniczy w wymianie nici w tej strukturze6,7,8. Aby skutecznie przeprowadzić tę reakcję, Rad51 wymaga kilku rodzajów białek pomocniczych, takich jak BRCA1 i BRCA2, produkty genów podatności na raka piersi9,10.

Zrozumienie, w jaki sposób czynniki pomocnicze regulują Rad51, jest integralnym krokiem w odkrywaniu przyczyn niestabilności genomu podczas nowotworzenia. Chociaż wiele badań dotyczy wpływu tych czynników na tworzenie i stabilność włókien presynaptycznych11,12,13,14,15,16, wpływ tych czynników na powstanie trójniciowego produktu pośredniego i jego przetwarzanie w produkt końcowy jest nadal niejasny. Obserwacja tych etapów reakcji za pomocą konwencjonalnych eksperymentów biochemicznych jest bardzo trudna, ponieważ trójniciowy produkt pośredni jest niestabilny i podatny na zapadanie się w wyniku typowych manipulacji eksperymentalnych, takich jak deproteinizacja próbek lub elektroforeza.

Aby przezwyciężyć ten problem, dostosowaliśmy dwa wcześniej opracowane systemy obserwacji w czasie rzeczywistym reakcji wymiany nici DNA za pomocą transferu energii rezonansu fluorescencji (FRET): testy parowania nici DNA i przemieszczenia nici DNA17,18 (Rysunek 1). W teście parowania nici DNA Rad51 tworzy włókno presynaptyczne z ssDNA znakowanym amidytem fluoresceiny (FAM), a następnie dodaje się homologiczny dsDNA znakowany karboksy-x-rodaminą (ROX) w celu zainicjowania reakcji wymiany nici. Kiedy włókno złapie znakowane ROX dsDNA i utworzy trójniciowy produkt pośredni, dwa fluorofory zbliżają się do siebie, a emisja fluorescencji FAM jest gaszona przez ROX (Figura 1A). W teście przemieszczenia nici DNA włókno presynaptyczne utworzone na nieznakowanym ssDNA inkubuje się z podwójnie znakowanym dsDNA FAM i ROX. Kiedy wymiana nici zostanie zakończona, a ssDNA znakowane FAM zostanie uwolnione z trójniciowego produktu pośredniego, emisja FAM wzrasta, ponieważ FAM nie znajduje się już w bliskiej odległości od ROX (Figura 1B). Testy te pozwalają nam obserwować powstawanie trójniciowych półproduktów i ich przetwarzanie na produkty końcowe w czasie rzeczywistym bez żadnych zakłóceń reakcji.

Korzystając z tego systemu obserwacji w czasie rzeczywistym, stwierdziliśmy, że reakcja wymiany nici DNA, w której pośredniczy Rad51, przebiega w trzech etapach, w tym tworzeniu pierwszego pośredniego produktu (C1), przejściu pierwszego pośredniego do drugiego pośredniego (C2) i uwolnieniu ssDNA z C219. Odkryliśmy również, że drożdże rozszczepienia (S. pombe) Swi5-Sfr1, które są ewolucyjnie konserwatywnym kompleksem białek pomocniczych Rad5113,16,20,21,22, stymuluje przejście C1-C2 i uwalnianie ssDNA z C2 w sposób zależny od hydrolizy ATP przez Rad5119.

Nie wiadomo, czy te odkrycia są ewolucyjnie zachowane. Protokół ten ma nadzieję, że naukowcy zajmujący się HR, zwłaszcza ci pracujący z białkami organizmów innych niż S. pombe, mogą zastosować te techniki w celu określenia stopnia, w jakim molekularny mechanizm wymiany nici sterowanej przez Rad51 jest zachowany. Co więcej, techniki te okazały się bardzo skuteczne w określaniu roli S. pombe Swi5-Sfr1. W związku z tym można racjonalnie przewidzieć, że techniki te będą nieocenione w odkrywaniu dokładnych ról innych dodatkowych czynników HR.

Protokół

1. Przygotowanie białek i substratów DNA

  1. Oczyść białka S. pombe Rad51 i Swi5-Sfr1 do jednorodności (ocenianej na podstawie barwienia Coomassie), jak wcześniej zgłoszono13,21.
  2. Przygotuj oligonukleotydowe substraty DNA wymienione w tabeli 118.
    UWAGA: Oligonukleotydy zakupiono (patrz tabela materiałów) i zsyntetyzowano w klasie HPLC. Do reakcji parowania nici DNA wymagane są oligonukleotydy 16FA(-), 16A(-)_40bp i 16AR(+)_40bp. Do testu przemieszczenia DNA wymagane są oligonukleotydy 16A(-), 16FA(-)_40bp i 16AR(+)_40bp (Rysunek 1 i Tabela 1). Wszystkie stężenia DNA w tym protokole odnoszą się do stężeń fragmentów, a nie do stężeń nukleotydów.
  3. Aby utworzyć dsDNA donora, wymieszaj równomolowe ilości komplementarnych nici w cienkościennej probówce do PCR z buforem do wyżarzania (10 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2), zapewniając całkowitą objętość większą niż 20 μL. Wykonaj to mieszanie na wstępnie schłodzonym metalowym stojaku na lodzie (między 2 °C a 4 °C).
    UWAGA: Kombinacja oligonukleotydów do testu parowania to 16A(-)_40bp i 16AR(+)_40bp. Do testu przemieszczenia wyżarzane oligonukleotydy 16FA(-)_40bp i 16AR(+)_40bp.
  4. Podgrzewać mieszaninę do wyżarzania w temperaturze 90 °C przez 5 minut i schładzać przez 3 godziny do 30 °C za pomocą maszyny do PCR. Wyżarzone DNA należy przechowywać w temperaturze -20 °C.

2. Testy parowania i przemieszczenia nici DNA

  1. Wykonaj test parowania nici DNA.
    1. Przygotować 1,6 ml buforu reakcyjnego A (30 mM HEPES-KOH o pH 7,5, 1 mM ditiotreitolu [DTT], 15 mM MgCl2, 0,25 mM ATP, 0,1 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej [BSA] i 0,0075% monolaurynianu polioksyetylenosorbitolu) zawierającego 36 nM 16FA(-) w 2,0 ml plastikowej probówce do mikrowirówek (polipropylen) i wstępnie inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut.
    2. Aby utworzyć włókna Rad51-ssDNA, należy dodać białko Rad51 do końcowego stężenia 1,5 μM we wstępnie inkubowanym buforze reakcyjnym i inkubować go w temperaturze 37 °C przez 5 minut.
    3. Dodać białko Swi5-Sfr1 do mieszaniny do końcowego stężenia 0,15 μM i inkubować w temperaturze 37 °C przez dalsze 5 minut.
    4. Weź 1,5 ml mieszaniny i przenieś ją do kuwety kwarcowej o wymiarach 1,0 x 1,0 cm zawierającej mieszadło magnetyczne i umieść kuwetę w spektrofluorometrze. Ustawić regulator temperatury peltiera spektrofotometru na 37 °C i ustawić mieszadło magnetyczne na 450 obr./min, aby zapewnić szybkie mieszanie wstrzykiwanej próbki.
    5. Rozpocznij pomiar emisji fluorescencji FAM przy 525 nm (szerokość pasma: 20 nm) po wzbudzeniu przy 493 nm (szerokość pasma: 1 nm). Zbieraj dane co sekundę.
    6. Po rozpoczęciu pomiaru przez 100 s, wstrzyknąć do mieszaniny za pomocą strzykawki donorowy dsDNA znakowany ROX do końcowego stężenia 36 nM i mierzyć zmianę emisji w odstępach 1 s przez kolejne 30 minut.
  2. Wykonaj test przemieszczenia nici DNA.
    1. Przygotować 1,6 ml buforu reakcyjnego A zawierającego 36 nM 16A(-) w plastikowej probówce do mikrowirówki o pojemności 2,0 ml i wstępnie inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut.
    2. Utworzyć włókna Rad51-ssDNA w obecności Swi5-Sfr1 w temperaturze 37 °C, jak opisano w krokach 2.1.2 i 2.1.3.
    3. Pobrać 1,5 ml mieszaniny i przenieść ją do kuwety kwarcowej zawierającej mieszadło magnetyczne i umieścić kuwetę w spektrofotometrze, jak opisano w kroku 2.1.4.
    4. Rozpocznij pomiar emisji fluorescencji i po 100 s wstrzyknij dsDNA dawcy znakowane FAM i ROX, jak opisano w kroku 2.1.6. Mierzyć zmianę emisji fluorescencji w odstępach 1 s przez kolejne 30 minut.

3. Analiza danych eksperymentalnych z testów parowania i przemieszczenia

  1. Oszacuj maksymalną wydajność fretu.
    1. Przygotować 16FA(-) wyżarzony za pomocą 16AR(+)_40bp i 16FA(-)_40bp wyżarzony za pomocą 16AR(+)_40bp stosując tę samą procedurę opisaną w krokach 1.3 i 1.4.
    2. Przygotować 130 μl buforu reakcyjnego A zawierającego 36 nM 16FA(-), 16FA(-) wyżarzonych 16AR(+)_40bp, 16FA(-)_40bp wyżarzonych 16AR(+)_40bp lub 16FA(-)_40bp w kuwecie kwarcowej o wymiarach 0,2 x 1,0 cm.
    3. Umieścić kuwetę w spektrofluorometrze i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut.
    4. Zmierz widma fluorescencji od 500 do 600 nm po wzbudzeniu przy 493 nm.
    5. W celu zbadania wpływu Rad51 na emisję FAM i wygaszanie FAM przez ROX, należy dodać Rad51 do końcowego stężenia 1,5 μM do mieszaniny i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut.
    6. Zmierz widma fluorescencji od 500 do 600 nm po wzbudzeniu przy 493 nm.
    7. Oblicz maksymalną wydajność FRET (E maksymalnie) za pomocą równania opisanego poniżej:
      E maksimum = (Intensywność fluorescencji przy 525 nm dsDNA znakowanego zarówno FAM, jak i ROX) / (Intensywność fluorescencji przy 525 nm ssDNA znakowanego FAM)
  2. Analizuj dane eksperymentalne z testu przemieszczenia.
    1. Aby przeliczyć zmianę fluorescencji zaobserwowaną w teście przemieszczenia na zmianę ilości produktu końcowego, należy znormalizować surowe dane doświadczalne uzyskane z tego testu, korzystając z równania opisanego poniżej, gdzie Fsurowy to intensywność fluorescencji na podstawie danych surowych, a Fznormalizowany to zmiana fluorescencji obliczona za pomocą następującego równania.
      Fznormalizowane = ([Fsurowe w czasie x] - [Fsurowe w czasie 0]) / (([Fsurowe w czasie 0] /E maksimum) - [Fsurowe w czasie 0])
      Fsurowa w czasie 0 jest średnią fluorescencją monitorowaną przez pierwsze 5 s po czasie martwym (tj. czasie wymaganym do wymieszania po wprowadzeniu iniektora do kuwety).
    2. Aby wykluczyć skutki fotowybielania i spontanicznego przemieszczenia, odejmij Fznormalizowane bez białka od Fznormalizowanego próbki, aby uzyskać FD, czyli zmianę ilości produktu końcowego w tym teście.
      FD = [Fznormalizowane próbki] - [Fznormalizowane bez białka]
  3. Przeanalizuj dane eksperymentalne z testu parowania.
    1. Znormalizować surowe dane eksperymentalne uzyskane z testu parowania przy użyciu równania opisanego poniżej, gdzie Fsurowy to intensywność fluorescencji na podstawie danych surowych, a Fznormalizowany to zmiana fluorescencji obliczona za pomocą następującego równania.
      Fznormalizowane = (Fsurowe w czasie x) / (Fsurowe w czasie 0)
      Fsurowy w czasie 0 jest średnią fluorescencją monitorowaną przez ostatnie 20 s przed zainicjowaniem reakcji poprzez wstrzyknięcie substratu dsDNA.
    2. Aby przekształcić zmianę fluorescencji w zmianę ilości substratu i wykluczyć efekty fotowybielania i spontanicznego parowania, znormalizuj Fznormalizowane próbki za pomocą równania opisanego poniżej, gdzie FP jest zmianą ilości substratu w tym teście.
      FP = 1 - (([F znormalizowane bez białka] - [Fznormalizowane próbki]) / [1-Emaksimum])
    3. Aby zbadać kinetykę reakcji wymiany nici DNA, należy przeprowadzić nieliniową analizę regresji długokwadratowej reakcji parowania za pomocą programu analitycznego23 (patrz Tabela materiałów).
      1. Przygotuj plik w .txt formacie zawierający dane przebiegu czasowego FP.
      2. Uruchom program i wklej skrypt z pliku kodu uzupełniającego do okna programu:
      3. Rozpocznij nieliniową analizę regresji ostatniego kwadratu. Wyniki tej analizy zostaną wyświetlone w tym samym oknie.

Wyniki

Aby skutecznie przeanalizować dane eksperymentalne z testów parowania i wypierania, konieczne jest określenie, w jaki sposób zmiana emisji fluorescencji FAM odpowiada konwersji substratów DNA w produkty. W tym celu należy wyznaczyć odpowiedni zakres intensywności fluorescencji. W przypadku testu parowania emisję fluorescencji 16FA(-), odpowiadającą substratowi ssDNA, porównuje się z emisją 16FA(-) zdenaturowanego z 16AR(+)_40bp, co odpowiada końcowym produktom tej reakcji (Rycina 2A). Odpowiada to maksymalnej wydajności FRET, a tym samym maksymalnemu spadkowi intensywności fluorescencji, jakiego należałoby się spodziewać, gdyby cały substrat ssDNA został przekształcony w produkt dsDNA. W przypadku testu wypierania emisję 16FA(-)_40bp zdenaturowanego z 16AR(+)_40bp, odpowiadającą substratowi, porównuje się z emisją 16FA(-)_40bp, która odpowiada produktowi końcowemu (Rycina 2B). W tym przypadku maksymalny wzrost intensywności fluorescencji FAM odzwierciedla scenariusz, w którym cały substrat dsDNA zostaje przekształcony w produkt ssDNA. Rad51 z S. pombe nie wpływał na emisję fluorescencji FAM ani na wydajność gaszenia FAM przez ROX w obu testach (Rycina 2). Maksymalną wydajność FRET należy mierzyć ponownie przy każdym nowym przygotowaniu oligonukleotydów, ponieważ zależy ona od wydajności znakowania oligonukleotydów.

Reprezentatywne dane dotyczące reakcji parowania i wypierania nici DNA przedstawiono na Rysunku 3. Efekty reakcji spontanicznych pomiędzy substratowymi DNA a fotoblaknięciem były niewielkie w obu testach, co potwierdzają pomijalne zmiany w emisji FAM bez udziału Rad51 w porównaniu do znacznych zmian zaobserwowanych z udziałem Rad51 (Rysunek 3A oraz Rysunek 3B). Na podstawie danych przedstawionych na Rysunku 3A lub Rysunku 3B, zmianę fluorescencji przeliczono odpowiednio na zmianę ilości substratu (FP) lub produktu końcowego (FD), stosując równania opisane w krokach 3.2.2 lub 3.3.2 (Rysunek 3C oraz Rysunek 3D).

Reakcję parowania zasymulowano przy użyciu sekwencyjnego modelu reakcji trójetapowej, składającego się z tworzenia pierwszego trójnićiciowego produktu pośredniego (C1), przejścia pierwszego produktu pośredniego w drugi produkt pośredni (z C1 do C2) oraz uwalniania ssDNA z drugiego produktu pośredniego w celu utworzenia dwóch produktów (D + E) (Rysunek 3E). Aby sprawdzić, czy symulacja z wykorzystaniem sekwencyjnego modelu reakcji trójetapowej jest zgodna z danymi eksperymentalnymi, obliczono rezydua między danymi eksperymentalnymi z testu parowania nici DNA a krzywą teoretyczną uzyskaną z symulacji (Rysunek 3F). Dodatkowo obliczono rezydua między reakcją parowania a krzywą teoretyczną wygenerowaną przy użyciu sekwencyjnego modelu reakcji dwuetapowej (Rysunek 3G). Rezydua dla reakcji parowania i modelu dwuetapowego wykazują systematyczne odchylenie w początkowej fazie, natomiast rezydua dla reakcji parowania i modelu trójetapowego nie wykazują takiego odchylenia. Wskazuje to, że model trójetapowy lepiej nadaje się do symulowania reakcji parowania niż model dwuetapowy.

Aby sprawdzić, czy model trzystopniowy jest zgodny z reakcją wypierania, która wykrywa późny etap wymiany nici DNA, wygenerowano teoretyczną krzywą reakcji wypierania, wykorzystując parametry kinetyczne uzyskane z symulacji reakcji parowania przedstawionej na Ryc. 3C, a następnie porównano ją z danymi eksperymentalnymi reakcji wypierania pokazanymi na Ryc. 3D (Ryc. 3H). Krzywa teoretyczna była zgodna z danymi eksperymentalnymi z testu wypierania. Na podstawie tych wyników wyciągnięto wniosek, że symulacja z wykorzystaniem modelu trzystopniowego pozwala na racjonalną ocenę reakcji wymiany nici DNA pośredniczonej przez białko Rad51.

Reprezentatywne dane z reakcji parowania nici DNA z udziałem Rad51 oraz kompleksu Swi5-Sfr1, białka pomocniczego Rad51, przedstawiono w Rysunek 4AKompleks Swi5-Sfr1 silnie stymulował aktywność parowania Rad51. Podobnie jak w przypadku braku Swi5-Sfr1, w obecności Swi5-Sfr1 reakcja parowania lepiej odpowiadała modelowi trzystopniowemu niż modelowi dwustopniowemu (Rysunek 4B). Poprzez symulację reakcji przy użyciu modelu trzyetapowego obliczono stałe równowagi reakcji dla każdego etapu reakcji z kompleksem Swi5-Sfr1 lub bez niego. Stałe równowagi reakcji wykazały, że kompleks Swi5-Sfr1 nie stymuluje pierwszego etapu reakcji (Rysunek 4C, panel a), w którym powstaje trzyniciowy kompleks pośredni, ale który silnie stymuluje przejście C1-C2 (Rysunek 4C, panel b) oraz uwalnianie ssDNA z kompleksu pośredniego C2 (Rycina 4C, panel c).

Schemat replikacji DNA pokazujący wiązanie starterów; zestawienie 16FA(-), 16A(-) ze starterami 16AR(+).
Rysunek 1: Projekt eksperymentalny analiz parowania i wypierania nici DNA. Schematy analiz parowania (A) i wypierania (B) nici DNA. Żółte kółka reprezentują monomery Rad51. Zielone kółka z literą „F” i czerwone kółka z literą „R” reprezentują odpowiednio fluoresceinę (FAM) i karboksy-X-rodaminę (ROX). Czarne nici DNA są identyczne pod względem sekwencji i komplementarne do niebieskich nici DNA. Cienkie czarne linie z grotami strzałek wskazują nazwę każdego oligonukleotydu, zgodnie z Tabelą 1. Rysunek został zaadaptowany i zmodyfikowany na podstawie pracy Ito et al.19. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Widma emisji fluorescencji; wykres hybrydyzacji DNA; względna intensywność w funkcji długości fali.
Rysunek 2: Pomiary maksymalnej wydajności FRET w testach parowania i wypierania. (A) Porównanie widm fluorescencji między substratem ssDNA, 16FA(-), a produktem dsDNA, 16FA(-) sparowanym z 16AR(+)_40bp, w teście parowania. Linie niebieska i czerwona reprezentują widma fluorescencji substratu odpowiednio bez i z dodatkiem Rad51. Linie zielona i fioletowa przedstawiają widma fluorescencji produktu końcowego odpowiednio bez i z dodatkiem Rad51. (B) Porównanie widm fluorescencji między substratem dsDNA, 16FA(-)_40bp sparowanym z 16AR(+)_40bp, a produktem ssDNA, 16FA(-)_40bp, w teście wypierania. Linie niebieska i czerwona reprezentują widma fluorescencji produktu końcowego odpowiednio bez i z dodatkiem Rad51. Linie zielona i fioletowa przedstawiają widma fluorescencji substratu odpowiednio bez i z dodatkiem Rad51. Rysunek ten został zaadaptowany i zmodyfikowany na podstawie pracy Ito et al.19. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Kinetyka oddziaływania DNA-Rad51; wykresy, modele i analiza residuów w badaniu spektroskopowym.
Rysunek 3: Reakcje parowania i wypierania nici DNA pośredniczone przez Rad51. (A) Przebieg czasowy znormalizowanej fluorescencji reakcji parowania z Rad51 lub bez niego. (B) Przebieg czasowy znormalizowanej fluorescencji reakcji wypierania z Rad51 lub bez niego. (C) Przebieg czasowy zmiany ilości substratu w reakcji parowania z Rad51. (D) Przebieg czasowy zmiany ilości substratu w reakcji wypierania z Rad51. (E) Schemat sekwencyjnego trzystopniowego modelu reakcji. A i B odpowiadają filamentowi presynaptycznemu i donorowemu dsDNA. C1 odpowiada pierwszemu (niedojrzałemu) tronicowemu intermediatowi. C2 odpowiada drugiemu (dojrzałemu) tronicowemu intermediatowi. D i E odpowiadają heterodupleksowi i ssDNA uwolnionemu z C2. (F i G) Residuwa pomiędzy danymi eksperymentalnymi z testu parowania nici DNA a krzywą teoretyczną uzyskaną w drodze symulacji z użyciem modelu trzystopniowego (F) lub dwustopniowego (G). (H) Czerwone kropki wskazują dane eksperymentalne z reakcji wypierania z Rad51 przedstawionej na panelu D. Niebieska linia wskazuje krzywą teoretyczną produktów końcowych. Krzywa teoretyczna została wygenerowana za pomocą symulacji z wykorzystaniem stałych szybkości reakcji uzyskanych z testu parowania przedstawionego na panelu C. Rysunek zaadaptowany i zmodyfikowany z Ito et al.19. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Kinetyka wiązania białek; Rad51 vs. Rad51+SSS1; wykresy porównawcze; modele dwuetapowe vs. trzyetapowe.
Rysunek 4: Swi5-Sfr1 stymuluje drugi i trzeci etap reakcji wymiany nici DNA. (A) Przebieg czasowy zmiany ilości substratu w reakcji parowania z dodatkiem lub bez dodatku Swi5-Sfr1 (S5S1). (B) Reszty między danymi eksperymentalnymi z testu parowania nici DNA z Swi5-Sfr1 a krzywą teoretyczną uzyskaną w drodze symulacji z wykorzystaniem modelu dwuetapowego (linia niebieska) lub trzyetapowego (linia czerwona). (C) Reakcja parowania przedstawiona na Rysunku 4A została zasymulowana za pomocą modelu trzyetapowego z wykorzystaniem programu analitycznego23 (patrz Tabela Materiałów). Stałe równowagi każdego etapu reakcji, K1 (a), K2 (b) i K3 (c), zostały wyznaczone z symulacji. Rysunek został zaadaptowany i zmodyfikowany z pracy Ito et al.19. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Oligonukleotydy do testu parowania nici DNA
16FA(-)5’-[FAM]-AAATGAACATAAAGTAAATAAGTATAAGGATAATACA
AAATAAGTAAATGAATAAACATAGAAAATAAAGTAAAGGATAT AAA -3’
16A(-)_40bp5’-AAATGAACATAAAGTAAATAAGTATAAGGATAATACAAAA-3’
16AR(+)_40bp5’-TTTTGTATTATCCTTATACTTATTTACTTTATGTTCATTT-[ROX]-3’
Oligonukleotydy do testu wypierania nici DNA
16A(-)5’-AAATGAACATAAAGTAAATAAGTATAAGGATAATACAAAATA
AGTAAATGAATAAACATAGAAAATAAAGTAAAGGATAT AAA -3’
16FA(-)_40bp5’-[FAM]-AAATGAACATAAAGTAAATAAGTATAAGGATAATACAAAA-3’
16AR(+)_40bp5’-TTTTGTATTATCCTTATACTTATTTACTTTATGTTCATTT-[ROX]-3’

Tabela 1: Lista oligonukleotydów użytych w analizach parowania i wypierania nici DNA. W odpowiednich przypadkach pozycje fluoroforów (fluoresceina amidydowa, FAM; karboksy-x-rodamina, ROX) zostały wskazane w nawiasach kwadratowych.

Dyskusja

Tutaj opisaliśmy szczegółowy protokół, który wykorzystuje FRET do pomiaru wymiany nici DNA sterowanej przez Rad51 w czasie rzeczywistym. Co ważne, pomiary te pozwalają na wyznaczenie kinetyki reakcji. Chociaż powyższe opisy są wystarczające do odtworzenia opublikowanych przez nas wyników, istnieje kilka krytycznych punktów, które zostaną opisane w tej sekcji. Ponadto omówione zostaną zalety i wady metodologii opartych na FRET do badania wymiany nici DNA, a także zastosowanie takich technik do badania innych aspektów metabolizmu DNA.

Podobnie jak w przypadku wszystkich rekonstytucji biochemicznych, niezbędne jest zapewnienie, że wszystkie substraty reakcyjne mają wysoką czystość. Niedbalstwem jest zakładanie braku działań zanieczyszczających wyłącznie na podstawie pozornej czystości preparatu białkowego ocenianej na podstawie barwienia Coomassie. W szczególności obecność śladowych ilości nukleaz lub helikaz może drastycznie wpłynąć na wyniki testów parowania i przemieszczenia. Dlatego gorąco zachęcamy do testowania pod kątem takich czynności za każdym razem, gdy oczyszczana jest nowa partia białka. Ponadto rozsądnie jest sprawdzić czystość zsyntetyzowanych substratów DNA za pomocą natywnej elektroforezy w żelu poliakrylamidowym. Pomimo tego, że wiele firm gwarantuje czystość oligonukleotydów, często odkrywamy dzięki naszym własnym testom, że czystość zsyntetyzowanego DNA może się różnić w zależności od partii.

Podczas przeprowadzania eksperymentów z kuwetami kwarcowymi należy wziąć pod uwagę następujące dwa punkty. Po pierwsze, niektóre białka mają skłonność do niespecyficznego wiązania kuwet kwarcowych. Aby temu przeciwdziałać, w reakcyjnych znajdują się BSA i monolaurynian polioksyetylenosorbitanu. Po drugie, temperatura ma drastyczny wpływ na szybkość reakcji i intensywność fluorescencji. Aby zminimalizować ten efekt, kuweta kwarcowa powinna być wstępnie inkubowana w temperaturze 37 °C przed użyciem.

Chociaż konwencjonalne testy biochemiczne były niezwykle przydatne w badaniu wymiany nici DNA, mają one kilka wad. W typowym eksperymencie z przebiegiem czasu reakcja jest inkubowana w określonej temperaturze, a podwielokrotności są usuwane w pożądanych punktach czasowych i odbiałczone przez traktowanie detergentem i proteazą w celu zakończenia reakcji. Po zakończeniu przebiegu czasowego próbki są następnie poddawane elektroforezie w celu oddzielenia substratów DNA od produktów. Główną zaletą opisywanej tutaj metody jest to, że pozwala ona na obserwację reakcji w czasie rzeczywistym bez żadnych zakłóceń. Każdy punkt czasowy podczas reakcji może być kontrolowany bez zakłóceń samej reakcji i nie ma potrzeby deproteinizacji próbek ani poddawania ich potencjalnie zakłócającym siłom elektroforezy. Jest to szczególnie istotne w przypadku monitorowania labilnych struktur DNA.

Pomimo tych zalet w porównaniu z konwencjonalnymi testami, opisana tutaj metoda ma pewne wady. Chociaż zastosowanie oligonukleotydowych substratów DNA do wymiany nici upraszcza interpretację wyników, należy pamiętać, że takie substraty nie przypominają substratów DNA zaangażowanych w HR w komórce. Niektóre konwencjonalne testy wykorzystują substraty DNA wielkości plazmidu, które z większym prawdopodobieństwem odzwierciedlają liczbę par zasad, które są wymieniane in vivo. Co więcej, zastosowanie topologicznie ograniczonych kolistych substratów dsDNA w podzbiorze konwencjonalnych testów może przynajmniej częściowo odtworzyć napięcia w fizjologicznym DNA.

Zastosowanie opisanej tutaj metody zaczęło odkrywać molekularne mechanizmy wymiany nici DNA sterowanej przez Rad51. Niemniej jednak pozostaje wiele interesujących pytań, na które nie ma odpowiedzi. Istnieją wyraźne dowody na to, że HR podczas mejozy wymaga zarówno Rad51, jak i Dmc1, specyficznej dla mejozy rekombinazy typu RecA u eukariontów24. Jednak brak większych różnic biochemicznych między tymi dwoma rekombinatami od lat wprawia w zakłopotanie naukowców zajmujących się tą dziedziną. Co więcej, rola wielu odrębnych grup czynników pomocniczych rekombinacji była głównym tematem badań w dziedzinie HR. Oprócz wyjaśnienia różnic biochemicznych między Rad51 i Dmc1, naszym celem jest zbadanie i porównanie wpływu różnych czynników pomocniczych rekombinacji na kinetykę wymiany nici DNA w najbliższej przyszłości. Na koniec należy podkreślić, że opisana tutaj metodologia oparta na FRET nie ogranicza się do badania wymiany nici DNA. Przy stosunkowo niewielkich modyfikacjach przewidujemy wiele rodzajów zastosowań tej techniki w badaniu funkcjonalnie zróżnicowanych białek zaangażowanych w metabolizm DNA 25,26,27,28. Mamy nadzieję, że opisane tu osiągnięcia dostarczą dalszych możliwości badaczom należącym do wielu różnych dyscyplin.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca została sfinansowana przez Grants-in-Aid for Scientific Research (A) (18H03985) i Innovative Areas (15H05974) do HI, dla Młodych Naukowców (B) (17K15061) do BA, oraz dla Scientific Research (B) (18H02371) dla HT od Japońskiego Towarzystwa Promocji Nauki (JSPS).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kuweta kwarcowa 0,2 x 1,0 cmHellma Analytics105-250-15-40
1,0 x 1,0 cm kuweta kwarcowaHellma Analytics101-10-40
trifosforan adenozyny (ATP)SigmaA2383
DynaFitBioKin, Ldt.DynaFit to program do analizy kinetyki reakcji biochemicznych.
Oligonukleotydy znakowane fluorescencyjnie i nieznakowaneEurofins GenomicsSekwencje oligonukleotydów są wymienione w tabeli. 1.
Mieszadło magnetyczneAisis (Japonia)CM1609
Maszyna do PCRTAKARA (Japonia)TP600TAKARA PCR Thermal Cycler
Spektrofluorometrkości JASCOFP8300Zawiera regulator temperatury peltiera i system mieszadła magnetycznego
StrzykawkaHAMILTON1702RN 25ul SYR (22s/2"/2)

Bibliografia

  1. Camerini-Otero, R. D., Hsieh, P. Homologous recombination proteins in prokaryotes and eukaryotes. Annual Review of Genetics. 29 (1), 509-552 (1995).
  2. Cromie, G. A., Connelly, J. C., Leach, D. R. Recombination at double-strand breaks and DNA ends: conserved mechanisms from phage to humans. Molecular Cell. 8 (6), 1163-1174 (2001).
  3. Pierce, A. J., et al. Double-strand breaks and tumorigenesis. Trends in cell biology. 11 (11), S52-S59 (2001).
  4. Haber, J. E. Genome Stability. , Garland Science. (2013).
  5. Kowalczykowski, S. C. An Overview of the Molecular Mechanisms of Recombinational DNA Repair. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 7 (11), a016410(2015).
  6. Bianco, P. R., Tracy, R. B., Kowalczykowski, S. C. DNA strand exchange proteins: a biochemical and physical comparison. Frontiers in bioscience: a journal and virtual library. 3, D570-D603 (1998).
  7. Renkawitz, J., Lademann, C. A., Jentsch, S. Mechanisms and principles of homology search during recombination. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (6), 369-383 (2014).
  8. Greene, E. C. DNA Sequence Alignment during Homologous Recombination. The Journal of biological chemistry. 291 (22), 11572-11580 (2016).
  9. Sung, P., Krejci, L., Van Komen, S., Sehorn, M. G. Rad51 recombinase and recombination mediators. Journal of Biological Chemistry. 278 (44), 42729-42732 (2003).
  10. Prakash, R., Zhang, Y., Feng, W., Jasin, M. Homologous recombination and human health: the roles of BRCA1, BRCA2, and associated proteins. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 7 (4), a016600(2015).
  11. Sung, P. Function of yeast Rad52 protein as a mediator between replication protein A and the Rad51 recombinase. Journal of Biological Chemistry. 272 (45), 28194-28197 (1997).
  12. Sung, P. Yeast Rad55 and Rad57 proteins form a heterodimer that functions with replication protein A to promote DNA strand exchange by Rad51 recombinase. Genes & Development. 11 (9), 1111-1121 (1997).
  13. Kurokawa, Y., Murayama, Y., Haruta-Takahashi, N., Urabe, I., Iwasaki, H. Reconstitution of DNA strand exchange mediated by Rhp51 recombinase and two mediators. PLoS biology. 6 (4), e88(2008).
  14. Jensen, R. B., Carreira, A., Kowalczykowski, S. C. Purified human BRCA2 stimulates RAD51-mediated recombination. Nature. 467 (7316), 678-683 (2010).
  15. Liu, J., et al. Rad51 paralogues Rad55-Rad57 balance the antirecombinase Srs2 in Rad51 filament formation. Nature. 479 (7372), 245-248 (2011).
  16. Lu, C. -H., et al. Swi5-Sfr1 stimulates Rad51 recombinase filament assembly by modulating Rad51 dissociation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2018).
  17. Bazemore, L. R., Takahashi, M., Radding, C. M. Kinetic analysis of pairing and strand exchange catalyzed by RecA. Detection by fluorescence energy transfer. Journal of Biological Chemistry. 272 (23), 14672-14682 (1997).
  18. Gupta, R. C., Bazemore, L. R., Golub, E. I., Radding, C. M. Activities of human recombination protein Rad51. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (2), 463-468 (1997).
  19. Ito, K., Murayama, Y., Takahashi, M., Iwasaki, H. Two three-strand intermediates are processed during Rad51-driven DNA strand exchange. Nature Structural & Molecular Biology. 25 (1), 29-36 (2018).
  20. Akamatsu, Y., Dziadkowiec, D., Ikeguchi, M., Shinagawa, H., Iwasaki, H. Two different Swi5-containing protein complexes are involved in mating-type switching and recombination repair in fission yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (26), 15770-15775 (2003).
  21. Haruta, N., et al. The Swi5-Sfr1 complex stimulates Rhp51/Rad51- and Dmc1-mediated DNA strand exchange in vitro. Nature Structural & Molecular Biology. 13 (9), 823-830 (2006).
  22. Argunhan, B., Murayama, Y., Iwasaki, H. The differentiated and conserved roles of Swi5-Sfr1 in homologous recombination. FEBS Letters. 591 (14), 2035-2047 (2017).
  23. Kuzmic, P. Program DYNAFIT for the analysis of enzyme kinetic data: application to HIV proteinase. Analytical biochemistry. 237 (2), 260-273 (1996).
  24. Brown, M. S., Bishop, D. K. DNA strand exchange and RecA homologs in meiosis. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 7 (1), a016659(2014).
  25. Rudert, W. A., et al. Double-labeled fluorescent probes for 5' nuclease assays: purification and performance evaluation. BioTechniques. 22 (6), 1140-1145 (1997).
  26. Xiao, J., Singleton, S. F. Elucidating a key intermediate in homologous DNA strand exchange: structural characterization of the RecA-triple-stranded DNA complex using fluorescence resonance energy transfer. Journal of Molecular Biology. 320 (3), 529-558 (2002).
  27. Grimme, J. M., et al. Human Rad52 binds and wraps single-stranded DNA and mediates annealing via two hRad52-ssDNA complexes. Nucleic Acids Research. 38 (9), 2917-2930 (2010).
  28. Algasaier, S. I., et al. DNA and Protein Requirements for Substrate Conformational Changes Necessary for Human Flap Endonuclease-1-catalyzed Reaction. The Journal of biological chemistry. 291 (15), 8258-8268 (2016).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Bia ko Rad51test oparty na FRETrekombinacja homologicznakompleks Swi5 Sfr1model tr jstopniowyspektroskopia fluorescencyjnaanaliza spektrofluorometrycznaanaliza kinetyczna
Obserwacja w czasie rzeczywistym reakcji wymiany nici DNA, w której pośredniczy Rad51
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.