Artykuł metodologiczny

Edycja genomu w liniach komórkowych ssaków przy użyciu CRISPR-Cas

DOI:

10.3791/59086

⸱

11 kwietnia 2019

 ,  ,  , 
1Genome Institute of Singapore, Agency for Science Technology and Research, 2School of Chemical and Biomedical Engineering, Nanyang Technological University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CRISPR-Cas to potężna technologia do inżynierii złożonych genomów roślin i zwierząt. W tym miejscu szczegółowo opisujemy protokół skutecznej edycji ludzkiego genomu przy użyciu różnych endonukleaz Cas. Zwracamy uwagę na ważne kwestie i parametry projektowe, aby zoptymalizować wydajność edycji.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

System CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) funkcjonuje naturalnie w bakteryjnej odporności adaptacyjnej, ale został z powodzeniem wykorzystany do inżynierii genomu w wielu różnych organizmach żywych. Najczęściej endonukleaza 9 (Cas9) lub Cas12a związana z CRISPR typu dzikiego jest używana do rozszczepiania określonych miejsc w genomie, po czym dwuniciowe pęknięcie DNA jest naprawiane za pośrednictwem szlaku niehomologicznego łączenia końców (NHEJ) lub szlaku naprawy kierowanej homologią (HDR) w zależności od tego, czy szablon dawcy jest odpowiednio nieobecny, czy obecny. Do tej pory wykazano, że systemy CRISPR pochodzące od różnych gatunków bakterii są zdolne do edycji genomu w komórkach ssaków. Jednak pomimo pozornej prostoty technologii, należy wziąć pod uwagę wiele parametrów projektowych, które często pozostawiają użytkowników w zakłopotaniu, jak najlepiej przeprowadzić eksperymenty z edycją genomu. W tym miejscu opisujemy kompletny przepływ pracy od projektu eksperymentalnego do identyfikacji klonów komórkowych, które zawierają pożądane modyfikacje DNA, w celu ułatwienia pomyślnego przeprowadzenia eksperymentów z edycją genomu w liniach komórkowych ssaków. Zwracamy uwagę na kluczowe kwestie, na które użytkownicy powinni zwrócić uwagę, w tym wybór systemu CRISPR, długość przekładki i projekt jednoniciowego szablonu dawcy oligodeoksynukleotydu (ssODN). Przewidujemy, że ten przepływ pracy będzie przydatny w badaniach nad nokautem genów, modelowaniu chorób lub generowaniu reporterowych linii komórkowych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zdolność do inżynierii genomu dowolnego żywego organizmu ma wiele zastosowań biomedycznych i biotechnologicznych, takich jak korekta mutacji powodujących choroby, budowa dokładnych modeli komórkowych do badań nad chorobami, czy generowanie upraw rolnych o pożądanych cechach. Od przełomu wieków opracowano różne technologie inżynierii genomu w komórkach ssaków, w tym meganukleazy1,2,3, nukleazy palców cynkowych4,5, lub aktywatory transkrypcji podobne do efektorów nukleazy (TALENs)6,7,8,9. Jednak te wcześniejsze technologie są albo trudne do zaprogramowania, albo żmudne w montażu, co utrudnia ich powszechne zastosowanie w badaniach i przemyśle.

W ostatnich latach system CRISPR-associated (Cas) z regularnie rozmieszczonymi krótkimi powtórzeniami palindromicznymi (CRISPR) stał się nową potężną technologią inżynierii genomu10,11. Pierwotnie był to adaptacyjny układ odpornościowy u bakterii, ale został z powodzeniem wykorzystany do modyfikacji genomu roślin i zwierząt, w tym ludzi. Głównym powodem, dla którego CRISPR-Cas zyskał tak dużą popularność w tak krótkim czasie, jest to, że elementem, który przenosi kluczową endonukleazę Cas, taką jak Cas9 lub Cas12a (znaną również jako Cpf1), do właściwego miejsca w genomie, jest po prostu krótki fragment chimerycznego pojedynczego przewodnika RNA (sgRNA), który jest prosty do zaprojektowania i tani w syntezie. Po rekrutacji do miejsca docelowego, enzym Cas działa jak para molekularnych nożyczek i rozszczepia związane DNA za pomocą swoich domen RuvC, HNH lub Nuc12,13,14. Powstałe w ten sposób pęknięcie dwuniciowe (DSB) jest następnie naprawiane przez komórki za pośrednictwem szlaku niehomologicznego łączenia końców (NHEJ) lub naprawy ukierunkowanej na homologię (HDR). W przypadku braku matrycy naprawczej, DSB jest naprawiany przez podatny na błędy szlak NHEJ, który może powodować pseudolosową insercję lub delecję nukleotydów (indeli) w miejscu cięcia, potencjalnie powodując mutacje przesunięcia ramki w genach kodujących białka. Jednak w obecności matrycy dawcy, która zawiera pożądane zmiany DNA, DSB jest naprawiany przez szlak HDR o wysokiej wierności. Typowe typy matryc dawców obejmują jednoniciowe oligonukleotydy (ssODN) i plazmidy. Pierwsza z nich jest zwykle stosowana, jeśli zamierzone zmiany w DNA są małe (na przykład zmiana pojedynczej pary zasad), podczas gdy druga jest zwykle stosowana, jeśli chce się wprowadzić stosunkowo długą sekwencję (na przykład sekwencję kodującą białko zielonej fluorescencji lub GFP) do locus docelowego.

Aktywność endonukleazy białka Cas wymaga obecności motywu sąsiadującego z protospacer (PAM) w miejscu docelowym15. PAM Cas9 znajduje się na końcu 3' protospaceru, podczas gdy PAM Cas12a (zwany również Cpf1) znajduje się na końcu 5' zamiast tego16. Kompleks Cas-guide RNA nie jest w stanie wprowadzić DSB, jeśli PAM jest nieobecny17. W związku z tym PAM nakłada ograniczenia na lokalizacje genomu, w których dana nukleaza Cas jest w stanie się rozszczepić. Na szczęście nukleazy Cas z różnych gatunków bakterii zazwyczaj wykazują różne wymagania dotyczące PAM. W związku z tym, integrując różne systemy CRISPR-Cas z naszym zestawem narzędzi inżynieryjnych, możemy rozszerzyć zakres miejsc, które mogą być celem w genomie. Co więcej, naturalny enzym Cas może zostać zmodyfikowany lub wyewoluowany w celu rozpoznawania alternatywnych sekwencji PAM, co jeszcze bardziej poszerza zakres celów genomowych dostępnych do manipulacji18,19,20.

Chociaż wiele systemów CRISPR-Cas jest dostępnych do celów inżynierii genomu, większość użytkowników tej technologii polegała głównie na nukleazie Cas9 ze Streptococcus pyogenes (SpCas9) z wielu powodów. Po pierwsze, wymaga stosunkowo prostego PAM NGG, w przeciwieństwie do wielu innych białek Cas, które mogą się rozszczepiać tylko w obecności bardziej złożonych PAM. Po drugie, jest to pierwsza endonukleaza Cas, która została pomyślnie wdrożona w komórkach ludzkich21,22,23,24. Po trzecie, SpCas9 jest zdecydowanie najlepiej scharakteryzowanym enzymem do tej pory. Jeśli badacz chce użyć innej nukleazy Cas, często nie ma jasności co do tego, jak najlepiej zaprojektować eksperyment i jak dobrze inne enzymy będą działać w różnych kontekstach biologicznych w porównaniu ze SpCas9.

Aby zapewnić przejrzystość względnej wydajności różnych systemów CRISPR-Cas, niedawno przeprowadziliśmy systematyczne porównanie pięciu endonukleaz Cas - SpCas9, enzymu Cas9 ze Staphylococcus aureus (SaCas9), enzymu Cas9 z Neisseria meningitidis (NmCas9), enzymu Cas12a z Acidaminococcus sp. BV3L6 (AsCas12a) oraz enzymu Cas12a z bakterii Lachnospiraceae ND2006 (LbCas12a)25. Aby uzyskać uczciwe porównanie, oceniliśmy różne nukleazy Cas przy użyciu tego samego zestawu miejsc docelowych i innych warunków eksperymentalnych. W badaniu określono również parametry projektowe dla każdego systemu CRISPR-Cas, które posłużą jako użyteczny punkt odniesienia dla użytkowników tej technologii. Tutaj, aby umożliwić naukowcom lepsze wykorzystanie systemu CRISPR-Cas, udostępniamy protokół krok po kroku do optymalnej inżynierii genomu z różnymi enzymami Cas9 i Cas12a (patrz Rysunek 1). Protokół zawiera nie tylko szczegóły eksperymentalne, ale także ważne rozważania projektowe, aby zmaksymalizować prawdopodobieństwo pomyślnego wyniku inżynierii genomu w komórkach ssaków.

Diagram procesu edycji genów CRISPR; Projektowanie sgRNA, klonowanie plazmidów, transdukcja komórek, badania przesiewowe klonów
Rysunek 1: Przegląd procesu generowania linii komórek ludzkich edytowanych pod kątem genomu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Projektowanie sgRNA

  1. Wybierz odpowiedni system CRISPR-Cas.
    1. Najpierw sprawdź region docelowy pod kątem sekwencji PAM wszystkich nukleaz Cas9 i Cas12a, które, jak wykazano, działają w komórkach ssaków16,21-32. W tabeli 1 podano pięć często stosowanych enzymów wraz z odpowiadającymi im PAMami.
      UWAGA: Oprócz endonukleaz wymienionych w Tabeli 1 istnieją inne, rzadziej stosowane enzymy Cas, które zostały z powodzeniem wdrożone również w komórkach ssaków, takie jak nukleaza Cas9 ze Streptococcus thermophilus (St1Cas9), która rozpoznaje PAM NNAGAAW. Jeśli pożądane miejsce docelowe nie zawiera znanego PAM, nie będzie można użyć systemu CRISPR-Cas do inżynierii genomu.
    2. Po drugie, należy wziąć pod uwagę wszelkie znane właściwości docelowego locus lub genu genomowego. Niektóre właściwości, które należy wziąć pod uwagę, obejmują poziomy ekspresji genów lub dostępność chromatyny oraz to, czy istnieją również inne blisko spokrewnione sekwencje.
      UWAGA: Niektóre enzymy są lepiej przystosowane do określonych kontekstów biologicznych. Na przykład, aby edytować powtarzający się locus genomowy lub gen z kilkoma innymi bliskimi paralogami, zaleca się użycie AsCas12a (ze względu na niższą tolerancję na niezgodności między sgRNA a docelowym DNA niż SpCas9 i LbCas12a) lub SaCas9 (ze względu na wymóg dłuższych odstępów, co zapewnia wyższą swoistość docelową)25.
Endonukleaza Cas Pam Optymalna długość podkładki dystansowej SpCas9 powiedział: Organizacja NGG 17-22 NT włącznie Dysk SaCas9 powiedział: NNGRRT powiedział: ≥ 21 nt Protokół NmCas9 powiedział: NNNNGATT powiedział: ≥ 19 nt AsCas12a oraz LbCas12a Telewizja TTTV ≥ 19 nt

Tabela 1: Niektóre powszechnie używane enzymy Cas z ich pokrewnymi PAM i optymalnymi długościami sgRNA. N = dowolny nukleotyd (A, T, G lub C); R = A lub G; V = A, C lub G.

  1. Wybierz odpowiednią sekwencję przekładek. Zidentyfikuj jak najbardziej unikalną sekwencję, aby zminimalizować ryzyko zdarzeń rozszczepienia poza celem, badając genom docelowy za pomocą BLAST33 lub korzystając z kilku bezpłatnych narzędzi online, takich jak: (a) Program z laboratorium Feng Zhanga34 (http://crispr.mit.edu/); (b) CHOPCHOP35 (http://chopchop.cbu.uib.no/); (c) E-CRISP36 (http://www.e-crisp.org/E-CRISP/); (d) CRISPOR37 (http://crispor.tefor.net/); (e) Cas-OFFinder38 (http://www.rgenome.net/cas-offinder/).
    UWAGA: Optymalna długość przekładki może wynosić od 17 do 25 nukleotydów (nt) włącznie, w zależności od użytego enzymu Cas (patrz tabela 1). W przypadku Cas9 element dystansowy znajduje się przed PAM, podczas gdy w przypadku Cas12a element dystansowy znajduje się za PAM. Ponadto wydajność HDR gwałtownie spada wraz ze wzrostem odległości od miejsca cięcia. Dlatego, aby uzyskać precyzyjną edycję DNA, umieść sgRNA jak najbliżej zamierzonego miejsca modyfikacji.
  2. Zsyntetyzuj oligonukleotydy DNA z odpowiednimi zwisami dla używanego plazmidu CRISPR.
    1. Dodaj nukleotyd G przed przekładką, jeśli pierwsza pozycja prowadnicy nie jest G. Określ odwrotną sekwencję komplementarną przekładki. Dodaj niezbędne zwisy do celów klonowania.
      UWAGA: Tytułem ilustracji, dla plazmidów użytych w naszym badaniu ewaluacyjnym25, oligonukleotydy, które mają być syntetyzowane, przedstawiono w tabeli 2. W razie potrzeby skorzystaj z przykładu podanego w Rysunek 2 jako przewodnika. Wiele plazmidów CRISPR jest dostępnych ze źródeł komercyjnych (np. Addgene). Niektóre z bardziej popularnych plazmidów podano w Tabeli materiałów.
Plazmid CRISPR kolejność pSpCas9 i pSaCas9 Sens: 5' - CACC(G)NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN - 3'
Antysens: 3' - (C)NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA - 5' pNmCas9 powiedział: Sens: 5' - CACC(G)NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN - 3'
Antysens: 3' - (C)NNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAC - 5' pAsCas12a oraz pLbCas12a Sens: 5' - AGATNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN - 3'
Antysens: 3' - NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAAAA - 5'

Tabela 2: Oligonukleotydy wymagane do klonowania sekwencji sgRNA na plazmidy CRISPR użyte w niedawnym badaniu ewaluacyjnym25. Zwisy są zaznaczone kursywą.

Diagram edycji genów CRISPR, celowanie w eksony, sekwencje oligonukleotydowe, SpCas9, porównanie SaCas9.
Rysunek 2: Przykład ilustrujący, jak wybrać miejsca docelowe i zaprojektować oligonukleotydy do klonowania na plazmidy CRISPR. Docelowym locus genomowym jest tutaj ekson 45 ludzkiego genu CACNA1D. PAM dla SpCas9 i SaCas9 to odpowiednio NGG i NNGRRT i są wyróżnione na czerwono, podczas gdy PAM dla AsCas12a i LbCas12a to TTTN i są podświetlone na zielono. Czerwony poziomy pasek wskazuje protodystans dla SpCas9 i SaCas9, podczas gdy zielony poziomy pasek wskazuje protodystans dla dwóch enzymów Cas12a. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Klonowanie oligonukleotydów do wektora szkieletowego

  1. Oligonukleotydy fosforylowane i wyżarzane oraz antysensowne.
    1. Jeżeli oligonukleotydy są liofilizowane, należy je ponownie zawiesić do stężenia 100 μM w kwasie tris-etylenodiaminotetraoctowym (EDTA) (bufor TE, patrz tabela materiałów) lub ddH2O.
    2. Przygotować 10 μl mieszaniny reakcyjnej zawierającej 1 μl oligonukleotydu sensownego, 1 μl oligonukleotydu antysensownego, 1 μl buforu ligazy DNA T4 (10x), 1 μl kinazy polinukleotydowej T4 (PNK) i 6 μl ddH2O. Dobrze wymieszać pipetując i umieścić mieszaninę reakcyjną w termocyklerze, stosując następujące parametry: 37 °C przez 30 min, 95 °C przez 5 min i zmniejszać do 25 °C przy 6 °C/min.
    3. Rozcieńczyć mieszaninę reakcyjną w stosunku 1:100 w ddH2O (np. 2 μl mieszaniny reakcyjnej + 198 μl ddH2O).

Diagram plazmidowy CRISPR z sekwencjami genów, starterami do edycji DNA, analizą mapy wektorowej.
Rysunek 3: Przykład plazmidu CRISPR. (a) Mapa wskazująca różne ważne cechy plazmidu. W tym przypadku promotor EF-1a napędza ekspresję Cas9, podczas gdy promotor U6 napędza ekspresję sgRNA. Amp(R) wskazuje na gen oporności na ampicylinę w plazmidzie. (b) Sekwencja "miejsca klonowania BbsI-BplI" w plazmidzie. Sekwencja rozpoznawania BbsI to GAAGAC i jest oznaczona kolorem czerwonym, podczas gdy sekwencja rozpoznawania BplI to GAG-N5-CTC i jest oznaczona kolorem zielonym. (c) Startery, które można wykorzystać do PCR kolonii w celu sprawdzenia, czy sekwencja sgRNA została pomyślnie sklonowana do plazmidu. Starter hU6_forward jest oznaczony fioletową strzałką na mapie plazmidowej, podczas gdy uniwersalny starter M13R(-20) jest oznaczony różową strzałką na mapie plazmidowej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Trawić plazmid CRISPR za pomocą odpowiedniego enzymu restrykcyjnego.
    UWAGA: Klonowanie sgRNA zazwyczaj opiera się na połączeniu Golden Gate z enzymami restrykcyjnymi typu II. Różne enzymy mogą być używane do różnych plazmidów CRISPR. Dla pSpCas9 użyj BbsI lub BplI (patrz Rysunek 3). Dla pSaCas9, pNmCas9, pAsCas12a i pLbCas12a należy użyć BsmBI.
    1. Przygotować mieszaninę reakcyjną o objętości 20 μl zawierającą 1 μg kołowego wektora plazmidowego, 2 μl buforu (10x), 1 μl enzymu restrykcyjnego (np. BbsI, BplI lub BsmBI) i ddH2O do końcowej objętości 20 μl. Inkubować reakcję w temperaturze 37 °C przez 2,5 godziny.
    2. Dodać 1 μl fosfatazy alkalicznej krewetek (SAP) do reakcji i inkubować w temperaturze 37 °C przez kolejne 30 minut.
    3. Ugasić reakcję, dodając 5 μl 6x barwnika ładującego DNA (patrz tabela materiałów), dobrze wymieszać i rozpuść reakcję na 0,8% żelu agarozowym z 1x buforem tris-octanu-EDTA (TAE). Następnie należy wyciąć właściwe pasmo i przystąpić do żelowego oczyszczania zlinearyzowanego wektora.
  2. Zliguj wyżarzane oligonukleotydy do strawionego plazmidu CRISPR.
    1. Przygotować 10 μl mieszaniny reakcyjnej: 50 ng zlinearyzowanego wektora, 1 μl rozcieńczonych wyżarzonych oligonukleotydów, 1 μl buforu ligazy DNA T4 (10x), 1 μl ligazy DNA T4 i ddH2O do końcowej objętości 10 μl (patrz tabela materiałów). Inkubować reakcję w temperaturze 16 °C przez noc lub w temperaturze pokojowej przez 2 h.
      UWAGA: Aby przyspieszyć proces ligacji, należy użyć skoncentrowanej ligazy DNA T4 i inkubować mieszaninę reakcyjną w temperaturze pokojowej przez 15 minut (patrz Tabela materiałów).
  3. Przekształcić zligowane produkty w chemicznie kompetentne komórki E. coli (patrz plik uzupełniający 1). Rozprowadzić przekształcone komórki bakteryjne na płytce agarowej LB ze 100 μg/ml ampicyliny.
  4. Wykonaj reakcję łańcuchową polimerazy kolonii (PCR), aby zidentyfikować bakterie za pomocą wstawki.
    1. Przygotuj dwa zestawy sterylnych probówek paskowych do PCR. W zestawie 1 dodaj 4,7 μl ddH2O, natomiast w zestawie 2 dodaj 50 μl bulionu LB z odpowiednim antybiotykiem (np. 100 μg/ml ampicyliny).
    2. Za pomocą sterylnej końcówki do pipet wybierz kolonię z płytki, przeciągnij ją krótko w probówce z zestawu 1 i pozostaw końcówkę w probówce z zestawu 2. Powtórz dla kilku kolonii, upewniając się, że za każdym razem używasz różnych probówek PCR.
      UWAGA: Zazwyczaj wystarczające jest przebadanie czterech rodzin. Może się to jednak różnić w zależności od skuteczności klonowania.
    3. Do każdej probówki zestawu 1 (dla 10 μl PCR) dodać następujące odczynniki: 5 μl 2x PCR master mix (z barwnikiem ładującym, patrz tabela materiałów), 0,15 μl oligonukleotydu sensownego lub antysensownego (100 μM), 0,15 μl startera (100 μM) celującego odpowiednio w plazmid CRISPR za lub przed kasetą sgRNA (patrz Rysunek 3).
      UWAGA: Produkt PCR powinien w idealnym przypadku dawać produkt o wielkości około 150 pz lub większej, aby żadne dodatnie prążki nie zostały pomylone z dimerami starterów.
    4. Uruchomić PCR w termocyklerze, stosując następujące parametry: 95 °C przez 3 min, 95 °C przez 30 s (krok 2), 60 °C przez 30 s (krok 3), 72 °C przez 30 s (krok 4), powtórz kroki 2\u20124 przez kolejne 34 cykle, 72 °C przez 5 min, i utrzymywać w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Temperatura wyżarzania wynosząca 60 °C może wymagać optymalizacji dla zaprojektowanych podkładów. Czas wydłużenia wynoszący 30 s może się również różnić w zależności od oczekiwanej wielkości amplikonu PCR i użytej polimerazy DNA.
    5. Rozwiąż reakcje na 1% żelu agarozowym za pomocą 1x buforu TAE.
    6. Zaszczepić kolonię, która daje dodatni prążek w PCR, przenosząc 50 μl jej kultury z odpowiedniej probówki zestawu 2 do większej stożkowej probówki zawierającej 5 ml LB z odpowiednim antybiotykiem. Pozwól kulturze rosnąć przez noc w inkubatorze-wytrząsarce o temperaturze 37 °C.
    7. Wyizoluj plazmidy z nocnej hodowli za pomocą zestawu do minipreparacji (patrz tabela materiałów) i zsekwencjonuj próbkę za pomocą startera do PCR kolonii, który nie jest oligonukleotydem sensownym lub antysensownym (hU6_forward lub M13R(-20) w Rysunek 3).
      UWAGA: W razie potrzeby wykonaj maxiprep zweryfikowanego pod kątem sekwencji plazmidu CRISPR, aby uzyskać większą ilość do dalszych eksperymentów.

3. Projektowanie i synteza szablonów naprawczych

UWAGA: Do precyzyjnej inżynierii genomu, szablon określający pożądane modyfikacje DNA musi być dostarczony razem z odczynnikami CRISPR. W przypadku małych zmian DNA, takich jak zmiana pojedynczego nukleotydu, najbardziej odpowiednie są matryce dawcy ssODN (patrz punkt 3.1). W przypadku większych zmian DNA, takich jak wstawienie znacznika GFP 5' lub 3' określonego genu kodującego białko, najbardziej odpowiednie są matryce dawcy plazmidu (patrz punkt 3.2).

  1. Zaprojektuj i zsyntetyzuj szablon dawcy ssODN (patrz Rysunek 4).
    1. Określ prawidłowe pasmo, którego kolejność powinien być zgodny z szablonem.
      UWAGA: Cas12a wykazuje preferencję dla ssODN sekwencji nici niedocelowej, podczas gdy Cas9 wykazuje preferencję dla ssODN sekwencji nici docelowej zamiast tego25 (patrz Rysunek 4a).
    2. Upewnij się, że naprawiona sekwencja nie jest ponownie celowana przez wybraną nukleazę Cas. Na przykład zmutuj PAM w taki sposób, aby nie doszło do zmiany aminokwasu lub wyeliminuj PAM z matrycy dawcy, jeśli nie ma to żadnych konsekwencji funkcjonalnych. W razie potrzeby skorzystaj z przykładu podanego w Rysunek 4b jako wskazówkę.
    3. Zdecyduj, czy pożądany jest symetryczny czy asymetryczny szablon dawcy. W przypadku dawców symetrycznych upewnij się, że każde ramię homologiczne flankujące miejsce modyfikacji DNA ma co najmniej 17 nt długości25. W przypadku asymetrycznych matryc dawców należy użyć dłuższych ramion 5′ pożądanych zmian DNA (patrz Rysunek 4a). Co ważne, upewnij się, że krótsze ramię ma około 37 nt długości, podczas gdy drugie ramię homologii ma około 77 nt długości25,39.
    4. Zsyntetyzuj zaprojektowaną matrycę jako fragment jednoniciowego DNA.
      UWAGA: Asymetryczne ssODN mogą, ale nie zawsze, wykazywać wyższą wydajność HDR niż symetryczne ssODN. Ogólnie rzecz biorąc, dawca asymetryczny zazwyczaj działa co najmniej tak samo dobrze jak dawca symetryczny, jeśli jest prawidłowo zaprojektowany. Jednak asymetryczny szablon kosztuje znacznie więcej, ponieważ jest dłuższy i dlatego wymaga oczyszczania elektroforezą w żelu poliakrylamidowym (PAGE) lub specjalnej procedury syntezy. Rutynowe nokauty genów zwykle opierają się na szlaku naprawy NHEJ i nie wymagają szablonu naprawczego. Jeśli jednak skuteczność nokautu jest niska, zaprojektuj szablon dawcy ssODN, który zawiera mutację przesunięcia ramki i ma długość co najmniej 120 nt25,40.

Diagram edycji genów przedstawiający symetryczną/asymetryczną integrację ssODN w locus docelowym za pośrednictwem CAS9/12a.
Rysunek 4: Projektowanie szablonów dawców ssODN. (a) Schemat ilustrujący najróżniejsze możliwe konstrukcje. Czerwone poziome prostokąty wskazują pasmo niebędące celem (NT), podczas gdy niebieskie prostokąty wskazują pasmo docelowe (T). Ponadto małe zielone prostokąty wskazują pożądane modyfikacje DNA (takie jak zmiany pojedynczego nukleotydu). Gdy używany jest symetryczny ssODN, minimalna długość każdego ramienia homologii powinna wynosić co najmniej 17 nt (ale może być dłuższa). W przypadku asymetrycznych ssODN, 37/77 T ssODN wydaje się być optymalny dla HDR indukowanego przez SpCas9, podczas gdy 77/37 NT ssODN wydaje się być optymalny dla HDR indukowanego przez Cas12a. L = lewe ramię homologiczne; R = prawe ramię homologii. (b) Konkretny przykład pokazujący, jak projektować szablony ssODN. W tym przypadku docelowym locus genomowym jest ekson 45 ludzkiego genu CACNA1D. PAM dla Cas9 jest różowy i podkreślony, podczas gdy PAM dla Cas12a jest brązowy i podkreślony. Celem jest stworzenie mutacji missense (zaznaczonej na zielono) poprzez konwersję AGU (kodującej serynę) na AGG (kodującą argininę). Aby zapobiec ponownemu kierowaniu przez Cas12a, TTTC PAM jest zmutowany do CTTC. Należy pamiętać, że nie ma zmian w aminokwasach (UAU i UAC kodują tyrozynę). Aby jeszcze bardziej zapobiec ponownemu nakierowaniu przez Cas9, kodon AGU został zastąpiony kodonem UCC (pogrubionym), z których oba kodują serynę. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Zaprojektuj i sklonuj odpowiednią matrycę dawcy plazmidu. Na przykład, może zawierać sekwencję GFP otoczoną długimi ramionami, które są homologiczne do docelowego locus genomowego (patrz Rysunek 5).
    1. Upewnij się, że zmodyfikowana sekwencja nie jest ponownie celowana przez wybraną nukleazę Cas. Na przykład protospacer może być podzielony przez wstawiony znacznik (GFP). Alternatywnie, PAM może zostać zmutowany lub usunięty z matrycy dawcy w taki sposób, że nie wpływa na funkcję genu.
    2. Amplifikuj ramiona homologii z genomowego DNA za pomocą PCR. Długość każdego ramienia homologii wynosi zwykle od 1000 do 1500 bp.
      UWAGA: Aby ułatwić klonowanie, upewnij się, że starter do przodu dla lewego ramienia homologii i starter odwrotny dla prawego ramienia homologii mają co najmniej 20 nt nakładającą się sekwencję z wybranym szkieletem wektorowym. Dodatkowo upewnij się, że odwrotny starter dla lewego ramienia homologii i przedniego starter dla prawego ramienia homologii mają również pewne nakładające się sekwencje ze znacznikiem epitopu.
    3. Sklonuj dwa ramiona homologii i znacznik (GFP) do szkieletu wektora za pomocą Gibson assembly41 (patrz Tabela materiałów). Sprawdź plazmid za pomocą sekwencjonowania Sangera przy użyciu starterów do przodu i do tyłu, które znajdują się odpowiednio przed i za matrycą dawcy.
      UWAGA: Sekwencjonowanie Sangera jest szeroko i tanio dostępne jako usługa komercyjna. Wyślij podwielokrotność plazmidu wraz ze starterami sekwencjonowania do usługodawcy.
    4. Zlinearyzuj matrycę dawcy za pomocą enzymu restrykcyjnego, który przecina plazmid tylko raz, albo przed lewym ramieniem homologii, albo za prawym ramieniem homologii.
      UWAGA: Ostatnio wykazano, że podwójnie przecięty donor, który jest otoczony sekwencjami sgRNA-PAM i jest uwalniany z plazmidu po rozszczepieniu przez odpowiednią nukleazę Cas, zwiększa wydajność HDR42. Gdy sekwencje sgRNA-PAM są wprowadzane odpowiednio przed i za lewym i prawym ramieniem homologii (na przykład przez montaż Gibsona), długość ramienia homologii może zostać zmniejszona do 300 pz i nie ma potrzeby linearyzacji plazmidu.

Diagram edycji genów z sgRNA, celowaniem w geny CLTA, integracją P2A-GFP i sekwencjami starterów.
Rysunek 5: Projektowanie i klonowanie szablonu dawcy plazmidu. (a) Celem w tym konkretnym przykładzie jest fuzja P2A-GFP z C-końcem białka CLTA. Niebieski poziomy prostokąt wskazuje lewe ramię homologii, podczas gdy czerwony poziomy prostokąt wskazuje prawe ramię homologii. Wielkie litery oznaczają sekwencje kodujące białka, podczas gdy małe litery oznaczają sekwencje niekodujące. PAM dla SpCas9 i Cas12a są podkreślone kursywą. (b) Matryca dawcy plazmidu, która może być używana do endogennego znakowania P2A-GFP na C-końcu CLTA. Dostarczone sekwencje starterów można wykorzystać do sklonowania plazmidu przez montaż Gibsona. Warunki PCR są następujące: 98 °C przez 3 min, 98 °C przez 30 s (krok 2), 63 °C przez 30 s (krok 3), 72 °C przez 1 minutę (krok 4), powtórz kroki 2\u20124 przez kolejne 34 cykle, 72 °C przez 3 minuty i przytrzymaj w 4 °C. Czarne litery odpowiadają sekwencjom wektorowym, niebieskie litery odpowiadają lewemu ramieniu homologii, zielone litery odpowiadają P2A-GFP, a czerwone litery odpowiadają prawemu ramieniu homologii. Należy zauważyć, że po pomyślnym zintegrowaniu sekwencji kodującej P2A-GFP z locus docelowym, ponowne namierzenie przez SpCas9 nie będzie możliwe, ponieważ tylko 9 nt jego protospacer (GTGCACCAG) pozostanie nienaruszone. Ponadto, aby zapobiec ponownemu nakierowaniu przez Cas12a, trzy pary zasad znajdujące się bezpośrednio za kodonem STOP (pogrubioną czcionką) są usuwane z sekwencji plazmidu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. Transfekcja komórkowa

UWAGA: Pozostałe części protokołu są napisane z myślą o HEK293T komórkach. Zastosowana pożywka hodowlana składa się z pożywki Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) uzupełnionej 4,5 g/l glukozy, 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 2 mM L-glutaminy i 0,1% penicyliny/streptomycyny. Różne etapy protokołu mogą wymagać modyfikacji w zależności od faktycznie użytej linii komórkowej. Wszystkie prace związane z hodowlą komórkową są wykonywane w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II, aby zapewnić sterylne środowisko pracy.

  1. Wysiewaj 1,8 x 105 komórek na 24-dołkowej płytce do hodowli tkankowej na dzień przed transfekcją.
    1. Oddziel komórki, odsysając pożywkę, a następnie dodając 150 μl 0,25% trypsyny-EDTA na studzienkę. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 2 minuty.
    2. Zneutralizuj trypsynę, dodając 150 μl (lub 1x objętość) pożywki do hodowli komórkowych. Przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki. Odwiruj komórki w wirówce stołowej o sile 1000 x g przez 5 minut.
    3. Odessać supernatant i ponownie zawiesić z 5 ml pożywki do hodowli komórkowych. W oddzielnej probówce wirówkowej podwielokrotność 10 μl 0,4% roztworu błękitu trypanowego. Następnie dodać 10 μl zawieszonych komórek z kroku 4.1.2 i dokładnie wymieszać.
    4. Odpipetować 10 μl mieszaniny (komórki + błękit trypanowy) do hemocytometru. Kontynuuj liczenie komórek ręcznie lub za pomocą automatycznego licznika komórek.
    5. Zasiać 1,8 x 105 komórek w jednym dołku 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej.
  2. Przygotuj mieszankę transfekcyjną zawierającą 500 ng plazmidu CRISPR (do edycji za pośrednictwem NHEJ) lub 300 ng plazmidu CRISPR i 300 ng matrycy dawcy (do edycji za pośrednictwem HDR), zgodnie z instrukcjami dostarczonymi z odczynnikiem do transfekcji (patrz Tabela materiałów). Inkubować w temperaturze pokojowej przez zalecany czas (zwykle około 10-20 min).
  3. Dodaj mieszankę transfekcyjną do komórek kroplami, a następnie delikatnie zakręć płytką.
  4. Inkubować w temperaturze 37 °C w nawilżonym inkubatorze z 5%CO2 przez 24 godziny (w przypadku eksperymentów opartych na NHEJ) lub 72 godziny (w przypadku eksperymentów opartych na HDR).

5. Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) transfekowanych komórek

  1. Oddziel komórki, odsysając pożywkę, a następnie dodając 150 μl 0,25% trypsyny-EDTA na studzienkę. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 2 minuty.
  2. Zneutralizuj trypsynę, dodając 150 μl (lub 1x objętość) pożywki do hodowli komórkowych. Przenieść zawiesinę komórkową do probówki wirówkowej. Odwirowywać komórki w mikrowirówce o masie 235 x g przez 5 minut.
  3. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki z 2% płodową surowicą bydlęcą (FBS) w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Przefiltruj komórki przez siatkę 30 μm lub sitko do komórek w probówce FACS o pojemności 5 ml.
  4. Przygotować kolejną probówkę wirówkową z około 100 μl pożywki hodowlanej lub 2% FBS w PBS do pobrania komórek.
  5. Na cytometrze przepływowym bramkować komórki z komórkami nietransfekowanymi jako kontrolę ujemną. Posortuj i zbierz transfekowane komórki, zgodnie z którymi marker fluorescencyjny jest obecny na użytym plazmidzie CRISPR. Na przykład, jeśli plazmid zawiera gen mCherry, posortuj według komórek RFP-dodatnich.
    UWAGA: Różne plazmidy CRISPR będą miały różne markery, które można wybrać. Zestaw plazmidów (pSpCas9, pSaCas9, pNmCas9, pAsCpf1 i pLbCpf1) użytych w tym badaniu ewaluacyjnym zawiera albo pomarańczowe białko fluorescencyjne (OFP), albo gen mCherry.

6. Ekspansja poszczególnych klonów

  1. Odwirować posortowane komórki w wirówce stołowej z maksymalną prędkością (18 000 x g) przez 5 minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad za pomocą pożywki hodowlanej o pojemności 300 μl. Wysiewaj 200 μl komórek na 24-dołkowej płytce do hodowli tkankowej i pozwól im dojść do siebie przez kilka dni w inkubatorze o temperaturze 37 °C. Pozostałe 100 μl komórek należy zachować do punktu 7.
  2. Gdy komórki zaczną się zlewać, przejdź je zgodnie z krokami 4.1.1\u20124.1.3. Umieść komórki z rzadka w naczyniu do hodowli tkankowej o średnicy 100 mm, aby zapewnić wystarczającą ilość miejsca do wzrostu poszczególnych kolonii. Inkubować w temperaturze 37 °C w nawilżonym inkubatorze z 5% stężeniemCO2.
    UWAGA: Wypróbuj różne rozcieńczenia. Pojedyncze komórki potrzebują wystarczająco dużo miejsca, aby rosnąć jako pojedyncze kolonie. Jednak nie mogą być one również zbyt rzadkie, ponieważ niektóre linie komórkowe nie rosną dobrze, gdy liczba komórek jest zbyt mała.
  3. Gdy kolonie zaczną się formować, pobierz je pod mikroskopem (z 4-krotnym powiększeniem) i umieść każdy klon w indywidualnym dołku 24-dołkowej płytki, która zawiera pożywkę do hodowli komórkowych. Inkubować w temperaturze 37 °C w nawilżonym inkubatorze z 5% stężeniemCO2 do momentu, aż komórki zaczną się zlewać.
    UWAGA: Alternatywą dla seryjnych rozcieńczeń i pobierania kolonii jest użycie cytometrii przepływowej do sortowania pojedynczych komórek na 96-dołkową płytkę. Jednak może to nie działać w przypadku niektórych linii komórkowych, które nie rosną dobrze, gdy obecna jest tylko jedna komórka.

7. Ocena efektywności edycji

  1. Ekstrahować genomowe DNA poprzez odwirowanie pozostałych 100 μl posortowanych komórek (od kroku 6.1) w wirówce stołowej z maksymalną prędkością (18 000 x g) przez 5 minut. Odessać supernatant i przystąpić do izolowania genomowego DNA za pomocą zestawu do ekstrakcji (patrz tabela materiałów).
  2. Wykonaj test rozszczepienia endonukleazy T7 I (T7EI) (patrz Rysunek 6).
    1. Przygotuj 50 μl PCR zawierający 10 μl buforu reakcyjnego PCR (5x), 1 μl mieszanki dNTP (10 mM), 2,5 μl zdefiniowanego przez użytkownika startera forward (10 μM), 2,5 μl zdefiniowanego przez użytkownika startera odwrotnego (10 μM), 0,5 μl polimerazy DNA, 2\u20125 μl matrycy genomowego DNA (w zależności od liczby komórek posortowanych), następnie uzupełnić do 50 μL roztworem ddH2O (patrz tabela materiałów).
      UWAGA: Startery są zaprojektowane tak, aby flankować docelowe locus genomowe i dawać produkt PCR o wartości około 400-700 pz. Zazwyczaj jeden starter jest umieszczony bliżej miejsca cięcia enzymu Cas niż drugi starter, tak że wynikiem testu T7EI są dwa odrębne prążki na żelu agarozowym (patrz Rysunek 6).
    2. Uruchom PCR w termocyklerze o następujących parametrach: 98 °C przez 3 min, 98 °C przez 30 s (krok 2), 63 °C przez 30 s (krok 3), 72 °C przez 30 s (krok 4), powtórz kroki 2\u20124 przez kolejne 34 cykle, 72 °C przez 2 min, i utrzymywać w temperaturze 4 °C.
    3. Rozwiąż reakcję na 2% żelu agarozowym za pomocą 1x buforu TAE.
    4. Wyciąć produkt PCR z żelu za pomocą czystego, ostrego skalpela i oczyścić DNA za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu, zgodnie z instrukcjami producenta. Zmierzyć stężenie produktu PCR za pomocą spektrofotometru o długości fali 260 nm absorbancji (patrz tabela materiałów).
    5. Przygotować mieszaninę testową zawierającą 200 ng DNA, 2 μl buforu reakcyjnego T7EI (10x) i uzupełnioną do 19 μl ddH2O (patrz tabela materiałów).
    6. Ponownie wyżarzyć produkt PCR w termocyklerze, stosując następujące parametry: 95 °C przez 5 minut, obniżyć do 25 °C przy 6 °C/min, a następnie utrzymać w temperaturze 4 °C.
    7. Dodać 5 U T7EI do ponownie wyżarzonego produktu PCR, dobrze wymieszać pipetując i inkubować w temperaturze 37 °C przez 50 minut.
    8. Rozpuścić DNA strawione przez T7EI na 2,5% żelu agarozowym za pomocą 1x buforu TAE.
    9. Zobrazuj żel, określ ilościowo intensywność pasma za pomocą ImageJ i oblicz szybkość tworzenia indelu za pomocą następującego wzoru:
      Formuła procentowa indel; równanie mutacji insercji/delecji; aplikacje do analizy genetycznej.
      gdzie a oznacza intensywność nienaruszonego produktu PCR, a b i c odpowiadają intensywności produktów rozszczepienia43.
      1. Aby określić ilościowo intensywność pasma w obrazie ImageJ, najpierw narysuj prostokątną ramkę wokół pasma jak najbliżej jego granicy. Po drugie, kliknij Analizuj, a następnie Ustaw pomiary. Upewnij się, że zaznaczone są opcje obszaru, średniej wartości szarości i zintegrowanej gęstości. Zamknij okno ustawień, klikając przycisk OK. Po trzecie, kliknij Analizuj, a następnie Zmierz. Średnia lub wartość RawIntDen jest używana jako intensywność pasma.

Diagram procesu edycji genów CRISPR z konfiguracją PCR, testem rozszczepienia niedopasowania, wynikami NGS.
Rysunek 6: Sprawdzanie komórek pod kątem pomyślnych wyników edycji genomu. a) Schemat ilustrujący dwa powszechnie stosowane testy, a mianowicie test rozszczepienia niedopasowania z enzymem endonukleazy T7 I (T7EI) oraz sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) lub celowane sekwencjonowanie amplikonowe. Niebieskie poziome prostokąty wskazują DNA, a żółte kółka wskazują modyfikacje wywołane przez system CRISPR-Cas. Startery do testu T7E1 są oznaczone kolorem zielonym, natomiast startery do generowania amplikonów dla NGS są oznaczone kolorem czerwonym. b) Projektowanie sekwencji starterów do testu rozszczepienia T7EI i dla NGS. W tym przypadku docelowym locus genomowym jest ekson 45 ludzkiego genu CACNA1D. Miejsce, w którym ma zostać dokonana modyfikacja, jest oznaczone gwiazdką. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Wykonaj ukierunkowane sekwencjonowanie amplikonów (patrz Rysunek 6).
    1. Zaprojektuj startery PCR w celu amplifikacji docelowego locus genomu. Umieścić jeden ze starterów w odległości mniejszej niż 100 pz, ale większej niż 20 pz od protospacer.
      UWAGA: Zazwyczaj całkowity rozmiar produktu PCR jest projektowany na około 150\u2012300 pz (patrz Rysunek 6).
    2. Do starterów należy dołączyć dodatkowe sekwencje w następujący sposób: (a) 5'\u2012GCGTTATCGAGGTC-NNNN-[Forward Primer] – 3'; (b) 5' - GTGCTCTCTCCGATCT-[Odwrócony elementarz]–3'.
    3. Przygotować 50 μl mieszaniny reakcyjnej PCR zawierającej 10 μl buforu reakcyjnego PCR (5x), 1 μL dNTP (10 mM), 5 μl startera a (10 μM), 5 μL startera b (10 μM), 0,5 μl polimerazy DNA, 2\u20125 μL matrycy genomowego DNA (w zależności od liczby posortowanych komórek), następnie uzupełnić do 50 μl środkiem ddH20.
    4. Uruchom PCR w termocyklerze o następujących parametrach: 98 °C przez 3 min, 98 °C przez 30 s (krok 2), 63 °C przez 30 s (krok 3), 72 °C przez 15 s (krok 4), powtórz kroki 2\u20124 przez kolejne 34 cykle, 72 °C przez 2 min, i utrzymywać w temperaturze 4 °C.
    5. Rozwiąż reakcję na 2% żelu agarozowym i oczyść produkt PCR za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu zgodnie z instrukcjami producenta. Określić ilościowo DNA za pomocą spektrofotometru o długości fali o absorbancji 260 nm (patrz tabela materiałów).
    6. Zsyntetyzuj następujące startery 2 rundy PCR: (c) 5'\u2012 AATGATACGGCGACCGAGATCACCACACACGAGCGTC-3'; (d) 5'\u2012CAAGCAGAGACGGCATACGAGAT-[kod kreskowy]-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT–3'
    7. Przygotować mieszaninę reakcyjną o pojemności 20 μl PCR zawierającą 4 μl buforu reakcyjnego PCR (5x), 0,4 μl dNTP (10 mM), 2 μl startera c (10 μM), 2 μl startera d (10 μM), 0,2 μl polimerazy DNA, 2 μl matrycy DNA (z kroku 7.3.5, rozcieńczony w stosunku 1:100) i 9,4 μl ddH2O.
      UWAGA: Współczynnik rozcieńczenia matrycy DNA może się różnić w zależności od jej pierwotnego stężenia. Jeśli stężenie wynosi około 20\u201240 ng/μL, należy zastosować współczynnik rozcieńczenia 1:100. Ponadto należy wybrać inny kod kreskowy dla każdej próbki eksperymentalnej, jeśli w kroku 7.3.3 użyto tego samego startera a i startera b.
    8. Uruchom PCR w termocyklerze o następujących parametrach: 98 °C przez 3 min, 98 °C przez 30 s (krok 2), 65 °C przez 30 s (krok 3), 72 °C przez 30 s (krok 4), powtarzaj kroki 2\u20124 przez kolejne 14 cykli, 72 °C przez 2 min, i utrzymać w temperaturze 4 °C.
    9. Rozpuść 5 μl każdej reakcji na 2% żelu agarozowym, aby określić powodzenie PCR. Połącz wszystkie próbki razem (zakładając, że dla każdej próbki użyto innego kodu kreskowego) i oczyść zebrane DNA za pomocą zestawu do oczyszczania PCR zgodnie z instrukcjami producenta. Jeśli niektóre z PCR wykazują więcej niż jedno prążki (wskazujące na obecność produktów niespecyficznych), należy wykonać dodatkowy etap ekstrakcji żelu.
    10. Sekwencjonuj bibliotekę na przyrządzie do sekwencjonowania o wysokiej przepustowości (patrz tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta, aby uzyskać sparowane odczyty 151 bp. Starter sekwencjonowania odczytu 1 jest projektowany na zamówienie i musi być dostarczony osobno. Jego sekwencja jest następująca: Read1_seq: 5' – CCACCGAGATCTACACCCTACACGAGCGTTATCGAGGTC–3'. Starter do sekwencjonowania Read 2 i starter do sekwencjonowania indeksowego są standardowe i znajdują się w kartridżu z odczynnikiem.
      UWAGA: Test T7EI i celowane sekwencjonowanie amplikonów są powszechnie stosowane do sprawdzania skuteczności edycji genomu. Jednak inne eksperymenty mogą być przeprowadzone w celu oceny wydajności edycji, w zależności od rodzaju wprowadzonych modyfikacji DNA. Na przykład, jeśli miejsce restrykcji zostanie utworzone w miejscu docelowym, można przeprowadzić test polimorfizmu długości fragmentu restrykcyjnego (RFLP). Jest podobny do testu T7EI, z tą różnicą, że zamiast tego do trawienia produktu PCR stosuje się endonukleazę restrykcyjną.

8. Badanie przesiewowe poszczególnych klonów

  1. Począwszy od kroku 6.3, podziel komórki, gdy zaczną się zlewać. Dla każdego pojedynczego klonu zbierz pozostałe komórki i wyodrębnij genomowe DNA zgodnie z krokiem 7.1.
  2. Przeprowadzić test T7EI dla wszystkich indywidualnych klonów zgodnie z sekcją 7.2, z wyjątkiem jednej modyfikacji. Amplifikować docelowe locus genomowe z komórek typu dzikiego i w kroku 7.2.5, zamiast używać tylko 200 ng testowego DNA, zmieszać 100 ng testowego DNA ze 100 ng DNA typu dzikiego.
    UWAGA: Powodem zmodyfikowanego kroku jest to, że niektóre klony mogły przejść pomyślną konwersję bialleliczną i są homozygotycznymi mutantami. W takich przypadkach nie będzie pasm rozszczepienia w teście T7EI, jeśli DNA typu dzikiego nie zostanie zmieszane.
  3. Zsekwencjonuj miejsce docelowe w klonach, które wykazują pasma rozszczepienia w teście T7EI.
    1. Amplifikować zmodyfikowane locus genomowe zgodnie z krokami 7.2.1–7.2.4.
    2. Ustaw następującą reakcję klonowania: 4 μl produktu PCR, 1 μl roztworu soli, 1 μl wektora TOPO (patrz tabela materiałów).
    3. Delikatnie wymieszać pipetując i inkubować w temperaturze pokojowej przez co najmniej 5 minut.
    4. Przekształć 3 μl mieszaniny reakcyjnej w chemicznie kompetentne komórki E. coli (takie jak TOP10 lub Stbl3) (patrz plik uzupełniający 1). Rozprowadź przekształcone komórki bakteryjne na płytce agarowej LB z 50 μg/ml kanamycyny.
    5. Następnego dnia zaszczepij co najmniej 10 kolonii w płynnym pożywce LB zawierającej 50 μg/ml kanamycyny.
    6. Gdy kultury bakteryjne są mętne, wyizoluj plazmidy za pomocą zestawu miniprep (patrz Tabela materiałów) i zsekwencjonuj je za pomocą standardowego startera M13 do przodu lub M13 do tyłu.
  4. Wykonaj western blot (znany również jako immunoblot), aby określić brak lub obecność docelowego białka (jeśli eksperyment z edycją genomu obejmuje wybicie genu kodującego białko poprzez mutacje przesunięcia ramki odczytu). Patrz plik uzupełniający 1.
    UWAGA: Można przeprowadzić inne eksperymenty w celu zidentyfikowania klonu niosącego pożądane modyfikacje genomowe. Na przykład test fenotypowy można przeprowadzić, jeśli wiadomo, że wyeliminowanie określonego genu powoduje pewne zmiany w zachowaniu komórki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby przeprowadzić eksperyment edycji genomu, należy sklonować plazmid CRISPR wyrażający sgRNA ukierunkowany na interesujące go miejsce. Najpierw plazmid jest trawiony enzymem restrykcyjnym (zwykle enzymem typu II) w celu jego linearyzacji. Zaleca się rozpuszczenie strawionego produktu na 1% żelu agarozowym wraz z niestrawionym plazmidem w celu rozróżnienia całkowitego i częściowego trawienia. Ponieważ niestrawione plazmidy są superskręcone, mają tendencję do szybszego biegania niż ich zlinearyzowane odpowiedniki (patrz <...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

System CRISPR-Cas to potężna, rewolucyjna technologia inżynierii genomów i transkryptomów roślin i zwierząt. Stwierdzono, że wiele gatunków bakterii zawiera systemy CRISPR-Cas, które mogą być potencjalnie przystosowane do celów inżynierii genomu i transkryptomu44. Chociaż endonukleaza Cas9 ze Streptococcus pyogenes (SpCas9) była pierwszym enzymem, który został z powodzeniem zastosowany w komórkach ludzkich 21,22,23,24, wykazano również, że enzymy z innych gatunków bakterii, w tym te pokaz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

M.H.T. jest wspierany przez grant Biura Wspólnej Rady Agencji ds. Nauki, Technologii i Badań (1431AFG103), grant Narodowej Rady Badań Medycznych (OFIRG/0017/2016), granty National Research Foundation (NRF2013-THE001-046 i NRF2013-THE001-093), grant Ministerstwa Edukacji Tier 1 (RG50/17 (S)), grant na rozpoczęcie działalności z Uniwersytetu Technologicznego Nanyang oraz fundusze na konkurs International Genetically Engineering Machine (iGEM) od Nanyang Technological Uniwersytet.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kinaza polinukleotydowa T4 (PNK)NEBM0201
Fosfataza alkaliczna krewetek (rSAP)NEBM0371
Bufor tris-octano-EDTA (TAE), 50X1st BaseBUF-3000-50X4LRozcieńczyć do 1X przed użyciem. Roztwór 1X zawiera 40 mM Tris, 20 mM kwasu octowego i 1 mM EDTA.
Bufor Tris-EDTA (TE), 10X1st BaseBUF-3020-10X4LRozcieńczyć do 1X przed użyciem. Roztwór 1X zawiera 10 mM Tris (pH 8,0) i 1 mM EDTA. 
BbsINEBR0539
BsmBINEBR0580
T4 Ligaza DNANEBM0202400 000 jednostek/ml
Zestaw do szybkiego ligowaniaNEBM2200Alternatywa dla ligazy DNA T4.
Zestaw do szybkiej ligacji DNAThermo ScientificK1423Alternatywa dla ligazy DNA T4.
Zestaw do klonowania Zero Blunt TOPO PCRThermo Scientific451245Roztwór soli jest dostarczany z wektorem TOPO w zestawie.
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master MixNEBE2621LZestaw do montażu Gibsona.
One Shot Stbl3 Chemicznie kompetentny bulion E.ColiThermo ScientificC737303
LB (Lennox), proszekSigma AldrichL3022Rozpuszcza w ddH20 i autoklaw przed użyciem
Bulion z agarem (Lennox), proszekSigma AldrichL2897Rozpuszcza w ddH20 i autoklaw przed użyciem
SOC-2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM glukozy w 1 l bulionu LB
Ampicylina (sód), USPGrade Gold BiotechnologyA-301
REDiant 2X PCR Mastermix1st BaseBIO-5185
Agaroza1st BaseBIO-1000
T7 Endonukleaza INEBM0302
Zestaw miniprep do ekstrakcji plazmidowego DNAFavorgenFAPDE 300
Zmodyfikowana pożywka Dulbecco's Eagle (DMEM), hyklon o wysokiej zawartości glukozySH30081,014,5 g / l glukozy, bez L-glutaminy, HEPES i pirogronianu sodu
L-glutamina, 200mMGibco25030
Penicylina-Streptomycyna, 10, 000U/mlGibco15140
0,25% trypsyna-EDTA, 1XGibco25200
Bydło płodowe SerumHycloneSV30160FBS jest inaktywowane termicznie przed użyciem w temperaturze 56 oC przez 30 minut
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami, 1Xodczynnik20012
jetPRIMEPolyplus Transfection114-75
Roztwór do ekstrakcji DNA QuickExtract, 1,0EpicentrumLUCG-QE09050
Zestaw do genomowego DNA ISOLATE IIBiolineBIO-52067Alternatywa dla QuickExtract
Q5 High-Fidelity DNA PolymerazaNEBM0491
Deoxynukleotyd (dNTP) Mieszanina roztworówNEBN0447
6X Barwnik ładujący DNAThermo ScientificR061110 mM Tris-HCl (pH 7,6) 0,03% błękitu bromofenolowego, 0,03% cyjanolu ksylenu FF, 60% glicerolu, 60 mM
Koktajl inhibitorów proteazy EDTA, Set3Merck
Membrana nitrocelulozowa, 0,2 i mikro; mBio-Rad1620112
Bufor Tris-glycine-SDS, 10XBio-Rad1610772Rozcieńczyć do 1X przed użyciem. Roztwór 1x zawiera 25 mM Tris, 192 mM glicyny i 0,1% SDS.
Bufor tris-glicynowy, 10X1st baseBUF-2020Rozcieńczyć do 1X przed użyciem. Roztwór 1x zawiera 25 mM Tris i 192 mM glicyny.
Ponceau S roztwórSigma AldrichP7170
TBS, 20X1st baseBUF-3030Rozcieńczyć do 1X przed użyciem. 1x roztwór zawiera 25 mM Tris-HCl (pH 7,5) i 150 mM NaCl.
Tween 20Sigma AldrichP9416
Odtłuszczone mleko do testu immunologicznegoNacalai Tesque31149-75
WesternBright Sirius-femtogram HRPAdvanstaK12043
Przeciwciało dla β-aktyny (C4)Santa Cruz Biotechnologysc-47778Numer partii: C0916
System MiSeqIlluminaSY-410-1003
Spektrofotometr NanoDropThermo ScientificND-2000
Fluorometr kubitowyThermo ScientificQ33226
EVOS FL System obrazowania komórekThermo ScientificAMF4300
Plazmid CRISPR: pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458)Addgene48138System pojedynczego wektora: gRNA ulega ekspresji z tego samego plazmidu.
Plazmid CRISPR: pX601-AAV-CMV::NLS-SaCas9-NLS-3xHA-bGHpAAddgene61591System pojedynczego wektora: gRNA ulega ekspresji z tego samego plazmidu.
Plazmid CRISPR: xCas9 3.7Addgene108379System podwójnego wektora: gRNA ulega ekspresji z innego plazmidu.
Plazmid CRISPR: pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9Addgene42230System pojedynczych wektorów: gRNA ulega ekspresji z tego samego plazmidu.
Plazmid CRISPR: hCas9Addgene41815System podwójnego wektora: gRNA ulega ekspresji z innego plazmidu.
Plazmid CRISPR: eSpCas9(1.1)Addgene71814System pojedynczego wektora: gRNA ulega ekspresji z tego samego plazmidu.
Plazmid CRISPR: VP12 (SpCas9-HF1)Addgene72247System dwuwektorowy: gRNA ulega ekspresji z innego plazmidu.
LB - do transfekcji Gibco 539134

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Epinat, J. C., et al. A novel engineered meganuclease induces homologous recombination in yeast and mammalian cells. Nucleic Acids Research. 31 (11), 2952-2962 (2003).
  2. Arnould, S., et al. Engineered I-CreI derivatives cleaving sequences from the human XPC gene can induce highly efficient gene correction in mammalian cells. Journal of Molecular Biology. 371 (1), 49-65 (2007).
  3. Chapdelaine, P., Pichavant, C., Rousseau, J., Paques, F., Tremblay, J. P. Meganucleases can restore the reading frame of a mutated dystrophin. Gene Therapy. 17 (7), 846-858 (2010).
  4. Carroll, D. Genome engineering with zinc-finger nucleases. Genetics. 188 (4), 773-782 (2011).
  5. Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nature Reviews Genetics. 11 (9), 636-646 (2010).
  6. Miller, J. C., et al. A TALE nuclease architecture for efficient genome editing. Nature Biotechnology. 29 (2), 143-148 (2011).
  7. Zhang, F., et al. Efficient construction of sequence-specific TAL effectors for modulating mammalian transcription. Nature Biotechnology. 29 (2), 149-153 (2011).
  8. Boch, J., et al. Breaking the code of DNA binding specificity of TAL-type III effectors. Science. 326 (5959), 1509-1512 (2009).
  9. Moscou, M. J., Bogdanove, A. J. A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors. Science. 326 (5959), 1501(2009).
  10. Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
  11. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature Biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).
  12. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  13. Nishimasu, H., et al. Crystal structure of Cas9 in complex with guide RNA and target DNA. Cell. 156 (5), 935-949 (2014).
  14. Yamano, T., et al. Crystal Structure of Cpf1 in Complex with Guide RNA and Target DNA. Cell. 165 (4), 949-962 (2016).
  15. Swarts, D. C., Mosterd, C., van Passel, M. W., Brouns, S. J. CRISPR interference directs strand specific spacer acquisition. PLoS One. 7 (4), e35888(2012).
  16. Zetsche, B., et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 163 (3), 759-771 (2015).
  17. Sternberg, S. H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E. C., Doudna, J. A. DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9. Nature. 507 (7490), 62-67 (2014).
  18. Hu, J. H., et al. Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity. Nature. 556 (7699), 57-63 (2018).
  19. Kleinstiver, B. P., et al. Broadening the targeting range of Staphylococcus aureus CRISPR-Cas9 by modifying PAM recognition. Nature Biotechnology. 33 (12), 1293-1298 (2015).
  20. Kleinstiver, B. P., et al. Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities. Nature. 523 (7561), 481-485 (2015).
  21. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  22. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
  23. Jinek, M., et al. RNA-programmed genome editing in human cells. Elife. 2, e00471(2013).
  24. Cho, S. W., Kim, S., Kim, J. M., Kim, J. S. Targeted genome engineering in human cells with the Cas9 RNA-guided endonuclease. Nature Biotechnology. 31 (3), 230-232 (2013).
  25. Wang, Y., et al. Systematic evaluation of CRISPR-Cas systems reveals design principles for genome editing in human cells. Genome Biology. 19 (1), 62(2018).
  26. Ran, F. A., et al. In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9. Nature. 520 (7546), 186-191 (2015).
  27. Hou, Z., et al. Efficient genome engineering in human pluripotent stem cells using Cas9 from Neisseria meningitidis. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (39), 15644-15649 (2013).
  28. Kim, E., et al. In vivo genome editing with a small Cas9 orthologue derived from Campylobacter jejuni. Nature Communications. 8, 14500(2017).
  29. Edraki, A., et al. A Compact, High-Accuracy Cas9 with a Dinucleotide PAM for In Vivo Genome Editing. Molecular Cell. , (2018).
  30. Chatterjee, P., Jakimo, N., Jacobson, J. M. Minimal PAM specificity of a highly similar SpCas9 ortholog. Science Advances. 4 (10), (2018).
  31. Muller, M., et al. Streptococcus thermophilus CRISPR-Cas9 Systems Enable Specific Editing of the Human Genome. Mol Therapy. 24 (3), 636-644 (2016).
  32. Esvelt, K. M., et al. Orthogonal Cas9 proteins for RNA-guided gene regulation and editing. Nature Methods. 10 (11), 1116-1121 (2013).
  33. Boratyn, G. M., et al. BLAST: a more efficient report with usability improvements. Nucleic Acids Research. 41 (Web Server issue), W29-W33 (2013).
  34. Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature Biotechnology. 31 (9), 827-832 (2013).
  35. Montague, T. G., Cruz, J. M., Gagnon, J. A., Church, G. M., Valen, E. CHOPCHOP: a CRISPR/Cas9 and TALEN web tool for genome editing. Nucleic Acids Research. 42 (Web Server issue), W401-W407 (2014).
  36. Heigwer, F., Kerr, G., Boutros, M. E-CRISP: fast CRISPR target site identification. Nature Methods. 11 (2), 122-123 (2014).
  37. Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148(2016).
  38. Bae, S., Park, J., Kim, J. S. Cas-OFFinder: a fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of Cas9 RNA-guided endonucleases. Bioinformatics. 30 (10), 1473-1475 (2014).
  39. Richardson, C. D., Ray, G. J., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. Enhancing homology-directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA. Nature Biotechnology. 34 (3), 339-344 (2016).
  40. Richardson, C. D., Ray, G. J., Bray, N. L., Corn, J. E. Non-homologous DNA increases gene disruption efficiency by altering DNA repair outcomes. Nature Communications. 7, 12463(2016).
  41. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  42. Zhang, J. P., et al. Efficient precise knockin with a double cut HDR donor after CRISPR/Cas9-mediated double-stranded DNA cleavage. Genome Biology. 18 (1), 35(2017).
  43. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  44. Shmakov, S., et al. Diversity and evolution of class 2 CRISPR-Cas systems. Nature Reviews Microbiology. 15 (3), 169-182 (2017).
  45. Moreno-Mateos, M. A., et al. CRISPR-Cpf1 mediates efficient homology-directed repair and temperature-controlled genome editing. Nature Communications. 8 (1), 2024(2017).
  46. Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. Elife. 3, e04766(2014).
  47. Yang, L., et al. Optimization of scarless human stem cell genome editing. Nucleic Acids Research. 41 (19), 9049-9061 (2013).
  48. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

CRISPR Cas9kom rki ssak wtransfekcja kom rekcytometria przep ywowatest nukleazy T7PCR koloniiWestern blotekstrakcja DNAklonowanie kom rek

Powiązane artykuły