Artykuł metodologiczny

Fluorescencyjna wizualizacja RNA znakowanego mango w żelach poliakrylamidowych metodą poststainingu

DOI:

10.3791/59112

⸱

21 czerwca 2019

 ,  , 
1Department of Molecular Biology and Biochemistry, Simon Fraser University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy czułą, szybką i dyskryminującą metodę barwienia po żelu do obrazowania RNA oznaczonych aptamerami RNA Mango I, II, III lub IV, przy użyciu natywnych lub denaturujących żeli do elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (PAGE). Po uruchomieniu standardowych żeli PAGE, RNA znakowane mango można łatwo wybarwić TO1-Biotyną, a następnie przeanalizować za pomocą powszechnie dostępnych czytników fluorescencji.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Natywne i denaturujące żele poliakrylamidowe są rutynowo używane odpowiednio do charakteryzowania mobilności kompleksu rybonukleoproteinowego (RNP) i do pomiaru wielkości RNA. Ponieważ wiele technik obrazowania żelowego wykorzystuje niespecyficzne barwienia lub drogie sondy fluoroforowe, bardzo pożądane są czułe, dyskryminujące i ekonomiczne metodologie obrazowania żelowego. Sekwencje rdzenia RNA Mango to małe (19-22 nt) motywy sekwencji, które po zamknięciu przez dowolną łodygę RNA można łatwo i niedrogo dołączyć do interesującego RNA. Te znaczniki mango wiążą się z wysokim powinowactwem i specyficznością z tiazolowo-pomarańczowym ligandem fluoroforowym zwanym TO1-Biotyną, który po związaniu staje się tysiące razy bardziej fluorescencyjny. Tutaj pokazujemy, że Mango I, II, III i IV mogą być używane do specyficznego obrazowania RNA w żelach o wysokiej czułości. Zaledwie 62,5 fmol RNA w natywnych żelach i 125 fmol RNA w żelach denaturujących można wykryć, mocząc żele w buforze obrazowania zawierającym potas i 20 nM TO1-biotynę przez 30 minut. Wykazujemy specyficzność systemu znakowanego mango, obrazując bakteryjne RNA 6S znakowane mango w kontekście złożonej mieszaniny całkowitego bakteryjnego RNA.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mango to system znakowania RNA składający się z zestawu czterech małych fluorescencyjnych aptamerów RNA, które ściśle wiążą się (wiązanie nanomolowe) z prostymi pochodnymi oranżu tiazolowego (TO1-Biotyna, Rysunek 1A)1,2,3. Po związaniu fluorescencja tego liganda zwiększa się od 1000 do 4000 razy w zależności od konkretnego aptameru. Wysoka jasność systemu Mango, która w przypadku Mango III przewyższa jasność wzmocnionego białka zielonej fluorescencji (eGFP), w połączeniu z powinowactwem do wiązania nanomolowego aptamerów RNA Mango, pozwala na wykorzystanie go zarówno w obrazowaniu, jak i oczyszczaniu kompleksów RNA2,4.

Struktury rentgenowskie Mango I5, II6, oraz III7 zostały określone w wysokiej rozdzielczości, a wszystkie trzy aptamery wykorzystują kwadrupleks RNA do wiązania TO1-Biotyny (Rysunek 1B–D). Zwarte rdzenie wszystkich trzech aptamerów są izolowane od zewnętrznej sekwencji RNA za pomocą kompaktowych motywów adaptacyjnych. Zarówno Mango I, jak i II wykorzystują elastyczny adapter pętli podobny do GNRA, aby połączyć swoje rdzenie Mango z dowolnym dupleksem RNA (Rysunek 1B, C). W przeciwieństwie do tego, Mango III wykorzystuje sztywny motyw triplex do połączenia swojego rdzenia z dowolną helisą RNA (Rysunek 1D, fioletowe reszty ), podczas gdy struktura Mango IV nie jest obecnie znana. Ponieważ rdzeń wiążący ligand każdego z tych aptamerów jest oddzielony od zewnętrznej sekwencji RNA przez te spiralne adaptory, wydaje się prawdopodobne, że wszystkie one mogą być po prostu włączone do różnych RNA. Bakteryjne regulatorowe RNA 6S (Mango I), składniki spliceosomu drożdży (Mango I) oraz ludzkie RNA 5S, U6 RNA i C/D scaRNA (Mango II i IV) zostały pomyślnie oznaczone w ten sposób2,8, co sugeruje, że wiele biologicznych RNA można oznaczyć za pomocą systemu aptamerowego RNA Mango.

Denaturing i natywne żele są powszechnie używane do badania RNA. Żele denaturacyjne są często używane do oceny wielkości RNA lub przetwarzania RNA, ale zazwyczaj, na przykład w przypadku northern blot, wymagają kilku powolnych i sekwencyjnych kroków w celu wygenerowania obrazu. Podczas gdy inne aptamery fluorogenne RNA, takie jak RNA Szpinak i Brokuły, były z powodzeniem stosowane do obrazowania żelowego9, żaden fluorogenny system aptamerowy do tej pory nie posiada tak wysokiej jasności i powinowactwa jak system Mango, co czyni go bardzo interesującym do zbadania zdolności obrazowania żelu Mango. W tym badaniu zastanawialiśmy się, czy system RNA Mango można po prostu rozszerzyć na obrazowanie żelowe, ponieważ długości fal wzbudzenia i emisji TO1-biotyny (odpowiednio 510 nm i 535 nm) są odpowiednie do obrazowania w kanale eGFP wspólnym dla większości fluorescencyjnych oprzyrządowań do skanowania żelowego.

Przedstawiony tutaj protokół barwienia po żelu zapewnia szybki sposób na specyficzne wykrywanie cząsteczek RNA znakowanych mango w natywnych i denaturujących żelach do elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (PAGE). Ta metoda barwienia polega na moczeniu żeli w buforze zawierającym potas i TO1-Biotynę. APTAMERY RNA Mango są oparte na G-quadruplex, a do stabilizacji takich struktur potrzebny jest potas. Używając RNA transkrybowanego z minimalnych matryc DNA kodujących Mango (patrz sekcja protokołu), możemy po prostu wykryć zaledwie 62,5 fmol RNA w natywnych żelach i 125 fmol RNA w żelach denaturujących, używając prostego protokołu barwienia. W przeciwieństwie do zwykłych niespecyficznych barwień kwasami nukleinowymi (patrz Tabela materiałów, odniesiona do SG dalej), możemy wyraźnie zidentyfikować RNA znakowane mango, nawet jeśli w próbce obecne są wysokie stężenia całkowitego nieoznakowanego RNA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie odczynników

  1. TO1-Biotyna roztwór do barwienia (żelowy roztwór barwiący)
    1. Przygotować 1 l 1 M buforu fosforanowego o pH 7,2 w temperaturze 25 °C, dodając 342 ml 1 M Na2HPO4 i 158 ml 1 M NaH2PO4. Doprowadzić pH do 7,2 przy 50 mM, dodając odpowiedni roztwór fosforanu. Przefiltruj sterylnie za pomocą filtra 0,2 μm i przechowuj roztwór w plastikowych naczyniach w temperaturze pokojowej.
    2. Przygotować 5x żelowy roztwór barwiący (bez TO1-Biotyny) w następujący sposób. Uzupełnić 1 l roztworu, mieszając 247,5 ml ddH2O, 700 ml 1 M KCl, 50 ml 1 M buforu fosforanowego (pH 7,2) i 2,5 ml Tween 20. Sterylnie przefiltruj za pomocą filtra 0,2 μm i przechowuj roztwór w plastikowych naczyniach. Może być przechowywany w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: MgCl2 można dodać do tego roztworu w razie potrzeby, ponieważ może on potencjalnie stabilizować kompleksy RNA. Będzie to miało niewielki wpływ na sygnał fluorescencyjny2.
    3. Uzupełnić 1x żelowy roztwór barwiący za pomocą 5x żelowego roztworu barwiącego z kroku 1.1.2 i bezpośrednio przed użyciem uzupełnić go fluoroforem TO1-Biotyny (patrz Tabela Materiałów) do końcowego stężenia 20 nM. Na przykład dodaj 20 ml 5x żelowego roztworu barwiącego do 80 ml wody dejonizowanej, aby uzyskać 100 ml 1x żelowego roztworu barwiącego i dodaj 2 μl 1 mM TO1-Biotyny (przygotowanej w dimetyloformamidzie).
      UWAGA: Współczynnik ekstynkcji dla barwnika TO1-biotyny przy 500 nm wynosi 63 000 M-1·cm-1, mierzony w roztworze barwiącym1.
  2. Denaturyzacja PAGE (2x roztwór ładujący żel denaturujący i roztwory A, B, C, nadsiarczan amonu i tetrametyloetylenodiamina)
    1. Przygotuj 50 ml 2x roztworu ładującego żel denaturujący, mieszając 40 ml formamidu, 0,5 ml 0,5 M kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA, pH 8,0) i 9,5 ml ddH2O. Roztwór można przechowywać w temperaturze pokojowej. Do tego roztworu nie dodaje się barwników obciążających, ponieważ może to zaciemniać obrazowanie fluorescencyjne.
    2. Przygotuj 2x denaturujący żel ładujący barwnik w następujący sposób. Podczas oczyszczania oligonukleotydów RNA i DNA dodaj 0,5 ml 2,5% (w/v) błękitu bromofenolowego (BB) i 0,5 ml 2,5% (w/v) cyjanolu ksylenu (XC) do roztworu opisanego w kroku 1.2.1 i dodaj 8,5 ml ddH2O zamiast 9,5 ml. Roztwór można przechowywać w temperaturze pokojowej.
    3. Przygotować 100 ml roztworu A, odważając 200,2 g mocznika (masa formuły: 60,06 g/mol) i dodając go do 312,5 ml 40% 19:1 akrylamidu:N,N'-metylenobisakryloamidu. Wymieszać mieszadłem magnetycznym z maksymalną prędkością aż do rozpuszczenia (około 3 godziny) i uzupełnić roztwór do 500 ml za pomocą ddH2O. Należy zauważyć, że końcowe stężenia to 6,667 M mocznik i 25% 19:1 akryloamidu: N,N'-metylenobisakryloamid. Przechowywać w temperaturze 4 °C w czystym plastiku.
    4. Przygotować 1 l roztworu B, odważając 400,4 g mocznika i uzupełnić roztwór do 1 lddH2O; mieszać aż do rozpuszczenia mocznika. Roztwór B można przechowywać w temperaturze pokojowej.
    5. Przygotować roztwór C (10x Tris-boran-EDTA [TBE]) w następujący sposób. Przygotować 4 litry 10x TBE, ważąc 432 g zasady Tris i 220 g kwasu borowego, dodając 160 ml 0,5 M EDTA o pH 8 (przefiltrowany) i uzupełniając roztwór do 4 l ddH2O. Wytwarzany jest duży zapas tego bufora, ponieważ jest on również używany jako bufor do biegania w żelu.
    6. Przygotować 10% nadsiarczan amonu (APS) rozpuszczając 1 g APS w całkowitej objętości 10 mlddH2O. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
    7. Miej pod ręką tetrametyloetylenodiaminę (TEMED). Przechowywać w temperaturze 4 °C razem z roztworem APS.
  3. Native PAGE (2x natywne rozwiązanie do ładowania żelem)
    1. Przygotuj 50 ml 2x natywnego roztworu ładującego żel, mieszając 25 ml 100% glicerolu, 10 ml 5x żelowego roztworu barwiącego i 15 ml ddH2O, aby uzupełnić roztwór do 50 ml.
      UWAGA: Podobnie jak w sekcji żelu denaturującego, do tego materiału można dodać barwniki ładujące, ale ich dodanie może potencjalnie zaciemnić sygnał fluorescencyjny w żelu i dlatego należy tego unikać.

2. Przygotowanie i ładowanie żeli denaturujących

  1. Przygotować żel denaturujący o odpowiedniej zawartości procentowej, postępując zgodnie z tabelą 1. Weź pod uwagę konkretny system odlewania żelu; Powszechnie stosuje się żele o pojemności 30 ml. Odpowiednią zawartość procentową żelu można oszacować, korzystając z tabeli 2: należy wybrać zawartość procentową poliakrylamidu, w której barwniki BB i XC mają ruchliwość odpowiednio szybszą i wolniejszą niż RNA będące przedmiotem zainteresowania, aby zapewnić separację wysokopasmową w odpowiednim zakresie rozmiarów.
  2. Wymieszać roztwory A, B i C zgodnie z tabelą 1 i dodać APS i TEMED bezpośrednio przed nalewaniem żelu. Dobrze wymieszaj roztwory w czystych naczyniach z tworzywa sztucznego.
  3. Wlej roztwór żelu do odpowiedniego aparatu do odlewania żelu, po upewnieniu się, że wszystkie elementy są skrupulatnie czyste. Podnieś jedną stronę aparatu tak, aby żel był lekko przechylony podczas nalewania, aby uniknąć uwięzienia pęcherzyków powietrza w samym żelu.
  4. Włóż żądany grzebień i pozostaw go do polimeryzacji (około 30 min). Obserwuj polimeryzację, uważnie przyglądając się zmianie współczynnika załamania światła wokół dołków żelowych. Uzupełnij zbiornik żelu za pomocą 1x roztwór C (1x TBE) i ostrożnie wyjmij grzebień. Za pomocą strzykawki odessać studzienki bezpośrednio przed załadowaniem próbki.
  5. Przygotować próbki do denaturacji w następujący sposób. Dodaj 2x roztwór ładujący żel denaturujący do próbek RNA, które są przedmiotem zainteresowania, aby uzyskać roztwór ładujący żel denaturujący 1x i denaturować termicznie w temperaturze 95 °C przez 5 minut za pomocą termocyklera lub łaźni wodnej.
  6. Przed załadowaniem próbek schłodź je powietrzem przez kilka minut, aż ostygną w dotyku. Załaduj próbki, układając je warstwami na dnie każdej studzienki za pomocą końcówek do ładowania żelem.
    UWAGA: Okrągłe końcówki mogą być używane do żeli o grubości 1 mm lub większej; Do cieńszych żeli używaj płaskich końcówek.
  7. Uruchom żele denaturujące w temperaturze pokojowej. Upewnij się, że moc jest wystarczająco niska, aby szklane płytki systemu żelowego nie pękły.
    UWAGA: W naszym laboratorium do tego celu wystarczyło 28 W na płytki o wymiarach 20 cm x 16 cm.

3. Przygotowanie i ładowanie natywnych żeli

  1. Przygotować natywny żel o odpowiedniej zawartości procentowej, odwołując się do Tabeli 3. Weź pod uwagę konkretny system odlewania żelu, ale pamiętaj, że powszechnie stosuje się żele o pojemności 30 ml. Zmieszać roztwory 1x TBE, 40% 29:1 akrylamidu:N,N'-metylenobisakryloamidu i glicerolu zgodnie z tabelą 3 i dodać APS i TEMED bezpośrednio przed wlaniem żelu. Postępuj zgodnie z opisem w krokach 2.3 i 2.4.
  2. Przygotuj próbki natywne, dodając 2x natywny roztwór ładujący żel do próbek RNA, które Cię interesują, aby roztwór był 1x i pozwól mu inkubować w temperaturze pokojowej przez 100 minut przed uruchomieniem żelu, aby zapewnić całkowite fałdowanie RNA.
  3. Uruchom natywny żel w chłodni o temperaturze 4 °C, upewniając się, że moc jest wystarczająco niska, aby nie podgrzewać żelu.
    UWAGA: W naszym laboratorium do tego celu wystarczyło 14 W na płytki o wymiarach 20 cm x 16 cm.

4. Przygotowanie RNA przez spływ transkrypcji T7

UWAGA: Sekwencje DNA używane do transkrypcji odpływowej10 konstruktów RNA Mango zostało zamówionych komercyjnie. W tej metodzie oligonukleotydy DNA zawierające odwrotny dopełniacz (RC) zarówno sekwencji, która ma być transkrybowana, jak i promotora T7 są hybrydyzowane z sekwencją górnej nici promotora T7, a następnie transkrybowane in vitro. Poniżej, dla każdego oligonukleotydu, RC sekwencji rdzenia mango jest pokazany pogrubioną czcionką, a RC regionu promotora T7 jest pokazany kursywą. Pozostałości w regularnej czcionce odpowiadają arbitralnie dowolnym, komplementarnym obszarom spiralnym wymaganym do prawidłowego złożenia rdzenia mango.

Mango I: GCA CGT ACT CTC CTC TCC GCA CCG TCC CTT CGT ACG TGC CTA TAG TGA GTC GTA TTA AAG
Mango II: GCA CGT ACT CTC CTC TTC CTC TCC TCT CCT CGT ACG TGCC TA TAG TGA GTC GTA TTA AAG
Mango III: GGC, ACG, TAC, GAA, TAT, ACC, ACA, TAC, CAA, TCC, TTC, C, TT, CGT, ACG, TGC,C, TA, TAG, TGA, GTC, GTA, TTA, AAG
Mango IV: GCA CGT ACT CGC CTC ATC CTC ACC ACT CCC TCG GTA CGT GCC TAT AGT GAG TCG TAT TAA AG
Górne pasmo T7: CTT TAA TAC GAC TCA CTA CTA TAG G

  1. Preparatywne oczyszczanie oligonukleotydów DNA w żelu
    1. W celu syntezy DNA w skali 0,2 μmol należy ponownie zawiesić odchroniony oligonukleotyd DNA w 100 μl ddH2O i 100 μl 2x denaturującego barwnika ładującego (od kroku 1.2.2). W takim przypadku zaleca się włączenie do roztworu nasycającego barwników wypełniających żel o takim samym stężeniu, jak w kroku 1.2.2.
    2. Oczyścić oligonukleotyd DNA za pomocą 50 ml preparatywnego żelu denaturującego o odpowiedniej zawartości procentowej poliakryloamidu; skorzystać z tabeli 2, aby wybrać zawartość procentową żelu. Na przykład użyj 8% żelu do sekwencji 50 nt. Idealnie byłoby, gdyby błękit bromofenolowy działał szybciej niż oligonukleotyd, a cyjanol ksylenowy działał wolniej.
      UWAGA: W naszym laboratorium takie żele odlewano za pomocą przekładek odlewniczych o grubości 1,5 mm i grzebienia z wkładem żelowym z dołkami o szerokości 2–2,5 cm.
    3. Załadować 100 μl roztworów oligonukleotydów DNA przygotowanych w kroku 4.1.2 do każdego żelu preparatywnego, jak opisano w krokach 2.4–2.7.
    4. Ostrożnie osusz żel na zewnątrz, usuń szklane płytki i przykryj obie strony żelu folią. Umieść go na fluorescencyjnym ekranie obrazowania (ekonomicznym rozwiązaniem są płytki chromatografii cienkowarstwowej z aluminiowym podkładem nasączone fluoroforem) i użyj ręcznej lampy UV o krótkiej długości fali, aby uwidocznić prążki DNA za pomocą cieniowania UV.
    5. Wyraźny, dobrze zdefiniowany cień powinien być obserwowany, jeśli synteza DNA jest wysokiej jakości. Zaznacz pasma na folii za pomocą markera permanentnego.
      UWAGA: Chroń skórę i oczy przed światłem UV i utrzymuj krótką ekspozycję, aby uniknąć uszkodzenia próbki kwasu nukleinowego.
    6. Umieszczając żel na czystej szklanej płytce, ostrożnie wytnij zaznaczone pasma i umieść każdy fragment żelu w 400 μl 300 mM NaCl. Eluuj DNA przez noc, używając rotatora w temperaturze pokojowej.
    7. Odzyskaj eluent w czystej probówce wirówkowej i dodaj 2,5 ekwiwalentu etanolu, aby wytrącić DNA. Dobrze przemieszać i umieścić probówkę w temperaturze -20 °C na 30 minut.
    8. Osadzać próbkę w wirówce stołowej o stężeniu 156 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w ddH2O. Użyć spektrofotometru, aby dokładnie określić stężenie oligonukleotydów DNA. Dla wygody należy przechowywać próbkę jako zapas 10 μM w temperaturze -20 °C.
  2. Odpływowa transkrypcja i oczyszczanie żelowe próbek RNA
    1. Przygotować 5x trifosforan nukleozydu (NTP) przez zmieszanie płynnych zapasów NTP składających się z końcowego stężenia 40 mM trifosforanu guanozyny (GTP, 11 400 M-1·cm-1), 25 mM trifosforanu cytydyny (CTP, 7 600 M-1·cm-1), 25 mM trifosforanu adenozyny (ATP, 5 000 M-1·cm-1) i 10 mM trifosforanu urydyny (UTP, 10 000 M-1·cm-1); Wszystkie współczynniki ekstynkcji przy 260 nm.
      UWAGA: Płynne lub sproszkowane buliony można uzyskać w handlu. W przypadku przygotowywania wywarów pierwotnych z proszku należy ostrożnie dostosować pH do końcowego pH 7,9, używając 1 M NaOH. Porcję wywaru rozmieścić w probówkach do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C.
    2. Przygotuj 100 ml 10x bufora transkrypcyjnego T7, mieszając 25,6 ml 1 M Tris-HCl, 14,4 ml 1 M zasady Tris, 26 ml 1 M MgCl2, 10 ml 10% Triton X-100 i 0,637 g spermidyny. Uzupełnić wywar do końcowej objętości 100 ml, dodając ddH2O.
      UWAGA: Końcowe pH 7,9 roztworu 1x należy potwierdzić za pomocą skalibrowanego pH-metru. 10x powinien być sterylnie przefiltrowany i przechowywany w temperaturze -20 °C w porcjach o odpowiedniej wielkości.
    3. Wykonaj transkrypcję w następujący sposób.
      1. Dodać następujące odczynniki, aby uzyskać końcowe stężenie 1x buforu transkrypcyjnego T7 przy użyciu 10x buforu transkrypcyjnego T7 i ddH2O (z kroku 4.2.2), 1x NTP, 10 mM ditiotreitolu (DTT), 1 μM sekwencji górnej nici T7 (patrz sekcja 4 Uwaga dotycząca sekwencji), 1 μM oczyszczonej żelowo sekwencji DNA mango (krok 2.1), i enzym polimerazy RNA T7 (1 U/μL).
      2. Odwirować, odwirować w dół i inkubować roztwór w temperaturze 37 °C przez 2 godziny lub do momentu, gdy stanie się mętny i na dnie probówki utworzy się biały osad. Transkrypcja 50 μL powinna dać 50 μL ~50 μM RNA po oczyszczeniu żelu. Dodaj równą objętość 2x barwnika denaturującego i przechowuj w temperaturze -20 °C, aż będzie gotowa do oczyszczenia żelem.
    4. Powstały RNA należy oczyścić żelem zgodnie z opisem w sekcji Oczyszczanie żelem oligonukleotydów DNA, wykonując kroki 4.1.2\u20124.1.8, zastępując próbkę RNA DNA.
      UWAGA: RNA jest niezwykle wrażliwe na degradację RNazy, więc upewnij się, że na wszystkich etapach przez cały czas noszone są rękawice i czysty fartuch laboratoryjny. Upewnij się, że wszystkie próbki są przygotowane i przechowywane w jednorazowych naczyniach z tworzywa sztucznego w celu ochrony przed zanieczyszczeniem RNazą, a przed użyciem dokładnie umyj szklane płytki gorącym mydłem i wodą, dokładnie spłucz je ddH2O i osusz szkło za pomocą etanolu nałożonego z butelki do wyciskania.
    5. Użyć 1 μl końcowej próbki RNA i za pomocą spektrofotometru kropelkowego oznaczyć absorbancję przy 260 nm. Korzystając ze współczynnika ekstynkcji określonego metodą najbliższego sąsiada, oblicz stężenie RNA i dla wygody dostosuj stężenie próbki do 10 μM z ddH2O. Próbki RNA należy przechowywać w temperaturze -20 °C.
  3. Ekstrakcja całkowitych surowych kwasów nukleinowych Escherichia coli
    UWAGA: Poniższy protokół jest przykładem. Protokół ten wykorzystuje endogennie eksprymowane RNA 6S znakowane mango I-znakowane z plazmidu w E. coli, a indukcja z tego plazmidu jest szczegółowo opisana w innym miejscu4.
    1. Na potrzeby tego badania należy przygotować 500 ml indukowanych komórek zarówno dla plazmidów pEcoli-RNA Mango, jak i pEcoli-T1 (komórki są indukowane przy OD600 nm 1). Przed użyciem należy ogranulować ogniwa i przechowywać je w temperaturze -80 °C.
    2. Wykonaj ekstrakcję RNA w następujący sposób.
      1. Weź 0,5 ml indukowanego osadu komórek pEcoli i dodaj 500 μl zrównoważonego fenolu. Następnie odwiruj próbkę; Roztwór stanie się mlecznobiały. Wirować z maksymalną prędkością przez 2 minuty, aby oddzielić warstwy.
      2. Wyodrębnić górną warstwę, która będzie lekko żółta, i powtórzyć krok 4.3.2.1, dodając równą objętość fenolu, odwirowując i ekstrahując, w sumie 5x (lub do momentu, gdy środkowa warstwa, która jest nieprzezroczysta biała, zniknie i pozostaną tylko dwie przezroczyste warstwy).
      3. Dodaj wyekstrahowaną fenolem wodną objętość do równej objętości chloroformu, odwiruj, a następnie odwiruj z maksymalną prędkością przez 2 minuty.
      4. Ekstrahować warstwę wodną i dodać NaCl do końcowego stężenia 300 mM. Wytrącić otrzymany kwas nukleinowy przez dodanie 2,5 równoważnika etanolu, odwirować, odwirować i wytrącić w temperaturze -20 °C przez co najmniej 30 minut.
      5. Osad w wirówce stołowej o wymiarach 15,6 x 1 000 x g w temperaturze 4 °C przez 30 min. Ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 100 μl ddH2O.
      6. Dodaj etap trawienia DNazy I do tej procedury, postępując zgodnie z przywoływanym protokołem11, aby uzyskać całkowity RNA.
        UWAGA: Energicznie wirować, aż granulka całkowicie rozpuści się w ddH2O.

5. Barwienie po żelu

  1. Przygotuj 1x żelowy roztwór barwiący zgodnie z przepisem w kroku 1.1.3 i dodaj go do czystego szklanego pojemnika, który jest wystarczająco szeroki, aby wygodnie zmieścił się żel.
    UWAGA: Pojemniki ze szkła borokrzemianowego z pokrywkami zatrzaskowymi dobrze służą temu celowi.
  2. Dodaj tyle 1x żelowy roztwór barwiący do pojemnika, aby żel był całkowicie pokryty roztworem, a płyn rozlał się po wierzchu żelu, gdy zostanie umieszczony na rotatorze orbitalnym.
    UWAGA: Pojemnik musi być wystarczająco duży, aby zmieścił się żel, aby mógł się poruszać i mieć wystarczającą ilość bufora w pojemniku, aby całkowicie pokryć żel.
  3. Gdy żel natywny lub denaturujący zakończy działanie (odpowiednio sekcja 2 lub 3), usuń żel z aparatu i odetnij jego studzienki. Przydatne może być usunięcie rogu żelu w celu orientacji w dalszej części analizy.
  4. Ostrożnie przenieść żel do 1x żelowego roztworu barwiącego przygotowanego w kroku 5.2.
    UWAGA: Żele są delikatne i podatne na pękanie, dlatego należy zachować ostrożność podczas przenoszenia żelu. Przez cały czas trzymaj pokrywkę na pojemniku do barwienia, aby nie zanieczyścić żelu.
  5. Umieść żel na rotatorze orbitalnym z prędkością 100 obr./min przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Upewnij się, że żel nie składa się z powrotem na siebie; w przeciwnym razie RNA może dyfundować z żelu i w ten sposób oznaczać inną część żelu.

6. Obrazowanie RNA znakowanych mango w żelu

  1. Ostrożnie zdekantować bufor obrazowania. Szybko spłucz żel wodą, upewniając się, że pozostała wystarczająca ilość płynu, aby żel był lekko ruchliwy w pojemniku.
  2. Ostrożnie przenieś żel na imager. Przenosić, ostrożnie podnosząc boki żelu i umieszczając go na tacy termowizora; Alternatywnie żel można powoli wylewać na tackę. Upewnij się, że pod żelem nie ma pęcherzyków i że pod żelem nie ma nadmiaru płynu. Pipeta przetoczona po żelu może być przydatna do usunięcia nadmiaru płynu.
    UWAGA: Użyj ręcznika papierowego, aby wchłonąć nadmiar płynu.
  3. Wykonaj zdjęcie żelowe, obserwując fluorescencję między długością fali wzbudzenia 510 nm a długością fali emisji 535 nm (na przykład zielone światło przy ustawieniach fluorescencji o długości fali 520 nm w kamerze). Upewnij się, że ustawienia instrumentu są w pełni zoptymalizowane i dokładnie postępuj zgodnie z instrukcjami dotyczącymi używanego instrumentu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Krótkie RNA oznaczone mango zostały przygotowane zgodnie z opisem w sekcji protokołu. Zakładając, że fluorescencja w warunkach denaturacji byłaby najtrudniejsza do zaobserwowania ze względu na obecność mocznika w żelach, najpierw zbadaliśmy oporność aptamerów mango na mocznik, który działa jako denaturant kwasów nukleinowych. Stwierdziliśmy, że aptamery mango są zasadniczo odporne na denaturację do stężenia mocznika około 1 M (ryc. 2A). Przed dodaniem roztworu barwiącego ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Istotną zaletą znacznika fluorescencyjnego Mango jest to, że pojedynczy znacznik może być używany na wiele sposobów. Wysoka jasność i powinowactwo tych aptamerów sprawiają, że są one przydatne nie tylko do wizualizacjikomórki2 , ale także do oczyszczania RNA lub RNP in vitro4. Dlatego obrazowanie żelowe w prosty sposób rozszerza wszechstronność znacznika Mango. Czułość obrazowania w żelu mango jest nieco mniejsza niż w przypadku northern blot14 , ale...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zgłoszono patent na system fluorogeniczny Mango.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują Razvanowi Cojocaru i Amirowi Abdolahdehowi za pomoc techniczną oraz Lenie Dolgosheina za korektę rękopisu. Finansowanie tego projektu zostało zapewnione przez grant operacyjny Kanadyjskiej Rady ds. Nauk Przyrodniczych i Inżynierii (NSERC) dla P.J.U.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Grzebień o grubości 0,8 mm 14 dołków na 30 ml żele PAGELabRepCo11956042
101-1000 µ L  końcówkiFisher02-707-511
20-200 &mikro; L niska retencja  wskazówkiFisher Scientific02-717-143
Akrylamid: N,N'-metylenobisakryloamid (40% 19:1)BioodczynnikiBP1406-1Ostra toksyczność
Akrylamid:N,N'-metylenobisakryloamid (40% 29:1)FisherBP1408-1Ostra toksyczność
Anachemiaagarowa02116-380
Aluminiowa płyta TLCSigma-Aldrich
Amersham Imager 600GE Healthcare Nauki przyrodnicze29083461
Nadsiarczan amonuBiorad161-0700Szkodliwe
komórki BL21NEBC2527H
Kwas borowyACPB-2940
Bromofenol Niebieska sól sodowaSigmaB8026-25G
ChloloformACPC3300
DithiothreitolSigma Aldrich AlkoholeD0632-5G
DNase IThermoFisherEN0525
EDTA Sól disodowaACPE-4320
EtanolHandlowy 
Płaski żel Końcówki obciążająceCostarCS004854
Formamid 99%AlfaAesar A11076
Zestaw aparatów żelowych z przekładkami i grzebieniamiLabRepCo41077017
Szklane naczynie z plastikową pokrywkąPyrex1122963Powinien być wystarczająco duży, aby zmieścić się w kawałku żelu
GlycerolAnachemia43567-540
HClAnachemia464140468
ImageQuanTLGE Healthcare Nauki przyrodnicze29000605
IPTGInvitrogen15529-019
KClACPP-2940
MgCl2Caledron4903-01
MgSO4Sigma-AldrichM3409
NaClACPS-2830
NaOHBDHBDH9292
Rotator orbitalnyLab-Line
PhenolInvitrogen15513-039
Okrągły żel Końcówki ładująceCostarCS004853
Fosforan sodu dwuzasadowyCaledron8120-1
Fosforan sodu jednozasadowyCaledron8180-01
SYBRGoldThermoFisherS11494
T7 Polimeraza RNAABME041
TEMEDSigma-AldrichT7024-50 ml
TO1-3PEG-Biotyna FluoroforABMG955
Tris BaseFisherBP152-500
TryptonFisherBP1421-500
Tween-20SigmaP9496-100
MocznikFisherU15-3
Ksylen CyanolSigmaX4126-10G
Ekstrakt z drożdżyBioshopYEX401.500
1164840001P016EAAN

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dolgosheina, E. V., et al. RNA Mango Aptamer-Fluorophore: A Bright, High-Affinity Complex for RNA Labeling and Tracking. ACS Chemical Biology. , (2014).
  2. Autour, A., et al. Fluorogenic RNA Mango aptamers for imaging small non-coding RNAs in mammalian cells. Nature Communications. 9, 656(2018).
  3. Dolgosheina, E. V., Unrau, P. J. Fluorophore-binding RNA aptamers and their applications: Fluorophore-binding RNA aptamers. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. , (2016).
  4. Panchapakesan, S. S., et al. Ribonucleoprotein Purification and Characterization using RNA Mango. RNA. , 1592-1599 (2017).
  5. Trachman, R. J. III, et al. Structural basis for high-affinity fluorophore binding and activation by RNA Mango. Nature Chemical Biology. 13, 807(2017).
  6. Trachman, R. J., et al. Crystal Structures of the Mango-II RNA Aptamer Reveal Heterogeneous Fluorophore Binding and Guide Engineering of Variants with Improved Selectivity and Brightness. Biochemistry. 57, 3544-3548 (2018).
  7. Trachman, R., et al. Mango-III is a compact fluorogenic RNA aptamer of unusual structural complexity. Nature Chemical Biology. , in review (2018).
  8. Panchapakesan, S. S. S., Jeng, S. C. Y., Unrau, P. J. RNA complex purification using high-affinity fluorescent RNA aptamer tags. Annals of the New York Academy of Sciences. , (2015).
  9. Filonov, G. S., Kam, C. W., Song, W., Jaffrey, S. R. In-gel imaging of RNA processing using Broccoli reveals optimal aptamer expression strategies. Chemistry & Biology. 22, 649-660 (2015).
  10. Milligan, J. F., Groebe, D. R., Witherell, G. W., Uhlenbeck, O. C. Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates. Nucleic Acids Research. 15, 8783-8798 (1987).
  11. A Typical DNase I Reaction Protocol (M0303). NEB. , Available from: https://www.neb.com/protocols/1/01/01/a-typical-dnase-i-reaction-protocol-m0303 (2018).
  12. Sambrook, J., Russell, D. W. Purification of Nucleic Acids by Extraction with Phenol:Chloroform. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), pdb.prot4455 (2006).
  13. Tuma, R. S., et al. Characterization of SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain: A Dye Optimized for Use with 300-nm Ultraviolet Transilluminators. Analytical Biochemistry. 268, 278-288 (1999).
  14. Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Northern Friess, H. Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues. Nature Protocols. 4, 37-43 (2009).
  15. Ebhardt, H. A., Unrau, P. J. Characterizing multiple exogenous and endogenous small RNA populations in parallel with subfemtomolar sensitivity using a streptavidin gel-shift assay. RNA. 15, 724-731 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Obrazowanie eli poliakrylamidowychbarwienie TO1 biotynanaliza eli w warunkach natywnychanaliza eli denaturuj cychbadanie mobilno ci RNAfluorescencyjna detekcja RNAprotok barwienia elikwantyfikacja RNA

Powiązane artykuły