Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wykrywanie miejsc ubikwitynacji białek za pomocą wzbogacania peptydów i spektrometrii mas

9.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59079

⸱

23 marca 2020

 ,  , 
1Proteomics Center, Erasmus University Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

Prezentujemy metodę oczyszczania, wykrywania i identyfikacji peptydów diGly, które pochodzą z ubikwitynowanych białek ze złożonych próbek biologicznych. Przedstawiona metoda jest powtarzalna, solidna i przewyższa opublikowane metody pod względem poziomu szczegółowości analizy wszechobecności.

Streszczenie

Potranslacyjna modyfikacja białek przez małe białko ubikwityna jest zaangażowana w wiele zdarzeń komórkowych. Po tryptycznym trawieniu ubikwitynowanych białek, peptydy z pozostałością diglicyny sprzężonej z grupą aminową lizyny epsilon ("K-ε-diglicyna" lub po prostu "diGly") mogą być użyte do wyśledzenia pierwotnego miejsca modyfikacji. Skuteczne oczyszczanie immunologiczne peptydów diGly w połączeniu z czułym wykrywaniem za pomocą spektrometrii mas spowodowało ogromny wzrost liczby zidentyfikowanych do tej pory miejsc ubikwitynacji. Wprowadziliśmy kilka ulepszeń w tym przepływie pracy, w tym frakcjonowanie peptydów w odwróconej fazie offline o wysokim pH przed procedurą wzbogacania oraz włączenie bardziej zaawansowanych ustawień fragmentacji peptydów do wielopola routingu jonów. Ponadto bardziej efektywne oczyszczanie próbki za pomocą zatyczki opartej na filtrze w celu zatrzymania kulek przeciwciała skutkuje większą specyficznością dla peptydów diGly. Ulepszenia te skutkują rutynowym wykrywaniem ponad 23 000 peptydów diGly z lizatów komórek ludzkiego raka szyjki macicy (HeLa) po zahamowaniu proteasomu w komórce. Pokazujemy skuteczność tej strategii w dogłębnej analizie profili ubikwitinomu kilku różnych typów komórek oraz próbek in vivo, takich jak tkanka mózgowa. Badanie to stanowi oryginalny dodatek do zestawu narzędzi do analizy ubikwitynacji białek w celu odkrycia głęboko komórkowego ubikwitinomu.

Wprowadzenie

Koniugacja ubikwityny z białkami oznacza je do degradacji przez proteasom i jest kluczowym procesem w proteostazie. C-końcowa grupa karboksylowa ubikwityny tworzy wiązanie izopeptydowe z grupą lizynową ε-aminową docelowego białka1,2. Ponadto ubikwityna może być przyłączana do innych modułów ubikwityny, co powoduje tworzenie jednorodnych (tj. K48 lub K11) lub rozgałęzionych (tj. niejednorodnych lub mieszanych) struktur poliubikwityny1,3. Najbardziej znaną funkcją ubikwityny jest jej rola w degradacji proteasomalnej, w której pośredniczy poliubikwityna związana z K48. Stało się jednak jasne, że zarówno mono-, jak i poliubikwitynacja odgrywają również rolę w wielu procesach, które są niezależne od degradacji przez proteasom. Na przykład łańcuchy połączone z K63 odgrywają niedegradacyjną rolę w transporcie wewnątrzkomórkowym, degradacji lizosomalnej, sygnalizacji kinazy i odpowiedzi na uszkodzenie DNA4,5. Pozostałe sześć typów sprzężeń jest mniej licznych, a ich role są nadal w dużej mierze enigmatyczne, chociaż pojawiają się pierwsze wskazówki dotyczące ich funkcji w komórce, głównie z powodu rozwoju nowych narzędzi umożliwiających wykrywanie specyficzne dla sprzężenia6,7.

Spektrometria mas stała się nieodzownym narzędziem do analiz proteomów i obecnie tysiące różnych białek z praktycznie każdego źródła biologicznego można zidentyfikować w jednym eksperymencie. Dodatkową warstwę złożoności stanowią modyfikacje potranslacyjne (PTM) białek (np. fosforylacja, metylacja, acetylacja i ubikwitynacja), które mogą modulować aktywność białek. Identyfikacja białek zawierających PTM na dużą skalę stała się również możliwa dzięki postępom w dziedzinie spektrometrii mas. Stosunkowo niska stechiometria peptydów zawierających PTM w porównaniu z ich niezmodyfikowanymi odpowiednikami stanowi wyzwanie techniczne, a przed analizą spektrometrii mas na ogół konieczne są etapy wzbogacania biochemicznego. W ciągu ostatnich dwóch dekad opracowano kilka różnych specyficznych metod wzbogacania do analizy PTM.

Ze względu na wieloaspektowość roli ubikwitynacji białek w komórce, istnieje duże zapotrzebowanie na rozwój metod analitycznych do wykrywania miejsc ubikwitynacji na białkach8. Zastosowanie metod spektrometrii mas doprowadziło do eksplozji liczby zidentyfikowanych miejsc ubikwitynacji w białkach muszek owocowych, myszy, ludzi i drożdży9,10,11,12,13,14. Ważnym krokiem było opracowanie strategii wzbogacania opartych na immunoprecypitacji na poziomie peptydów z wykorzystaniem przeciwciał skierowanych przeciwko motywowi pozostałości K-ε-GG (określanemu również jako "diglicyna" lub "diGly"). Te peptydy diGly są wytwarzane podczas trawienia ubikwitynowanych białek przy użyciu trypsyny jako proteazy15,16.

Tutaj prezentujemy zoptymalizowany przepływ pracy do wzbogacania peptydów diGly za pomocą immunooczyszczania i późniejszej detekcji za pomocą spektrometrii mas Orbitrap. Korzystając z kombinacji kilku modyfikacji istniejących procesów pracy, zwłaszcza na etapie przygotowania próbki i spektrometrii mas, możemy teraz rutynowo zidentyfikować ponad 23 000 peptydów diGly z pojedynczej próbki komórek HeLa traktowanych inhibitorem proteasomu i ~10 000 z nieleczonych komórek HeLa. Zastosowaliśmy ten protokół do lizatów zarówno z nieznakowanych, jak i stabilnych izotopów znakowanych aminokwasami w hodowlach komórkowych (SILAC) znakowanych komórkami HeLa, a także do próbek endogennych, takich jak tkanka mózgowa.

Ten przepływ pracy stanowi cenne uzupełnienie repertuaru narzędzi do analizy miejsc ubikwitynacji w celu odkrycia głębokiego ubikwitinomu. Poniższy protokół szczegółowo opisuje wszystkie kroki przepływu pracy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania (EDC) Erasmus MC.

1. Przygotowanie próbki

  1. Hodowane komórki
    1. Wybierz interesującą Cię linię komórkową (np. HeLa lub komórki kostniakomięsaka [U2OS]) i hoduj komórki w pożywce Minimal Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionej 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 100 jednostkami/ml penicyliny/streptomycyny.
    2. W przypadku ilościowych eksperymentów proteomicznych, hodowla komórek w DMEM pozbawionych argininy i lizyny. Pożywkę należy uzupełnić 10% dializowaną płodową surowicą bydlęcą (FBS), 100 jednostek/ml penicyliny/streptomycyny i alaniną-glutaminą. Przygotuj dwa rodzaje pożywki, dodając konwencjonalną lizynę i argininę ("Light" Medium) lub lizynę-8 (13C6;15N2) i arginina-10 (13C6;15N4) ("Ciężki" Średni).
    3. Partie hodowli komórek w pożywce lekkiej (tj. nieznakowanej) i pożywce ciężkiej (tj. znakowanej, SILAC) przez co najmniej sześć podwojeń przed ekspansją i obróbką, aby upewnić się, że wszystkie białka w kulturze ciężkiej pożywki są znakowane ciężkim stabilnym izotopem zawierającym aminokwasy.
    4. Traktować komórki przez 8 godzin 10 μM inhibitora proteasomu bortezomibu lub równoważną objętością DMSO jako próbne leczenie. Umyj komórki PBS, zdysocjuj je za pomocą 1% trypsyny/EDTA i otul komórki.
    5. Poddać lizie osad komórkowy z jednej płytki hodowlanej o długości 150 cm2 na badane warunki w 2 ml lodowatego 50 mM Tris-HCl (pH = 8,2) z 0,5% deoksycholanem sodu (DOC). Gotować lizat w temperaturze 95 °C przez 5 minut i sonikować przez 10 minut (ustawienie "H" dla sonikatora wymienionego w Tabeli Materiałów) w temperaturze 4 °C. Nie zalecamy stosowania inhibitorów deubikwitynazy, takich jak N-etylomaleimid (NEM), ponieważ może to wprowadzić niepożądane modyfikacje białek, które mogą skomplikować identyfikację peptydów.
  2. Tkanka mózgowa myszy in vivo
    1. W przypadku stosowania tkanki in vivo należy poddać ją lizie w lodowatym buforze zawierającym 100 mM Tris-HCl (pH = 8,5), 12 mM DOC sodu i 12 mM N-lauroilosarkosynianu sodu17. Sonikować lizat przez 10 minut (ustawienie "H" dla sonikatora wymienionego w Tabeli Materiałów) w temperaturze 4 °C i gotować lizat przez 5 minut w temperaturze 95 °C.
  3. Określ ilościowo całkowitą ilość białka za pomocą zestawu do oznaczania białka BCA z absorbancją, metodą kolorymetryczną. Całkowita ilość białka powinna wynosić co najmniej kilka miligramów, aby zapewnić skuteczną immunoprecypitację peptydów diGly (IP). W eksperymentach SILAC należy zmieszać lekkie i ciężkie znakowane białka w stosunku 1:1 w oparciu o całkowitą ilość białka.
  4. Zredukować wszystkie białka za pomocą 5 mM 1,4-ditiotreitolu przez 30 minut w temperaturze 50 °C, a następnie alkilować je 10 mM jodoacetamidem przez 15 minut w ciemności. Przeprowadzić trawienie białka za pomocą Lys-C (stosunek enzymu do substratu 1:200) przez 4 godziny, a następnie trawienie przez noc trypsyną (stosunek enzymu do substratu 1:50) w temperaturze 30 °C lub w temperaturze pokojowej (RT).
  5. Dodać kwas trifluorooctowy (TFA) do strawionej próbki do końcowego stężenia 0,5% i odwirować próbkę przy 10 000 x g przez 10 minut w celu wytrącenia i usunięcia całego detergentu. Zebrać supernatant zawierający peptydy do późniejszego frakcjonowania.

2. Frakcjonowanie peptydów offline

  1. Użyć chromatografii C18 o wysokim pH z fazami odwróconymi (RP) z polimerowym materiałem fazy stacjonarnej (300 A, 50 μM; patrz Tabela Materiałów) załadowanym do pustego wkładu kolumnowego w celu frakcjonowania peptydów tryptycznych. Wielkość złoża fazy stacjonarnej musi być dostosowana do ilości trawionego białka, które ma być frakcjonowane. Przygotować pusty wkład kolumnowy o pojemności 6 ml (patrz Tabela materiałów) wypełniony 0,5 g materiału fazy stacjonarnej na ~10 mg trawienia białka. Stosunek trawienia białka do fazy stacjonarnej powinien wynosić około 1:50 (w/w).
  2. Załadować peptydy do przygotowanej kolumny i przemyć kolumnę około 10 objętościami kolumny 0,1% TFA, a następnie około 10 objętościami kolumnyH2O.
  3. Rozpuść peptydy na trzy frakcje z 10 objętościami kolumn 10 mM roztworu mrówczanu amonu (pH = 10) z odpowiednio 7%, 13,5% i 50% acetonitrylu (AcN). Liofilizuj wszystkie frakcje do kompletności.
  4. Użyj przeciwciał przeciwko motywowi resztki ubikwityny (K-ε-GG) sprzężonych z kulkami agarozowymi białka A w celu wzbogacenia immunologicznego peptydów diGly. Ponieważ dokładna ilość przeciwciał w partii kulek jest informacją zastrzeżoną i nie jest ujawniana przez producenta, zaleca się stosowanie tej samej definicji dla partii kulek, co producent, aby uniknąć nieporozumień. Umyj jedną partię tych kulek 2x PBS i podziel zawiesinę kulki na sześć równych frakcji. Zobacz Rysunek 1 dla szczegółowego schematu eksperymentalnego.
  5. Rozpuścić trzy frakcje peptydowe zebrane w kroku 2.3 w 1,4 ml buforu składającego się z 50 mM MOPS, 10 mM fosforanu sodu i 50 mM NaCl (pH = 7,2) i odwirować zanieczyszczenia.
  6. Dodać supernatanty frakcji do kulek przeciwciała dwupoziomowego i inkubować przez 2 godziny w temperaturze 4 °C na rotatorze. Odwirować kulki i przenieść supernatant do świeżej partii kulek przeciwciał i ponownie inkubować przez 2 godziny w temperaturze 4 °C.
  7. Przechowuj supernatanty do późniejszej globalnej analizy proteomu (GP).
  8. Przenieś kulki z każdej frakcji do końcówki do pipety o pojemności 200 μl wyposażonej w zatyczkę filtrującą GF/F, która zatrzymuje kulki. Umieść końcówkę pipety z koralikami w probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml wyposażonej w adapter końcówki wirówki. Przemyć kulki 3x 200 μl lodowatego buforu IAP, a następnie 3x 200 μl lodowatego miliQH 2O. Przed każdym etapem płukania należy odwirować kolumnę przy 200 x g przez 2 minuty, ale należy uważać, aby kolumna nie wyschła. Eluować peptydy za pomocą 2 cykli po 50 μl 0,15% TFA.
  9. Odsolić peptydy za pomocą końcówki do stopniowania C18 (zasadniczo końcówki pipety o pojemności 200 μl z dwoma krążkami C18) i wysuszyć je do pełnej konsystencji za pomocą wirowania próżniowego.

3. Nanoflow LC-MS/MS

  1. Wykonaj eksperymenty LC-MS/MS na czułym spektrometrze mas sprzężonym z nanoprzepływowym systemem LC.
  2. Użyj wewnętrznie wypełnionej 50 cm kolumny z odwróconymi fazami o średnicy wewnętrznej 75 μm, wypełnionej żywicą CSH130 (3,5 μm, 130 A) i eluuj peptydy o gradiencie 2−28% (AcN, 0,1% FA) przez 120 minut przy 300 nL/min. Alternatywnie użyj dostępnych na rynku kolumn LC o podobnych właściwościach. Utrzymuj kolumnę w temperaturze 50 °C za pomocą pieca kolumnowego, npample, (patrz Tabela materiałów).
  3. Wykonaj analizę spektrometrii mas.
    1. Spektrometr mas musi pracować w trybie akwizycji zależnej od danych (DDA). Widma masowe MS1 powinny być zbierane w wysokiej rozdzielczości (np. 120 000), z ustawieniem celu automatycznej kontroli wzmocnienia (AGC) na 4E5 i maksymalnym czasem wstrzykiwania 50 ms w przypadku spektrometru masowego Orbitrap.
    2. Najpierw wykonaj analizę spektrometrii mas w trybie "Najpierw najwyższa intensywność". W ten sposób najintensywniejszy jon jest wybierany najpierw do fragmentacji, następnie drugi co do wielkości i tak dalej, przy użyciu metody maksymalnej prędkości z całkowitym czasem cyklu wynoszącym 3 s. Następnie wykonaj drugą rundę analizy DDA MS w trybie "Najpierw najniższa intensywność", tak aby najpierw wybrany był jon o najmniejszej intensywności, a następnie drugi najniższy i tak dalej. Strategia ta zapewnia optymalne wykrywanie peptydów o bardzo niskiej liczebności.
    3. Filtruj jony prekursorowe zgodnie z ich stanami naładowania (2-7 ładunków) i monoizotopowym przypisaniem pików. Wykluczaj wcześniej badane prekursory dynamicznie przez 60 sekund. Wyizolować prekursory peptydów za pomocą kwadrupolowego filtra masowego ustawionego na szerokość 1,6 Th.
    4. Zbieraj widma MS2 w pułapce jonowej przy AGC 7E3 z maksymalnym czasem wtrysku 50 ms i energią zderzenia HCD wynoszącą 30%.

4. Analiza danych

  1. Analizuj surowe pliki spektrometrii mas za pomocą odpowiedniej wyszukiwarki, takiej jak bezpłatny pakiet oprogramowania MaxQuant oparty na wyszukiwarce Andromeda18,19. W MaxQuant wybierz ustawienia domyślne z kilkoma adaptacjami, które są wskazane poniżej. Ustaw specyficzność enzymatyczną na trypsynę, z maksymalną liczbą pominiętych rozszczepień zwiększoną do trzech. Ustaw lizynę z pozostałością diGly (+114,04 Da), utlenianie metioniny i N-końcową acetylację jako zmienne modyfikacje, a ustaw karbamidometylację cysteiny jako ustaloną modyfikację.
  2. Przeszukaj bazę danych w pliku FASTA zawierającym sekwencje białek pobrane na przykład z repozytorium Uniprot (https://www.uniprot.org/downloads) w połączeniu z wabikiem i standardową bazą danych wspólnych zanieczyszczeń, która jest automatycznie dostarczana przez MaxQuant. Ustaw współczynnik fałszywych wykryć (FDR) na 1% i ustaw minimalny wynik dla zmodyfikowanych peptydów (diGly) na 40 (wartość domyślna). Wykluczyć peptydy zidentyfikowane z C-końcową zmodyfikowaną cyfrowo modyfikowaną resztą lizyny z dalszej analizy.
  3. W przypadku analizy ilościowej plików eksperymentu SILAC ustaw liczebność na "2" i powtórz krok 4.2.
  4. Wykonuj wszystkie dalsze analizy (np. statystyczne, analizy ontologii genów) za pomocą modułu Perseus module20 pakietu oprogramowania MaxQuant.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Proteiny ubikwitynowane pozostawiają pozostałość diglicyny o masie 114,04 Da na resztach lizyny w białku docelowym po trawieniu białek trypsyną. Różnica masy spowodowana przez ten motyw została wykorzystana do jednoznacznego rozpoznania miejsca ubikwitynowania w eksperymencie z wykorzystaniem spektrometrii mas. Strategia opisana w niniejszym opracowaniu stanowi nowoczesną metodę wzbogacania i późniejszej identyfikacji peptydów diGly za pomocą nanoflow LC-MS/MS (Rycina...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisany tutaj protokół został zastosowany do próbek z różnych źródeł biologicznych, takich jak hodowane komórki i tkanki in vivo. We wszystkich przypadkach zidentyfikowaliśmy tysiące peptydów diGly, pod warunkiem, że całkowita ilość białka wynosiła co najmniej 1 mg. Wzbogacanie przy użyciu specyficznych przeciwciał jest bardzo wydajne, biorąc pod uwagę, że z lizatów całych komórek zidentyfikowano co najwyżej 100-150 bardzo mało obfitych peptydów diGly, jeśli nie zastosowano procedur wzbogacania ubikwitynowanych białek lu...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca jest częścią projektu "Proteins at Work", programu Holenderskiego Centrum Proteomiki finansowanego przez Holenderską Organizację Badań Naukowych (NWO) jako część National Roadmap Large-Scale Research Facilities (numer projektu 184.032.201).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1,4-DithioerythritolSigma-AldrichD8255
3M Empore C18 Octadecyl disksSupelco66883-Uprodukt wycofany z produkcji w Supelco; CDS Analytical to nowy producent (https://www.cdsanalytical.com/empore)
Żywicy im. mrówczanu amonuSigma-Aldrich70221
BortezomibUBPbio
CSH130, 3,5 μ m, 130 i Aring;Wody
Dimetylosulfotlenek (DMSO)Sigma-Aldrich34869
DMEMThermoFisher
EASY-nanoLC 1200ThermoFisher
FBSGibco
GF/F zatyczka filtraWhatman1825-021
JodoacetamidSigma-AldrichI6125
Lizyna, ArgininaSigma-Aldrich
Lizyna-8 (13C6; 15N2), arginina-10 (13C6; 15N4)Cambridge Isotope Laboratories
Lizylowa endopeptydaza (LysC)Wako Pure Chemicals129-02541
Konstrukcja MPI piekarnika NanoLC, MS Wil GmbH
Sól sodowa N-lauroilsarkozynySigma-AldrichL-5125
Spektrometr masowy Orbitrap Fusion LumosThermoFisher
Zestaw do oznaczania białek Pierce BCAThermoFisher / Pierce23225
PLRP-S (300 Å, 50 µ m) polimerowe cząstki o odwróconej fazieAgilent TechnologiesPL1412-2K01
PTMScan Ubiquitin Remnant Motif (K-ε-GG) KitCell Signaling Technologies5562
Sep-Pak tC18 6 cc Vac CartridgeWodyWAT036790Usuń materiał tC18 z wkładu przed napełnieniem wkładu PLRP-S
Deoksycholan soduSigma-Aldrich30970
Tris-baseSigma-AldrichT6066
Tris-HClSigma-AldrichT5941
Trypsyna, ThermoFisher z powłoką TPCK20233

Bibliografia

  1. Clague, M. J., Urbé, S. Ubiquitin: Same molecule, different degradation pathways. Cell. 143, 682-685 (2010).
  2. Ciechanover, A. The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway. Cell. 79 (1), 13-21 (1995).
  3. Ohtake, F., Tsuchiya, H. JB special review - Recent topics in ubiquitin-proteasome system and autophagy: The emerging complexity of ubiquitin architecture. Journal of Biochemistry. 161 (2), 125-133 (2017).
  4. Bergink, S., Jentsch, S. Principles of ubiquitin and SUMO modifications in DNA repair. Nature. 458 (7237), 461-467 (2009).
  5. Komander, D., Rape, M. The Ubiquitin Code. Annual Review of Biochemistry. 81 (1), 203-229 (2012).
  6. Michel, M. A., Swatek, K. N., Hospenthal, M. K., Komander, D. Ubiquitin Linkage-Specific Affimers Reveal Insights into K6-Linked Ubiquitin Signaling. Molecular Cell. 68 (1), 233-246 (2017).
  7. Swatek, K. N., et al. Insights into ubiquitin chain architecture using Ub-clipping. Nature. 572, 533-537 (2019).
  8. Peng, J., et al. A proteomics approach to understanding protein ubiquitination. Nature Biotechnology. 21 (8), 921-926 (2003).
  9. Wagner, S. A., et al. Proteomic Analyses Reveal Divergent Ubiquitylation Site Patterns in Murine Tissues. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (12), 1578-1585 (2012).
  10. Iesmantavicius, V., Weinert, B. T., Choudhary, C. Convergence of Ubiquitylation and Phosphorylation Signaling in Rapamycin-treated Yeast Cells. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (8), 1979-1992 (2014).
  11. Elia, A. E. H., et al. Quantitative Proteomic Atlas of Ubiquitination and Acetylation in the DNA Damage Response. Molecular Cell. 59 (5), 867-881 (2015).
  12. Wagner, S. A., et al. A Proteome-wide, Quantitative Survey of In Vivo Ubiquitylation Sites Reveals Widespread Regulatory Roles. Molecular & Cellular Proteomics. 10 (10), M111.013284(2011).
  13. Udeshi, N. D., et al. Methods for Quantification of in vivo Changes in Protein Ubiquitination following Proteasome and Deubiquitinase Inhibition. Molecular & Cellular Proteomics. 11, 148-159 (2012).
  14. Sap, K. A., Bezstarosti, K., Dekkers, D. H., Voets, O., Demmers, J. A. Quantitative proteomics reveals extensive remodeling of the ubiquitinome after perturbation of the proteasome by dsRNA mediated subunit knockdown. Journal of Proteome Research. 16 (8), 2848-2862 (2017).
  15. Xu, G., Paige, J. S., Jaffrey, S. R. Global analysis of lysine ubiquitination by ubiquitin remnant immunoaffinity profiling. Nature Biotechnology. 28 (8), 868-873 (2010).
  16. Kim, W., et al. Systematic and quantitative assessment of the ubiquitin-modified proteome. Molecular Cell. 44 (2), 325-340 (2011).
  17. Wakabayashi, M., et al. Phosphoproteome analysis of formalin-fixed and paraffin-embedded tissue sections mounted on microscope slides. Journal of Proteome Research. 13 (2), 915-924 (2014).
  18. Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).
  19. Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).
  20. Tyanova, S., et al. The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nature Methods. 13 (June), 731-740 (2016).
  21. Rose, C. M., et al. Highly Multiplexed Quantitative Mass Spectrometry Analysis of Ubiquitylomes. Cell Systems. 3 (4), 395-403 (2016).
  22. Kaiser, S. E., et al. Protein standard absolute quantification (PSAQ) method for the measurement of cellular ubiquitin pools. Nature Methods. 8 (8), 691-696 (2011).
  23. Van Der Wal, L., et al. Improvement of ubiquitylation site detection by Orbitrap mass spectrometry. Journal of Proteomics. (July), (2017).
  24. Nielsen, M. L., et al. Iodoacetamide-induced artifact mimics ubiquitination in mass spectrometry. Nature Methods. 5 (6), 459-460 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Wykrywanie peptyd w DiGlyfrakcjonowanie przy wysokim pHanaliza LC MS MSimmunopuryfikacjaustawienia Orbitraplizaty kom rek HeLapr bki tkanki m zgowej
Wykrywanie miejsc ubikwitynacji białek za pomocą wzbogacania peptydów i spektrometrii mas
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.