Artykuł metodologiczny

Manipulacja funkcją genów u meksykańskich ryb jaskiniowych

DOI:

10.3791/59093

⸱

22 kwietnia 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Florida Atlantic University, 2Jupiter Life Science Initiative, Florida Atlantic University, 3Harriet L. Wilkes Honors College, Florida Atlantic University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy podejścia do manipulacji genami w systemie modelu ewolucyjnego Astyanax mexicanus. Opisano trzy różne techniki: transgenezę za pośrednictwem Tol2, ukierunkowaną manipulację genomem za pomocą CRISPR/Cas9 oraz knockdown ekspresji za pomocą morpholinos. Narzędzia te powinny ułatwić bezpośrednie badanie genów leżących u podstaw zmienności między formami zamieszkującymi powierzchnię i jaskinie.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zwierzęta jaskiniowe dostarczają fascynującego systemu do badania mechanizmów ewolucyjnych i podstaw genetycznych leżących u podstaw zmian w wielu złożonych cechach, takich jak zwyrodnienie oczu, albinizm, utrata snu, hiperfagia i przetwarzanie sensoryczne. Gatunki ryb jaskiniowych z całego świata wykazują zbieżną ewolucję cech morfologicznych i behawioralnych ze względu na wspólne naciski środowiskowe między różnymi systemami jaskiniowymi. W warunkach laboratoryjnych badano różne gatunki jaskiniowe. Meksykańska tetra, Astyanax mexicanus, z formami widzącymi i niewidomymi, dostarczyła unikalnych spostrzeżeń na temat procesów biologicznych i molekularnych leżących u podstaw ewolucji złożonych cech i jest dobrze przygotowana jako wyłaniający się system modelowy. Podczas gdy geny kandydujące regulujące ewolucję różnych procesów biologicznych zostały zidentyfikowane u A. mexicanus, zdolność do walidacji roli poszczególnych genów była ograniczona. Zastosowanie technologii transgenezy i edycji genów ma potencjał, aby przezwyciężyć tę istotną przeszkodę i zbadać mechanizmy leżące u podstaw ewolucji złożonych cech. W tym miejscu opisujemy inną metodologię manipulowania ekspresją genów u A. mexicanus. Podejścia obejmują wykorzystanie morfolinosów, transgenezy Tol2 i systemów edycji genów, powszechnie stosowanych w danio pręgowanym i innych modelach ryb, do manipulowania funkcją genów u A. mexicanus. Protokoły te zawierają szczegółowe opisy procedur hodowlanych w określonym czasie, pobierania zapłodnionych jaj, wstrzykiwań i selekcji zwierząt modyfikowanych genetycznie. Te podejścia metodologiczne pozwolą na zbadanie mechanizmów genetycznych i neuronalnych leżących u podstaw ewolucji różnorodnych cech u A. mexicanus.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Od czasu Darwin's Origin of Species1, naukowcy uzyskali dogłębny wgląd w to, jak cechy kształtują się ewolucyjnie w odpowiedzi na określone naciski środowiskowe i ekologiczne, dzięki organizmom jaskiniowym2. Tetra meksykańska, A. mexicanus, składa się z ocznych przodków "powierzchniowych", które zamieszkują rzeki w całym Meksyku i południowym Teksasie oraz z co najmniej 29 geograficznie izolowanych populacji pochodnych morfów jaskiniowych zamieszkujących Sierra del Abra i inne obszary północno-wschodniego Meksyku3. U A. mexicanus zidentyfikowano szereg cech związanych z jaskiniami, w tym zmienione zużycie tlenu, depigmentację, utratę oczu oraz zmienione zachowania związane z żerowaniem i żerowaniem4,5,<sup class="xref">6,7,8,9. A. mexicanus przedstawia potężny model do badania mechanizmów ewolucji konwergentnej ze względu na dobrze zdefiniowaną historię ewolucyjną, szczegółową charakterystykę środowiska ekologicznego oraz obecność niezależnie wyewoluowanych populacji jaskiniowych10,11. Wiele cech pochodzących z jaskiń, które są obecne u ryb jaskiniowych, w tym utrata wzroku, utrata snu, zwiększone żerowanie, utrata szkoły, zmniejszona agresja i zmniejszone reakcje na stres, ewoluowało wielokrotnie poprzez niezależne pochodzenie, często wykorzystując różne ścieżki genetyczne między jaskiniami8,12,13,14,15. Ta powtarzająca się ewolucja jest potężnym aspektem systemu A. mexicanus i może dostarczyć wglądu w bardziej ogólne pytanie, w jaki sposób systemy genetyczne mogą być zaburzone w celu wytworzenia podobnych fenotypów.

Podczas gdy zastosowanie technologii genetycznej do mechanistycznego badania funkcji genów było ograniczone u wielu gatunków ryb (w tym A. mexicanus), ostatnie postępy w dziedzinie danio pręgowanego stanowią podstawę do rozwoju technologii genetycznej u ryb16,17,18,19,20. Liczne narzędzia są szeroko stosowane u danio pręgowanego do manipulowania ekspresją genów, a realizacja tych procedur od dawna jest ustandaryzowana. Na przykład wstrzyknięcie oligonukleotydów morfolino-olegonukleotydów (MO) na etapie pojedynczej komórki selektywnie blokuje RNA i zapobiega translacji przez krótki okres podczas rozwoju21,22. Ponadto podejścia do edycji genów, takie jak zgrupowane regularnie rozmieszczone krótkie powtórzenia palindromiczne (CRISPR)/białko 9 związane z CRISPR (Cas9) i nukleaza efektorowa podobna do aktywatora transkrypcji (TALEN), pozwalają na generowanie zdefiniowanych delecji lub, w niektórych przypadkach, insercji poprzez rekombinację w genomach19,20,23,24. Transgeneza jest stosowana do manipulowania stabilną ekspresją lub funkcją genów w sposób specyficzny dla typu komórki. System Tol2 jest skutecznie wykorzystywany do generowania zwierząt transgenicznych poprzez jednoczesne wstrzykiwanie mRNA transpozazy z plazmidem DNA Tol2 zawierającym transgene25,26. System Tol2 wykorzystuje transpozazę Tol2 medaka do generowania stabilnych insercji linii zarodkowej konstruktu transgenicznego17. Generowanie transgeników Tol2 polega na jednoczesnym wstrzyknięciu plazmidu zawierającego transgen otoczony miejscami integracji Tol2 i mRNA dla transpozazy Tol217. System ten został wykorzystany do wygenerowania szeregu linii transgenicznych u danio pręgowanego, a ostatnio jego zastosowanie rozszerzyło się na dodatkowe pojawiające się systemy modelowe, w tym pielęgnice, karpiaki, cierniki, a ostatnio meksykańskie ryby jaskiniowe27,28,29,30.

Chociaż ryba jaskiniowa jest fascynującym systemem biologicznym do wyjaśniania mechanizmów ewolucji cech, jej pełne możliwości jako modelu ewolucyjnego nie zostały w pełni wykorzystane. Było to częściowo spowodowane niezdolnością do bezpośredniego manipulowania funkcjami genetycznymi i komórkowymi31. Geny kandydujące regulujące złożone cechy zostały zidentyfikowane za pomocą badań loci cech ilościowych (QTL), ale walidacja tych genów kandydujących była trudna32,33,34. Ostatnio przejściowe knockdown za pomocą morpholinos, edycja genów za pomocą systemów CRISPR i TALEN oraz zastosowanie transgenezy za pośrednictwem Tol2 zostały wykorzystane do zbadania podstaw genetycznych leżących u podstaw wielu cech35,36,37,38. Wdrożenie i standaryzacja tych technik pozwoli na manipulacje, które badają molekularne i neuronalne podstawy cech biologicznych, w tym manipulację funkcją genów, znakowanie zdefiniowanych populacji komórek i ekspresję funkcjonalnych reporterów. Podczas gdy pomyślne wdrożenie tych narzędzi genetycznych do manipulowania funkcjami genów lub komórek zostało zademonstrowane w nowych systemach modelowych, w przypadku A. mexicanus nadal brakuje szczegółowych protokołów.

A. mexicanus dostarcza krytycznego wglądu w mechanizmy ewolucji w odpowiedzi na zmieniające się środowisko i daje możliwość zidentyfikowania nowych genów regulujących różne cechy. Wiele czynników sugeruje, że A. mexicanus jest niezwykle elastycznym modelem do stosowania uznanych narzędzi genomicznych dostępnych obecnie w uznanych modelach genetycznych, w tym zdolności do łatwego utrzymywania ryb w laboratoriach, dużego rozmiaru lęgu, przezroczystości, sekwencjonowanego genomu i zdefiniowanych testów behawioralnych39. W tym miejscu opisano metodologię stosowania morfolinosów, transgenezy i edycji genów w populacjach powierzchniowych i jaskiniowych A. mexicanus. Szersze zastosowanie tych narzędzi u A. mexicanus pozwoli na mechanistyczne badanie procesów molekularnych leżących u podstaw ewolucji różnic rozwojowych, fizjologicznych i behawioralnych między rybami jaskiniowymi a rybami powierzchniowymi.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Projekt oligo Morpholino

UWAGA: Sekwencje dla A. mexicanus są dostępne przez National Center of Biotechnology Information (NCBI) Gene i NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov), a także przez przeglądarkę genomu Ensembl (https://www.ensembl.org). Projektując morfolino do stosowania zarówno w formach żyjących na powierzchni, jak i w jaskiniach, kluczowe znaczenie ma zidentyfikowanie na tym etapie wszelkich różnic genetycznych między morfami, aby można było uniknąć tych regionów genetycznych jako celów dla morfolinosów. Każda zmienność polimorficzna w miejscu docelowym morfolino może prowadzić do nieskutecznego wiązania. Projekt jest podobny do innych systemów rybnych, takich jak danio pręgowany, i wcześniej wykazano, że działa skutecznie w A. mexicanus21,36,40.

  1. Konstrukcja morfinów blokujących translację
    UWAGA: Morfoliny blokujące translację blokują translację poprzez wiązanie się z endogennym miejscem startowym i utrudniają maszynerii translacyjnej wiązanie sekwencji mRNA poprzez przeszkodę steryczną.
    1. Zidentyfikuj region kodujący docelowego genu, zaczynając od miejsca startowego ATG.
    2. Zapisz pierwsze 25 par zasad sekwencji docelowej, kopiując i wklejając sekwencję w edytorze tekstu lub notatniku laboratoryjnym.
    3. Korzystając z oprogramowania online (np. http://reverse-complement.com) lub ręcznego tłumaczenia, wygeneruj odwrotne dopełnienie sekwencji docelowej. Zapisz wynikowe odwrotne uzupełnienie w edytorze tekstu lub notatniku laboratoryjnym.
    4. Zamów morfolino z odwrotną sekwencją dopełniacza w firmie produkującej oligonukleotydy morfolinooligonukleotydów. Zobacz tabelę materiałów dla firm.
  2. Projektowanie morpholinos
    blokujących spawy     UWAGA: Morfoliny blokujące splicing blokują splicing, a tym samym zapobiegają tworzeniu się dojrzałej cząsteczki mRNA. Zapewnia to alternatywną metodę knockdownu, gdy miejsca startowe nie są dobrze zdefiniowane, lub bardziej optymalne podejście, gdy pożądana jest walidacja knockdown za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). Ta zaleta morfolinos blokujących splice (nad MO blokującymi ATG) polega na tym, że wykluczenie eksonów lub włączenie intronów można łatwo ocenić za pomocą odwrotnej transkryptazy (RT)-PCR i różnic wielkości uwidocznionych na żelu. RT-PCR i elektroforeza żelowa w celu określenia skuteczności morfoliny powinny być wykonywane przy użyciu standardowych procedur laboratoryjnych.
    1. Zidentyfikuj sekwencję pre-mRNA genu docelowego. Wykorzystaj dostępne informacje z genomu A. mexicanus za pośrednictwem NCBI lub Ensembl, aby określić granice intron-ekson33.
    2. Docelowe miejsca inkornu egzonu i intronu (donora splicingu) lub granicy intron-ekson (akceptor splicingu) w celu włączenia lub wykluczenia eksonu.
      UWAGA: Spliceosom zwykle celuje w sekwencję "GU" (cel U1) w intronie w miejscu splicingu 5' i sekwencję "AG" w miejscu splicingu intronowego 3' (cel U2). W normalnych warunkach podjednostki spliceosomów U1 i U2 wiążą te miejsca docelowe w sekwencji pre-mRNA, aby nastąpił prawidłowy splicing. Jeśli jednak którakolwiek z tych sekwencji docelowych zostanie zablokowana przez morfolino, spliceosom przejdzie do następnego dostępnego miejsca U1 lub U2, powodując wykluczenie intronu lub ekson w sekwencji mRNA. Będzie to wymagało planowania/optymalizacji, w zależności od charakteru docelowego genu 21. Ogólnie rzecz biorąc, zablokowanie wewnętrznego miejsca U1 przekierowuje splot do następnego dostępnego miejsca U1, powodując wycięcie eksonu. Alternatywnie, zablokowanie pierwszego lub ostatniego złącza spawu powoduje włączenie intronu, ponieważ nie ma innego miejsca, do którego można przekierować spawóz. Użyj oprogramowania sekwencyjnego, aby przewidzieć wpływ różnych wykluczeń i włączeń. Przewidywania mogą wskazywać na potencjalne przesunięcia ramki odczytu lub przedwczesne kodony stop, wskazując na bardziej efektywne miejsce docelowe dla rozerwania mRNA.
    3. Po zidentyfikowaniu miejsca docelowego zapisz jego sekwencję w edytorze tekstu lub książce laboratoryjnej. Upewnij się, że lokacja docelowa ma długość 25 par zasad (bp).
    4. Korzystając z oprogramowania online (np. http://reverse-complement.com) lub ręcznego tłumaczenia, wygeneruj odwrotne dopełnienie sekwencji docelowej. Zapisz jego sekwencję w edytorze tekstu lub książce laboratoryjnej.
    5. Zamów morfolino z odwrotną sekwencją dopełniacza w firmie produkującej oligonukleotydy morfolinooligonukleotydów. Zobacz tabelę materiałów dla przykładowych firm.

2. Morfolinosy do wstrzykiwań

UWAGA: Konieczne będzie wykonanie kilku stężeń lub objętości iniekcji MO, aby ustalić optymalne stężenie do wstrzyknięcia. Typowe ilości iniekcji to 400–800 pg MO. Efekt knockdown morpholino może utrzymywać się do 6 dni po wstrzyknięciu.

  1. Zdobądź zapas morpholino. Morfolino zapasowe przybywa liofilizowane. Przed użyciem należy go uwodnić sterylnymH2Ow pożądanym stężeniu podstawowym (np. 4 mM). Przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu użycia.

3. Projektowanie gRNA CRISPR, transkrypcja in vitro i przygotowanie

  1. Konstrukcja CRISPR gRNA
    UWAGA: gRNA zostały wygenerowane na podstawie wcześniej opublikowanych badań przez Varshney et al.40 i Wierson et al.41.
    1. Korzystając z przeglądarki genomu, zidentyfikuj region kodujący gen będący przedmiotem zainteresowania. Korzystając z sekwencji genomowej, zidentyfikuj sekwencję docelową gRNA w eksonie, szukając sekwencjonowania docelowego nukleotydu o długości 20 pz, zaczynając od GG, a następnie sekwencję PAM (NGG). Region genu po starcie (ATG) będzie celowany.
      UWAGA: Jeśli nie można znaleźć sekwencji docelowej z GG na końcu 5' w pożądanym eksonie genu, jeden lub oba G można zastąpić pierwszym i drugim nukleotydem na końcu sekwencji 5'. Jednak dwa G muszą być włączone do oligogo, ponieważ są one wymagane do transkrypcji T7.
    2. Zaprojektuj i zamów oligonukleotyd specyficzny dla genu (oligo A: 5'-TAATACGACTCACTATAGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3'). Dodaj specyficzną dla genu sekwencję docelową gRNA 20 pz (pogrubioną) bez sekwencji PAM między sekwencją promotora T7 (czerwony) a sekwencją nakładającą się używaną do wyżarzania do drugiego oligonukleotydu (niebieski). Wyżarzaj i amplifikuj (patrz krok 3.2.1) ten oligo A i drugi oligo (oligo B: 5'- GATCCGCACCGACTCGTGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTT AACTTGTATTTCTAGCTCTAAAAC-3') w celu wygenerowania matrycy gRNA używanej do transkrypcji.
      UWAGA: Oligo B jest taki sam dla każdej reakcji i wystarczy zamówić go tylko 1x.
  2. Otrzymywanie i transkrypcja gRNA
    1. Wyżarzanie i wzmacnianie oligonukleotydów. Dołącz następujące startery do amplifikacji gRNA w celu zwiększenia wydajności: 5'-TAATACGACTCACTATA-3' (starter T7) i 5'- GATCCGACCGACTCGGTG-3' (starter 3' gRNA). Wykonaj PCR przy użyciu polimerazy Thermococcus kodakaraensis (KOD).
      UWAGA: W przypadku zarówno starterów w oligo A, jak i oligo B, zaleca się 10 cykli w celu uzyskania dobrej wydajności. Szczegółowy protokół można znaleźć w Wierson et al.41.
    2. Transkrybuj gRNA przy użyciu dostępnych na rynku zestawów do transkrypcji in vitro (patrz tabela materiałów). Odbywa się to poprzez modyfikacje protokołu producenta opublikowanego przez Klaassena i wsp.42.
    3. Wytrącić, przemyć i ponownie zawiesić gRNA zgodnie z opisem Klaassena i wsp.42.
      UWAGA: gRNA musi być ponownie zawieszone w wodzie wolnej od RNaz, aby zapobiec degradacji.
    4. Zapisz stężenie gRNA, które można określić za pomocą spektrofotometru. Oceń jakość RNA, przeprowadzając 2 μl na żelu agarozowym. Podwielokrotność RNA, aby uniknąć zamrożenia/rozmrożenia i przechowywać ją w temperaturze -80 °C do momentu bezpośrednio przed wstrzyknięciem.
  3. Przygotowanie i transkrypcja Cas9
    1. MRNA Cas9 można transkrybować za pomocą dostępnych na rynku zestawów do transkrypcji in vitro (patrz tabela materiałów), jak opisano wcześniej43. Użyj wersji nls-Cas9-nls 43.
    2. Zapisz stężenie gRNA i oceń jego jakość, przeprowadzając 2 μl na żelu agarozowym. Podwielokrotność RNA, aby uniknąć rozkładu, który powstaje w wyniku wielu cykli zamrażania i rozmrażania, i przechowywać podwielokrotności w temperaturze -80 °C.

4. Przygotowanie konstrukcji Tol2, transpozaza Tol2 i transgeneza

  1. Przygotuj konstrukty transgenu Tol2 do wstrzyknięcia.
    UWAGA: Z powodzeniem wykorzystaliśmy opublikowane/dostępne konstrukty danio pręgowanego i medaka w A. mexicanus. Konstrukty te są w pełni funkcjonalne u A. mexicanus, prawdopodobnie ze względu na wysoki poziom homologii sekwencji (dostępne konstrukcje można znaleźć w repozytorium AddGene i bazach danych Zebrafish Information Network [ZFIN]). Fragmenty promotora danio pręgowanego uległy ekspresji transgenów w oczekiwanych tkankach, gdy są stosowane u A. mexicanus.
    1. Zdobądź konstrukty Tol2 lub wygeneruj plazmid z specyficznym tkankowo promotorem, pożądanym transgenem i ramionami Tol2 (patrz Kwan et al.44). Po otrzymaniu zsekwencjonuj konstrukt, aby zweryfikować plazmid.
    2. Wykonaj midiprep dla konstrukcji zgodnie z wytycznymi producenta. Eluować końcowy plazmid w H2O wolnym od RNaz, oznaczyć stężenie za pomocą spektrofotometru, rozcieńczyć stężenie do 100–300 ng/μL, a następnie podwielokrotnić i przechowywać konstrukty w temperaturze -20 °C.
  2. Trawić plazmid transpozazy Tol2 i syntetyzować mRNA.
    1. Uzyskaj kopię plazmidu transpozazy Tol2 (pCS-zT2TP) jako matrycę do generowania mRNA45.
    2. Midiprep konstrukcję pCS-zT2TP zgodnie z wytycznymi producenta. Eluuj go w małej objętości wody lub buforu wolnego od RNaz (~50 μL). Przechowywać podwielokrotności w temperaturze -20 °C.
    3. Trawić plazmid Tol2 za pomocą enzymu restrykcyjnego.
      1. Przeprowadzić trawienie restrykcyjne na 10 μg kolistego plazmidu pCS-zT2TP, korzystając z Tabeli 1.
      2. Podzielić reakcję na 2–50 μl i inkubować reakcje przez noc w temperaturze 37 °C w termocyklerze.
      3. Następnego dnia dezaktywować enzym, podgrzewając go do temperatury 65 °C przez 20 minut.
      4. Zlinearyzowany plazmid należy oczyścić natychmiast po trawieniu, używając dostępnych na rynku zestawów do oczyszczania PCR (patrz tabela materiałów) zgodnie z wytycznymi producentów. Eluować plazmid w 15 μlH2Owolnego od RNaz i oznaczyć stężenie produktu za pomocą spektrofotometru.
      5. Uruchom 1 μl strawionego plazmidu i 1 μl nieoszlifowanego plazmidu na 1,5% żelu agarozowym, aby potwierdzić linearyzację plazmidu.
    4. Wykonaj transkrypcję in vitro mRNA Tol2.
      1. Wykorzystaj 1 μg zlinearyzowanego plazmidu pCS-zT2TP jako matrycę do transkrypcji. Należy postępować zgodnie z wytycznymi producenta dotyczącymi transkrypcji in vitro (patrz tabela materiałów) zgodnie z opisem w tabeli 2.
      2. Inkubować w temperaturze 37 °C w termocyklerze zgodnie z wytycznymi producenta.
      3. Dodać 1 μl DNazy, inkubować w temperaturze 37 °C w termocyklerze zgodnie z wytycznymi producenta.
      4. Wykonaj wytrącanie chlorku litu zgodnie z protokołem zestawu do transkrypcji. Zawiesić osad RNA w ~20–30 μL H2O wolnego od RNaz.
      5. Oznaczyć stężenie produktu za pomocą spektrofotometru i zarejestrować jakość RNA.
      6. Rozcieńczyć produkt do ~100–300 ng/μl i podzielić go na próbki o objętości 5–10 μl, aby uniknąć wielokrotnego zamrażania i rozmrażania. Przechowywać je w temperaturze -80 °C do momentu użycia.
        UWAGA: Możliwe jest sprawdzenie 1–2 μl oczyszczonego mRNA Tol2 pod kątem rozmazu/opaski za pomocą elektroforezy żelowej.

5. Mikroiniekcje

  1. Przygotowanie ogólnych narzędzi do wstrzykiwań
    UWAGA: Procedury opisane w tej sekcji zostały szczegółowo opisane przez Kowalko et al.46, a przegląd z niewielkimi modyfikacjami znajduje się tutaj.
    1. Wytwarzać płytki iniekcyjne, wlewając ciepłą 3% agarozę rozpuszczoną w wodzie z systemu rybnego do płytki Petriego o pojemności 100 ml. Ostrożnie umieść formę do wtryskiwania jaj w świeżo nalanej agarozie, aby zrobić dołki na ikrę ryb. Umieść bok formy w agarze pod kątem 45°, a następnie powoli opuść go do agarozy; Powolne opuszczanie formy pod kątem zapobiega uwięzieniu powietrza pod formą. Delikatnie usuń pleśń, gdy agaroza zastygnie. Płytki można przechowywać, szczelnie, w temperaturze 4 °C przez okres do 1 tygodnia.
    2. Z kapilar ze szkła borokrzemianowego wyciągnąć igły do wstrzykiwań w ściągaczu elektroda/igła zgodnie z wytycznymi producenta. Protokół ten różni się w zależności od ściągacza pipet; jednak przykładowy program wyciągania igły można znaleźć w tabeli 3.
      UWAGA: Optymalizacja igły jest ważna w przypadku wstrzyknięć, ponieważ igły, które są zbyt długie, będą się raczej zginać niż czysto penetrować jajo.
    3. Wykonaj szklane pipety o dużym otworze do przenoszenia jaj, rozbijając standardowe szklane pipety tak, aby otwór był wystarczająco duży dla jaj. Za pomocą palnika Bunsena wypoleruj pęknięty koniec szklanki, wystawiając koniec potłuczonych pipet na działanie płomienia, aż będzie gładki.
  2. Konfiguracja hodowlana
    UWAGA: Istnieje wiele różnych protokołów stosowanych do hodowli A. mexicanus. Szczegółowy protokół można znaleźć na stronie Borowsky39. Rozpocznij hodowlę 1 tydzień przed wstrzyknięciami.
    1. W dniu 1 umieść dwie do trzech samic i trzy do czterech samców w pojedynczym zbiorniku o pojemności 10 galonów utrzymywanym w temperaturze 24 ± 1 °C.
    2. W dniach 1-7 zwiększ karmienie do ~3x dziennie. Upewnij się, że dieta zawiera żywe pokarmy, takie jak czarne robaki i krewetki solankowe.
    3. W dniu 6 dodaj pojedynczą grzałkę zbiornika ustawioną na 27 °C. Temperatury zbiornika laboratoryjnego mogą się różnić, dlatego będzie to wzrost o 2-3 °C w stosunku do normalnej temperatury zbiornika.
    4. Wieczorem dnia 7, który jest wieczorem (zeitgeber [ZT] 9–11) nocy iniekcyjnej, należy dokładnie oczyścić zbiorniki gąbką nasączoną wodą i usunąć nadmiar jedzenia lub zanieczyszczeń za pomocą siatki o drobnych oczkach lub syfonu.
    5. W nocy 7 dnia rozpocznij sprawdzanie ikry ryb powierzchniowych w ZT15 i kontynuuj sprawdzanie co 15–30 minut aż do ZT18. W przypadku ryb jaskiniowych rozpocznij sprawdzanie ikry w ZT17 i kontynuuj sprawdzanie co 15–30 minut do ZT20.
      UWAGA: Czasy są oparte na cyklu 14:10 h światło:ciemność przy użyciu czasu zeitgeber. Czas hodowli jest szacunkowy, a poszczególne laboratoria muszą określić dokładny czas. Bardzo ważne jest, aby pobrać jaja wkrótce po ich uwolnieniu/zapłodnieniu, aby wstrzyknąć je na etapie pojedynczej komórki.
  3. Pobieranie jaj w stadium jednokomórkowym
    1. W nocy, w której spodziewany jest lęg, sprawdzaj zbiorniki co 15–30 minut i monitoruj jaja na dnie zbiornika. Jaja wydają się półprzezroczyste, mają średnicę około 1 mm.
    2. Użyj siatki rybackiej o drobnych oczkach, aby zebrać jaja i przenieść je do szklanej miski wypełnionej świeżą wodą z systemu rybnego. Zbadaj jaja pod mikroskopem, aby potwierdzić, że jaja są w stadium jednokomórkowym.
    3. Za pomocą szklanych pipet przenieść jednokomórkowe komórki jajowe na płytki iniekcyjne. Na tym etapie wymagane są szklane pipety, ponieważ jaja będą przyklejać się do plastiku.
    4. Za pomocą pipety ostrożnie wypuścić jaja do dołków płytki do wstrzykiwań agarozy z ppkt 5.1. Rzędy wstępnie podgrzanej (w temperaturze pokojowej) płytki iniekcyjnej należy wypełnić maksymalną liczbą jaj (30–40 w rzędzie i do pięciu rzędów). Pełne rzędy zapobiegają przemieszczaniu się jaj podczas wstrzyknięć. Jaja należy przechowywać nawodnione na płytce iniekcyjnej z niewielką ilością wody z systemu rybnego do czasu wykonania wstrzyknięć.
  4. Konfiguracja wtrysku Pico i ogólne wytyczne dotyczące optymalizacji wtrysku
    1. Wypełnić igły iniekcyjne za pomocą końcówek do pipet z żelem, które mieszczą się w kapilarze, lub za pomocą standardowych końcówek do mikropipet, dodając na końcu bolus o objętości 2–4 μl. Po napełnieniu igły należy użyć kleszczyków, aby przyciąć nadmiar długości z igły do wstrzykiwań.
    2. Mikroiniekcje należy wykonywać za pomocą igły zamontowanej w mikromanipulatorze, podłączonej do mikroiniektora pikolitrowego.
    3. Ustaw czas wtrysku na 0,03 s, a ciśnienie wyjściowe na ~0,0 psi. Ciśnienie iniekcji będzie się odpowiednio różnić z niewielkimi różnicami między igłami, więc zoptymalizuj, aby uzyskać bolus iniekcyjny ~1,0 nL.
      UWAGA: Ciśnienie wtrysku często mieści się w zakresie ~10–30 psi.
    4. Ustandaryzować bolus iniekcyjny, wstrzykując go do oleju mineralnego i mierząc rozmiar bolusa za pomocą mikrometru szkiełkowego, aby uzyskać objętość wstrzyknięcia ~1–1,5 nL. Wyreguluj ciśnienie wtrysku (psi), aby zwiększyć lub zmniejszyć objętość bolusa.
    5. Odciągnij wodę z samej górnej części jaj za pomocą chusteczki laboratoryjnej.
      UWAGA: Kosmówka jaja Astyanax jest nieco trudniejsza do przeniknięcia niż jaja danio pręgowanego. Odkryliśmy, że ściąganie wody z wierzchu jaj ułatwia penetrację igły w jaju. Optymalizacja talerza może pozwolić na ~200 jaj na jednym talerzu.
    6. Za pomocą mikromanipulatora przeniknąć igłą do każdego jajka i wstrzyknąć bezpośrednio do żółtka. Po umieszczeniu w żółtku należy wstrzyknąć jajko, naciskając przycisk wstrzykiwania lub pedał nożny wstrzykiwania.
      UWAGA: Pełną płytkę można wstrzyknąć w ciągu ~15 min. Faza jednokomórkowa trwa ~40 min.
  5. Wstrzykiwanie morfolinos
    UWAGA: Ilość morfolino niezbędna do knockdownu bez powodowania toksyczności będzie musiała być zoptymalizowana dla każdego docelowego genu; Jednak stężenie 400 pg jest dobrym punktem wyjścia.
    1. Przygotuj morpholino tak, aby wstrzyknąć 400 pg morpholino na jajko. Rozmrozić morpholino na lodzie. Roztwór do wstrzykiwań składa się z morfoliny (w pożądanym stężeniu), wolnego od RNazH2Olub roztworu Danieau oraz czerwieni fenolowej (10% końcowej objętości). Przykład znajduje się w tabeli 4.
    2. Wstrzyknąć 1 nl na zarodek.
  6. Iniekcje CRISPR
    1. Przygotuj RNA tak, aby na zarodek zostało wstrzyknięte łącznie 25 pg gRNA i 300 pg mRNA Cas9. Próbkę mieszaniny iniekcyjnej CRISPR/Cas9 przedstawiono w tabeli 5.
    2. Wstrzyknąć 2 nL mRNA gRNA/Cas9 na zarodek bezpośrednio do zarodka.
  7. Wstrzyknięcie transpozazy Tol2 i plazmidu flankowanego Tol2 w celu transgenezy
    1. Rozmrozić transpozazę mRNA i plazmid Tol2 na lodzie. Połącz mRNA Cas9 (przy 25 ng / μl), pożądany konstrukt Tol2 (przy 25 ng / μl) i czerwień fenolową (≤10% końcowej objętości) w wodzie wolnej od RNaz. Próbkę mieszaniny do wstrzykiwań transgenezy Tol2 znajduje się w Tabeli 6.
    2. Roztwór do wstrzykiwań i igły należy przechowywać na lodzie, aby uniknąć degradacji mRNA. Wstrzykiwać w objętości 1 nl na zarodek.

6. Hodowla i przesiewanie wstrzykiwanych ryb

  1. Hodowla ryb iniekcyjnych
    1. Po wstrzyknięciu jaj należy je natychmiast przenieść do szklanych misek (10 x 5 cm) wypełnionych ~200 ml wody z systemu rybnego. Jaja można łatwo wypłukać, zanurzając płytki iniekcyjne w miskach wypełnionych wodą rybną i płucząc jaja pipetą.
    2. Umieść ~50–80 wstrzykniętych zarodków w misce i hoduj je w temperaturze 22–24 °C.
    3. Czyść miski z wstrzykiwanymi rybami 2 razy dziennie, aby usunąć martwe zarodki i codziennie wymieniaj ~20% wody.
    4. Dodatkowy chów odbywa się zgodnie z wcześniej opublikowanymi protokołami39.
  2. Badania przesiewowe osób, którym wstrzyknięto morfolinę
    1. Wizualizuj zwierzęta pod mikroskopem stereoskopowym, aby przeprowadzić badania przesiewowe pod kątem fenotypów. Działanie morpholinos może utrzymywać się do ~5 dni po wstrzyknięciu21.
    2. Zmierz fenotypy behawioralne po 4 dniach od wstrzyknięcia.
  3. Badania przesiewowe pod kątem indeli CRISPR
    1. Zaprojektuj startery do amplifikacji genomowego DNA wokół miejsca docelowego. Zaprojektuj startery tak, aby docelowy produkt PCR wynosił około 100–125 p.
      UWAGA: Na przykład w przypadku locus oca2 region otaczający miejsce docelowe gRNA amplifikowano przy użyciu startera do przodu 5'-CTCCTCTGTCAGGCTGTGC-3' i startera odwrotnego 5'- GAAGGGGATGTTGTCTATGAGC-3' dla produktu PCR o długości 105 pz.
    2. Składaj w ofierze zarodki lub obcinaj płetwy dorosłym rybom zgodnie z instytucjonalnym protokołem dla zwierząt.
    3. Pobrać zarodki lub wypreparowane płetwy do probówek PCR, wyekstrahować DNA i przeprowadzić PCR. Przykładowe protokoły PCR dla starterów specyficznych dla genu można znaleźć w Ma et al.35.
    4. Aby ocenić mutagenezę, uruchom 5 μl produktu PCR na 3% żelu agarozowym pod napięciem 70 V przez 3 godziny. DNA typu dzikiego (niemutagenizowanego) spowoduje, że produkt PCR będzie odrębnym pasmem. Zmutowane DNA spowoduje powstanie rozmazu na żelu.
    5. Aby określić sekwencję zmutowanych alleli, TA klonuje produkt PCR zgodnie z instrukcjami producenta, wybiera kolonie i miniprep kultury. Wyślij powstałe DNA do sekwencjonowania.
    6. Aby ustalić i utrzymać linie ryb przenoszących zmutowane allele, krzyżuj dorosłe ryby, którym wstrzyknięto rośliny, z rybami typu dzikiego i przesiewaj 5-10 zarodków w celu ustalenia, czy którekolwiek z potomstwa jest nosicielem zmutowanego allelu genu, wykonując kroki 6.3.1-6.3.6.
      UWAGA: Różne osobniki F1 z tej samej ryby założyciela F0 mogą być nosicielami różnych mutacji. Upewnij się, że linie mutantów są sekwencjonowane w celu uzyskania mutacji, które zgodnie z przewidywaniami wytwarzają allele poza ramką.
    7. Zidentyfikuj ryby będące nosicielami zmutowanego allelu za pomocą PCR przy użyciu testu prążkowania rozmazu (kroki 6.3.1-6.3.6) lub projektując startery PCR specyficzne dla alleli, które wzmocnią zmutowane i dzikie prążki (Rysunek 2C).
    8. Po ustaleniu linii ryb homozygotyczne zmutowane allele do przetestowania pod kątem fenotypów recesywnych.
  4. Badania przesiewowe dla osób transgenicznych dodatnich
    UWAGA: Zaleca się stosowanie konstruktów zawierających fluorescencyjny ekspres w celu usprawnienia badań przesiewowych dla osób transgenicznych dodatnich. Jednak standardowe metody przesiewowe PCR mogą być stosowane do badań przesiewowych pod kątem transmisji.
    1. Wizualizacja specyficznych tkankowo białek fluorescencyjnych u ryb F0 już 2 dni po wstrzyknięciu, za pomocą zakresu preparacji epifluorescencji.
      UWAGA: Ekspresja larw F0 jest mozaikowa, a osoby dodatnie mogą mieć szereg fenotypów ekspresji.
    2. Utrzymuj pozytywne osoby jako rybę założyciela F0.
    3. Gdy F0s osiągną dojrzałość, krzyżuj wstecznie ryby z nietransgenicznymi osobnikami pochodzącymi z tej samej populacji/stada laboratoryjnego. Potomstwo na ekranie F1 przy użyciu tego samego protokołu, co opisano w kroku 6.2.
      UWAGA: Ekspresja larw F1 jest jednolita i zapewnia spójność wśród rodzeństwa F1.
    4. Ponieważ integracja Tol2 nie jest zapośredniczona przez witrynę, a integracja może się różnić w zależności od założycieli, wybrane rodzeństwo F1 uzyskało jednego założyciela F0 i krzyżowało rodzeństwo F1 o dodatniej ekspresji, aby wygenerować F2s. To potomstwo będzie podstawą stabilnej linii.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wiele populacji A. mexicanus żyjących w jaskiniach wykazuje zmniejszoną ilość snu i zwiększoną czujność/aktywność w stosunku do ich współplemieńców żyjących na powierzchni14. Hipokretyna/oreksyna (HCRT) jest wysoce konserwatywnym neuropeptydem, który działa w celu zwiększenia czuwania, a aberracje w szlaku HCRT powodują narkolepsję u ludzi i innych ssaków47,48. Wcześniej wykazaliśmy, że jaskiniowy A. mexicanus ma zwiększo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym miejscu przedstawiliśmy metodologię manipulowania funkcją genów za pomocą morfolinosów, edycji genów CRISPR/Cas9 i metodologii transgenezy. Bogactwo technologii genetycznej i optymalizacja tych systemów u danio pręgowanego prawdopodobnie pozwoli na łatwe przeniesienie tych narzędzi do A. mexicanus 52. Ostatnie odkrycia wykorzystują te podejścia u A. mexicanus, ale pozostają one niedostatecznie wykorzystane w badaniu różnych cech morfologicznych, rozwojowych i behawioralnych...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują Sunishce Thakur za pomoc w genotypowaniu i obrazowaniu zmutowanej ryby oca2 przedstawionej w Rysunek 2. Praca ta była wspierana przez nagrodę National Science Foundation (NSF) 1656574 dla A.C.K., nagrodę NSF 1754321 dla J.K. i A.C.K. oraz nagrodę National Institutes of Health (NIH) R21NS105071 dla A.C.K. i E.R.D.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Hodowla ryb i zaopatrzenie jaj
Siatka na ryby o drobnych oczkachPenn PlaxBN4
Podgrzewacz akwariumAqueon100106108
Pułapki na jajkaWykonane na zamówienieNAZaprojektuj i stwórz plastikową kratkę do umieszczenia na dnie zbiornika, aby chronić jaja
Pipety szklaneFisher Scientific13-678-20C
Żarówki do pipetFisher Scientific03-448-21
AgarozaFisher ScientificBP160-500
Foremki do jajAdaptacyjne narzędzia naukoweTU-1
Morpholino supplies
Control MorpholinoGene Tools, LLCStandardowa kontrola olio
Niestandardowe narzędzia genowe Morpholino, LLCNA
Phenol RedSigma AldrichP0290-100ML
em>CRISPR supplies
Cas9 PlasmidAddGene46757
Polimeraza DNA GoTaqPromegaM3001
KOD Hot Start TaqEMD Millipore71-842-3
StarteryZintegrowane technologie DNANiestandardowy
zestaw T7 MegascriptZestaw Ambion/ThermofisherAM1333
miRNeasyQiagen217004
mMessage Zestaw mMachine T3Ambion/ThermofisherAM1348
MinElute ZestawQiagen28204
Tol2 transgenesis supplies
pCS-zT2TPplazmid Kawakami et al., 2004Prośba od starszego autora
CutSmart BufferNew England BiolabsB7204
NotI-HF Restriction EnzymeNew England BiolabsR3189
Zestaw do oczyszczania PCRQiagen28104
SP6 mMessenger KitAmbion/ThermofisherAM1340
Mikroiniekcyjne materiały
szklane rurki kapilarneSutter InstrumentsBF100-58-10
Ściągacz do pipetSutter InstrumentsP-97
PicowtryskiwaczWarner InstrumentsPLI-100A
MikromanipulatorWorld Precision InstrumentsM3301R
Stojak na mikromanipulatorWorld Precision InstrumentsM10
Podstawa mikrofonizatoraWorld Precision InstrumentsPodstawa z blachy stalowej, 10 funtów
<

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Darwin, C. On the Origin of Species by Means of Natural Selection. , D. Appleton and Company. (1859).
  2. Culver, D. C., Pipan, T. The Biology of Caves and Other Subterranean Habitats. , Oxford University Press. New York, NY. (2009).
  3. Mitchell, R. W., Russell, W. H., Elliott, W. R. Mexican Eyeless Characin Fishes, Genus Astyanax: Environment, Distribution, and Evolution. , (1977).
  4. Huppop, K. Oxygen consumption of Astyanax fasciatus (Characidae, Pisces): A comparison of epigean and hypogean populations. Environmental Biology of Fishes. 17, 299-308 (1986).
  5. Moran, D., Softley, R., Warrant, E. J. Eyeless Mexican Cavefish Save Energy by Eliminating the Circadian Rhythm in Metabolism. PLoS ONE. 9 (9), e107877(2014).
  6. Protas, M. E., et al. Genetic analysis of cavefish reveals molecular convergence in the evolution of albinism. Nature genetics. 38, 107-111 (2006).
  7. Wall, A., Volkoff, H. Effects of fasting and feeding on the brain mRNA expressions of orexin tyrosine hydroxylase (TH), PYY and CCK in the Mexican blind cavefish (Astyanax fasciatus mexicanus). General and Comparative Endocrinology. 183, 44-52 (2013).
  8. Aspiras, A., Rohner, N., Marineau, B., Borowsky, R., Tabin, J. Melanocortin 4 receptor mutations contribute to the adaptation of cavefish to nutrient-poor conditions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (31), 9668-9673 (2015).
  9. Yoshizawa, M., Gorički, Š, Soares, D., Jeffery, W. R. Evolution of a behavioral shift mediated by superficial neuromasts helps cavefish find food in darkness. Current Biology. 20 (18), 1631-1636 (2010).
  10. Jeffery, W. R. Regressive Evolution in Astyanax Cavefish. Annual Review of Genetics. 43, 25-47 (2009).
  11. Gross, J. B. The complex origin of Astyanax cavefish. BMC Evolutionary Biology. 12, 105(2012).
  12. Elipot, Y., Hinaux, H., Callebert, J., Rétaux, S. Evolutionary shift from fighting to foraging in blind cavefish through changes in the serotonin network. Current Biology. 23 (1), 1-10 (2013).
  13. Kowalko, J. E. J., et al. Loss of schooling behavior in cavefish through sight-dependent and sight-independent mechanisms. Current Biology. 23 (19), 1874-1883 (2013).
  14. Duboué, E. R. E. R., Keene, A. C. A. C., Borowsky, R. L. R. L. Evolutionary convergence on sleep loss in cavefish populations. Current Biology. 21 (8), 671-676 (2011).
  15. Chin, J. S., et al. Convergence on reduced stress behavior in the Mexican blind cavefish. Developmental Biology. , (2018).
  16. Scheer, N., Campos-Ortega, J. A. Use of the Gal4-UAS technique for targeted gene expression in the zebrafish. Mechanisms of Development. 80 (2), 153-158 (1999).
  17. Kawakami, K., Shima, A., Kawakami, N. Identification of a functional transposase of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish, and its transposition in the zebrafish germ lineage. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (21), 11403-11408 (2000).
  18. Balciunas, D., et al. Enhancer trapping in zebrafish using the Sleeping Beauty transposon. BMC Genomics. , (2004).
  19. Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair. Genome Research. 24 (1), 142-153 (2014).
  20. Kimura, Y., Hisano, Y., Kawahara, A., Higashijima, S. I. Efficient generation of knock-in transgenic zebrafish carrying reporter/driver genes by CRISPR/Cas9-mediated genome engineering. Scientific Reports. 4, (2014).
  21. Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. A Primer for Morpholino Use in Zebrafish. Zebrafish. 6 (1), 69-77 (2009).
  22. Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene “knockdown” in zebrafish. Nature Genetics. , (2000).
  23. Sander, J. D., et al. Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs. Nature Biotechnology. , (2011).
  24. Huang, P., et al. Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs. Nature Biotechnology. , (2011).
  25. Kawakami, K. Transposon tools and methods in zebrafish. Developmental Dynamics. 234 (2), 244-254 (2005).
  26. Urasaki, A., Morvan, G., Kawakami, K. Functional dissection of the Tol2 transposable element identified the minimal cis-sequence and a highly repetitive sequence in the subterminal region essential for transposition. Genetics. 174 (2), 639-649 (2006).
  27. Juntti, S. A., Hu, C. K., Fernald, R. D. Tol2-Mediated Generation of a Transgenic Haplochromine Cichlid, Astatotilapia burtoni. PLoS ONE. 8 (10), (2013).
  28. Harel, I., Valenzano, D. R., Brunet, A. Efficient genome engineering approaches for the short-lived African turquoise killifish. Nature Protocols. 11 (10), 2010-2028 (2016).
  29. Erickson, P. A., Ellis, N. A., Miller, C. T. Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks. Journal of Visualized Experiments. (111), e54055(2016).
  30. Elipot, Y., Legendre, L., Père, S., Sohm, F., Rétaux, S. Astyanax transgenesis and husbandry: how cavefish enters the laboratory. Zebrafish. 11 (4), 291-299 (2014).
  31. Keene, A., Yoshizawa, M., McGaugh, S. Biology and Evolution of the Mexican Cavefish. , Academic Press. New York, NY. (2015).
  32. Casane, D., Rétaux, S. Evolutionary Genetics of the Cavefish Astyanax mexicanus. Advances in Genetics. 95, 117-159 (2016).
  33. Mcgaugh, S., et al. The cavefish genome reveals candidate genes for eye loss. Nature Communications. 5, 5307(2014).
  34. Yoshizawa, M., et al. Distinct genetic architecture underlies the emergence of sleep loss and prey-seeking behavior in the Mexican cavefish. BMC Biology. 13 (1), (2015).
  35. Ma, L., Jeffery, W. R., Essner, J. J., Kowalko, J. E. Genome editing using TALENs in blind Mexican cavefish, Astyanax mexicanus. PLoS ONE. 10 (3), (2015).
  36. Bilandzija, H., Ma, L., Parkhurst, A., Jeffery, W. A potential benefit of albinism in Astyanax cavefish: downregulation of the oca2 gene increases tyrosine and catecholamine levels as an alternative to melanin synthesis. PLoS ONE. 8 (11), e80823(2013).
  37. Alie, A., et al. Developmental evolution of the forebrain in cavefish: from natural variations in neuropeptides to behavior. eLife. 7, e32808(2018).
  38. Jaggard, J. B., et al. Hypocretin underlies the evolution of sleep loss in the Mexican cavefish. eLife. 7, e32637(2018).
  39. Borowsky, R. Handling Astyanax mexicanus eggs and fry. Cold Spring Harbor Protocols. 3 (11), (2008).
  40. Varshney, G. K., Sood, R., Burgess, S. M. Understanding and Editing the Zebrafish Genome. Advances in Genetics. 92, 1-52 (2015).
  41. Wierson, W. A., et al. GeneWeld: a method for efficient targeted integration directed by short homology. BioRxiv. , (2018).
  42. Klaassen, H., Wang, Y., Adamski, K., Rohner, N., Kowalko, J. E. CRISPR mutagenesis confirms the role of oca2 in melanin pigmentation in Astyanax mexicanus. Developmental Biology. , (2018).
  43. Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (34), 13904-13909 (2013).
  44. Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: A multisite gateway-based construction Kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).
  45. Kawakami, K., et al. A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish. Developmental Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
  46. Kowalko, J., Ma, L., Jeffery, W. Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases (TALENs). Journal of Visualized Experiments. (112), e54113(2016).
  47. Nishino, S., Ripley, B., Overeem, S., Lammers, G. J., Mignot, E. Hypocretin (orexin) deficiency in human narcolepsy. Lancet. , (2000).
  48. Lin, L., et al. The sleep disorder canine narcolepsy is caused by a mutation in the hypocretin (orexin) receptor 2. Cell. , (1999).
  49. Park, H. C., et al. Analysis of upstream elements in the HuC promoter leads to the establishment of transgenic Zebrafish with fluorescent neurons. Developmental Biology. 227 (2), 279-293 (2000).
  50. Higashijima, S., Masino, M. A., Mandel, G., Fetcho, J. R. Imaging Neuronal Activity During Zebrafish Behavior With a Genetically Encoded Calcium Indicator. Journal of Neurophysiology. , (2003).
  51. Vladimirov, N., et al. Light-sheet functional imaging in fictively behaving zebrafish. Nature Methods. 11 (9), 883-884 (2014).
  52. Halpern, M. E., et al. Gal4/UAS transgenic tools and their application to zebrafish. Zebrafish. 5 (2), 97-110 (2008).
  53. Jaggard, J. B., Stahl, B. A., Lloyd, E., Prober, D. A., Duboue, E. R., Keene, A. C. Hypocretin underlies the evolution of sleep loss in the Mexican cavefish. bioRxiv. 7, e32637(2018).
  54. Bedell, V. M., Westcot, S. E., Ekker, S. C. Lessons from morpholino-based screening in zebrafish. Briefings in Functional Genomics. , (2011).
  55. Robu, M. E., et al. p53 activation by knockdown technologies. PLoS Genetics. , (2007).
  56. Hisano, Y., et al. Precise in-frame integration of exogenous DNA mediated by CRISPR/Cas9 system in zebrafish. Scientific reports. 5, 8841(2015).
  57. Prykhozhij, S., et al. Optimized knock-in of point mutations in zebrafish using CRISPR/Cas9. Nucleic Acids Res. 46 (17), (2018).
  58. Tessadori, F., et al. Effective CRISPR/Cas9-based nucleotide editing in zebrafish to model human genetic cardiovascular disorders. Disease Model Mechanisms. 11 (10), (2018).
  59. Armstrong, G., Liao, M., You, Z., Lissouba, A., Chen, B., Drapeau, P. Homology Directed Knockin of Point Mutations in the Zebrafish tardbp and fus Genes in ALS Using the CRISPR/Cas9 System. PLoS ONE. 11 (3), (2016).
  60. Friedrich, R. W., Jacobson, G. A., Zhu, P. Circuit Neuroscience in Zebrafish. Current Biology. 20 (8), (2010).
  61. Friedrich, R. W., Genoud, C., Wanner, A. A. Analyzing the structure and function of neuronal circuits in zebrafish. Frontiers in Neural Circuits. 7, (2013).
  62. Scott, E. K., et al. Targeting neural circuitry in zebrafish using GAL4 enhancer trapping. Nature Methods. 4 (4), 323-326 (2007).
  63. Asakawa, K., Kawakami, K. Targeted gene expression by the Gal4-UAS system in zebrafish. Development Growth and Differentiation. , (2008).
  64. Lloyd, E., et al. Evolutionary shift towards lateral line dependent prey capture behavior in the blind Mexican cavefish. Developmental Biology. , (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Manipulacja genamiiniekcja morfolinoedycja gen w CRISPRtransgeneza Tol2procedura mikroiniekcjipobieranie embrion wprzesiew fenotypowyekstrakcja DNAobrazowanie wapnia

Powiązane artykuły