Tutaj prezentujemy dwa protokoły przekształcania roślin ziemniaka. Transformacja Agrobacterium tumefaciens prowadzi do kompletnej rośliny transgenicznej, podczas gdy Agrobacterium rhizogenes wytwarza transgeniczne owłosione korzenie w pędach typu dzikiego, które mogą się samodzielnie rozmnażać. Następnie wykrywamy aktywność promotora poprzez barwienie GUS w przekształconych korzeniach.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Przemiana ziemniaka w ziemniaku za pośrednictwem Agrobacterium tumefaciens i Agrobacterium rhizogenes oraz aktywność promotorowa genu suberyny przez barwienie GUS
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Agrobacterium sp. jest jedną z najczęściej stosowanych metod pozyskiwania roślin transgenicznych, ponieważ posiada zdolność do przenoszenia i integrowania własnego T-DNA z genomem rośliny. W tym miejscu przedstawiamy dwa systemy transformacji w celu genetycznej modyfikacji roślin ziemniaka (Solanum tuberosum). W transformacji A. tumefaciens liście są infekowane, transformowane komórki są selekcjonowane, a nowa, kompletna przekształcona roślina jest regenerowana przy użyciu fitohormonów w ciągu 18 tygodni. W transformacji A. rhizogenes łodygi są infekowane przez wstrzyknięcie bakterii igłą, nowo powstałe, przekształcone owłosione korzenie są wykrywane za pomocą czerwonego markera fluorescencyjnego, a nieprzekształcone korzenie są usuwane. W ciągu 5-6 tygodni powstała roślina jest kompozytem pędu typu dzikiego z w pełni rozwiniętymi, przekształconymi owłosionymi korzeniami. Aby zwiększyć biomasę, przekształcone owłosione korzenie można wyciąć i samodzielnie rozmnożyć. Zastosowaliśmy obie metody transformacji za pośrednictwem Agrobacterium, aby uzyskać korzenie wyrażające gen reporterowy GUS napędzany przez promotor genu biosyntezy suberyny. Zapewniona jest procedura barwienia GUS, która pozwala na lokalizację komórkową indukcji promotora. W obu metodach przekształcone korzenie ziemniaka wykazywały zabarwienie GUS w korkowatej endodermie i egzodermie, a dodatkowo w korzeniach przekształconych przez A. rhizogenes aktywność GUS wykryto również w pojawieniu się korzeni bocznych. Wyniki te sugerują, że A. rhizogenes może być szybkim alternatywnym narzędziem do badania genów ulegających ekspresji w korzeniach.
Wprowadzenie
Oprócz interesu ekonomicznego, generowanie roślin transgenicznych ma swoje własne znaczenie w badaniach, które demonstrują ostateczną funkcję genów i lepiej rozumieją fizjologię i rozwój roślin. Najczęściej stosowaną metodą insercji DNA roślinnego jest transformacja za pośrednictwem Agrobacterium. Agrobacterium tumefaciens jest w stanie wytwarzać galasy koronowe w zakażonych tkankach wielu gatunków roślin poprzez działanie plazmidu indukującego nowotwór (Ti). Plazmid zawiera region T-DNA z zestawem genów, które zostaną zintegrowane z genomem rośliny i wywołają dedyferencjację tkanek 1,2. Wymiana tych genów w obrębie T-DNA przez transgen pozwoliła na wygenerowanie specyficznych modyfikacji roślin, unikając efektów fenotypowych3. Aby ułatwić klonowanie transgenu do T-DNA, region T-DNA został wycięty w niezależnym plazmidzie zwanym plazmidem binarnym, podczas gdy reszta genów plazmidu Ti (geny wirulencji, które umożliwiają mechanizmy transferu i insercji T-DNA) została umieszczona w plazmidzie pomocniczym. W przypadku badań nad biotechnologią roślin, transformacja przez A. tumefaciens ma kilka zalet: nie wymaga drogich urządzeń, jest w stanie generować zarówno stabilną, jak i przejściową transformację roślin, a niewielka liczba kopii genów jest zintegrowana z klasą chromosomów4. Jednak w przypadku większości roślin, ale nie rzodkiewnika, wytwarzanie stabilnych transformantów wymaga regeneracji roślin z jednej lub kilku komórek przy użyciu egzogennych fitohormonów, co sprawia, że proces ten jest pracochłonny i czasochłonny. A. rhizogenes jest również w stanie modyfikować genom rośliny, wytwarzając owłosione korzenie lub korzenie przybyszowe w miejscach infekcji z powodu ekspresji genów rol (loci korzenia) kodowanych w plazmidzie indukującym korzenie (Ri) class<="xref">5. Chociaż mniej przebadany niż A. tumefaciens, A. rhizogenes jest również używany do uzyskiwania korzeni transgenicznych. W tym przypadku A. rhizogenes zawiera oryginalne T-DNA w plazmidzie Ri i binarny plazmid z drugim T-DNA przenoszącym transgen. Gdy miejsce infekcji znajduje się w łodygach lub hipokotylach, można uzyskać roślinę kompozytową, z nowymi owłosionymi korzeniami transgenicznymi wyłaniającymi się z pędów typu dzikiego. Alternatywnie, owłosione, przekształcone korzenie mogą rosnąć autonomicznie in vitro w pożywkach ze źródłem węgla. Stosowanie A. rhizogenes zamiast A. tumefaciens do produkcji tkanki transgenicznej zyskuje na znaczeniu, gdy korzeń jest organem docelowym, ponieważ regeneracja roślin nie jest wymagana, a zatem jest szybsza i mniej kosztowna. Wcześniejsze badania wykazały, że ta metodologia jest odpowiednia do charakterystyki fenotypowej genów specyficznych dla korzenia6,7,8,9.
Ziemniak (Solanum tuberosum) jest czwartą najważniejszą uprawą na świecie według Organizacji Narodów Zjednoczonych ds. Wyżywienia i Rolnictwa (FAO), ponieważ bulwa ma znaczenie odżywcze dla ludzi, ponieważ jest dobrym źródłem witamin i minerałów. Z tego powodu ziemniak znalazł się w centrum uwagi biotechnologii rolniczej, a także jest uważany za dobry model biologiczny do badań genetycznych i rozwojowych10,11. Transformacja ziemniaka znacząco przyczyniła się do zrozumienia mechanizmów molekularnych leżących u podstaw skorkowaciałych tkanek poprzez charakterystykę genów zaangażowanych w biosyntezę suberyny i wosku12,13,14,15,16,17, transport monomeru suberyny18 oraz Regulacja transkrypcji19. Gen feruloilotransferazy suberyny, FHT, jest jednym z tych scharakteryzowanych genów biosyntetycznych; Jego regulacja w dół powoduje silne upośledzenie ochrony perydermy, co jest skorelowane z silnym spadkiem estrów ferulanowych suberyny i wosków w bulwach ziemniaka14. Równocześnie, w korzeniach i nasionach rzodkiewnika, nokaut jego domniemanego ortologu (ASFT/RWP1) również wykazał jego rolę w wytwarzaniu ferulianów alkilowych w suberin20,21. U ziemniaka transkrypcyjna linia reporterowa FHT i przeciwciało FHT wykazały odpowiednio, że aktywność promotora i białko są zlokalizowane w egzodermii, endodermie, pochodnych phellogenu oraz w uszkodzonych tkankach15.
W tej pracy szczegółowo opisujemy protokół wykorzystujący A. rhizogenes do produkcji transgenicznych owłosionych korzeni, które są utrzymywane w pędach typu dzikiego, generując złożone rośliny ziemniaka lub wycinane do autonomicznego wzrostu in vitro. Udostępniamy również protokół z wykorzystaniem A. tumefaciens w celu uzyskania kompletnych transgenicznych roślin ziemniaka. Jako studium przypadku, A. rhizogenes i A. tumefaciens transformowane za pomocą tego samego wektora binarnego są wykorzystywane do uzyskania korzeni z promotorem FHT napędzającym ekspresję genu reporterowego GUS. Wyniki są raportowane i porównywane.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Protokół transformacji A. rhizogenes został zaadaptowany i zmodyfikowany na podstawie pracy Horn i wsp.7, a testowanym genotypem był S. tuberosum ssp. tuberosum (cv. Désirée). Protokół transformacji A. tumefaciens został zaadaptowany i zmodyfikowany na podstawie pracy Banerjee i wsp.22, a testowanymi genotypami były S. tuberosum ssp. tuberosum (cv. Désirée) oraz S. tuberosum ssp. andigena. Główne etapy obu procedur zostały podsumowane odpowiednio na Rysunku 1 i Rysunku 2.
UWAGA: Wszystkie etapy procedury przenoszenia roślin in vitro należy przeprowadzać szybko i, w miarę możliwości, utrzymywać płytki lub doniczki zamknięte, aby zminimalizować ekspozycję roślin na powietrze i uniknąć więdnięcia oraz kontaminacji. O ile nie zaznaczono inaczej, wszystkie inkubacje roślin przeprowadzano w komorach w warunkach 12 h światła w 24 °C/12 h ciemności w 20 °C oraz przy natężeniu 67 µmol m-1 s-1. O ile nie zaznaczono inaczej, wszystkie manipulacje z bakteriami oraz przeniesienia roślin in vitro należy wykonywać w warunkach aseptycznych w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Wszystkie receptury pożywek dla Agrobacterium oraz kultur roślin in vitro podano w Tabeli S1.
UWAGA: Wszystkie genetycznie zmodyfikowane bakterie i rośliny należy umieścić w odpowiednim pojemniku na odpady.
1. Hodowle Agrobacterium wykorzystywane do transformacji
UWAGA: Szczep użyty do transformacji A. rhizogenes to C58C1:Pri15837 (udostępniony przez dr Inge Broer), a dla A. tumefaciens był to GV2260 (udostępniony przez dr Salomé Prat). A. rhizogenes został poddany transformacji wektorem binarnym PK7GWIWG2_II-RedRoot (VIB-Department of Plant Systems Biology at Universiteit Gent; http://gateway.psb.ugent.be), który zawiera T-DNA z markerem transformacji służącym do monitorowania powstawania korzeni włosych. Aby porównać korzenie transformowane przez A. rhizogenes oraz A. tumefaciens, oba szczepy przekształcono wektorem binarnym pKGWFS7, który zawiera T-DNA z promotorem FHT sterującym genem reporterowym β-glukuronidazy (GUS) oraz genem oporności na kanamycynę jako markerem selekcyjnym15.
- Wybrać kolonię Agrobacterium i hodować ją przez noc (O/N) w 5 mL pożywki YEB z dodatkiem antybiotyków (Tabela S1) w 50 mL probówce wirówkowej w temperaturze 28 °C przy wstrząsaniu z prędkością 200 rpm.
- W przypadku transformacji A. tumefaciens zmierzyć gęstość optyczną, która musi wynosić OD600 = 0,6-1,0.
- Jeśli gęstość optyczna jest wyższa, wykonać subkulturę, obniżając ją do OD600 = 0,3 przy użyciu świeżej pożywki i czekać, aż kultura osiągnie OD600 = 0,6-1.
- Odwirować 1 mL kultury Agrobacterium przy 3 000 x g w wirówce laboratoryjnej przez 10 min w temperaturze pokojowej.
- Usunąć nadosad za pomocą pipety i resuspenderć komórki w 1 mL świeżej pożywki YEB bez antybiotyków. Powtórzyć ten krok, aby zapewnić całkowite usunięcie antybiotyków.
- W przypadku transformacji A. tumefaciens, podczas ostatniej resuspensji dodać odpowiednią objętość pożywki YEB, aby uzyskać końcową gęstość optyczną OD600 = 0,8.
- Przechowywać komórki w lodzie podczas przygotowywania roślin do infekcji.
2. Materiał roślinny do transformacji
- Wykonaj jeden lub dwa węzłowe sadzonki pędowe zawierające pąki wierzchołkowe lub pachyne z jałowych roślin ziemniaka in vitro (rośliny dawcy); hoduj je w doniczkach na stałej pożywce 2MS przez 3 do 4 tygodni (Rysunek 1A oraz Rysunek 2A).
3. Transformacja roślin z użyciem A. rhizogenes (Rysunek 1)
UWAGA: Niniejsza procedura pozwala na otrzymanie zmodyfikowanych genetycznie korzeni włosowatych. W celu oceny ekspresji transgenu niezbędna jest kontrola negatywna. Aby przygotować kontrolę negatywną, należy przeprowadzić procedurę z użyciem szczepu A. rhizogenes niezmodyfikowanego lub zmodyfikowanego pustym wektorem zawierającym marker transformacji.
- Należy użyć świeżych szalek z pożywką; alternatywnie szalki można przechowywać w 4 °C z pokrywką skierowaną do góry, szczelnie zabezpieczone przezroczystą folią, aby zapobiec odwodnieniu pożywki. Aby przygotować kwadratowe płytki z pożywką, należy je przechylić o ~15°należy wypełnić 40 ml pożywki MS i pozostawić do zastygnięcia. Pozwoli to zminimalizować kontakt części nadziemnej rośliny z podłożem.
- Bardzo ostrożnie przenieś roślinę dawcy z pożywki 2MS na kwadratową płytkę o wymiarach 120 mm x 120 mm.
- Wstrzyknąć do jednego międzywęźla łodygi 3 μL z *A. rhizogenes* kultury za pomocą igły chirurgicznej; czynność tę należy powtórzyć dwukrotnie dla każdej rośliny, w miarę możliwości w różnych międzywęzlach.
UWAGA: Każdy wtrysk należy traktować jako niezależne zdarzenie transformacji (Rysunek 1B). - Niezwłocznie przenieś całą roślinę na kwadratową płytkę z litym podłożem MS uzupełnionym o 0,1 mM acetosyringonu. Umieść 2 rośliny na jednej płytce.
UWAGA: Roztwór zapasowy acetosyringonu o stężeniu 1 M jest przygotowany w DMSO i może być przechowywany w temperaturze -20 °C. - Uszczelnij płytkę za pomocą taśmy chirurgicznej i umieść ją w pozycji pionowej w komorze inkubacyjnej na 4 dni.
- Przenieś roślinę na nową kwadratową płytkę z pożywką MS uzupełnioną o cefotaksym sodowy [500 µg/mLaby zabić A. rhizogenes.
- Po 10–12 dniach zaczną pojawiać się korzenie włochate (Rycina 1C,1D). Następnie wyciąć naturalne korzenie rośliny i przenieść roślinę na nową kwadratową płytkę z pożywką MS uzupełnioną o cefotaksym sodowy [500 µg/mL].
UWAGA: Przekształcone włochate korzenie można zweryfikować pod kątem fluorescencji czerwonej przy użyciu markera transformacyjnego DsRed (Rysunek 3D). - Aby uzyskać roślinę kompozytową (Rycina 1E), pozostawić transgeniczne włochate korzenie do wzrostu przez 3-4 tygodnie na pożywce MS uzupełnionej o cefotaksym sodowy [500 μg/mL] (wymieniać pożywkę co tydzień).
- W zależności od celu, należy przeprowadzić rozmnażanie transgenicznych włośnikowych korzeni oraz kontroli negatywnych w następujący sposób.
- Przenieś całą roślinę kompozytową do układu hydroponicznego (Tabela S2) lub podłoże glebowe, aby umożliwić intensywny wzrost.
- Aby indywidualnie propagować transformowane korzenie włochate, należy za pomocą skalpela odciąć korzenie wykazujące ekspresję czerwonego fluorescencyjnego markera transformacji (białko DsRed), gdy osiągną one długość 4-8 cm (Rysunek 1E) i przenieść je do szalki Petriego z pożywką stałą Gamborg B5 uzupełnioną o 2% sacharozy oraz cefotaksym sodowy [500 μg/mL]. Uszczel płytki plastikową folią laboratoryjną i inkubuj je w ciemności w temperaturze 20 °C.
UWAGA: Korzenie można manipulować pod stereomikroskopem wyposażonym w detekcję fluorescencji w warunkach sterylnych (patrz Tabela materiałów). - W celu produkcji biomasy (tj. analizy ekspresji genów), odciąć korzeń włókowaty o długości 5 cm i przenieść go do kolby Erlenmeyera o pojemności 150 ml zawierającej 20 ml płynnej pożywki Gamborg B5 uzupełnionej o 2% sacharozy i cefotaksym sodowy [500 µg/mL]. Hodować przez 6 tygodni w ciemności w temperaturze 20 °C oraz 60 obr./min.
Rysunek 1: Harmonogram otrzymywania transgenicznych korzeni włochatych ziemniaka przy użyciu A. rhizogenes. Przedstawiono skumulowaną liczbę tygodni potrzebną do osiągnięcia każdego etapu procesu transformacji oraz kolejne kroki w celu wyhodowania korzeni włóknistych. Przedstawiono reprezentatywne obrazy różnych etapów: inicjację procesu z wykorzystaniem 3-tygodniowych in vitro rośliny (A), a następnie zakażenie roślin poprzez wstrzyknięcie A. rhizogenes (B), tworzenie tkanki proliferacyjnej (C, strzałki) z wyrastającymi korzeniami włosokosmowymi (D), a rozwinięte korzenie włoskowate wykazujące ekspresję czerwonego fluorescencyjnego markera transformacji DsRed (E). Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
4. Transformacja roślin z użyciem A. tumefaciens (Rysunek 2)
UWAGA: Niniejsza procedura umożliwia uzyskanie roślin transformowanych. Aby ocenić efekt transgenu, niezbędna jest kontrola negatywna. Jedną z opcji jest przeprowadzenie procedury z użyciem A. tumefaciens transformowanego pustym wektorem. Alternatywnie można zastosować rośliny typu dzikiego.
- Odetnij liść z roślin w wieku 3-4 tygodni (Rysunek 2A) i umieść go w szalce Petriego. Za pomocą skalpela usuń ogonek i wykonaj nacięcia poprzeczne (od 1 do 3, zależnie od wielkości liścia) od środka liścia w kierunku krawędzi, uważając, aby ich nie przeciąć całkowicie (Rysunek 2B).
- Bezzwłocznie umieść liść stroną abaksjalną do góry, tak aby pływał na 10 mL świeżej płynnej pożywki 2MS w szalce Petriego, a następnie zamknij szalkę. Powtórz ten krok, mieszcząc do 15 liści dla odmiany cv. Désirée oraz do 25 liści dla ssp. andigena (w zależności od wielkości liści).
- Bezzwłocznie dodaj do płynnej pożywki 80 µL kultury A. tumefaciens o gęstości OD600 = 0,8 i homogenizuj szalkę ręcznie przez 1 min, aby rozprowadzić roztwór bakteryjny.
- Starannie zabezpiecz szalkę folią uszczelniającą, przykryj folią aluminiową i inkubuj przez 2 dni w komorze w temperaturze 24 °C, aby umożliwić przeprowadzenie transformacji.
- Przenieś liście, zachowując orientację stroną abaksjalną do góry, na pożywkę CIM (Rysunek 2B) i inkubuj je przez jeden tydzień w komorze wzrostowej.
- Przesuń pożywkę CIM pęsetą, aby liście mogły lepiej przylegać do podłoża.
- Przenieś liście, zachowując orientację stroną abaksjalną do góry, na pożywkę SIM (Rysunek 2C) i inkubuj je w komorze wzrostowej, odnawiając pożywkę co 7-10 dni, aż pędy osiągną wysokość około 2 cm.
- Przesuń pożywkę SIM pęsetą, aby liście były w pełni otoczone przez podłoże. Gdy wyrośnięte pędy dotkną pokrywki, należy używać wysokich szalek Petriego (100 x 20 mm, wysokość x średnica).
UWAGA: Kalus utworzy się po 2-3 tygodniach na pożywce SIM (Rysunek 2D), a pędy po 6-7 tygodniach (Rysunek 2E). Pędy uznaje się za niezależne zdarzenia transformacyjne, jeśli wyrastają z kalusów powstałych w obrębie niezależnych ran.
- Przesuń pożywkę SIM pęsetą, aby liście były w pełni otoczone przez podłoże. Gdy wyrośnięte pędy dotkną pokrywki, należy używać wysokich szalek Petriego (100 x 20 mm, wysokość x średnica).
- Odetnij po trzy pędy z każdego kalusa (uznawanego za to samo zdarzenie transformacyjne) (Rysunek 2E), przenieś je do kolb hodowlanych z pożywką MG uzupełnioną cefotaksymem sodowym [250 mg/L], aby umożliwić ukorzenienie; oznacz podzbiór numerem i inkubuj w komorze wzrostowej przez 3-4 tygodnie lub do momentu, gdy pędy staną się wigorystyczne (Rysunek 2F).
UWAGA: Podczas odcinania pędów należy dokładnie usunąć kalus, w przeciwnym razie korzeń nie wytworzy się.- Powtórz ten krok tyle razy, ile potrzebnych jest niezależnych linii. Do kolby hodowlanej o średnicy 8 cm można przenieść do 5 różnych zdarzeń transformacyjnych, aby mieć pełną pewność, że rośliny z różnych zdarzeń nie zostaną wymieszane.
- Wybierz najbardziej wigorystyczną roślinę z każdego zdarzenia, odetnij segment szczytowy pędu z 3-4 międzywęzłami i umieść go w nowej kolbie hodowlanej z pożywką 2MS uzupełnioną cefotaksymem sodowym [250 mg/L].
UWAGA: W ciągu 3-6 tygodni roślina będzie rosła efektywnie, rozwijając wigorystyczny pęd i korzenie.- Wróć do komory z pędami niewybranymi, dopóki wybrana roślina nie rozwinie się w pełni.
- Odetnij z rośliny segmenty łodygi z co najmniej jednym międzywęzłem lub z pąkiem szczytowym i przenieś je na nową pożywkę 2MS uzupełnioną cefotaksymem [250 mg/L]. Inkubuj je w komorze wzrostowej.
- Powtarzaj transfer co 3-4 tygodnie, aby ustabilizować linie transformowane in vitro.
UWAGA: Cefotaksym sodowy jest wymagany w co najmniej trzech kolejnych transferach na pożywkę 2MS, aby mieć pewność wyeliminowania A. tumefaciens; jeśli później zaobserwowany zostanie nadmierny wzrost A. tumefaciens, przenieś rośliny ponownie na pożywkę 2MS uzupełnioną cefotaksymem sodowym.
- Powtarzaj transfer co 3-4 tygodnie, aby ustabilizować linie transformowane in vitro.
- Aby scharakteryzować fenotyp roślin, przenieś je do gleby w celu pełnej charakterystyki lub do kultury hydroponicznej w celu oceny systemu korzeniowego.
- Zatrzymaj bulwy wyprodukowane w glebie, aby propagować i utrzymać ustabilizowane linie.
Rysunek 2: Oś czasu uzyskiwania transformowanych roślin ziemniaka przy użyciu A. tumefaciens. Przedstawiono skumulowaną liczbę tygodni potrzebnych do osiągnięcia każdego etapu procesu transformacji oraz kolejne kroki wzrostu roślin. Przedstawiono reprezentatywne obrazy różnych etapów: rozpoczęcie procesu z wykorzystaniem liści z 3-tygodniowych roślin in vitro (A), przeniesienie skaleczonych i zainfekowanych liści na pożywkę CIM (B), liście po przeniesieniu na pożywkę SIM (C), wizualizacja kalusa wokół skaleczonych obszarów po 2–3 tygodniach na pożywce SIM (D), tworzenie pędów po 9–11 tygodniach na pożywce SIM (E) oraz pędy po przeniesieniu na pożywkę MG (F). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
5. Hodowla hydroponiczna
- Przygotować roztwór Hoaglanda o połowie stężenia (0,5x) (Tabela S2) w wiadrze o pojemności 10 L.
- Zanurzyć pompkę akwariową, aby utrzymać jednorodność i odpowiednie warunki natlenienia.
- Wyłożyć ścianki wiadra folią aluminiową, aby zapewnić wzrost korzeni w ciemności.
- Przenieść rośliny in vitro do kultury hydroponicznej, unikając uszkodzenia korzeni.
UWAGA: Aby zapobiec proliferacji mikroorganizmów podczas inkubacji, należy usunąć pozostałości pożywki in vitro z korzeni, ostrożnie wstrząsając nimi w wodzie. - Przykryć rośliny przezroczystą folią (tworząc rodzaj szklarni), aby zapewnić odpowiednią aklimatyzację, a następnie inkubować w komorze wzrostowej.
- Po 3 dniach wykonać otwory w folii, a po tygodniu usunąć ją całkowicie.
- Wymieniać pożywkę na świeżą co 10 dni.
6. GUS histochemiczny test genu reporterowego
UWAGA: W naszym przypadku analiza GUS została przeprowadzona na korzeniach hodowanych przez 2-3 tygodnie w hydroponice lub in vitro.
- Utrwal korzenie w 90% schłodzonym acetonie (v/v) i inkubuj przez 20 minut na lodzie.
- Przeprowadź dwa płukania wodą destylowaną.
- Dodaj świeży roztwór do barwienia GUS (Tabela 1) i zastosuj próżnię (-70 Pa) przez 20 min.
- Inkubuj w temperaturze 37 °C w ciemności, aby chronić światłoczułe GUS, przez 4 h lub do czasu pojawienia się niebieskiego zabarwienia.
UWAGA: Obecność żelazo(III)- i żelazo(II)-cyjanków w roztworze GUS minimalizuje dyfuzję produktów reakcji i zapewnia bardziej precyzyjną lokalizację.
OSTROŻNIE: Podczas pracy z toksycznymi pochodnymi cyjanków w roztworze GUS (żelazo(III)cyjanek potasu i żelazo(II)cyjanek potasu) należy używać wyciągu i nosić odzież ochronną. Substrat GUS oraz materiały zużyte należy utylizować w bezpieczny sposób. - Usuń roztwór do barwienia GUS i wylej go do odpowiednich pojemników.
- Przeprowadź dwa płukania 70% (v/v) etanolem.
- Obserwuj pod mikroskopem w polu jasnym.
UWAGA: Barwienie GUS jest stabilne przez kilka tygodni; jednak w pierwszym tygodniu sygnał GUS jest wyraźny i mniej dyfunduje do sąsiednich komórek. W celu dłuższego przechowywania szczelnie zamknij probówkę i przechowuj w temperaturze 4 °C.
Tabela 1: Skład roztworu do barwienia GUS.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Agrobacterium rhizogenes-pośrednia transformacja ziemniaka
W niniejszej pracy przedstawiono szczegółową procedurę uzyskiwania korzeni transformowanych A. rhizogenes. Rysunek 1 prezentuje schemat procedury, która łącznie trwa około 5-6 tygodni (od iniekcji A. rhizogenes do uzyskania w pełni rozwiniętych korzeni włochatych). Następnie roślin...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W ziemniakach najpowszechniejszym systemem uzyskiwania stabilnych, kompletnych roślin transgenicznych jest transformacja przez szczepy Agrobacterium tumefaciens, które wymagają organogenezy przy użyciu egzogennych fitohormonów. Chociaż protokoły oparte na Agrobacterium mają potencjał do integracji sekwencji25 wektorów innych niż T-DNA, metodologia ta jest nadal najłatwiejsza i tańsza dostępna do przekształcania roślin ziemniaka. W ostatnich latach zainteresowanie transformacją za...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez Ministerio de Innovación y Ciencia (AGL2009-13745, grant FPI dla PB), Ministerio de Economía y Competitividad i finansowanie FEDER (AGL2012-36725, AGL2015-67495-C2-1-R) oraz Uniwersytet w Gironie (grant doktorski dla SF i grant SING11/1). Autorzy są wdzięczni dr Inge Broer (Institute for Land Use, Uniwersytet w Rostocku, Rostock, Niemcy) i dr Salomé Prat (Centro Nacional de Biotecnología, Madryt, Hiszpania) za dostarczenie odpowiednio szczepu A. rhizogenes i A. tumefaciens oraz dr Marçal Soler i dr Annie Plasencia za pomoc i wsparcie otrzymane w inicjacji A. rhizogenes eksperymenty transformacyjne (Uniwersytet Paula Sabatiera w Tuluzie III — CNRS, Laboratorium Badań Roślin (LRSV), Castanet Tolosan, Francja). Autorzy dziękują Sarze Gómez (Department de Biologia, UdG, Girona) za jej cenną pomoc w prowadzeniu prac laboratoryjnych i opiece nad roślinami, a także Ferranowi Fontdecabie i Carli Sánchez, którzy pomagali w niektórych eksperymentach podczas wykonywania prac dyplomowych.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Aceton < | p>Panreac | 1.310.071.21 | |
| Acetosyringon | Acros | 115540050 | |
| Pompa akwariowa | Prodac | MP350 | |
| Autoklaw | Ragpa Strelimatic | ||
| Agar bakteriologiczny | Lab Conda | 1800 | |
| BAP | Duchefa | B0904 | |
| Ekstrakt z wołowiny | Lab Conda | < p>1700 | |
| Szafa do uprawy roślin | Nuaire | ||
| Carbenicillin | Duchefa | C0109 | |
| Cefotaksym sodowy | Duchefa | C0111 | |
| DMSO | Merck | 1029310161 | |
| Ecotron infors | HT | 29378 | |
| Etanol | Merck | 1,009,831,011 | |
| >rurka Falcon | Control tecnica | CFT011500 | |
| Frycyjanian | Sigma | 101001081 | |
| Ferrocyanate | Sigma | 100979088 | |
| Kolba (8,06 cm średnicy i 11,3 cm wysokości) i plastikowa pokrywka do hodowli in vitro | Apiglass | ref16 | |
| GA3 | Sigma | G7645 | |
| Gamborg B5 media | Duchefa | G0210 | |
| Gelrite | Duchefa | < p>G1101 | |
| Glukoza | Sigma | G5767 | |
| Kanamycyna | Sigma | K1377 | |
| Leukopor tape | BSN Leukopor | BDF47467 | |
| Lupe | Wild-Heerbrugg | M420 | |
| Wytrząsarka magnetyczna | Agimatic | 7000243 | |
| MES hydrat | Sigma | M2933-25G | |
MgSO4 | Panreac | 131404 | |
| mikroskop | Olympus | ||
| Minufugue centrifugue 5415R | Eppendorf | ||
| Murashige i Skoog media | Duchefa | M0254.0050 | |
Na2HPO4 | Panreac | 131679 | |
| NAA | Duchefa | N0903 | |
| NaCl | Panreac | 131659 | |
NaH2PO4 | Sigma | 58282 | |
| NightSea Stereo | SFA Moonting Adapter | ||
| Parafilm | < p>Anorsa | PRFL-001-001 | |
| >pepton | Lab Conda | 1616 | |
| Petri (90 x 14) | Anorsa | 200200 | |
| pHmetre | Crison | < p> | |
| Phytotron | Inkoa | RFTI-R5485 | |
| Plant Agar | Duchefa | P1001 | |
| Refrigeratot | Liebherr Medline | ||
| ryfampicyna | Duchefa | R0146 | |
| Spectinomycin | Sigma | 59007 | |
| Spektrofotometr | Shimadzu | ||
| Płytki kwadratowe (120 x 120) | Deltalab | < p>200204 | |
| Streptomycyna | Sigma | S6501 | |
| Sacharoza | Panreac | 131621 | |
| Ostrza chirurgiczne | Swann-Morton | 201 | |
| Igła chirurgiczna | NIPRO | 015/0204 | |
| Triptone | Lab Conda | 1612 | |
| Triton | Serva | 37240 | |
| Unimax 1010 shaker | Heidolph | < | |
| p>Próżnia | Dinko | ||
| x-GlcA (kwas 5-bromo-4-chloro-3-indoksyl-beta-D-glukuronowy, sól sodowa bezwodna) | Biosynth | B-7398 | |
| Ekstrakt drożdżowy | Lab Conda | 1702.00 | |
| Rybozyd zeatyny | Sigma | 1001042850 |
Bibliografia
- Gelvin, S. B. Traversing the Cell: Agrobacterium T-DNA's journey to the host genome. Frontiers in Plant Science. 3, 1-11 (2012).
- Lacroix, B., Citovsky, V. The roles of bacterial and host plant factors in Agrobacterium-mediated genetic transformation. The International Journal of Developmental Biology. 57 (6-8), 467-481 (2013).
- Lee, L. Y., Gelvin, S. B. T-DNA binary vectors and systems. Plant Physiology. 146 (2), 325-332 (2008).
- Ishida, Y., et al. High efficiency transformation of maize (Zea mays L.) mediated by Agrobacteriumtumefaciens. Nature Biotechnology. 14 (6), 745-750 (1996).
- White, F. F., Taylor, B. H., Huffman, G. A., Gordon, M. P., Nester, E. W. Molecular and genetic analysis of the transferred DNA regions of the root-inducing plasmid of Agrobacterium rhizogenes. Journal of Bacteriology. 164 (1), 33-44 (1985).
- Dinh, P. T. Y., Brown, C. R., Elling, A. A. RNA Interference of effector gene Mc16D10L confers resistance against Meloidogyne chitwoodi in Arabidopsis and Potato. Phytopathology. 104 (10), 1098-1106 (2014).
- Horn, P., et al. Composite potato plants with transgenic roots on non-transgenic shoots: a model system for studying gene silencing in roots. Plant Cell Reports. 33 (12), 1977-1992 (2014).
- Plasencia, A., et al. Eucalyptus hairy roots, a fast, efficient and versatile tool to explore function and expression of genes involved in wood formation. Plant Biotechnology Journal. 14 (6), 1381-1393 (2015).
- Ron, M., et al. Hairy root transformation using Agrobacteriumrhizogenes as a tool for exploring cell type-specific gene expression and function using tomato as a model. Plant Physiology. 166 (2), 455-469 (2014).
- Zhang, W., et al. Development and application of a universal and simplified multiplex RT-PCR assay to detect five potato viruses. Journal of General Plant Pathology. 83 (1), 33-45 (2017).
- Almasia, N. I., et al. Successful production of the potato antimicrobial peptide Snakin-1 in baculovirus-infected insect cells and development of specific antibodies. BMC Biotechnology. 17 (1), 1-11 (2017).
- Serra, O., et al. Silencing of StKCS6 in potato periderm leads to reduced chain lengths of suberin and wax compounds and increased peridermal transpiration. Journal of Experimental Botany. 60 (2), 697-707 (2009).
- Serra, O., et al. CYP86A33-Targeted gene silencing in potato tuber alters suberin composition, distorts suberin lamellae, and impairs the periderm's water barrier function. Plant Physiology. 149 (2), 1050-1060 (2008).
- Serra, O., et al. A feruloyl transferase involved in the biosynthesis of suberin and suberin-associated wax is required for maturation and sealing properties of potato periderm. The Plant Journal. 62 (2), 277-290 (2010).
- Boher, P., Serra, O., Soler, M., Molinas, M., Figueras, M. The potato suberin feruloyl transferase FHT which accumulates in the phellogen is induced by wounding and regulated by abscisic and salicylic acids. Journal of Experimental Botany. 64 (11), 3225-3236 (2013).
- Serra, O., Chatterjee, S., Figueras, M., Molinas, M., Stark, R. E. Deconstructing a plant macromolecular assembly: chemical architecture, molecular flexibility, and mechanical performance of natural and engineered potato suberins. Biomacromolecules. 15 (3), 799-811 (2014).
- Vulavala, V. K. R., et al. Identification of genes related to skin development in potato. Plant Molecular Biology. 94 (4-5), 481-494 (2017).
- Landgraf, R., et al. The ABC transporter ABCG1 is required for suberin formation in potato tuber periderm. The Plant Cell. 26 (8), 3403-3415 (2014).
- Verdaguer, R., et al. Silencing of the potato StNAC103 gene enhances the accumulation of suberin polyester and associated wax in tuber skin. Journal of Experimental Botany. 67 (18), 5415-5427 (2016).
- Molina, I., Li-Beisson, Y., Beisson, F., Ohlrogge, J. B., Pollard, M. Identification of an Arabidopsis feruloyl-coenzyme A transferase required for suberin synthesis. Plant Physiology. 151 (3), 1317-1328 (2009).
- Gou, J. Y., Yu, X. -H., Liu, C. J. A hydroxycinnamoyltransferase responsible for synthesizing suberin aromatics in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (44), 18855-18860 (2009).
- Banerjee, A. K., Prat, S., Hannapel, D. J. Efficient production of transgenic potato (S. tuberosum L. ssp. andigena) plants via Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation. Plant Science. 170 (4), 732-738 (2006).
- Sunil Kumar, G. B., Ganapathi, T. R., Srinivas, L., Revathi, C. J., Bapat, V. a Expression of hepatitis B surface antigen in potato hairy roots. Plant Science. 170 (5), 918-925 (2006).
- Schmidt, J. F., Moore, M. D., Pelcher, L. E., Covello, P. S. High efficiency Agrobacteriumrhizogenes-mediated transformation of Saponariavaccaria L. (Caryophyllaceae) using fluorescence selection. Plant Cell Reports. 26 (9), 1547-1554 (2007).
- Petti, C., Wendt, T., Meade, C., Mullins, E. Evidence of genotype dependency within Agrobacteriumtumefaciens in relation to the integration of vector backbone sequence in transgenic Phytophthorainfestans-tolerant potato. Journal of Bioscience and Bioengineering. 107 (3), 301-306 (2009).
- Gaudin, V., Vrain, T., Jouanin, L. Bacterial genes modifying hormonal balances in plants. Plant Physiology and Biochemistry. 32 (1), 11-29 (1994).
- Nemoto, K., et al. Function of the aux and rol genes of the Ri plasmid in plant cell division in vitro. Plant Signaling &. Behavior. 4 (12), 1145-1147 (2009).
- Visser, R. G. F., et al. Expression and inheritance of inserted markers in binary vector carrying Agrobacteriumrhizogenes-transformed potato (Solanumtuberosum L.). Theoretical and Applied Genetics. 78 (5), 705-714 (1989).
- Guillon, S., Trémouillaux-Guiller, J., Pati, P. K., Rideau, M., Gantet, P. Hairy root research: recent scenario and exciting prospects. Current Opinion in Plant Biology. 9 (3), 341-346 (2006).
- Georgiev, M. I., Agostini, E., Ludwig-Müller, J., Xu, J. Genetically transformed roots: from plant disease to biotechnological resource. Trends in Biotechnology. 30 (10), 528-537 (2012).
- Ooms, G., Lenton, J. R. T-DNA genes to study plant development: precocious tuberisation and enhanced cytokinins in A. tumefaciens transformed potato. Plant Molecular Biology. 5 (4), 205-212 (1985).
- de Vries-Uijtewaal, E., et al. Fate of introduced genetic markers in transformed root clones and regenerated plants of monohaploid and diploid potato genotypes. TAG. Theoretical and applied genetics. 78 (2), 185-193 (1989).
- Bird, D., et al. Characterization of Arabidopsis ABCG11/WBC11, an ATP binding cassette (ABC) transporter that is required for cuticular lipid secretion. The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 52 (3), 485-498 (2007).
- Luo, B., Xue, X. Y., Hu, W. L., Wang, L. J., Chen, X. Y. An ABC transporter gene of Arabidopsis thaliana, AtWBC11, is involved in cuticle development and prevention of organ fusion. Plant and Cell Physiology. 48 (12), 1780-1802 (2007).
- Panikashvili, D., et al. The Arabidopsis DESPERADO/AtWBC11 transporter is required for cutin and wax secretion. Plant Physiology. 145 (4), 1345-1360 (2007).
- Panikashvili, D., et al. The Arabidopsis DSO/ABCG11 transporter affects cutin metabolism in reproductive organs and suberin in roots. Molecular Plant. 3 (3), 563-575 (2010).
- Bjelica, A., et al. Fatty acid ω-hydroxylases from Solanum tuberosum. Plant Cell Reports. 35 (12), 2435-2448 (2016).
- Ding, Y., et al. Abscisic acid coordinates nod factor and cytokinin signaling during the regulation of nodulation in Medicago truncatula. The Plant Cell. 20 (10), 2681-2695 (2008).
- Isayenkov, S., Mrosk, C., Stenzel, I., Strack, D., Hause, B. Suppression of allene oxide cyclase in hairy roots of Medicagotruncatula reduces jasmonate levels and the degree of mycorrhization with glomus intraradices 1[w]. Plant Physiology. 139 (3), 1401-1410 (2005).
- Dalton, D. A., et al. Physiological roles of glutathione S-Transferases in soybean root Nodules 1[C][W][OA]. Plant Physiology. 150 (1), 521-530 (2009).
- Limpens, E., et al. RNA interference in Agrobacteriumrhizogenes-transformed roots of Arabidopsis and Medicago truncatula. Journal of Experimental Botany. 55 (399), 983-992 (2004).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
