Badania probiotyczne na nowonarodzonych myszach z użyciem zgłębnika

Podsumowanie

To badanie szczegółowo opisuje proces podawania precyzyjnych ilości probiotyków noworodkom myszy. Konfiguracja eksperymentalna została zoptymalizowana tak, aby obejmowała między innymi dawkowanie probiotyków, metody podawania i oznaczanie ilościowe bakterii w jelitach.

Streszczenie

Modele dorosłych myszy były powszechnie używane do zrozumienia mechanizmu progresji choroby u ludzi. Możliwość zastosowania badań przeprowadzonych na modelach dorosłych myszy do chorób noworodków jest ograniczona. Aby lepiej zrozumieć postęp choroby, reakcje gospodarza i długoterminowy wpływ interwencji u noworodków, prawdopodobnie lepszym rozwiązaniem jest model noworodka mysiego. Rzadkie wykorzystanie modeli nowonarodzonych myszy można częściowo przypisać trudnościom technicznym związanym z pracą z tymi małymi zwierzętami. Opracowano model noworodka myszy w celu określenia skutków podawania probiotyków we wczesnym okresie życia oraz specyficznej oceny zdolności do ustanowienia kolonizacji w przewodzie pokarmowym nowonarodzonej myszy. W szczególności, aby ocenić kolonizację probiotyczną u nowonarodzonych myszy, Lactobacillus plantarum (LP) dostarczono bezpośrednio do przewodu pokarmowego nowonarodzonych myszy. W tym celu LP podawano myszom poprzez karmienie przez zgłębnik wewnątrzprzełykowy (IE). Opracowano wysoce powtarzalną metodę w celu standaryzacji procesu zgłębnika IE, która umożliwia dokładne podawanie dawek probiotyków przy jednoczesnej minimalizacji urazu, co jest szczególnie ważne, biorąc pod uwagę kruchość nowonarodzonych myszy. Do ograniczeń tego procesu należy możliwość podrażnienia lub uszkodzenia przełyku oraz zachłyśnięcia w przypadku nieprawidłowego zgłębnika. Takie podejście stanowi ulepszenie w stosunku do obecnych praktyk, ponieważ wgryzanie się IE do dystalnego przełyku zmniejsza szanse na aspirację. Po zgłębniku prześledzono profil kolonizacji probiotyku za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (qPCR) wyekstrahowanego DNA jelitowego ze starterami specyficznymi dla LP. Do oceny potencjału rozprzestrzeniania się kolonizacji wykorzystano różne ustawienia ściółki i techniki zarządzania klatkami. Protokół szczegółowo opisuje zawiłości zgłębnika myszy noworodków IE i późniejszą kwantyfikację kolonizacji za pomocą LP.

Wprowadzenie

U niemowląt wczesna ekspozycja na probiotyki wiąże się z efektami immunomodulującymi, co prowadzi do zmniejszenia częstości występowania chorób, takich jak martwicze zapalenie jelit, atopowe zapalenie skóry i sepsa^1,2,3,4,5. Jednak mechanizm stojący za tą odpowiedzią immunomodulacyjną jest trudny do zbadania, biorąc pod uwagę ograniczenie do pobierania próbek w badaniach klinicznych u noworodków (tj. sekwencyjnych pobrań krwi i biopsji). Modele noworodków myszy mogą pomóc w badaniu mechanizmu działania związanego z regulacją immunologiczną noworodków związaną ze stosowaniem probiotyków i zmianami w mikrobiocie jelitowej. Niestety, większość mysich modeli probiotyków w dużej mierze skupiała się na dorosłych myszach; Jednak wpływ probiotyków będzie prawdopodobnie najwyższy we wczesnym okresie życia, co sugeruje, że przydatne będą modele specyficzne dla tej grupy wiekowej3^,6. Ponadto modele noworodków myszy lepiej nadają się do badania chorób i interwencji przeznaczonych do stosowania we wczesnym okresie życia niemowląt, ponieważ oczekuje się, że będą one bardziej naśladować rozwijający się układ odpornościowy i mikrobiologiczny^7,8,9,10. Celem było zbadanie zakresu i wzorców kolonizacji probiotyków u nowonarodzonych myszy, ze szczególnym uwzględnieniem mechanistycznej interakcji między gospodarzem a jego mikrobiomem. W literaturze nie znaleziono odpowiednich opisów modeli noworodkowych, w związku z czym zaspokoiła się potrzeba opracowania solidnej i ustandaryzowanej metody.

Ustalone metody doustnego podawania różnych związków nowonarodzonym myszom obejmują matczyne przenoszenie pożądanych związków przez mleko poprzez uzdatnianie źródła wody dla ciężarnych matek¹¹ lub używanie igieł do karmienia, aby ułatwić podawanie pożądanych związków do jamy ustnej gardła¹². Metody te są przydatne w eksperymentach, które nie mają precyzyjnych wymagań dotyczących dawkowania i gdy leczenie jest łatwo spożywane przez mysz biorcę. Probiotyki są często podawane w połączeniu z prebiotykami, takimi jak galaktooligosacharydy i fruktooligosacharydy (FOS), które służą jako źródło pożywienia dla bakterii probiotycznych; Te dodatki sprawiają, że roztwór jest lepki i trudny do podania za pomocą wyżej wymienionych metodologii. Konieczne było opracowanie metody podawania precyzyjnych ilości probiotyków i prebiotyków nowonarodzonym myszom już od pierwszego dnia życia (DOL). W procesie opracowywania techniki gaveage przetestowano możliwość rozprzestrzeniania się kolonizacji (jak zaobserwowano w innych badaniach probiotycznych między grupą leczoną a grupą kontrolną^13,14,15,16) oraz względna liczebność skolonizowanego Lactobacillus plantarum (LP) w jelitach szczeniąt z różnymi harmonogramami zgłębnika. Preparat probiotyczny użyty w eksperymentach składał się z 10⁹ jednostek tworzących kolonie (CFU) na zgłębnik LP (szczep ATCC-202195), zmieszanych z FOS (prebiotykiem) i maltodekstryną (substancją pomocniczą), jak opisano w niedawnym badaniu na ludziach³. Podawanie probiotyków zostało zrealizowane przy użyciu zgłębnika IE, a proces ten jest szczegółowo opisany w poniższym protokole. Profil kolonizacyjny probiotyku oceniano za pomocą amplifikacji w czasie rzeczywistym DNA wyekstrahowanego z całych jelit przy użyciu starterów specyficznych dla LP.

Protokół

Wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi ustalonymi przez personel pomocniczy w Ośrodku Opieki nad Zwierzętami na Uniwersytecie Kolumbii Brytyjskiej i wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Komitet Opieki nad Zwierzętami UBC.

1.Kwantyfikacja podawanych probiotyków

UWAGA: Ten krok jest zalecany do określenia dokładnej ilości probiotycznego CFU, która może być podana w pojedynczej dawce. Ilość probiotyków i nośnika (FOS i maltodekstryna) określa warunki nasycenia roztworu. Z doświadczenia wynika, że myszom na DOL 2 można podać nie więcej niż 30 μl (~ 20 ml na kg) płynu, ponieważ każda większa objętość zwiększa ryzyko aspiracji.

1. Przygotować sześć probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml do seryjnych rozcieńczeń, z których każda zawiera 180 μl sterylnego 5% roztworu soli fizjologicznej z dekstrozy.
2. Odważyć 0,2 g podwielokrotności mieszaniny probiotyk-prebiotyk i rozpuścić ją w 1 ml 5% roztworu dekstrozy soli fizjologicznej w sterylny sposób.
3. Wiruj przez 30 sekund i pipetę, aby rozbić grudki. Powtarzaj tak długo, aż nie zostaną zaobserwowane żadne widoczne grudki.
   UWAGA: Maltodekstryna sprawia, że roztwór jest lepki i przyczynia się do nasycenia roztworu.
4. Przeprowadzić rozcieńczanie szeregowe przy użyciu probówek przygotowanych w kroku 1.1. Wirować do mieszania.
5. Umieścić 40 μl każdego rozcieńczenia na oznakowanym kwadrancie płytki agarowej MRS. Każde rozcieńczenie należy przechowywać na płytkach w dwóch egzemplarzach.
6. Inkubować w warunkach beztlenowych (lub mikroaerofilnych) w temperaturze 37 °C przez 48 godzin w słoiku próżniowym przy użyciu pakietu gazowego.
7. Policz każdą płytkę w zakresie 20-70 kolonii na ćwiartkę. Średnia liczba płytek przy tym samym rozcieńczeniu i obliczenie z powrotem do żądanych jednostek.

2. Przygotowanie probiotyków i prebiotyków do gaźnika

UWAGA: Właściwe rozpuszczenie probiotyku i prebiotyku jest konieczne, aby zapewnić płynne wstrzykiwanie płynu przez igłę do karmienia podczas gaźnika.

1. Połączyć wymaganą ilość liofilizowanego organizmu probiotycznego z pożądanymi ilościami prebiotyków i nośnika w sterylnej probówce do mikrowirówki.
2. Dodać odpowiednią ilość rozpuszczalnika (5% soli fizjologicznej dekstrozy), aby rozpuścić mieszaninę probiotyku i prebiotyku.
   UWAGA: Zdolność rozpuszczania jest ograniczona przez użyty prebiotyk i nośnik. Z doświadczenia wynika, że kombinacja synbiotyczna (z FOS i maltodekstryną) osiągnęła nasycenie przy około 0,3 g/ml podczas rozpuszczania w probówce mikrowirówkowej o pojemności 2 ml przy użyciu 1 ml rozpuszczalnika.
3. Mieszaj, aby mieszać, aż wszystkie ciała stałe się rozpuszczą. Za pomocą pipety rozbijać kuleczki cząstek stałych w rozpuszczalniku, pipetując w górę i w dół.
4. Roztwór inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 20 min.
   UWAGA: Ten krok można pominąć, jeśli roztwór probiotyk-prebiotyk jest tworzony z żywej kultury.
5. Umieść pięć serii 10-krotnego rozcieńczenia na płytkach agarowych MRS przed zgłębnikowaniem, aby dokładnie określić ilościowo probiotyk podany młodemu. Ten krok można pominąć, jeśli dokładna liczba CFU nie jest potrzebna.

3. Przygotowanie komory bezpieczeństwa biologicznego

1. Podczas pracy z probiotykami należy używać komory bezpieczeństwa biologicznego, aby zachować technikę aseptyczną. Umieść klatkę z matkami i młodymi na kocu grzewczym (ustawionym na około 38 °C) na jednej połowie koca. Umieść czystą, pustą klatkę dla zwierząt na drugiej połowie koca grzewczego.
2. Umieść zdezynfekowaną lub sterylną, chłonną podkładkę na kocu grzewczym, aby opiekować się myszą podczas gavingu.
3. Zbierz materiał gniazdowy dla młodych ze szczytu istniejącego, utworzonego przez matkę gniazda i stwórz nowy stożkowy kubek lęgowy za pomocą rąk w rękawiczkach, zdezynfekowany przy użyciu 70% etanolu i wysuszony. Umieść to nowe gniazdo w czystej, pustej klatce. Ułatwia to przenoszenie zapachu gniazda na dłonie w rękawiczkach, a tym samym minimalizuje wprowadzanie innych zapachów na szczenię podczas obchodzenia się z nimi do zabiegu, zmniejszając ryzyko kanibalizacji.
4. Przenieś szczenięta do stożkowej klatki do trzymania gniazda i wyjmij klatkę z zaporą z szafki. Zmniejsza to stres matki, uniemożliwiając jej słyszenie szczeniąt podczas zabiegu.
   UWAGA: Jeśli probiotyk jest znanym kolonizatorem mysich jelit, warunki leczenia muszą być oddzielone klatkami lub nawet różnymi komorami bezpieczeństwa biologicznego, aby uniknąć możliwości kolonizacji krzyżowej.

4. Zgłębnik wewnątrzprzełykowy noworodka myszy

1. Otwórz opakowanie strzykawki, aby mieć do niej łatwy dostęp. Otworzyć opakowanie igły w sterylny sposób i przymocować ją do główki strzykawki. Przed zabiegiem umyj igłę 70% etanolem i przeprowadź w autoklawie. Używaj różnych zestawów igieł do leczenia i grupy kontrolnej, aby uniknąć zanieczyszczenia.
2. Wciągnij do strzykawki nieco więcej niż pożądana ilość roztworu barwnika probiotycznego. Trzymać strzykawkę skierowaną do góry. Następnie pociągnij dalej w dół i przesuń palcem, aby usunąć bąbelki i naciśnij tłok, aby usunąć bąbelki i dodatkową objętość płynu, aż do osiągnięcia żądanej objętości. Gwarantuje to, że w igle nie ma przestrzeni powietrznej. W przypadku myszy DOL 2 objętość zgłębnika nie może przekraczać 30 μl.
3. Umieść szczeniaka na sterylnej podkładce chłonnej na wierzchu poduszki grzewczej. Użyj igły do karmienia (rozmiar 24, długość igły 1", średnica kulki 1,25 mm) na zewnątrz, aby zmierzyć długość przełyku, umieszczając kulkę igły tuż poniżej wyrostka mieczykowatego (dolny koniec mostka). Zaznacz igłę na poziomie pyska, aby zanotować granicę wkłucia igły (Rysunek 1). Obserwuj szczeniaka pod kątem oznak zdrowotnych, do których należą regularny oddech i różowe zabarwienie skóry.
4. Zanurz końcówkę igły w rozpuszczalniku do zanurzania (5% sól fizjologiczna z dekstrozy lub - pożywka używana do rozpuszczenia probiotyku i prebiotyku) w celu nasmarowania zewnętrznych powierzchni igły do karmienia. Ułatwia to płynne wprowadzenie igły do przełyku myszy.
5. Podnieś szczeniaka za kark lub delikatnie trzymając głowę i ciało między kciukiem a palcem wskazującym. Upewnij się, że głowa, szyja i tułów są trzymane w pozycji prostej. Nie trzymaj szczeniaka za kark dłużej niż 60 sekund, ponieważ istnieje ryzyko niedrożności tchawicy prowadzącej do uduszenia. Upewnij się, że szczeniak może oddychać. Oznaki zbyt mocnego chrupania mogą obejmować niezdolność do oddychania, znaczne sapanie i wysunięty język poza usta. Monitoruj kolor i oddech szczeniaka podczas całego zabiegu.
6. Włóż bańkę igły do środka pyska szczeniaka pod kątem 45° do płaszczyzny tułowia, aż dotrze do tylnej części gardła.
7. Delikatnie zmienić kąt nachylenia igły, obracając się na gruszce igły i odsuwając strzykawkę od osoby pobierającej igłębkę (w kierunku grzbietowej strony szczeniaka), aż stanie się równoległa do płaszczyzny kręgosłupa szczeniaka. Chrupanie szczeniaka pomaga utrzymać igłę na miejscu w tylnej części gardła, a także zapobiega wierceniu się myszy. Upewnij się, że kulka igły nie przesuwa się ani nie wywiera żadnego nacisku na tylną część gardła podczas zmiany kąta.
8. Jeśli mysz próbuje połknąć igłę, pozwól jej naturalnie zsunąć się w dół i zatrzymaj ruch, gdy oznaczenie na igle zrówna się z pyskiem. Strzykawka i igła są zwykle wystarczająco ciężkie, aby zsunąć się w dół pod wpływem grawitacji. Utrzymuj ciężar igły przez cały czas, aby igła łatwo zsuwała się w dół przełyku, bez nacisku w dół ze strony osoby wykonującej zgłębnik.
   1. Jeśli igła napotka opór w tylnej części gardła, lekko wycofaj igłębkę, aby usunąć kulkę igły i ponownie ustaw igłę w jamie ustnej pod odpowiednim kątem w kierunku lewej strony myszy (po prawej stronie opiekuna) powoli w małych odstępach co 1 mm. Igła powinna zacząć łatwo zsuwać się w dół przełyku.
   2. Jeśli igła zatrzyma się, zanim oznaczenie na igle dotrze do ust, nie należy wstrzykiwać roztworu.
   3. Nie należy trzymać igły włożonej dłużej niż 20 sekund. Jeśli tak się stanie, powoli cofnij igłę, trzymając strzykawkę równolegle do tułowia i pozwól szczeniakowi spoczywać na ręczniku papierowym przez 30 s do 1 minuty. Spróbuj ponownie wykonać wgłębnik po nasmarowaniu zewnętrznej powierzchni igły rozpuszczalnikiem.
      UWAGA: W zabiegu nie stosuje się znieczulenia, ponieważ reakcja myszy jest niezbędna do oceny powodzenia zgłębnika.
9. Gdy oznaczenie na igle do karmienia znajduje się powyżej pyska i jest wyrównane z końcem pyska, nie pozwól, aby igła poruszała się lub przesuwała dalej. Powoli wstrzyknąć żądaną objętość płynu. Jeśli płyn zostanie zasysany lub zaobserwuje się, że pęcherzyki przez nos należy natychmiast przerwać wstrzykiwanie i powoli wycofać igłę.
   1. Umieść szczeniaka pionowo na ręczniku papierowym na poduszce grzewczej, aby pomóc w jego regeneracji. Uważnie monitoruj pod kątem utrzymujących się problemów z oddychaniem lub zmiany koloru szczeniaka, która wskazuje na aspirację. Poddaj eutanazji szczenięta, które zostały natychmiast zachcalone.
10. Po zakończeniu podawania delikatnie wyjmij igłę do karmienia pod tym samym kątem, pod jakim została włożona. Połóż szczeniaka na ręczniku papierowym na rozgrzanej poduszce grzewczej. Odczekaj 10 sekund, aż szczeniak odzyska normalną aktywność i wzorzec oddychania. Na ciele szczeniaka powinien pojawić się zdrowy różowy odcień, a barwnik powinien być widoczny tylko w komorze żołądkowej. Przenieś go z powrotem do klatki z innymi szczeniakami.
    UWAGA: Niebieski barwnik spożywczy to doskonały sposób na przećwiczenie procedury opisanej powyżej. Jeśli zgłębnik się powiedzie, brzuch myszy będzie widoczny jako niebieski odcień. Jeśli niebieski barwnik zostanie znaleziony poza żołądkiem szczeniaka (szyja, klatka piersiowa lub okolica pachowa), zwierzę powinno zostać humanitarnie uśpione (zgodnie z zasadami opieki nad zwierzętami), ponieważ wskazuje to na pęknięcie przełyku lub aspirację.

5. Pobieranie próbek jelitowych do analizy kolonizacji

1. Podczas późniejszego monitorowania lub pobierania próbek mikrobiomu kałowego od szczeniąt.
   UWAGA: Szczenię często oddaje mocz i kał po zgłębnikowaniu i ten czas może być wykorzystany jako okazja do pobrania próbek kału do analizy mikrobiomu.
2. Aby zakończyć eksperymenty, należy pobrać jelita od dwunastnicy do odbytnicy po eutanazji szczeniąt. Przypnij szczeniaka do deski chirurgicznej i zdezynfekuj skórę 70% etanolem. Przeciąć skórę na cztery ćwiartki, nie uszkadzając warstwy otrzewnej, za pomocą narzędzi wysterylizowanych 70% etanolem i sterylizacji gorącymi kulkami w temperaturze 250 °C.
3. Użyj innego zestawu sterylnych narzędzi, aby przeciąć otrzewną na cztery ćwiartki i odsunąć ją od środka w taki sposób, aby narządy trzewne były odsłonięte.
4. Zlokalizuj żołądek i użyj zacisku, aby uszczypnąć poniżej zwieracza odźwiernika i na końcu odbytnicy. Przeprowadź wzdłuż jelita za pomocą narzędzia lub kleszczy, aby usprawnić jelito i uwolnić je od tkanki łącznej i tkanki krezkowej. Gdy cała długość jelita zostanie uwolniona z tkanki łącznej, przeciąć na zaciśniętych końcach.
5. Zaznacz folię aluminiową zgodnie z orientacją jelita, zawiń w bezpieczny sposób i zamroź w temperaturze -80 °C.
   UWAGA: Procedurę ekstrakcji DNA można przeprowadzić w tym momencie bez zamrażania. Zaobserwowano również, że niebieski barwnik przechodzi przez jelito w ciągu 24 godzin, a pobieranie próbek do analizy kolonizacyjnej jest najlepsze, gdy jelita są pobierane co najmniej 24 godziny po ostatnim zgłębniku. Sygnały mogą być wzmacniane przed tym punktem czasowym przez nieprzylegające bakterie przejściowo przechodzące przez mieszaninę zgłębnika.

6. Ekstrakcja DNA z jelit do analizy kolonizacji

UWAGA: Ekstrakcja DNA odbywa się za pomocą komercyjnego zestawu z optymalizacją modyfikacji protokołu ekstrakcji DNA z jelit. Upewnij się, że urządzenie grzewcze jest ustawione na żądaną temperaturę, a roztwory, które wymagają zmian lub wstępnego podgrzania, są odpowiednio przygotowane.

1. Przygotuj bufor do lizy enzymatycznej (ELB) w następujący sposób: Przygotuj roztwór z 20 mM Tris-Cl, 2 mM EDTA sodu i 1,2% Triton X-100. Dostosuj pH do 8,0. Bezpośrednio przed użyciem ELB należy dodać lizozym do końcowego stężenia 20 mg/ml.
2. Wstępnie zważ probówki z kulkami granatu na wadze analitycznej ze zdjętymi nasadkami.
   UWAGA: Odbywa się to po to, aby w przypadku przekroczenia wymaganej masy łatwiej było usunąć zawartość jelitową.
3. Pokrój jelita na małe segmenty za pomocą sterylnego jednorazowego skalpela i zgarnij żądane segmenty do wstępnie zważonych tubek z koralikami granatu.
   UWAGA: Upewnij się, że zmieniasz skalpele między każdą próbką, ponieważ DNA jest wszechobecne i może wpływać na wyniki PCR.
4. Dodać 1 ml ELB z lizozymem (z kroku 6.1) do każdej probówki, umieścić na ubijaku do kulek wirujących i pracować na maksymalnym ustawieniu (14) przez 5 minut.
5. Po rozerwaniu tkanki przenieś probówki do łaźni wodnej o temperaturze 37°C i inkubuj przez 30 minut.
   UWAGA: Ten krok ma na celu aktywację lizozymu i wywołanie rozpadu peptydoglikanu ściany komórkowej bakterii Gram-dodatnich.
6. Przygotować probówki z 20 μl proteinazy K dla każdej próbki o stężeniu 600 mAU na ml.
7. Odwirować probówki o masie 400 x g przez 10 minut. Lisat powinien wyglądać na przezroczysty z pewnymi pozostałościami tkanek na wierzchu kulek.
8. Przenieść 180 μl supernatantu (górna faza) do probówki zawierającej proteinazę K, a następnie dodać 200 μl buforu AL do probówki. Wiruj przez 15 sekund, aby wymieszać.
9. Umieścić rurki na bloku grzewczym w temperaturze 56 °C na 10 minut.
10. Dodaj 200 μl 100% etanolu do probówki i mieszaj przez wirowanie przez 15 sekund.
11. Dodaj około 600 μl lizatu do kolumny wirowej (z zestawu).
12. Wirować przez 1 minutę przy 8 000 x g. Odrzuć przepływ.
13. Powtarzać krok 6.12, aż cały lizat zostanie przeciągnięty przez kolumnę.
14. Umieść kolumnę w nowej probówce zbiorczej. Dodać 500 μl buforu AW1 i odwirować przy 8 000 x g przez 1 minutę.
15. Odrzuć przepływ. Dodać 500 μl buforu AW2 i odwirować przy 8 000 x g przez 3 min.
16. Odrzucić przepływ i odwirować kolumnę w pustej probówce zbiorczej o stężeniu 8 000 x g przez 3 minuty.
17. Przenieść kolumnę do probówki elucyjnej DNA. Dodać 60 μl ultraczystej wody klasy PCR bezpośrednio na membranę i inkubować przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
18. Do elucji użyć wstępnie podgrzanej wody elucyjnej o temperaturze 37 °C. Elucję można przeprowadzić dwukrotnie, używając połowy końcowej objętości elucji i dwukrotnie powtarzając krok 6.15 w celu zwiększenia wydajności.
19. Wirować przez 1 minutę przy 8,000 x g, aby wymyć DNA.
20. Zmierzyć stężenie eluowanego DNA przy użyciu pożądanej metody kwantyfikacji. Wydajność procesu ekstrakcji mieści się w przedziale 10-40 ng/μL DNA.
21. Wymyte DNA należy przechowywać w temperaturze -20 °C.

7. konfiguracja qPCR

1. Warunki PCR
   1. Włącz maszynę i załaduj program z tabeli 1 do maszyny qPCR w czasie rzeczywistym.
   2. Wykonać pętlę etapową od 3 do 5 w tabeli 1 przez 40 cykli i utrzymać próbkę w temperaturze 4 °C pod koniec reakcji.
2. Konfiguracja eksperymentalna PCR
   1. Użyj starterów i temperatury znajdujących się w Tabeli 2. Stosować stężenia i warunki reakcji podane w tabeli 3. Ustaw każdą reakcję w trzech egzemplarzach, aby kontrolować zmienność proceduralną.
3. Umieść probówki/płytkę reakcyjną PCR w systemie qPCR i uruchom program załadowany do systemu z kroku 7.1.
4. Wyjmij rurkę na końcu cyklu, umieść ją w temperaturze 4 °C i przygotuj się do nałożenia żelu.

8. Kwantyfikacja kolonizacji LP

1. Przygotować mieszaniny qPCR do reakcji 10 μl lub 20 μl zgodnie z tabelą 3.
2. Krzywa standardowa genomowego DNA LP 10⁷ do 10¹ kopii/μL
   UWAGA: Ponieważ 4 μl każdego rozcieńczenia zostaną pokryte na płytce, w zapasie wyjściowym wymagane jest 10⁷ kopii w 4 μl lub 2,5 x 10⁶ kopii na μl. Użyj tej samej zasady dla pozostałej części krzywej.
   1. Przygotować rozcieńczenie 1:4: 10⁷ kopii na μl w 50 μl.
      3,147 μL LPDNA + 46,85 μL dH₂O = 2,5 x 10⁶ kopii na μL
   2. Rozcieńczyć seryjnie 10-krotnie: dodać 5 μL do 45 μL dH₂O dla 1,25 x 10⁵ kopii/μL.
   3. Płytka 4 μl na rozcieńczenie na studzienkę.
3. Wizualizacja amplikonów LP
   1. Użyj 2% żelu agarozowego, aby uzyskać wyraźną separację amplifikowanego fragmentu LP ~ 197 pz.
   2. Załadować 9 μl każdego produktu PCR do żelu.
   3. Uruchom żel na 30 minut przy napięciu 120 V.

Wyniki

Wyjątkowość tej metody polega na dostosowaniu techniki gavaging do wielkości i kruchości noworodka myszy. W poprzedniej sekcji opisano ważne kroki w celu przeprowadzenia udanej procedury zgłębnika na myszy DOL 2. Aby ustalić dobrą skalę kwantyfikacji, wygenerowano krzywą standardową przy użyciu czystego DNA LP z trzema technicznymi powtórzeniami (Rysunek 2). Krzywa standardowa zapewniła dynamiczny zakres detekcji DNA LP przy użyciu starterów. Zakres dynamiki wynosił od 7 do 28 cykli, w których wykryto zakres od 10,¹ do 10,⁷ kopii DNA LP. Stałe nachylenie krzywej standardowej reprezentowało wydajność i skalowalność reakcji.

Procedura zgłębnika IE została stosunkowo łatwo zastosowana u dorosłych myszy. Jednak górny odcinek przewodu pokarmowego noworodka myszy jest delikatny i wymagał skalibrowanych ruchów igły do zgłębnika podczas zabiegu. Powtarzające się zgłębniki mogą zwiększyć ryzyko podrażnienia przełyku, urazu i awarii lub odrzucenia przez zaporę z powodu obchodzenia się z nią. W związku z tym przetestowano dwa różne schematy zgrubiania, a kolonizację jelit określono ilościowo przy użyciu DNA z homogenatów całego jelita. Myszy badano od DOL 2 do DOL 8 probiotykiem podawanym codziennie lub co dwa dni (Ryc. 3). Każda próbka zawierała jedną kontrpróbę techniczną, a każdy stan miał co najmniej dwie kontrpróby biologiczne. Szczenięta podawane codziennie z 7 dawkami miały około 10³ kopii LP, podczas gdy szczenięta podawane co dwa dni z 4 dawkami miały około 10⁵ kopii. Spójność wyników między powtórzeniami dodaje uznania precyzji techniki. Stwierdzono więcej LP w jelitach szczeniąt poddawanych przez zgłębnik co dwa dni w porównaniu ze szczeniętami, które były poddawane przez zgłębnik codziennie. Biorąc to pod uwagę, kolejne eksperymenty zostały ustalone z harmonogramem gażdżulnika co drugi dzień, ponieważ zmniejsza to również stres u szczeniąt.

Ważne jest, aby unikać zanieczyszczenia krzyżowego probiotykami wewnątrz ściółki podczas pracy z probiotykami. Oczekiwano, że mikrobiom rodzeństwa z miotu będzie podobny, ponieważ dzielą one tę samą matkę i środowisko gniazdowania. Dowodzi to problemu w badaniach nad probiotykami, jeśli warunki leczenia i kontroli występowały w tym samym miocie, ponieważ organizm probiotyczny ma potencjał, aby stać się częścią mikrobioty ("rozprzestrzenianie się kolonizacji"). Aby ustalić, czy probiotyk zanieczyści i skolonizuje nieleczone rodzeństwo z miotu, połowę miotu pobrano jak powyżej, a jelita pobrano do qPCR. Jelitowa analiza qPCR myszy DOL 10 wykazała oczekiwaną amplifikację DNA LP u myszy z zgłębnikami, ale także, w mniejszym stopniu, u rodzeństwa z miotu bez zgłębnika (Figura 4). Jelita tych samych myszy DOL z nieleczonej klatki nie wykazywały amplifikacji lub minimalną amplifikację przy cyklach większych niż 32. Dostarczyło to dowodów na wspólne dzielenie się mikrobiomem w ściółce w klatce. W związku z tym w przypadku eksperymentów z probiotykami grupy poddawane działaniu probiotyków powinny być oddzielone klatkami w celu kontroli zmienności poprzez zanieczyszczenie krzyżowe. Wykorzystanie matek zastępczych może być brane pod uwagę, jeśli eksperyment ma być przeprowadzony w środowisku ściółki, ale należy ocenić i zoptymalizować efekty zakłócające, takie jak zmniejszona opieka ze strony matki zastępczej i odrzucenie. Kiedy myszy żyły do DOL 8, które nie były leczone przez sześć dni, a DNA jelitowe analizowano w DOL 14, znaleziono około 10 kopii LP (Ryc. 5). W związku z tym stwierdzono, że kolonizacja LP jest przejściowa, a wykrywalna populacja zmniejszała się z czasem.

Rysunek 1. Pomiar długości między wyrostkiem mieczykowatym (dolny koniec mostka) a pyskiem, aby uzyskać maksymalne oznaczenie wprowadzenia igły. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Krzywa standardowa wyznaczona przy użyciu starterów LP i ATCC LP DNA. Przeprowadzono seryjne rozcieńczanie ATCC LP DNA w celu ustalenia dynamicznego wykrywalnego zakresu dla starterów użytych w badaniu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3. Amplifikacja LP jelitowego DNA od młodych DOL 10 leczonych między DOL 2 a DOL 8 w zaplanowanych zgłębnikach codziennie (7 dawek) i co drugi dzień (4 dawki). Zgłębnik co drugi dzień wykazał wyższy LP jelitowy w porównaniu z codziennym zgłębnikowaniem. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4. Amplifikacja LP jelitowego DNA od DOL 10 młodych, z czego 2 leczone i 2 nieleczone w miocie 4 młodych. Dawka wynosiła od DOL 2 do DOL 8 w zaplanowanych zgłębnikach każdego dnia (7 dawek). Dwa młode leczone probiotykami wykazują oczekiwany profil amplifikacji. Nieleczone młode wykazują zmienne wzmocnienie LP, co wskazuje na wspólne dzielenie się organizmem probiotycznym w miocie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5. Amplifikacja LP jelitowego DNA od młodych DOL 14 leczonych między DOL 2 a DOL 8 w zaplanowanych zgłębnikach codziennie (7 dawek) i co drugi dzień (4 dawki). Ładunek LP spada poniżej cyklu 28, co wskazuje na usunięcie LP w ciągu 6 dni po ostatnim zgłębniku probiotyku. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

krok	temperatura	Godzina
1	50 °C	2 minuty
cyfra arabska	95 °C	3 minuty
3	95 °C	30 sekund
4	58 °C	30 sekund
5	72 °C	30 sekund

Tabela 1. warunki amplifikacji qPCR. Temperatura i liczba warunków cyklu dla reakcji PCR.

cel	Obszar dystansu międzygenowego 16S-23S
Oczekiwany rozmiar fragmentu	144 punkty bazowe
Podkład Tm	58°C
Podkład do przodu (FP)	Lpn-1: TGG ATC ACC TCC TTT CTA AGG AAT
Odwrócony starter (RP)	Lpn-2: TGT TCT CGG TTT CAT TAT GAA AAA ATA

Tabela 2. Szczegółowe informacje na temat składników reakcji qPCR. Szczegóły dotyczące starterów, ich temperatury wyżarzania i oczekiwanej wielkości fragmentu w reakcji PCR.

	koncentracja	10 μl reakcji	20 μl reakcji
Matrycowy DNA	200 pg/μL	1 μL	1 μL
Mieszanka główna SYBR	-	5 μL	10 μL
Fp	10 μM	0,3 μl	0,6 μL
Rp	10 μM	0,3 μl	0,6 μL
dH2O	-	3,4 μl	8,8 μl

Tabela 3. Na objętości i stężenia reakcji. Stężenie odczynników i objętości reakcji.

Dyskusja

Procedura zgłębnika IE została opracowana w celu bezpiecznego podawania określonej dawki probiotyku nowonarodzonym myszom. Niewielkie ilości płynu są dostarczane do górnego odcinka przewodu pokarmowego za pomocą igły do karmienia, aby zapobiec zachłyśnięciu, zapewniając jednocześnie pewne dostarczenie dawki. Jelita myszy pobrano do analizy kolonizacji dwa i sześć dni po zgłębniku. Procedura ekstrakcji DNA została zmodyfikowana w celu zapewnienia wysokiej wydajności probiotycznego organizmu Gram-dodatniego. Analiza qPCR DNA wyekstrahowanego dwa dni po ostatnim zgłębniku wykazała stosunkowo wyższą kolonizację LP u myszy pobieranych co dwa dni w porównaniu z myszami pobieranymi codziennie między DOL 2-8. Nastąpił również spadek ilości LP w ciągu sześciu dni, co pokazuje, że ten probiotyk jest przejściowym organizmem w jelitach myszy. Wyniki tych eksperymentów stwarzają warunki do prowadzenia badań z dużą dokładnością w tej grupie wiekowej.

Aby zaobserwować długoterminowe skutki probiotyków u nowonarodzonych myszy, podawano je nowonarodzonym myszom na DOL 2; Podobny punkt wyjścia do badania na ludziach. Żywienie jamy ustnej i gardła noworodków myszy było już wcześniej opisane w literaturze i zostało przeprowadzone dopiero po DOL 5-8^12,17, kiedy ryzyko zachłyśnięcia jest mniejsze ze względu na dobrze rozwiniętą mechanikę połykania. Jednak żywienie jamy ustnej i gardła nie jest dobrze odpowiednie dla myszy DOL 2, ponieważ w badaniu pilotażowym zaobserwowano wyższe wskaźniki aspiracji (dane nie pokazane). Lepki charakter roztworu probiotycznego i prebiotycznego zwiększał ryzyko aspiracji. Postępowanie po procedurze IE zgłębnika zminimalizowało ryzyko aspiracji u myszy DOL 2, jednocześnie dostarczając pożądaną objętość bezpośrednio do górnego odcinka przewodu pokarmowego. Sukces procedury został po raz pierwszy potwierdzony przy użyciu barwnika spożywczego z dodatkiem zgłębnika probiotycznego. Barwnik spożywczy działa jak marker, który jest widoczny przez skórę szczeniaka. Nie zaobserwowano żadnych negatywnych skutków u myszy poddanych barwieniu spożywczemu i zaleca się walidację procedury gavaging w ten sposób przed rozpoczęciem eksperymentów na dużą skalę. Szybkie ustąpienie odruchu sapania obserwowane po zgłębniku może być również wykorzystane jako dodatkowy wskaźnik udanego zgłębnika. Po umieszczeniu myszy na kocu grzewczym po zgłębniku, odruch sapania ustąpi, a w ciągu 20 sekund zaobserwuje się wzrost częstotliwości oddychania. Utrzymywanie się odruchu sapania przez okres dłuższy niż 30 sekund wskazuje na nieudane zgłębnik. Udana głębnik zależy również od odpowiedniego wkłucia igły do karmienia z bańką znajdującą się tuż nad otworem zwieracza serca żołądka. Można to ułatwić, upewniając się, że oznaczenie na igle mierzące długość między wyrostkiem mieczykowatym a czubkiem pyska nie przechodzi poza pysk myszy podczas gaźnika. Minimalizuje to ryzyko zranienia myszy. Częstotliwość gajbnika może mieć znaczący wpływ na wyniki eksperymentu. Częste gajnikowanie może również powodować większy stres dla szczeniąt i matki z powodu ciągłych zakłóceń klatki i gniazda. Najbardziej optymalnym harmonogramem gajnika jest ten, w którym zgłębniki są najrzadsze i trwają krócej bez utraty oczekiwanego efektu w systemie. Aby zapewnić bezpieczeństwo i sterylność zabiegu, igła do zgłębnika musi być sterylizowana poprzez mycie i autoklawowanie pomiędzy użyciami. Konieczne jest rygorystyczne mycie na zewnątrz za pomocą peelingu i wewnątrz poprzez przetłaczanie wody przez igłę za pomocą strzykawki przed autoklawowaniem, ponieważ wszelkie resztki cząstek mogą gromadzić się na igle podczas autoklawowania i mogą zakłócać procedurę oddawania.

Wyższą kolonizację LP zaobserwowano u szczeniąt, które były gajlowane co drugi dzień w porównaniu ze szczeniętami zbieranymi codziennie. Może to być spowodowane zmniejszonym stresem u szczeniąt spożywanych co drugi dzień i potencjalnie probiotyk otrzymuje więcej składników odżywczych poprzez stosunkowo więcej mleka spożywanego przez te szczenięta. Zależność leczenia probiotykami od dawki była wcześniej badana na modelach mysich^18,19, a zatem ważne jest podanie prawidłowej dawki. Przygotowany roztwór probiotyczny jest platerowany przed każdym pobraniem, aby uzyskać dokładną liczbę podanych CFU. Jeśli organizm probiotyczny jest beztlenowy, ważne jest, aby sprawdzić, czy występuje różnica w CFU podczas hodowli tlenowej lub beztlenowej. Ponieważ LP jest fakultatywnym beztlenowcem, hodowano go przy użyciu obu metod i nie zaobserwowano różnicy w CFU.

Analizę obciążenia jelit po zgłębniku przeprowadzono przy użyciu qPCR i wysokiej jakości próbek DNA. Aby zminimalizować zanieczyszczenie LP DNA między grupą leczoną a grupą kontrolną, zastosowano różne igły do karmienia, komory bezpieczeństwa biologicznego i sprzęt chirurgiczny, aby zapewnić najwyższą jakość próbek. Dokładny pomiar probiotyku w jelicie wymagał zoptymalizowanej metody ekstrakcji DNA. Najbardziej skuteczne metody ekstrakcji DNA ze stolca obejmują wiele etapów ubijania koralików 20,21,22^. Metodę tę przyjęto do ekstrakcji bakterii jelitowych za pomocą bicia kulek i zaobserwowano zmniejszoną reprezentację (<10² odzyskanych kopii) LP w ekstrakcji DNA z całego jelita. Ponieważ LP jest organizmem Gram-dodatnim ze znaczną ilością peptydoglikanu w ścianie komórkowej, protokół został zoptymalizowany za pomocą etapu rozpuszczania peptydoglikanu przy użyciu lizozymu^23,24 dodanego do buforu do lizy enzymatycznej. Zwiększyło to reprezentację LP w tej samej próbce jelitowej ponad dwukrotnie. Obróbka lizozymem zapewnia rozpuszczenie zewnętrznej warstwy, podczas gdy etap ubijania kulek ułatwia lizę organizmu. Optymalizacja ilości tkanki, rodzaju kulki granatu oraz czasu trwania rozerwania przy użyciu kulek jest niezbędna do uzyskania optymalnych produktów DNA do przeprowadzenia analizy PCR.

Pozytywny wpływ probiotyków stosowanych w profilaktyce lub leczeniu u wcześniaków i noworodków urodzonych w terminie jest potwierdzony w najnowszych badaniach 25,26,27,28. Ustanowienie odpowiedniego modelu myszy noworodkowej dla probiotyków jest uzasadnione, aby odkryć ochronne działanie probiotyków. Przedstawiony tutaj protokół stanowi przewodnik dla badaczy niezaznajomionych z pracą noworodków na myszach przy użyciu probiotyków. Niezależnie od problemów z mikrobiotą gryzoni podczas badania zdrowia i chorób ludzkich, metodę tę można rozszerzyć na badania skoncentrowane na zrozumieniu zmian mikrobiomu spowodowanych probiotykami. Model ten stanowi również platformę do badania interakcji gospodarz-mikroorganizm i odpowiedzi immunologicznych na różnych etapach rozwoju.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Strzykawka tuberkulinowa 1 ml z końcówką wsuwaną	BD	309659
1,2% Triton X-100	Millipore-Sigma	X100-100ML
2 mM sodu EDTA	Thermo Fisher Scientific	15575020
20 mM Tris· Cl	Thermo Fisher Scientific	15568025
5% roztwór do wstrzykiwań dekstrozy i 0,9% NaCl	Baxter Corp.	JB1064
Alphaimager	Alpha Innotech	N/A	System obrazowania żelowego
Słoik anaerobowy	Millipore-Sigma	28029-1EA-F	2,5 L
BD GasPak EZ system pojemników anaerobowych saszetki	BD	260678
BD  Difco Lactobacilli MRS Bulion	BD	288130
Zakłócacz Genie	Scientific Industries Inc.	SI-D236
Igły do karmienia/podawania doustnego dla nowonarodzonych myszy i szczurów	Nauka o kadencji Inc.	01-290-1	Miernik 24, długość igły 1", średnica kulki 1,25 mm
Fruktooligosacharydy	Millipore-Sigma	F8052	z cykorii
Rurki z koralików granatowych 0,70 mm	Qiagen	13123-50
iTaq Universal SYBR Green Supermix	BioRad	172-5120
Lactobacillus plantarum (Orla-Jensen) Bergey et al.	ATCC	BAA-793	dla krzywej standardowej qPCR
Liofilizowane bakterie probiotyczne	N/A	N/A
Lysozyme	Thermo Fisher Scientific	89833
Maltodekstryna	Millipore-Sigma	419672	ekwiwalent dekstrozy 4,0-7,0
Mini-Sub Cell GT Cell	BioRad	1704406	Komora żelowa
Nanodrop 1000	Thermo Fisher Scientific	N/A
QIAamp Zestaw do krwi i tkanek	Qiagen	51504
System StepOnePlus do PCR w czasie rzeczywistym	Thermo Fisher Scientific	4376600
UltraPure Agaroza	Invitrogen	16500-500
Ultrapure dH2O	Invitrogen	10977023