CRISPR-Cas to potężna technologia do inżynierii złożonych genomów roślin i zwierząt. W tym miejscu szczegółowo opisujemy protokół skutecznej edycji ludzkiego genomu przy użyciu różnych endonukleaz Cas. Zwracamy uwagę na ważne kwestie i parametry projektowe, aby zoptymalizować wydajność edycji.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Edycja genomu w liniach komórkowych ssaków przy użyciu CRISPR-Cas
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
System CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) funkcjonuje naturalnie w bakteryjnej odporności adaptacyjnej, ale został z powodzeniem wykorzystany do inżynierii genomu w wielu różnych organizmach żywych. Najczęściej endonukleaza 9 (Cas9) lub Cas12a związana z CRISPR typu dzikiego jest używana do rozszczepiania określonych miejsc w genomie, po czym dwuniciowe pęknięcie DNA jest naprawiane za pośrednictwem szlaku niehomologicznego łączenia końców (NHEJ) lub szlaku naprawy kierowanej homologią (HDR) w zależności od tego, czy szablon dawcy jest odpowiednio nieobecny, czy obecny. Do tej pory wykazano, że systemy CRISPR pochodzące od różnych gatunków bakterii są zdolne do edycji genomu w komórkach ssaków. Jednak pomimo pozornej prostoty technologii, należy wziąć pod uwagę wiele parametrów projektowych, które często pozostawiają użytkowników w zakłopotaniu, jak najlepiej przeprowadzić eksperymenty z edycją genomu. W tym miejscu opisujemy kompletny przepływ pracy od projektu eksperymentalnego do identyfikacji klonów komórkowych, które zawierają pożądane modyfikacje DNA, w celu ułatwienia pomyślnego przeprowadzenia eksperymentów z edycją genomu w liniach komórkowych ssaków. Zwracamy uwagę na kluczowe kwestie, na które użytkownicy powinni zwrócić uwagę, w tym wybór systemu CRISPR, długość przekładki i projekt jednoniciowego szablonu dawcy oligodeoksynukleotydu (ssODN). Przewidujemy, że ten przepływ pracy będzie przydatny w badaniach nad nokautem genów, modelowaniu chorób lub generowaniu reporterowych linii komórkowych.
Wprowadzenie
Zdolność do edycji genomu każdego organizmu żywego znajduje wiele zastosowań biomedycznych i biotechnologicznych, takich jak korekcja mutacji wywołujących choroby, tworzenie precyzyjnych modeli komórkowych do badań nad chorobami czy generowanie upraw rolniczych o pożądanych cechach. Od początku stulecia opracowano różne technologie inżynierii genomu w komórkach ssaków, w tym meganukleazy1,2,3, nukleazy z palcem cynkowym4,5 oraz nukleazy z efektorami podobnymi do aktywatorów transkrypcji (TALENs)6
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Projektowanie sgRNA
- Wybierz odpowiedni system CRISPR-Cas.
- Po pierwsze, sprawdź region docelowy pod kątem sekwencji PAM wszystkich nukleaz Cas9 i Cas12a, które wykazały funkcjonalność w komórkach ssaków16,21-32. Pięć często stosowanych enzymów wraz z ich odpowiednimi sekwencjami PAM przedstawiono w Tabeli 1.
UWAGA: Poza endonukleazami wymienionymi w Tabeli 1, istnieją inne, rzadziej stosowane enzymy Cas, które również zostały z powodzeniem wykorzystane w komórkach ssaków, takie jak nukleaza Cas9 z Streptococcus thermophilus (St1Cas9), która rozpoznaje PAM NNAGAAW. Jeśli pożądane miej....
- Po pierwsze, sprawdź region docelowy pod kątem sekwencji PAM wszystkich nukleaz Cas9 i Cas12a, które wykazały funkcjonalność w komórkach ssaków16,21-32. Pięć często stosowanych enzymów wraz z ich odpowiednimi sekwencjami PAM przedstawiono w Tabeli 1.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Aby przeprowadzić eksperyment edycji genomu, należy sklonować plazmid CRISPR wykazujący ekspresję sgRNA skierowanego do badanego locus. W pierwszej kolejności plazmid jest trawiony enzymem restrykcyjnym (zazwyczaj enzymem typu IIs) w celu jego linearyzacji. Zaleca się rozdzielenie produktu trawienia w 1% żelu agarozowym wraz z nietrawionym plazmidem, aby odróżnić trawienie całkowite od częściowego. Ponieważ nietrawione plazmidy są superzwinięte, mają one tendencję do szybszej migracji niż ich liniowe odpowiedniki (patrz .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
System CRISPR-Cas to potężna, rewolucyjna technologia inżynierii genomów i transkryptomów roślin i zwierząt. Stwierdzono, że wiele gatunków bakterii zawiera systemy CRISPR-Cas, które mogą być potencjalnie przystosowane do celów inżynierii genomu i transkryptomu44. Chociaż endonukleaza Cas9 ze Streptococcus pyogenes (SpCas9) była pierwszym enzymem, który został z powodzeniem zastosowany w komórkach ludzkich 21,22,23,24, wykazano również, że enzymy z innych gatunków bakterii, w tym te pokaz.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
M.H.T. jest wspierany przez grant Biura Wspólnej Rady Agencji ds. Nauki, Technologii i Badań (1431AFG103), grant Narodowej Rady Badań Medycznych (OFIRG/0017/2016), granty National Research Foundation (NRF2013-THE001-046 i NRF2013-THE001-093), grant Ministerstwa Edukacji Tier 1 (RG50/17 (S)), grant na rozpoczęcie działalności z Uniwersytetu Technologicznego Nanyang oraz fundusze na konkurs International Genetically Engineering Machine (iGEM) od Nanyang Technological Uniwersytet.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Kinaza polinukleotydowa T4 (PNK) | NEB | M0201 | |
| Fosfataza alkaliczna krewetek (rSAP) | NEB | M0371 | |
| Bufor tris-octano-EDTA (TAE), 50X | 1st Base | BUF-3000-50X4L | Rozcieńczyć do 1X przed użyciem. Roztwór 1X zawiera 40 mM Tris, 20 mM kwasu octowego i 1 mM EDTA. |
| Bufor Tris-EDTA (TE), 10X | 1st Base | BUF-3020-10X4L | Rozcieńczyć do 1X przed użyciem. Roztwór 1X zawiera 10 mM Tris (pH 8,0) i 1 mM EDTA. |
| BbsI | NEB | R0539 | |
| BsmBI | NEB | R0580 | |
| T4 Ligaza DNA | NEB | M0202 | 400 000 jednostek/ml |
| Zestaw do szybkiego ligowania | NEB | M2200 | Alternatywa dla ligazy DNA T4. |
| Zestaw do szybkiej ligacji DNA | Thermo Scientific | K1423 | Alternatywa dla ligazy DNA T4. |
| Zestaw do klonowania Zero Blunt TOPO PCR | Thermo Scientific | 451245 | Roztwór soli jest dostarczany z wektorem TOPO w zestawie. |
| NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix | NEB | E2621L | Zestaw do montażu Gibsona. |
| One Shot Stbl3 Chemicznie kompetentny bulion E.Coli | Thermo Scientific | C737303 | |
| LB (Lennox), proszek | Sigma Aldrich | L3022 | Rozpuszcza w ddH20 i autoklaw przed użyciem |
| Bulion z agarem (Lennox), proszek | Sigma Aldrich | L2897 | Rozpuszcza w ddH20 i autoklaw przed użyciem |
| SOC | - | 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM glukozy w 1 l bulionu LB | |
| Ampicylina (sód), USP | Grade Gold Biotechnology | A-301 | |
| REDiant 2X PCR Mastermix | 1st Base | BIO-5185 | |
| Agaroza | 1st Base | BIO-1000 | |
| T7 Endonukleaza I | NEB | M0302 | |
| Zestaw miniprep do ekstrakcji plazmidowego DNA | Favorgen | FAPDE 300 | |
| Zmodyfikowana pożywka Dulbecco's Eagle (DMEM), hyklon o wysokiej zawartości glukozy | SH30081,01 | 4,5 g / l glukozy, bez L-glutaminy, HEPES i pirogronianu sodu | |
| L-glutamina, 200mM | Gibco | 25030 | |
| Penicylina-Streptomycyna, 10, 000U/ml | Gibco | 15140 | |
| 0,25% trypsyna-EDTA, 1X | Gibco | 25200 | |
| Bydło płodowe Serum | Hyclone | SV30160 | FBS jest inaktywowane termicznie przed użyciem w temperaturze 56 oC przez 30 minut |
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanami, 1X | odczynnik | 20012 | |
| jetPRIME | Polyplus Transfection | 114-75 | |
| Roztwór do ekstrakcji DNA QuickExtract, 1,0 | Epicentrum | LUCG-QE09050 | |
| Zestaw do genomowego DNA ISOLATE II | Bioline | BIO-52067 | Alternatywa dla QuickExtract |
| Q5 High-Fidelity DNA Polymeraza | NEB | M0491 | |
| Deoxynukleotyd (dNTP) Mieszanina roztworów | NEB | N0447 | |
| 6X Barwnik ładujący DNA | Thermo Scientific | R0611 | 10 mM Tris-HCl (pH 7,6) 0,03% błękitu bromofenolowego, 0,03% cyjanolu ksylenu FF, 60% glicerolu, 60 mM |
| Koktajl inhibitorów proteazy EDTA, Set3 | Merck | ||
| Membrana nitrocelulozowa, 0,2 i mikro; m | Bio-Rad | 1620112 | |
| Bufor Tris-glycine-SDS, 10X | Bio-Rad | 1610772 | Rozcieńczyć do 1X przed użyciem. Roztwór 1x zawiera 25 mM Tris, 192 mM glicyny i 0,1% SDS. |
| Bufor tris-glicynowy, 10X | 1st base | BUF-2020 | Rozcieńczyć do 1X przed użyciem. Roztwór 1x zawiera 25 mM Tris i 192 mM glicyny. |
| Ponceau S roztwór | Sigma Aldrich | P7170 | |
| TBS, 20X | 1st base | BUF-3030 | Rozcieńczyć do 1X przed użyciem. 1x roztwór zawiera 25 mM Tris-HCl (pH 7,5) i 150 mM NaCl. |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 | |
| Odtłuszczone mleko do testu immunologicznego | Nacalai Tesque | 31149-75 | |
| WesternBright Sirius-femtogram HRP | Advansta | K12043 | |
| Przeciwciało dla β-aktyny (C4) | Santa Cruz Biotechnology | sc-47778 | Numer partii: C0916 |
| System MiSeq | Illumina | SY-410-1003 | |
| Spektrofotometr NanoDrop | Thermo Scientific | ND-2000 | |
| Fluorometr kubitowy | Thermo Scientific | Q33226 | |
| EVOS FL System obrazowania komórek | Thermo Scientific | AMF4300 | |
| Plazmid CRISPR: pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) | Addgene | 48138 | System pojedynczego wektora: gRNA ulega ekspresji z tego samego plazmidu. |
| Plazmid CRISPR: pX601-AAV-CMV::NLS-SaCas9-NLS-3xHA-bGHpA | Addgene | 61591 | System pojedynczego wektora: gRNA ulega ekspresji z tego samego plazmidu. |
| Plazmid CRISPR: xCas9 3.7 | Addgene | 108379 | System podwójnego wektora: gRNA ulega ekspresji z innego plazmidu. |
| Plazmid CRISPR: pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9 | Addgene | 42230 | System pojedynczych wektorów: gRNA ulega ekspresji z tego samego plazmidu. |
| Plazmid CRISPR: hCas9 | Addgene | 41815 | System podwójnego wektora: gRNA ulega ekspresji z innego plazmidu. |
| Plazmid CRISPR: eSpCas9(1.1) | Addgene | 71814 | System pojedynczego wektora: gRNA ulega ekspresji z tego samego plazmidu. |
| Plazmid CRISPR: VP12 (SpCas9-HF1) | Addgene | 72247 | System dwuwektorowy: gRNA ulega ekspresji z innego plazmidu. |
Bibliografia
- Epinat, J. C., et al. A novel engineered meganuclease induces homologous recombination in yeast and mammalian cells. Nucleic Acids Research. 31 (11), 2952-2962 (2003).
- Arnould, S., et al.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
