Artykuł metodologiczny

Badania probiotyczne na nowonarodzonych myszach z użyciem zgłębnika

21.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59074

⸱

27 stycznia 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Experimental Medicine, University of British Columbia, 2Department of Pediatrics, University of British Columbia, 3Department of Epidemiology and Pediatrics, University of Nebraska Medical Centre, 4Animal Care Services, University of British Columbia

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

To badanie szczegółowo opisuje proces podawania precyzyjnych ilości probiotyków noworodkom myszy. Konfiguracja eksperymentalna została zoptymalizowana tak, aby obejmowała między innymi dawkowanie probiotyków, metody podawania i oznaczanie ilościowe bakterii w jelitach.

Streszczenie

Modele dorosłych myszy były powszechnie używane do zrozumienia mechanizmu progresji choroby u ludzi. Możliwość zastosowania badań przeprowadzonych na modelach dorosłych myszy do chorób noworodków jest ograniczona. Aby lepiej zrozumieć postęp choroby, reakcje gospodarza i długoterminowy wpływ interwencji u noworodków, prawdopodobnie lepszym rozwiązaniem jest model noworodka mysiego. Rzadkie wykorzystanie modeli nowonarodzonych myszy można częściowo przypisać trudnościom technicznym związanym z pracą z tymi małymi zwierzętami. Opracowano model noworodka myszy w celu określenia skutków podawania probiotyków we wczesnym okresie życia oraz specyficznej oceny zdolności do ustanowienia kolonizacji w przewodzie pokarmowym nowonarodzonej myszy. W szczególności, aby ocenić kolonizację probiotyczną u nowonarodzonych myszy, Lactobacillus plantarum (LP) dostarczono bezpośrednio do przewodu pokarmowego nowonarodzonych myszy. W tym celu LP podawano myszom poprzez karmienie przez zgłębnik wewnątrzprzełykowy (IE). Opracowano wysoce powtarzalną metodę w celu standaryzacji procesu zgłębnika IE, która umożliwia dokładne podawanie dawek probiotyków przy jednoczesnej minimalizacji urazu, co jest szczególnie ważne, biorąc pod uwagę kruchość nowonarodzonych myszy. Do ograniczeń tego procesu należy możliwość podrażnienia lub uszkodzenia przełyku oraz zachłyśnięcia w przypadku nieprawidłowego zgłębnika. Takie podejście stanowi ulepszenie w stosunku do obecnych praktyk, ponieważ wgryzanie się IE do dystalnego przełyku zmniejsza szanse na aspirację. Po zgłębniku prześledzono profil kolonizacji probiotyku za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (qPCR) wyekstrahowanego DNA jelitowego ze starterami specyficznymi dla LP. Do oceny potencjału rozprzestrzeniania się kolonizacji wykorzystano różne ustawienia ściółki i techniki zarządzania klatkami. Protokół szczegółowo opisuje zawiłości zgłębnika myszy noworodków IE i późniejszą kwantyfikację kolonizacji za pomocą LP.

Wprowadzenie

U niemowląt wczesna ekspozycja na probiotyki wiąże się z efektami immunomodulującymi, co prowadzi do zmniejszenia częstości występowania chorób, takich jak martwicze zapalenie jelit, atopowe zapalenie skóry i sepsa1,2,3,4,5. Jednak mechanizm stojący za tą odpowiedzią immunomodulacyjną jest trudny do zbadania, biorąc pod uwagę ograniczenie do pobierania próbek w badaniach klinicznych u noworodków (tj. sekwencyjnych pobrań krwi i biopsji). Modele noworodków myszy mogą pomóc w badaniu mechanizmu działania związanego z regulacją immunologiczną noworodków związaną ze stosowaniem probiotyków i zmianami w mikrobiocie jelitowej. Niestety, większość mysich modeli probiotyków w dużej mierze skupiała się na dorosłych myszach; Jednak wpływ probiotyków będzie prawdopodobnie najwyższy we wczesnym okresie życia, co sugeruje, że przydatne będą modele specyficzne dla tej grupy wiekowej3,6. Ponadto modele noworodków myszy lepiej nadają się do badania chorób i interwencji przeznaczonych do stosowania we wczesnym okresie życia niemowląt, ponieważ oczekuje się, że będą one bardziej naśladować rozwijający się układ odpornościowy i mikrobiologiczny7,8,9,10. Celem było zbadanie zakresu i wzorców kolonizacji probiotyków u nowonarodzonych myszy, ze szczególnym uwzględnieniem mechanistycznej interakcji między gospodarzem a jego mikrobiomem. W literaturze nie znaleziono odpowiednich opisów modeli noworodkowych, w związku z czym zaspokoiła się potrzeba opracowania solidnej i ustandaryzowanej metody.

Ustalone metody doustnego podawania różnych związków nowonarodzonym myszom obejmują matczyne przenoszenie pożądanych związków przez mleko poprzez uzdatnianie źródła wody dla ciężarnych matek11 lub używanie igieł do karmienia, aby ułatwić podawanie pożądanych związków do jamy ustnej gardła12. Metody te są przydatne w eksperymentach, które nie mają precyzyjnych wymagań dotyczących dawkowania i gdy leczenie jest łatwo spożywane przez mysz biorcę. Probiotyki są często podawane w połączeniu z prebiotykami, takimi jak galaktooligosacharydy i fruktooligosacharydy (FOS), które służą jako źródło pożywienia dla bakterii probiotycznych; Te dodatki sprawiają, że roztwór jest lepki i trudny do podania za pomocą wyżej wymienionych metodologii. Konieczne było opracowanie metody podawania precyzyjnych ilości probiotyków i prebiotyków nowonarodzonym myszom już od pierwszego dnia życia (DOL). W procesie opracowywania techniki gaveage przetestowano możliwość rozprzestrzeniania się kolonizacji (jak zaobserwowano w innych badaniach probiotycznych między grupą leczoną a grupą kontrolną13,14,15,16) oraz względna liczebność skolonizowanego Lactobacillus plantarum (LP) w jelitach szczeniąt z różnymi harmonogramami zgłębnika. Preparat probiotyczny użyty w eksperymentach składał się z 109 jednostek tworzących kolonie (CFU) na zgłębnik LP (szczep ATCC-202195), zmieszanych z FOS (prebiotykiem) i maltodekstryną (substancją pomocniczą), jak opisano w niedawnym badaniu na ludziach3. Podawanie probiotyków zostało zrealizowane przy użyciu zgłębnika IE, a proces ten jest szczegółowo opisany w poniższym protokole. Profil kolonizacyjny probiotyku oceniano za pomocą amplifikacji w czasie rzeczywistym DNA wyekstrahowanego z całych jelit przy użyciu starterów specyficznych dla LP.

Protokół

Wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi ustalonymi przez personel pomocniczy w Ośrodku Opieki nad Zwierzętami na Uniwersytecie Kolumbii Brytyjskiej i wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Komitet Opieki nad Zwierzętami UBC.

1.Kwantyfikacja podawanych probiotyków

UWAGA: Ten krok jest zalecany do określenia dokładnej ilości probiotycznego CFU, która może być podana w pojedynczej dawce. Ilość probiotyków i nośnika (FOS i maltodekstryna) określa warunki nasycenia roztworu. Z doświadczenia wynika, że myszom na DOL 2 można podać nie więcej niż 30 μl (~ 20 ml na kg) płynu, ponieważ każda większa objętość zwiększa ryzyko aspiracji.

  1. Przygotować sześć probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml do seryjnych rozcieńczeń, z których każda zawiera 180 μl sterylnego 5% roztworu soli fizjologicznej z dekstrozy.
  2. Odważyć 0,2 g podwielokrotności mieszaniny probiotyk-prebiotyk i rozpuścić ją w 1 ml 5% roztworu dekstrozy soli fizjologicznej w sterylny sposób.
  3. Wiruj przez 30 sekund i pipetę, aby rozbić grudki. Powtarzaj tak długo, aż nie zostaną zaobserwowane żadne widoczne grudki.
    UWAGA: Maltodekstryna sprawia, że roztwór jest lepki i przyczynia się do nasycenia roztworu.
  4. Przeprowadzić rozcieńczanie szeregowe przy użyciu probówek przygotowanych w kroku 1.1. Wirować do mieszania.
  5. Umieścić 40 μl każdego rozcieńczenia na oznakowanym kwadrancie płytki agarowej MRS. Każde rozcieńczenie należy przechowywać na płytkach w dwóch egzemplarzach.
  6. Inkubować w warunkach beztlenowych (lub mikroaerofilnych) w temperaturze 37 °C przez 48 godzin w słoiku próżniowym przy użyciu pakietu gazowego.
  7. Policz każdą płytkę w zakresie 20-70 kolonii na ćwiartkę. Średnia liczba płytek przy tym samym rozcieńczeniu i obliczenie z powrotem do żądanych jednostek.

2. Przygotowanie probiotyków i prebiotyków do gaźnika

UWAGA: Właściwe rozpuszczenie probiotyku i prebiotyku jest konieczne, aby zapewnić płynne wstrzykiwanie płynu przez igłę do karmienia podczas gaźnika.

  1. Połączyć wymaganą ilość liofilizowanego organizmu probiotycznego z pożądanymi ilościami prebiotyków i nośnika w sterylnej probówce do mikrowirówki.
  2. Dodać odpowiednią ilość rozpuszczalnika (5% soli fizjologicznej dekstrozy), aby rozpuścić mieszaninę probiotyku i prebiotyku.
    UWAGA: Zdolność rozpuszczania jest ograniczona przez użyty prebiotyk i nośnik. Z doświadczenia wynika, że kombinacja synbiotyczna (z FOS i maltodekstryną) osiągnęła nasycenie przy około 0,3 g/ml podczas rozpuszczania w probówce mikrowirówkowej o pojemności 2 ml przy użyciu 1 ml rozpuszczalnika.
  3. Mieszaj, aby mieszać, aż wszystkie ciała stałe się rozpuszczą. Za pomocą pipety rozbijać kuleczki cząstek stałych w rozpuszczalniku, pipetując w górę i w dół.
  4. Roztwór inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 20 min.
    UWAGA: Ten krok można pominąć, jeśli roztwór probiotyk-prebiotyk jest tworzony z żywej kultury.
  5. Umieść pięć serii 10-krotnego rozcieńczenia na płytkach agarowych MRS przed zgłębnikowaniem, aby dokładnie określić ilościowo probiotyk podany młodemu. Ten krok można pominąć, jeśli dokładna liczba CFU nie jest potrzebna.

3. Przygotowanie komory bezpieczeństwa biologicznego

  1. Podczas pracy z probiotykami należy używać komory bezpieczeństwa biologicznego, aby zachować technikę aseptyczną. Umieść klatkę z matkami i młodymi na kocu grzewczym (ustawionym na około 38 °C) na jednej połowie koca. Umieść czystą, pustą klatkę dla zwierząt na drugiej połowie koca grzewczego.
  2. Umieść zdezynfekowaną lub sterylną, chłonną podkładkę na kocu grzewczym, aby opiekować się myszą podczas gavingu.
  3. Zbierz materiał gniazdowy dla młodych ze szczytu istniejącego, utworzonego przez matkę gniazda i stwórz nowy stożkowy kubek lęgowy za pomocą rąk w rękawiczkach, zdezynfekowany przy użyciu 70% etanolu i wysuszony. Umieść to nowe gniazdo w czystej, pustej klatce. Ułatwia to przenoszenie zapachu gniazda na dłonie w rękawiczkach, a tym samym minimalizuje wprowadzanie innych zapachów na szczenię podczas obchodzenia się z nimi do zabiegu, zmniejszając ryzyko kanibalizacji.
  4. Przenieś szczenięta do stożkowej klatki do trzymania gniazda i wyjmij klatkę z zaporą z szafki. Zmniejsza to stres matki, uniemożliwiając jej słyszenie szczeniąt podczas zabiegu.
    UWAGA: Jeśli probiotyk jest znanym kolonizatorem mysich jelit, warunki leczenia muszą być oddzielone klatkami lub nawet różnymi komorami bezpieczeństwa biologicznego, aby uniknąć możliwości kolonizacji krzyżowej.

4. Zgłębnik wewnątrzprzełykowy noworodka myszy

  1. Otwórz opakowanie strzykawki, aby mieć do niej łatwy dostęp. Otworzyć opakowanie igły w sterylny sposób i przymocować ją do główki strzykawki. Przed zabiegiem umyj igłę 70% etanolem i przeprowadź w autoklawie. Używaj różnych zestawów igieł do leczenia i grupy kontrolnej, aby uniknąć zanieczyszczenia.
  2. Wciągnij do strzykawki nieco więcej niż pożądana ilość roztworu barwnika probiotycznego. Trzymać strzykawkę skierowaną do góry. Następnie pociągnij dalej w dół i przesuń palcem, aby usunąć bąbelki i naciśnij tłok, aby usunąć bąbelki i dodatkową objętość płynu, aż do osiągnięcia żądanej objętości. Gwarantuje to, że w igle nie ma przestrzeni powietrznej. W przypadku myszy DOL 2 objętość zgłębnika nie może przekraczać 30 μl.
  3. Umieść szczeniaka na sterylnej podkładce chłonnej na wierzchu poduszki grzewczej. Użyj igły do karmienia (rozmiar 24, długość igły 1", średnica kulki 1,25 mm) na zewnątrz, aby zmierzyć długość przełyku, umieszczając kulkę igły tuż poniżej wyrostka mieczykowatego (dolny koniec mostka). Zaznacz igłę na poziomie pyska, aby zanotować granicę wkłucia igły (Rysunek 1). Obserwuj szczeniaka pod kątem oznak zdrowotnych, do których należą regularny oddech i różowe zabarwienie skóry.
  4. Zanurz końcówkę igły w rozpuszczalniku do zanurzania (5% sól fizjologiczna z dekstrozy lub - pożywka używana do rozpuszczenia probiotyku i prebiotyku) w celu nasmarowania zewnętrznych powierzchni igły do karmienia. Ułatwia to płynne wprowadzenie igły do przełyku myszy.
  5. Podnieś szczeniaka za kark lub delikatnie trzymając głowę i ciało między kciukiem a palcem wskazującym. Upewnij się, że głowa, szyja i tułów są trzymane w pozycji prostej. Nie trzymaj szczeniaka za kark dłużej niż 60 sekund, ponieważ istnieje ryzyko niedrożności tchawicy prowadzącej do uduszenia. Upewnij się, że szczeniak może oddychać. Oznaki zbyt mocnego chrupania mogą obejmować niezdolność do oddychania, znaczne sapanie i wysunięty język poza usta. Monitoruj kolor i oddech szczeniaka podczas całego zabiegu.
  6. Włóż bańkę igły do środka pyska szczeniaka pod kątem 45° do płaszczyzny tułowia, aż dotrze do tylnej części gardła.
  7. Delikatnie zmienić kąt nachylenia igły, obracając się na gruszce igły i odsuwając strzykawkę od osoby pobierającej igłębkę (w kierunku grzbietowej strony szczeniaka), aż stanie się równoległa do płaszczyzny kręgosłupa szczeniaka. Chrupanie szczeniaka pomaga utrzymać igłę na miejscu w tylnej części gardła, a także zapobiega wierceniu się myszy. Upewnij się, że kulka igły nie przesuwa się ani nie wywiera żadnego nacisku na tylną część gardła podczas zmiany kąta.
  8. Jeśli mysz próbuje połknąć igłę, pozwól jej naturalnie zsunąć się w dół i zatrzymaj ruch, gdy oznaczenie na igle zrówna się z pyskiem. Strzykawka i igła są zwykle wystarczająco ciężkie, aby zsunąć się w dół pod wpływem grawitacji. Utrzymuj ciężar igły przez cały czas, aby igła łatwo zsuwała się w dół przełyku, bez nacisku w dół ze strony osoby wykonującej zgłębnik.
    1. Jeśli igła napotka opór w tylnej części gardła, lekko wycofaj igłębkę, aby usunąć kulkę igły i ponownie ustaw igłę w jamie ustnej pod odpowiednim kątem w kierunku lewej strony myszy (po prawej stronie opiekuna) powoli w małych odstępach co 1 mm. Igła powinna zacząć łatwo zsuwać się w dół przełyku.
    2. Jeśli igła zatrzyma się, zanim oznaczenie na igle dotrze do ust, nie należy wstrzykiwać roztworu.
    3. Nie należy trzymać igły włożonej dłużej niż 20 sekund. Jeśli tak się stanie, powoli cofnij igłę, trzymając strzykawkę równolegle do tułowia i pozwól szczeniakowi spoczywać na ręczniku papierowym przez 30 s do 1 minuty. Spróbuj ponownie wykonać wgłębnik po nasmarowaniu zewnętrznej powierzchni igły rozpuszczalnikiem.
      UWAGA: W zabiegu nie stosuje się znieczulenia, ponieważ reakcja myszy jest niezbędna do oceny powodzenia zgłębnika.
  9. Gdy oznaczenie na igle do karmienia znajduje się powyżej pyska i jest wyrównane z końcem pyska, nie pozwól, aby igła poruszała się lub przesuwała dalej. Powoli wstrzyknąć żądaną objętość płynu. Jeśli płyn zostanie zasysany lub zaobserwuje się, że pęcherzyki przez nos należy natychmiast przerwać wstrzykiwanie i powoli wycofać igłę.
    1. Umieść szczeniaka pionowo na ręczniku papierowym na poduszce grzewczej, aby pomóc w jego regeneracji. Uważnie monitoruj pod kątem utrzymujących się problemów z oddychaniem lub zmiany koloru szczeniaka, która wskazuje na aspirację. Poddaj eutanazji szczenięta, które zostały natychmiast zachcalone.
  10. Po zakończeniu podawania delikatnie wyjmij igłę do karmienia pod tym samym kątem, pod jakim została włożona. Połóż szczeniaka na ręczniku papierowym na rozgrzanej poduszce grzewczej. Odczekaj 10 sekund, aż szczeniak odzyska normalną aktywność i wzorzec oddychania. Na ciele szczeniaka powinien pojawić się zdrowy różowy odcień, a barwnik powinien być widoczny tylko w komorze żołądkowej. Przenieś go z powrotem do klatki z innymi szczeniakami.
    UWAGA: Niebieski barwnik spożywczy to doskonały sposób na przećwiczenie procedury opisanej powyżej. Jeśli zgłębnik się powiedzie, brzuch myszy będzie widoczny jako niebieski odcień. Jeśli niebieski barwnik zostanie znaleziony poza żołądkiem szczeniaka (szyja, klatka piersiowa lub okolica pachowa), zwierzę powinno zostać humanitarnie uśpione (zgodnie z zasadami opieki nad zwierzętami), ponieważ wskazuje to na pęknięcie przełyku lub aspirację.

5. Pobieranie próbek jelitowych do analizy kolonizacji

  1. Podczas późniejszego monitorowania lub pobierania próbek mikrobiomu kałowego od szczeniąt.
    UWAGA: Szczenię często oddaje mocz i kał po zgłębnikowaniu i ten czas może być wykorzystany jako okazja do pobrania próbek kału do analizy mikrobiomu.
  2. Aby zakończyć eksperymenty, należy pobrać jelita od dwunastnicy do odbytnicy po eutanazji szczeniąt. Przypnij szczeniaka do deski chirurgicznej i zdezynfekuj skórę 70% etanolem. Przeciąć skórę na cztery ćwiartki, nie uszkadzając warstwy otrzewnej, za pomocą narzędzi wysterylizowanych 70% etanolem i sterylizacji gorącymi kulkami w temperaturze 250 °C.
  3. Użyj innego zestawu sterylnych narzędzi, aby przeciąć otrzewną na cztery ćwiartki i odsunąć ją od środka w taki sposób, aby narządy trzewne były odsłonięte.
  4. Zlokalizuj żołądek i użyj zacisku, aby uszczypnąć poniżej zwieracza odźwiernika i na końcu odbytnicy. Przeprowadź wzdłuż jelita za pomocą narzędzia lub kleszczy, aby usprawnić jelito i uwolnić je od tkanki łącznej i tkanki krezkowej. Gdy cała długość jelita zostanie uwolniona z tkanki łącznej, przeciąć na zaciśniętych końcach.
  5. Zaznacz folię aluminiową zgodnie z orientacją jelita, zawiń w bezpieczny sposób i zamroź w temperaturze -80 °C.
    UWAGA: Procedurę ekstrakcji DNA można przeprowadzić w tym momencie bez zamrażania. Zaobserwowano również, że niebieski barwnik przechodzi przez jelito w ciągu 24 godzin, a pobieranie próbek do analizy kolonizacyjnej jest najlepsze, gdy jelita są pobierane co najmniej 24 godziny po ostatnim zgłębniku. Sygnały mogą być wzmacniane przed tym punktem czasowym przez nieprzylegające bakterie przejściowo przechodzące przez mieszaninę zgłębnika.

6. Ekstrakcja DNA z jelit do analizy kolonizacji

UWAGA: Ekstrakcja DNA odbywa się za pomocą komercyjnego zestawu z optymalizacją modyfikacji protokołu ekstrakcji DNA z jelit. Upewnij się, że urządzenie grzewcze jest ustawione na żądaną temperaturę, a roztwory, które wymagają zmian lub wstępnego podgrzania, są odpowiednio przygotowane.

  1. Przygotuj bufor do lizy enzymatycznej (ELB) w następujący sposób: Przygotuj roztwór z 20 mM Tris-Cl, 2 mM EDTA sodu i 1,2% Triton X-100. Dostosuj pH do 8,0. Bezpośrednio przed użyciem ELB należy dodać lizozym do końcowego stężenia 20 mg/ml.
  2. Wstępnie zważ probówki z kulkami granatu na wadze analitycznej ze zdjętymi nasadkami.
    UWAGA: Odbywa się to po to, aby w przypadku przekroczenia wymaganej masy łatwiej było usunąć zawartość jelitową.
  3. Pokrój jelita na małe segmenty za pomocą sterylnego jednorazowego skalpela i zgarnij żądane segmenty do wstępnie zważonych tubek z koralikami granatu.
    UWAGA: Upewnij się, że zmieniasz skalpele między każdą próbką, ponieważ DNA jest wszechobecne i może wpływać na wyniki PCR.
  4. Dodać 1 ml ELB z lizozymem (z kroku 6.1) do każdej probówki, umieścić na ubijaku do kulek wirujących i pracować na maksymalnym ustawieniu (14) przez 5 minut.
  5. Po rozerwaniu tkanki przenieś probówki do łaźni wodnej o temperaturze 37°C i inkubuj przez 30 minut.
    UWAGA: Ten krok ma na celu aktywację lizozymu i wywołanie rozpadu peptydoglikanu ściany komórkowej bakterii Gram-dodatnich.
  6. Przygotować probówki z 20 μl proteinazy K dla każdej próbki o stężeniu 600 mAU na ml.
  7. Odwirować probówki o masie 400 x g przez 10 minut. Lisat powinien wyglądać na przezroczysty z pewnymi pozostałościami tkanek na wierzchu kulek.
  8. Przenieść 180 μl supernatantu (górna faza) do probówki zawierającej proteinazę K, a następnie dodać 200 μl buforu AL do probówki. Wiruj przez 15 sekund, aby wymieszać.
  9. Umieścić rurki na bloku grzewczym w temperaturze 56 °C na 10 minut.
  10. Dodaj 200 μl 100% etanolu do probówki i mieszaj przez wirowanie przez 15 sekund.
  11. Dodaj około 600 μl lizatu do kolumny wirowej (z zestawu).
  12. Wirować przez 1 minutę przy 8 000 x g. Odrzuć przepływ.
  13. Powtarzać krok 6.12, aż cały lizat zostanie przeciągnięty przez kolumnę.
  14. Umieść kolumnę w nowej probówce zbiorczej. Dodać 500 μl buforu AW1 i odwirować przy 8 000 x g przez 1 minutę.
  15. Odrzuć przepływ. Dodać 500 μl buforu AW2 i odwirować przy 8 000 x g przez 3 min.
  16. Odrzucić przepływ i odwirować kolumnę w pustej probówce zbiorczej o stężeniu 8 000 x g przez 3 minuty.
  17. Przenieść kolumnę do probówki elucyjnej DNA. Dodać 60 μl ultraczystej wody klasy PCR bezpośrednio na membranę i inkubować przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
  18. Do elucji użyć wstępnie podgrzanej wody elucyjnej o temperaturze 37 °C. Elucję można przeprowadzić dwukrotnie, używając połowy końcowej objętości elucji i dwukrotnie powtarzając krok 6.15 w celu zwiększenia wydajności.
  19. Wirować przez 1 minutę przy 8,000 x g, aby wymyć DNA.
  20. Zmierzyć stężenie eluowanego DNA przy użyciu pożądanej metody kwantyfikacji. Wydajność procesu ekstrakcji mieści się w przedziale 10-40 ng/μL DNA.
  21. Wymyte DNA należy przechowywać w temperaturze -20 °C.

7. konfiguracja qPCR

  1. Warunki PCR
    1. Włącz maszynę i załaduj program z tabeli 1 do maszyny qPCR w czasie rzeczywistym.
    2. Wykonać pętlę etapową od 3 do 5 w tabeli 1 przez 40 cykli i utrzymać próbkę w temperaturze 4 °C pod koniec reakcji.
  2. Konfiguracja eksperymentalna PCR
    1. Użyj starterów i temperatury znajdujących się w Tabeli 2. Stosować stężenia i warunki reakcji podane w tabeli 3. Ustaw każdą reakcję w trzech egzemplarzach, aby kontrolować zmienność proceduralną.
  3. Umieść probówki/płytkę reakcyjną PCR w systemie qPCR i uruchom program załadowany do systemu z kroku 7.1.
  4. Wyjmij rurkę na końcu cyklu, umieść ją w temperaturze 4 °C i przygotuj się do nałożenia żelu.

8. Kwantyfikacja kolonizacji LP

  1. Przygotować mieszaniny qPCR do reakcji 10 μl lub 20 μl zgodnie z tabelą 3.
  2. Krzywa standardowa genomowego DNA LP 107 do 101 kopii/μL
    UWAGA: Ponieważ 4 μl każdego rozcieńczenia zostaną pokryte na płytce, w zapasie wyjściowym wymagane jest 107 kopii w 4 μl lub 2,5 x 106 kopii na μl. Użyj tej samej zasady dla pozostałej części krzywej.
    1. Przygotować rozcieńczenie 1:4: 107 kopii na μl w 50 μl.
      3,147 μL LPDNA + 46,85 μL dH2O = 2,5 x 106 kopii na μL
    2. Rozcieńczyć seryjnie 10-krotnie: dodać 5 μL do 45 μL dH2O dla 1,25 x 105 kopii/μL.
    3. Płytka 4 μl na rozcieńczenie na studzienkę.
  3. Wizualizacja amplikonów LP
    1. Użyj 2% żelu agarozowego, aby uzyskać wyraźną separację amplifikowanego fragmentu LP ~ 197 pz.
    2. Załadować 9 μl każdego produktu PCR do żelu.
    3. Uruchom żel na 30 minut przy napięciu 120 V.

Wyniki

Wyjątkowość tej metody polega na dostosowaniu techniki gavage do rozmiarów i delikatności noworodka myszy. W poprzedniej sekcji opisano kluczowe kroki niezbędne do prawidłowego przeprowadzenia procedury gavage u myszy w 2. dniu życia (DOL 2). Aby ustanowić odpowiednią skalę ilościową, wygenerowano krzywą wzorcową przy użyciu czystego DNA LP z trzema powtórzeniami technicznymi (Rysunek 2). Krzywa wzorcowa określiła zakres dynamiczny detekcji DNA LP przy użyciu starterów. Zakres dynamiczny mieścił się między 7 a 28 cyklami, w których wykryto od 101 do 107 kopii DNA LP. Stabilne nachylenie krzywej wzorcowej odzwierciedlało wydajność i skalowalność reakcji.

Procedura gavage (podawania dożylnego/dojelitowego) IE była stosowana u dorosłych myszy z relatywną łatwością. Jednakże górny odcinek przewodu pokarmowego noworodka myszy jest delikatny i wymaga precyzyjnych ruchów igły podczas procedury. Powtarzane podania mogły zwiększyć ryzyko podrażnienia przełyku, urazów oraz odrzucenia młodych przez matkę z powodu manipulacji. W związku z tym przetestowano dwa różne schematy podawania, a kolonizację jelitową ilościowo określono, wykorzystując DNA z homogenatów całego jelita. Myszy otrzymywały probiotyk od 2. do 8. dnia życia (DOL 2–DOL 8) w odstępach codziennych lub co dwa dni (Rycina 3). Każda próbka zawierała jedną powtórkę techniczną, a każdy wariant miał co najmniej dwie powtórki biologiczne. U szczeniąt, którym podawano preparat codziennie (7 dawek), stwierdzono około 103 kopii LP, natomiast u szczeniąt otrzymujących dawki co dwa dni (4 dawki) stwierdzono około 105 kopii. Spójność wyników między powtórkami potwierdza precyzję techniki. W jelitach szczeniąt, którym podawano preparat co dwa dni, wykryto więcej LP w porównaniu z szczeniętami otrzymującymi dawki codziennie. W związku z tym kolejne eksperymenty zaplanowano z harmonogramem podawania co drugi dzień, co dodatkowo redukuje stres u młodych zwierząt.

Podczas pracy z probiotykami ważne jest unikanie wzajemnego zanieczyszczenia probiotykami w obrębie jednego miotu. Przewidywano, że mikrobiom rodzeństwa z jednego miotu będzie podobny, ponieważ dzielą one tę samą matkę i środowisko gniazdowe. Stanowi to problem w badaniach nad probiotykami, jeśli warunki traktowania i kontrolne występują w obrębie tego samego miotu, ponieważ organizm probiotyczny ma potencjał, aby stać się częścią mikrobioty („rozprzestrzenianie kolonizacji”). Aby ustalić, czy probiotyk zanieczyści i skolonizuje nieleczone rodzeństwo z miotu, połowie miotu podano dawkę drogą gavage'owania, jak opisano powyżej, a następnie pobrano jelita do analizy qPCR. Analiza qPCR jelit myszy w 10. dniu życia (DOL 10) wykazała oczekiwaną amplifikację DNA LP u myszy poddanych gavage'owaniu, ale także, w mniejszym stopniu, u nieleczonego rodzeństwa z tego samego miotu (Rysunek 4). Jelita tych samych myszy w dniu DOL z nieleczonej klatki nie wykazały amplifikacji lub wykazały minimalną amplifikację przy cyklach większych niż 32. Dostarczyło to dowodów na wspólne dzielenie mikrobiomu w obrębie miotu w jednej klatce. Zatem w eksperymentach z probiotykami grupy traktowane powinny być rozdzielone na osobne klatki, aby kontrolować zmienność wynikającą z wzajemnego zanieczyszczenia. W przypadku planowania eksperymentu w obrębie miotu można rozważyć zastosowanie matek zastępczych, jednak należy ocenić i zoptymalizować potencjalne efekty zakłócające, takie jak zmniejszona opieka matki zastępczej i odrzucenie młodych. Gdy myszy poddawane gavage'owaniu do 8. dnia życia (DOL 8) pozostawiono bez leczenia przez sześć dni, a DNA jelitowe przeanalizowano w 14. dniu życia (DOL 14), stwierdzono obecność około 10 kopii LP (Rysunek 5). Zatem stwierdzono, że kolonizacja przez LP ma charakter przejściowy, a wykrywalna populacja zmniejszała się z upływem czasu.

Proces sekcji gryzonia; metoda anatomiczna; analiza procedury laboratoryjnej.
Rysunek 1. Pomiar długości między wyrostkiem mieczowatym (dolnym końcem mostka) a końcem nosa w celu wyznaczenia maksymalnego punktu wprowadzenia igły. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Wykres krzywej standardowej, ilościowe oznaczenie DNA LP, średnie Ct względem liczby kopii DNA, analiza regresji liniowej.
Rysunek 2Krzywa wzorcowa sporządzona z użyciem starterów LP oraz DNA LP z ATCC. Wykonano rozcieńczenia szeregowe DNA ATCC LP w celu ustalenia dynamicznego zakresu detekcji dla starterów użytych w badaniu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Krzywe amplifikacji qPCR pokazujące wartości progu cyklu (Ct) na wykresie testu SYBR.
Rysunek 3. Amplifikacja LP z DNA jelitowego szczeniąt w 10. dniu życia (DOL 10), leczonych między 2. a 8. dniem życia (DOL 2–DOL 8) w harmonogramie podawania przez zgłębnik codziennie (7 dawek) oraz co drugi dzień (4 dawki). Podawanie co drugi dzień wykazało wyższy poziom LP w jelitach w porównaniu do podawania codziennego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres SYBR qPCR przedstawiający wartości Ct, wykresy amplifikacji dla różnych warunków, analiza ekspresji genów.
Rycina 4. Amplifikacja LP z DNA jelit szczeniąt w 10. dniu życia (DOL 10), w tym 2 osobników leczonych i 2 nieleczonych w miocie 4 szczeniąt. Gavage przeprowadzano między DOL 2 a DOL 8 w zaplanowanych dawkach codziennie (7 dawek). Dwa szczenięta leczone probiotykiem wykazują oczekiwany profil amplifikacji. Szczenięta nieleczone wykazują zmienną amplifikację LP, co wskazuje na wspólne dzielenie się organizmem probiotycznym w obrębie miotu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres amplifikacji SYBR qPCR, wartości Ct, analiza intensywności fluorescencji.
Rycina 5. Amplifikacja LP z DNA jelit szczeniąt w 14. dniu życia (DOL 14), które otrzymywały preparat między 2. a 8. dniem życia (DOL 2–DOL 8) w zaplanowanych zgłębnikowaniach codziennie (7 dawek) oraz co drugi dzień (4 dawki). Obciążenie LP spada poniżej cyklu 28, co wskazuje na eliminację LP w ciągu 6 dni po ostatnim podaniu probiotyku przez zgłębnik. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

KrokTemperaturaCzas
150 °C2 minuty
295 °C3 minuty
395 °C30 sekundów
458 °C30 sekundów
572 °C30 sekund

Tabela 1. Warunki amplifikacji qPCR. Temperatura i liczba cykli dla reakcji PCR.

Celregion międzygenowy 16S-23S
Oczekiwana wielkość fragmentu144 bp
Tm startera58˚C
Starter forward (FP)Lpn-1: TGG ATC ACC TCC TTT CTA AGG AAT 
Starter odwrotny (RP)Lpn-2: TGT TCT CGG TTT CAT TAT GAA AAA ATA

Tabela 2. Szczegóły komponentów reakcji qPCR. Szczegółowe informacje na temat starterów, ich temperatury przyłączania oraz oczekiwanej wielkości fragmentu w reakcji PCR.

Stężenie10 µL reakcja20 µL reakcja
Matryca DNA200 pg/µL1 µL1 µL
SYBR Master Mix-5 µL10 µL
FP10 µM0.3 µL0.6 µL
RP10 µM0.3 µL0.6 µL
dH2O-3.4 µL8.8 µL

Tabela 3. Objętości i stężenia na jedną reakcję. Stężenia odczynników i objętości dla reakcji.

Dyskusja

Procedura zgłębnika IE została opracowana w celu bezpiecznego podawania określonej dawki probiotyku nowonarodzonym myszom. Niewielkie ilości płynu są dostarczane do górnego odcinka przewodu pokarmowego za pomocą igły do karmienia, aby zapobiec zachłyśnięciu, zapewniając jednocześnie pewne dostarczenie dawki. Jelita myszy pobrano do analizy kolonizacji dwa i sześć dni po zgłębniku. Procedura ekstrakcji DNA została zmodyfikowana w celu zapewnienia wysokiej wydajności probiotycznego organizmu Gram-dodatniego. Analiza qPCR DNA wyekstrahowanego dwa dni po ostatnim zgłębniku wykazała stosunkowo wyższą kolonizację LP u myszy pobieranych co dwa dni w porównaniu z myszami pobieranymi codziennie między DOL 2-8. Nastąpił również spadek ilości LP w ciągu sześciu dni, co pokazuje, że ten probiotyk jest przejściowym organizmem w jelitach myszy. Wyniki tych eksperymentów stwarzają warunki do prowadzenia badań z dużą dokładnością w tej grupie wiekowej.

Aby zaobserwować długoterminowe skutki probiotyków u nowonarodzonych myszy, podawano je nowonarodzonym myszom na DOL 2; Podobny punkt wyjścia do badania na ludziach. Żywienie jamy ustnej i gardła noworodków myszy było już wcześniej opisane w literaturze i zostało przeprowadzone dopiero po DOL 5-812,17, kiedy ryzyko zachłyśnięcia jest mniejsze ze względu na dobrze rozwiniętą mechanikę połykania. Jednak żywienie jamy ustnej i gardła nie jest dobrze odpowiednie dla myszy DOL 2, ponieważ w badaniu pilotażowym zaobserwowano wyższe wskaźniki aspiracji (dane nie pokazane). Lepki charakter roztworu probiotycznego i prebiotycznego zwiększał ryzyko aspiracji. Postępowanie po procedurze IE zgłębnika zminimalizowało ryzyko aspiracji u myszy DOL 2, jednocześnie dostarczając pożądaną objętość bezpośrednio do górnego odcinka przewodu pokarmowego. Sukces procedury został po raz pierwszy potwierdzony przy użyciu barwnika spożywczego z dodatkiem zgłębnika probiotycznego. Barwnik spożywczy działa jak marker, który jest widoczny przez skórę szczeniaka. Nie zaobserwowano żadnych negatywnych skutków u myszy poddanych barwieniu spożywczemu i zaleca się walidację procedury gavaging w ten sposób przed rozpoczęciem eksperymentów na dużą skalę. Szybkie ustąpienie odruchu sapania obserwowane po zgłębniku może być również wykorzystane jako dodatkowy wskaźnik udanego zgłębnika. Po umieszczeniu myszy na kocu grzewczym po zgłębniku, odruch sapania ustąpi, a w ciągu 20 sekund zaobserwuje się wzrost częstotliwości oddychania. Utrzymywanie się odruchu sapania przez okres dłuższy niż 30 sekund wskazuje na nieudane zgłębnik. Udana głębnik zależy również od odpowiedniego wkłucia igły do karmienia z bańką znajdującą się tuż nad otworem zwieracza serca żołądka. Można to ułatwić, upewniając się, że oznaczenie na igle mierzące długość między wyrostkiem mieczykowatym a czubkiem pyska nie przechodzi poza pysk myszy podczas gaźnika. Minimalizuje to ryzyko zranienia myszy. Częstotliwość gajbnika może mieć znaczący wpływ na wyniki eksperymentu. Częste gajnikowanie może również powodować większy stres dla szczeniąt i matki z powodu ciągłych zakłóceń klatki i gniazda. Najbardziej optymalnym harmonogramem gajnika jest ten, w którym zgłębniki są najrzadsze i trwają krócej bez utraty oczekiwanego efektu w systemie. Aby zapewnić bezpieczeństwo i sterylność zabiegu, igła do zgłębnika musi być sterylizowana poprzez mycie i autoklawowanie pomiędzy użyciami. Konieczne jest rygorystyczne mycie na zewnątrz za pomocą peelingu i wewnątrz poprzez przetłaczanie wody przez igłę za pomocą strzykawki przed autoklawowaniem, ponieważ wszelkie resztki cząstek mogą gromadzić się na igle podczas autoklawowania i mogą zakłócać procedurę oddawania.

Wyższą kolonizację LP zaobserwowano u szczeniąt, które były gajlowane co drugi dzień w porównaniu ze szczeniętami zbieranymi codziennie. Może to być spowodowane zmniejszonym stresem u szczeniąt spożywanych co drugi dzień i potencjalnie probiotyk otrzymuje więcej składników odżywczych poprzez stosunkowo więcej mleka spożywanego przez te szczenięta. Zależność leczenia probiotykami od dawki była wcześniej badana na modelach mysich18,19, a zatem ważne jest podanie prawidłowej dawki. Przygotowany roztwór probiotyczny jest platerowany przed każdym pobraniem, aby uzyskać dokładną liczbę podanych CFU. Jeśli organizm probiotyczny jest beztlenowy, ważne jest, aby sprawdzić, czy występuje różnica w CFU podczas hodowli tlenowej lub beztlenowej. Ponieważ LP jest fakultatywnym beztlenowcem, hodowano go przy użyciu obu metod i nie zaobserwowano różnicy w CFU.

Analizę obciążenia jelit po zgłębniku przeprowadzono przy użyciu qPCR i wysokiej jakości próbek DNA. Aby zminimalizować zanieczyszczenie LP DNA między grupą leczoną a grupą kontrolną, zastosowano różne igły do karmienia, komory bezpieczeństwa biologicznego i sprzęt chirurgiczny, aby zapewnić najwyższą jakość próbek. Dokładny pomiar probiotyku w jelicie wymagał zoptymalizowanej metody ekstrakcji DNA. Najbardziej skuteczne metody ekstrakcji DNA ze stolca obejmują wiele etapów ubijania koralików 20,21,22. Metodę tę przyjęto do ekstrakcji bakterii jelitowych za pomocą bicia kulek i zaobserwowano zmniejszoną reprezentację (<102 odzyskanych kopii) LP w ekstrakcji DNA z całego jelita. Ponieważ LP jest organizmem Gram-dodatnim ze znaczną ilością peptydoglikanu w ścianie komórkowej, protokół został zoptymalizowany za pomocą etapu rozpuszczania peptydoglikanu przy użyciu lizozymu23,24 dodanego do buforu do lizy enzymatycznej. Zwiększyło to reprezentację LP w tej samej próbce jelitowej ponad dwukrotnie. Obróbka lizozymem zapewnia rozpuszczenie zewnętrznej warstwy, podczas gdy etap ubijania kulek ułatwia lizę organizmu. Optymalizacja ilości tkanki, rodzaju kulki granatu oraz czasu trwania rozerwania przy użyciu kulek jest niezbędna do uzyskania optymalnych produktów DNA do przeprowadzenia analizy PCR.

Pozytywny wpływ probiotyków stosowanych w profilaktyce lub leczeniu u wcześniaków i noworodków urodzonych w terminie jest potwierdzony w najnowszych badaniach 25,26,27,28. Ustanowienie odpowiedniego modelu myszy noworodkowej dla probiotyków jest uzasadnione, aby odkryć ochronne działanie probiotyków. Przedstawiony tutaj protokół stanowi przewodnik dla badaczy niezaznajomionych z pracą noworodków na myszach przy użyciu probiotyków. Niezależnie od problemów z mikrobiotą gryzoni podczas badania zdrowia i chorób ludzkich, metodę tę można rozszerzyć na badania skoncentrowane na zrozumieniu zmian mikrobiomu spowodowanych probiotykami. Model ten stanowi również platformę do badania interakcji gospodarz-mikroorganizm i odpowiedzi immunologicznych na różnych etapach rozwoju.

Oświadczenia

Brak konfliktu interesów do ujawnienia.

Podziękowania

Podziękowania dla personelu Zakładu Opieki nad Zwierzętami oraz weterynarzy UBC za szkolenie i pomoc w pracy z myszami w Instytucie Badawczym Szpitala Dziecięcego BC. Podziękowania dla University of British Columbia i Wydziału Medycyny Eksperymentalnej za sfinansowanie badania.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Strzykawka tuberkulinowa 1 ml z końcówką wsuwaną BD309659
1,2% Triton X-100 Millipore-SigmaX100-100ML
2 mM sodu EDTA   Thermo Fisher Scientific15575020
20 mM Tris· Cl Thermo Fisher Scientific15568025
5% roztwór do wstrzykiwań dekstrozy i 0,9% NaClBaxter Corp.JB1064
AlphaimagerAlpha InnotechN/ASystem obrazowania żelowego
Słoik anaerobowyMillipore-Sigma28029-1EA-F2,5 L
BD GasPak EZ system pojemników anaerobowych saszetkiBD260678
BD  Difco Lactobacilli MRS BulionBD288130
Zakłócacz GenieScientific Industries Inc.SI-D236
Igły do karmienia/podawania doustnego dla nowonarodzonych myszy i szczurów Nauka o kadencji Inc.01-290-1Miernik 24, długość igły 1", średnica kulki 1,25 mm
FruktooligosacharydyMillipore-SigmaF8052  z cykorii
Rurki z koralików granatowych 0,70 mm Qiagen13123-50
iTaq Universal SYBR Green SupermixBioRad172-5120
Lactobacillus plantarum (Orla-Jensen) Bergey et al. ATCCBAA-793dla krzywej standardowej qPCR
Liofilizowane bakterie probiotyczneN/AN/A
LysozymeThermo Fisher Scientific89833
MaltodekstrynaMillipore-Sigma419672 ekwiwalent dekstrozy 4,0-7,0
Mini-Sub Cell GT CellBioRad1704406Komora żelowa
Nanodrop 1000 Thermo Fisher ScientificN/A
QIAamp Zestaw do krwi i tkanek Qiagen51504
System StepOnePlus do PCR w czasie rzeczywistymThermo Fisher Scientific4376600
UltraPure AgarozaInvitrogen16500-500
Ultrapure dH2OInvitrogen10977023

Bibliografia

  1. Reid, G. Probiotics and prebiotics – Progress and challenges. International Dairy Journal. 18 (10-11), 969-975 (2008).
  2. Lin, H. C., et al. Oral probiotics reduce the incidence and severity of necrotizing enterocolitis in very low birth weight infants. Pediatrics. 115 (1), 1-4 (2005).
  3. Panigrahi, P., et al. A randomized synbiotic trial to prevent sepsis among infants in rural India. Nature. 548 (7668), 407-412 (2017).
  4. Amenyogbe, N., Kollmann, T. R., Ben-Othman, R. Early-Life Host–Microbiome Interphase: The Key Frontier for Immune Development. Frontiers in Pediatrics. 5, 111(2017).
  5. Ofek Shlomai, N., Deshpande, G., Rao, S., Patole, S. Probiotics for Preterm Neonates: What Will It Take to Change Clinical Practice? Neonatology. 105 (1), 64-70 (2014).
  6. Elazab, N., et al. Probiotic administration in early life, atopy, and asthma: a meta-analysis of clinical trials. Pediatrics. 132 (3), e666-e676 (2013).
  7. Arrieta, M. C., et al. Early infancy microbial and metabolic alterations affect risk of childhood asthma. Science Translational Medicine. 7 (307), 307ra152(2015).
  8. Arrieta, M. C., Walter, J., Finlay, B. B. Human Microbiota-Associated Mice: A Model with Challenges. Cell Host and Microbe. 19 (5), 575-578 (2016).
  9. Qi, F., et al. Combined effect of BCG vaccination and enriched environment promote neurogenesis and spatial cognition via a shift in meningeal macrophage M2 polarization. Journal of Neuroinflammation. 14 (1), 32(2017).
  10. Yang, J., et al. Neonatal BCG vaccination of mice improves neurogenesis and behavior in early life. Brain Research Bulletin. 120, 25-33 (2016).
  11. Deshmukh, H. S., et al. The microbiota regulates neutrophil homeostasis and host resistance to Escherichia coli K1 sepsis in neonatal mice. Nature Medicine. 20 (5), 524-530 (2014).
  12. Butchbach, M. E. R., Edwards, J. D., Schussler, K. R., Burghes, A. H. M. A novel method for oral delivery of drug compounds to the neonatal SMNDelta7 mouse model of spinal muscular atrophy. Journal of Neuroscience Methods. 161 (2), 285-290 (2007).
  13. Hickey, L., Garland, S. M., Jacobs, S. E., O’Donnell, C. P. F., Tabrizi, S. N. Cross-colonization of infants with probiotic organisms in a neonatal unit. Journal of Hospital Infection. 88 (4), 226-229 (2014).
  14. Costeloe, K., et al. A randomised controlled trial of the probiotic Bifidobacterium breve BBG-001 in preterm babies to prevent sepsis, necrotising enterocolitis and death: the Probiotics in Preterm infantS (PiPS) trial. Health Technology Assessment. 20 (66), 1-94 (2016).
  15. Kitajima, H., et al. Early administration of Bifidobacterium breve to preterm infants: randomised controlled trial. Archives of Disease In Childhood. Fetal and Neonatal Edition. 76 (2), F101-F107 (1997).
  16. Millar, M. R., Bacon, C., Smith, S. L., Walker, V., Hall, M. A. Enteral feeding of premature infants with Lactobacillus GG. Archives of Disease In Childhood. 69 ((5 Spec No)), 483-487 (1993).
  17. Preidis, G. A., et al. Probiotics stimulate enterocyte migration and microbial diversity in the neonatal mouse intestine. The FASEB Journal. 26 (5), 1960-1969 (2012).
  18. Kirjavainen, P. V., El-Nezami, H. S., Salminen, S. J., Ahokas, J. T., Wright, P. F. A. The effect of orally administered viable probiotic and dairy lactobacilli on mouse lymphocyte proliferation. FEMS Immunology & Medical Microbiology. 26 (2), 131-135 (1999).
  19. Gill, H. S., Rutherfurd, K. J. Viability and dose–response studies on the effects of the immunoenhancing lactic acid bacterium Lactobacillus rhamnosus in mice. British Journal of Nutrition. 86 (2), 285-289 (2001).
  20. Yu, Z., Morrison, M. Improved extraction of PCR-quality community DNA from digesta and fecal samples. BioTechniques. 36 (5), 808-812 (2004).
  21. Holland, J. L., Louie, L., Simor, A. E., Louie, M. PCR detection of Escherichia coli O157:H7 directly from stools: evaluation of commercial extraction methods for purifying fecal DNA. Journal of Clinical Microbiology. 38 (11), 4108-4113 (2000).
  22. Müller, A., et al. A powerful DNA extraction method and PCR for detection of microsporidia in clinical stool specimens. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 6 (2), 243-246 (1999).
  23. Pitcher, D. G., Saunders, N. A., Owen, R. J. Rapid extraction of bacterial genomic DNA with guanidium thiocyanate. Letters in Applied Microbiology. 8 (4), 151-156 (1989).
  24. Bollet, C., Gevaudan, M. J., de Lamballerie, X., Zandotti, C., de Micco, P. A simple method for the isolation of chromosomal DNA from gram positive or acid-fast bacteria. Nucleic Acids Research. 19 (8), 1955(1991).
  25. Thomas, C. M., Versalovic, J. Probiotics-host communication. Gut Microbes. 1 (3), 148-163 (2010).
  26. Tancredi, D. J. Probiotic prevents infections in newborns. Nature. 548 (7668), 404-405 (2017).
  27. Bernardo, W. M., et al. Effectiveness of Probiotics in the Prophylaxis of Necrotizing Enterocolitis in Preterm Neonates: A Systematic Review and Meta-analysis. Jornal de Pediatria. 89 (1), 18-24 (2013).
  28. Aceti, A., et al. Probiotics for prevention of necrotizing enterocolitis in preterm infants: systematic review and meta-analysis. Italian Journal of Pediatrics. 41 (1), 89(2015).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Gavage u noworodk w myszykolonizacja probiotykamigavage wewn trz prze ykowyekstrakcja DNA z jelitanaliza qPCRLactobacillus plantarumanaliza mikrobiomu jelitowegotechnika sterylnapost powanie ze zwierz tamikwantyfikacja kolonizacji
Badania probiotyczne na nowonarodzonych myszach z użyciem zgłębnika
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.