Artykuł metodologiczny

Zastosowanie technologii mikroprzepływowej Biochip do wykrywania immunoglobuliny E (sIgE) swoistej dla alergenu w surowicy

DOI:

10.3791/59100

⸱

21 kwietnia 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Guangzhou Institute of Respiratory Health, State Key Laboratory of Respiratory Disease, First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Guangzhou Medical University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł przedstawia protokół wykrywania specyficznej dla surowicy immunoglobuliny E za pomocą mikroprzepływowego systemu chemiluminescencji opartego na kartridżu oraz ocenę jego przydatności w diagnostyce alergii.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Choroba alergiczna jest powszechna zarówno u dorosłych, jak i u dzieci. Identyfikacja alergenów wywołujących chorobę ma istotne znaczenie w leczeniu i zapobieganiu chorobie. Jednak w Chinach kontynentalnych brakuje specyficznego systemu pomiaru immunoglobuliny E (IgE) o wysokim stosunku ceny do wydajności, zwłaszcza w szpitalach podstawowej opieki zdrowotnej. W artykule opisano zasadę działania i procedury działania systemu chemiluminescencji opartego na kartridżu mikroprzepływowym do wykrywania IgE swoistych dla alergenu w surowicy. Wyniki porównano z wynikami ImmunoCAP (System 1), standardu przemysłowego, i oceniono odtwarzalność systemu do wykrywania pacjentów uczulonych na powszechne alergeny. Wyniki pokazały, że w porównaniu z ImmunoCAP (System 1), BioIC System (System 2) charakteryzuje się dobrą precyzją i czułością w wykrywaniu IgE specyficznych dla surowicy wobec różnych alergenów wziewnych i pokarmowych, ale przy znacznie niższych kosztach. Może służyć jako dobra alternatywa dla Systemu 1 w szpitalach podstawowej opieki zdrowotnej w Chinach kontynentalnych, które mają niższą przystępność finansową.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Częstość występowania alergii stale wzrastała w ostatnich dziesięcioleciach i dotyka 20%-30% światowej populacji1. Identyfikacja alergenów wywołujących choroby ma ważne znaczenie w leczeniu chorób. W Chinach, ponieważ zarejestrowane punktowe testy skórne in vivo nie są dostępne w tym kraju, oznaczanie in vitro IgE specyficznych dla surowicy jest najważniejszym i najczęściej stosowanym narzędziem do diagnozowania alergii typu I2. Jest to podobne do praktyk stosowanych w świecie zachodnim, ale chociaż system ImmunoCAP (System 1), system immunoenzymatyczny sprzężony z enzymami fluorescencyjnymi, jest postrzegany jako złoty standard w diagnostyce alergii in vitro3, jego zastosowanie w Chinach jest bardzo ograniczone ze względu na wysoki sprzęt i cenę odczynników. Dlatego pilnie potrzebny jest nowy, alternatywny system diagnostyki alergii o wysokim stosunku ceny do wydajności.

System BioIC (System 2) to system oparty na kartridżu mikroprzepływowym oparty na zasadzie chemiluminescencji do multipleksowanych testów IgE specyficznych dla surowicy. Wkład mikroprzepływowy o wymiarach 7 cm x 4 cm składa się z trzech warstw tworzywa sztucznego formowanego wtryskowo. Górna część wykonana jest z przezroczystego poliwęglanu o grubości 3 mm, który zapewnia dobrą stabilność podczas procesów montażu termicznego. Wraz z dolną warstwą o grubości 3 mm, wykonaną z kopolimeru akrylonitrylu, butadienu i styrenu (ABS), tworzy warstwę środkową o grubości 0,5 mm wykonaną z kauczuku silikonowego. Będąc w kolorze czarnym, środkowa warstwa zapewnia niższe tło podczas detekcji chemiluminescencyjnej. Na wierzch żelu krzemionkowego rozpylana jest cienka warstwa membrany nitrocelulozowej (membrana NC) w pozycji odpowiadającej strefie reakcji, co umożliwia plamienie różnych białek alergizujących. Celem tego badania jest ocena skuteczności klinicznej układu mikroprzepływowego do multipleksowego oznaczania IgE swoistych dla alergenu w surowicy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie i użycie próbek ludzkiej surowicy zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki Pierwszego Szpitala Stowarzyszonego Uniwersytetu Medycznego w Kantonie (GYYY-2016-73). Wszyscy uczestnicy wyrazili pisemną zgodę samodzielnie lub za pośrednictwem rodziców (w przypadku dzieci).

1. Podstawowe informacje o grupie badanej

UWAGA: Repozytorium Informacji o Alergiach Państwowego Kluczowego Laboratorium Chorób Układu Oddechowego (AIR-SKLRD) to duży bank surowicy założony w Instytucie Szpitala Oddechowego w Kantonie (GIRH). Zainicjowany w ostatniej dekadzie projekt AIR-SKLRD rozpoczął już zbieranie i przechowywanie próbek surowicy od pacjentów z chorobami alergicznymi wraz z ich informacjami klinicznymi (Tabela 1)4,5. Obecne badanie przeprowadzono z użyciem surowic z AIR-SKLRD.

  1. Przeszukaj bazę danych AIR-SKLRD w poszukiwaniu surowic pobranych od stycznia 2015 r. do czerwca 2018 r. i wybierz pacjentów z chorobą alergiczną, u których stwierdzono wrażliwość na alergeny powszechne w regionie.
  2. Upewnij się, że wszyscy wybrani pacjenci mają choroby związane z alergią, takie jak alergiczny nieżyt nosa i/lub astma, alergiczne zapalenie skóry i/lub pokrzywka, oraz że surowica tych pacjentów zawiera wielokrotne uczulenie na immunoglobulinę E swoistą dla alergenu w surowicy (sIgE) na powszechne alergeny w tym regionie, wykryte przez System 1.
  3. Wykluczenie pacjentów z niekompletną dokumentacją medyczną, tych, którzy zostali utraceni w związku z obserwacją, tych, którzy odmawiają wyrażenia świadomej zgody na wykorzystanie ich próbek surowicy do celów naukowych, pacjentów ze zidentyfikowanym niedoborem odporności, osób obecnie stosujących immunoterapię lub leki immunomodulujące lub tych, u których stwierdzono infekcje pasożytnicze.
  4. Upewnij się, że przed pobraniem surowicy nie podano żadnego leczenia ani recepty na leki, aby zminimalizować zakłócenia w wynikach badań laboratoryjnych. Wszystkie próbki surowicy, które nie spełniały kryteriów, zostały odrzucone.

2. Przebieg badania i interesujące pomiary

UWAGA: System mikroprzepływowy potrzebuje 100 μL surowicy do określenia 19 alergenów. Krew żylną (5 ml) pobrano od każdego pacjenta za pomocą próżniowego naczynia krwionośnego zawierającego żel separacyjny. Po odwirowaniu przez 10 minut w stężeniu 1 000 x g pobrano górną warstwę do testów. Niewykorzystaną surowicę przechowywano w temperaturze -80 °C. Przed badaniem surowicę przechowywano w temperaturze pokojowej przez 30 minut i wstrząsano mieszadłem wirowym. Uniknięto powtarzających się cykli zamrażania i rozmrażania.

  1. Przede wszystkim należy przebadać próbki surowicy pod kątem sIgE do całych alergenów Dermatophagoides pteronyssinus (d1), Dermatophagoides farinae (d2), Blomia tropicalis (d201), sierści kotów (e1), sierści psów (e5), trawy bermudzkiej (g2), tymotki łąki (g6), karaluchów (i6), Aspergillus fumigatus (m3), Candida albicans (m5), ambrozji (w1), białka jaja kurzego (f1), mleka (f2), pszenicy (f4), orzeszków ziemnych (f13), soi (f14), migdałów (f20), kraba (f23), i krewetki (F24). Postępuj zgodnie z instrukcjami podanymi w sekcji 3.
    UWAGA: Oznaczenie sIgE wykonano za pomocą zestawu do oznaczania IgE swoistego dla alergenu (patrz Tabela materiałów) i zmierzono za pomocą analizatora chemiluminescencji.
  2. Losowo wybrać trzy próbki spośród próbek zawierających wystarczającą ilość surowicy (co najmniej 900 μl) do badania odtwarzalności. Utrzymując wszystkie warunki bez zmian, mierz trzy surowice na obecność alergenów sIgE codziennie przez 9 kolejnych dni (tj. łącznie 100 x 9 = 900 μl surowicy).

3. Procedura testu półautomatycznego systemu mikroprzepływowego

UWAGA: System 2 to integracja automatycznej technologii mikroprzepływowej, mikromacierzy białek, analizy zimnego światła, równoległej analizy IgE i technologii przetwarzania obrazu. Protokół testowy jest podzielony na cztery części: przygotowanie sprzętu, ładowanie próbki, inkubacja i pomiar.

  1. Przygotowanie sprzętu
    1. Włącz komputer i analizator power.
      UWAGA: Włącznik zasilania znajduje się po lewej stronie podstawy.
    2. Uruchom program LabIT na komputerze. Jeśli pojawi się okno ostrzegawcze Dark Frame, kliknij OK, aby uruchomić test szczelności. Następnie kliknij środkowe logo, aby przejść do interfejsu operacyjnego.
      UWAGA: System przypomni użytkownikowi o uruchomieniu testu szczelności, jeśli jest bezczynny przez ponad 24 godziny.
    3. Sprawdź temperaturę reakcji i temperaturę CCD (urządzenie sprzężone z ładunkiem) w prawym dolnym rogu ekranu. Temperatura reakcji powinna wzrosnąć do 37 °C ± 1 °C w ciągu około 10 minut, a temperatura CCD powinna spaść do -15 °C ± 1 °C.
    4. Uruchom test SZCZELNOŚCI, gdy temperatura CCD spadnie do -15 °C ± 1 °C. Przed uruchomieniem testu SZCZELNOŚCI upewnij się, że w przyrządzie nie pozostały żadne inne przedmioty i zamknij drzwi. Kliknij Narzędzia | Test systemu | Test szczelności. Nie otwieraj drzwi podczas testowania. Po zakończeniu testu pojawi się okno raportu.
  2. Ładowanie próbki
    1. Dodać 620 μl buforu do przemywania płuczkę, 120 μl buforu blokującego, 60 μl koniugatów A i B, 60 μl substratu A i B oraz 100 μl próbek surowicy do odpowiedniego zbiornika odczynnika we wkładzie mikroprzepływowym.
  3. Inkubacja
    1. Kliknij Identyfikator kasety, użyj skanera kodów kreskowych, aby zeskanować numer seryjny wkładu, wprowadź identyfikator próbki, włóż kasetę do analizatora i zamknij drzwiczki, a następnie kliknij Analyzer and Run (Analizator i uruchom), aby rozpocząć analizę.
  4. pomiar
    1. Eksport wyników do oprogramowania statystycznego (np. Excel) po wykonaniu pomiaru.
      UWAGA: Po 30 minutach inkubacji analizator automatycznie wykonuje pomiar i podaje wynik.
  5. Wyłączanie analizatora
    1. W celu rutynowej konserwacji, po zakończeniu testu, wyjmij wkład i delikatnie przetrzyj wewnętrzne żelazko grzewcze analizatora i elektromagnes 75% alkoholem.
      UWAGA: Nie naciskaj mocno ani nie potrząsaj elektromagnesem.
    2. Zamknij okno LabIT. Pojawi się okno monitorowania temperatury. Wyłączy się automatycznie, gdy CCD nagrzeje się do trybu ochrony 5 °C. Do tego czasu będzie można bezpiecznie wyłączyć zasilanie analizatora i komputera.
      UWAGA: Nie zamykaj ręcznie okna monitorowania temperatury, zanim temperatura CCD wzrośnie do 5 °C i nie wyłączaj zasilania analizatora ani komputera podczas nagrzewania CCD.

4. Definicja reaktywności sIgE

UWAGA: Dla próbki surowicy nierozcieńczonej, zakres wykrywania Systemu 2 wynosi 0,21–100 IU/ml.

  1. Na podstawie wartości progowej 0,35 IU/ml należy uznać, że poziom sIgE przekraczający 0,35 IU/ml jest dodatni6,7. Oceń reaktywność testów sIgE jako8: klasa 1 (≥0,35 i <0,70 IU/ml), klasa 2 (≥0,70 i <3,50 IU/ml), klasa 3 (≥3,50 i <17,50 IU/ml), klasa 4 (≥17,50 i <50,00 IU/ml), klasa 5 (≥50,00 i <100,00 IU/ml) i klasa 6 (≥100,00 IU/ml).

5. Analiza statystyczna

  1. Użyj histogramu, aby pokazać dodatni wskaźnik 19 alergenów (Rysunek 1) i użyj krzywej Leveya-Jenningsa, aby zademonstrować powtarzalność systemu wykrywania (Rysunek 2)9.
  2. Wybierz trzy najczęstsze alergeny wziewne i alergeny pokarmowe (w sumie sześć alergenów) i porównaj wyniki z I System 1, aby ocenić jego kliniczną skuteczność diagnostyczną10,11. Jako kryteria oceny należy uwzględnić współczynnik zgodności, czułość, swoistość, dodatnie i ujemne wartości predykcyjne oraz obszar pod krzywą charakterystyki operacyjnej odbiornika (ROC) (AUC).
  3. Zastosuj analizę korelacji Spearmana12, aby opisać korelacje między dwoma systemami i użyj wartości kappa dla spójności. Skategoryzuj wartość kappa jako prawie idealną (0,8–1,0), znaczną (0,6–0,8), umiarkowaną (0,4–0,6), dostateczną (0,2–0,4) lub słabą (<0,2)13. Użyj analizy statystycznej SPSS 23.0 i MedCalc 11.0 i zdefiniuj P < 0,05 jako istotność statystyczną.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pozytywne wskaźniki dla 19 powszechnych alergenów
Wyniki dotyczące 293 surowic są pokazane w Rysunek 3. Spośród wszystkich alergenów wziewnych najwyższy odsetek pozytywnych wyników miał D. farinae (80,89%, 273/293), a następnie D. pteronyssinus (78,84%, 231/293). Wśród alergenów pokarmowych najwyższy odsetek pozytywnych wyników ma krab (20,48%, 60/293), a następnie 13,65% (40/293) dla krewetek. Całkowity dodatni odsetek a...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podobnie jak wyniki wielu innych badań 15,16,17, wyniki systemu mikroprzepływowego opartego na surowicy od 293 alergicznych pacjentów wykazały, że roztocza kurzu domowego (w tym D. pteronyssinus, D. farinae i B. tropicalis) są głównymi alergenami wziewnymi prowadzącymi do chorób alergicznych w południowych Chinach, podczas gdy w przypadku żywności mleko, orzeszki ziemne, krewetki i kraby są najczęstszy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują profesor Mei Jiang za pomoc w analizie statystycznej oraz panu Hammer Tsui w przygotowaniu manuskryptu. Badanie to było wspierane przez Guangzhou Science and Technology Foundation (201804020043) oraz Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (NSFC 81572063 i NSFC 81802076). Grupy finansujące zgodziły się z projektem badania, analizą danych, przygotowaniem manuskryptu i decyzją o publikacji. Nie otrzymano żadnego innego finansowania na to badanie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Analizator Agnitio BioICAgnitio Nauka & Technologia (Tajwan, Chiny)BA-G2000
Zestaw do wykrywania IgE specyficzny dla alergenu BioICAgnitio Science & Technologia (Tajwan, Chiny)DR17A12
BioIC Cartrideg Płyta umieszczającaAgnitio Science & Technologia (Tajwan, Chiny)T20SET
BioICAgnitio Science & Technologia (Tajwan, Chiny)DS-1
Obraz dwuwymiarowy maszyna do kodów kreskowychAgnitio Science & Technologia (Tajwan, Chiny)NLS-HR200
, LabITAgnitio Science & Technologia (Tajwan, Chiny)Wersja 2.4.12
VORTEX-5 Vortex MixerHaimen Kylinbell Lab Lastruments Co., Ltd.WIR-5
Dozownik odczynnika Pakiet oprogramowania

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kamble, S., Bharmal, M. Incremental Direct Expenditure of Treating Asthma in the United States. Journal of Asthma Research. 46 (1), 73-80 (2009).
  2. Paganelli, R., et al. Specific IgE antibodies in the diagnosis of atopic disease. Clinical evaluation of a new in vitro test system, UniCAP, in six European allergy clinics. Allergy. 53 (8), 763-768 (1998).
  3. Wang, J., Godbold, J. H., Sampson, H. A. Correlation of serum allergy (ige) tests performed by different assay systems. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 121 (5), 1219-1224 (2008).
  4. Sun, B., Zheng, P., Wei, N., Huang, H., Zeng, G. Co-sensitization to silkworm moth (Bombyx mori) and 9 inhalant allergens among allergic patients in Guangzhou, Southern China. PLoS ONE. 9 (5), e94776(2014).
  5. Zeng, G., et al. Component-Resolved Diagnostic Study of Dermatophagoides Pteronyssinus Major Allergen Molecules in a Southern Chinese Cohort. Journal of Investigational Allergology & Clinical Immunology. 25 (5), 343-351 (2015).
  6. Luo, W., et al. grass pollen allergens and components detected in a southern Chinese cohort of patients with allergic rhinitis and/or asthma. Molecular Immunology. 78 (2016), 105-112 (2016).
  7. Zeng, G., et al. Longitudinal profiles of serum specific IgE and IgG4 to Dermatophagoides pteronyssinus allergen and its major components during allergen immunotherapy in a cohort of southern Chinese children. Molecular Immunology. 74 (2016), 1-9 (2016).
  8. Lee, J. H., et al. Specific IgE measurement using AdvanSure(R) system: comparison of detection performance with ImmunoCAP(R) system in Korean allergy patients. Clinica Chimica Acta. (9-10), 914-919 (2012).
  9. Eckels, J., et al. Quality control, analysis and secure sharing of Luminex(R) immunoassay data using the open source LabKey Server platform. Bmc Bioinformatics. 14 (1), 145(2013).
  10. Bland, J. M., Altman, D. G. Statistical methods for assessing agreement between two methods of clinical measurement. Lancet. 327 (8476), 307-310 (1986).
  11. Carletta, J. Assessing Agreement on Classification Tasks: The Kappa Statistic. Computational Linguistics. 22 (2), 249-254 (1996).
  12. Shyur, S. D., et al. Determination of multiple allergen-specific IgE by microfluidic immunoassay cartridge in clinical settings. Pediatric Allergy and Immunology. 21, 623-633 (2010).
  13. Cesana, B. M., Antonelli, P., Gallazzi, E., Marino, A. Comparison of measurement methods: an endless application of wrong statistical methods. Intensive Care Medicine. 37 (6), 1038-1040 (2011).
  14. Park, K. H., Lee, J., Sim, D. W., Lee, S. C. Comparison of Singleplex Specific IgE Detection Immunoassays: ImmunoCAP Phadia 250 and Immulite 2000 3gAllergy. Annals of Laboratory Medicine. 38 (1), 23-31 (2018).
  15. Teppo, H., Revonta, M., Haahtela, T. Allergic rhinitis and asthma have generally good outcome and little effect on quality of life - a 20-year follow-up. Allergy. 66 (8), 1123-1125 (2011).
  16. Fischer, J., et al. Prevalence of type I sensitization to alpha-gal in forest service employees and hunters. Allergy. 72 (10), 1540-1547 (2017).
  17. Li, J., et al. A multicentre study assessing the prevalence of sensitizations in patients with asthma and/or rhinitis in China. Allergy. 64 (7), 1083-1092 (2009).
  18. Ahlstedt, S. Understanding the usefulness of specific IgE blood tests in allergy. Clinical & Experimental Allergy. 32 (1), 11-16 (2002).
  19. Wood, R. A., Segall, N., Ahlstedt, S., Williams, P. B. Accuracy of IgE antibody laboratory results. Annals of Allergy Asthma & Immunology. 100 (2), 288-289 (2008).
  20. Aberer, W., Kränke, B., Hager, A., Wick, G. In vitro allergy testing needs better standardization--test results from different laboratories lack comparability mostly due to missing effective standards. International Archives of Allergy & Immunology. 108 (1), 82-88 (1995).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Serum Allergen specific IgE DetectionChemiluminescence SystemMicrofluidic CartridgeImmunoCAP ComparisonAllergen Sensitization AnalysisTemperature Monitoring ProtocolReagent Loading ProcedureClinical Error AssessmentAllergy Diagnosis Application

Powiązane artykuły