Artykuł metodologiczny

Pomiar globalnej metaloproteinazy macierzy komórkowej i aktywności metabolicznej w hydrożelach 3D

DOI:

10.3791/59123

⸱

22 stycznia 2019

 , 
1Department of Biomedical Engineering, The Ohio State University, 2The Ohio State University Comprehensive Cancer Center, Arthur G. James Cancer Hospital and Richard J. Solove Research Institute, 3Biomedical Technology Department, King Saud University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj przedstawiono protokół hermetyzacji i hodowli komórek w hydrożelach z poli(glikolu etylenowego) (PEG) funkcjonalizowanych peptydem degradowalnym przez metaloproteinazę o matrycy fluorogennej (MMP). Komórkowy MMP i aktywność metaboliczną mierzy się bezpośrednio z kultur hydrożelowych za pomocą standardowego czytnika mikropłytek.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Trójwymiarowe (3D) systemy hodowli komórkowej często bardziej odwzorowują in vivo odpowiedzi i funkcje komórkowe niż tradycyjne dwuwymiarowe (2D) systemy hodowlane. Jednak pomiar funkcji komórek w hodowli 3D jest często trudniejszy. Wiele testów biologicznych wymaga pobrania materiału komórkowego, co może być trudne w hodowlach 3D. Jednym ze sposobów sprostania temu wyzwaniu jest opracowanie nowych materiałów, które umożliwią pomiar funkcji komórek w materiale. W artykule przedstawiono metodę pomiaru aktywności metaloproteinazy macierzy komórkowej (MMP) w hydrożelach 3D w formacie 96-dołkowym. W tym systemie hydrożel z poli(glikolu etylenowego) (PEG) jest funkcjonalizowany fluorogennym czujnikiem rozszczepialnym MMP. Komórkowa aktywność MMP jest proporcjonalna do intensywności fluorescencji i może być mierzona za pomocą standardowego czytnika mikropłytek. Miniaturyzacja tego testu do formatu 96-dołkowego skróciła czas potrzebny na przygotowanie eksperymentu o 50%, a użycie odczynnika o 80% na warunek w porównaniu z poprzednią 24-dołkową wersją testu. Ten test jest również kompatybilny z innymi pomiarami funkcji komórkowych. Na przykład zademonstrowano tutaj test aktywności metabolicznej, który można przeprowadzić jednocześnie z pomiarami aktywności MMP w tym samym hydrożelu. Test jest demonstrowany z ludzkimi komórkami czerniaka zamkniętymi w szerokim zakresie gęstości wysiewu komórek w celu określenia odpowiedniej gęstości enkapsulacji dla zakresu roboczego testu. Po 24 godzinach enkapsulacji komórek odczyty MMP i aktywności metabolicznej były proporcjonalne do gęstości wysiewu komórek. Chociaż test jest tutaj demonstrowany z jednym degradowalnym substratem fluorogenicznym, test i metodologia mogą być dostosowane do szerokiej gamy systemów hydrożelowych i innych czujników fluorescencyjnych. Taki test zapewnia praktyczną, wydajną i łatwo dostępną platformę do hodowli 3D do szerokiej gamy zastosowań.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Trójwymiarowe (3D) systemy hodowli często bardziej odwzorowują odpowiedzi komórkowe in vivo niż tradycyjne dwuwymiarowe (2D) systemy hodowlane, zobacz kilka doskonałych publikacji1,2,3. Jednak wykorzystanie systemów hodowli 3D do pomiaru funkcji komórek było wyzwaniem ze względu na trudności w pobieraniu komórek i dalszym przetwarzaniu próbek. Ta trudność ogranicza pomiar wielu funkcji komórkowych w systemach hodowli 3D. Aby przezwyciężyć tę trudność, potrzebne są nowe techniki, które umożliwią łatwy pomiar funkcji komórek w środowiskach 3D. Jednym ze sposobów zaspokojenia tej potrzeby jest opracowanie materiałów, które nie tylko wspierają hodowlę komórek 3D, ale także zawierają czujniki do pomiaru funkcji komórek. Na przykład kilka systemów hydrożelowych zawiera frakcje rozszczepialne proteazy fluorogennej, aby umożliwić wizualizację aktywności proteazy w środowiskach 3D4,5,6,7. Podczas gdy systemy te były pierwotnie wykorzystywane do obrazowania mikroskopowego, systemy te można również dostosować do użycia w globalnym teście aktywności metaloproteinazy macierzy (MMP) przy użyciu standardowego czytnika płytek, umożliwiając łatwy pomiar funkcji komórki w środowisku 3D8.

MMPs, nadrodzina proteaz cynkowych, odgrywa kluczową rolę w normalnej homeostazie tkanek i w wielu chorobach. MMP degradują i przebudowują macierz zewnątrzkomórkową (ECM), rozszczepiają receptory i cytokiny na powierzchni komórek oraz aktywują inne MMP9,10. MMP odgrywają kluczową rolę w procesach fizjologicznych, takich jak gojenie się ran oraz w chorobach takich jak zapalenie stawów, miażdżyca, choroba Alzheimera i rak (zobacz recenzje w 9,10,11). W przypadku nowotworów wysoki poziom ekspresji MMP jest silnie skorelowany z przerzutami raka i złym rokowaniem12. Co więcej, MMP przyczyniają się do progresji nowotworu, promując inwazję i migrację komórek rakowych, procesy komórkowe, które są z natury zjawiskami 3D13,14. W związku z tym istnieje duże zainteresowanie możliwością pomiaru aktywności MMP w kulturze 3D w wielu kontekstach, w tym w podstawowych badaniach biologicznych i testach przesiewowych leków.

Hydrożele PEG są szeroko stosowane do hodowli komórkowych 3D ze względu na ich wysoką zawartość wody, odporność na adsorpcję białek i przestrajalny charakter. Hydrożele PEG zostały sfunkcjonalizowane wieloma ugrupowaniami w celu kierowania funkcją komórki, takich jak peptydy mimetyczne ECM, takie jak RGD, RLD i IKVAV w celu ułatwienia adhezji komórek lub bezpośredniego wiązania czynników wzrostu, takich jak transformujący czynnik wzrostu-β (TGF-β)15,16. Ostatnio hydrożele PEG zostały sfunkcjonalizowane peptydami czujnikowymi, które umożliwiają również pomiar funkcji komórek5,8. W szczególności zastosowanie systemu hydrożelowego PEG funkcjonalizowanego fluorogennym peptydem degradowalnym MMP umożliwiło pomiar aktywności komórkowej MMP w kulturach 3D za pomocą standardowego czytnika płytek i nie wymagało dalszego przetwarzania. Systemy te są również kompatybilne z innymi pomiarami funkcji komórkowych, w tym aktywności metabolicznej. W tym miejscu opisano protokół pomiaru aktywności MMP komórek hodowanych w hydrożelu 3D PEG funkcjonalizowanym fluorogennym peptydem degradowalnym MMP, a także przedstawiono wyniki demonstrujące wstępne eksperymenty optymalizacyjne potrzebne do zastosowania tego testu. Ludzkie komórki czerniaka (A375) zostały zamknięte w hydrożelach fluorogennych w zakresie gęstości wysiewu w celu określenia odpowiednich gęstości wysiewu, które mieszczą się w zakresie roboczym testu. Po 24 godzinach enkapsulacji zmierzono MMP i aktywność metaboliczną za pomocą standardowego czytnika mikropłytek. Następnie aktywność MMP znormalizowano do aktywności metabolicznej w celu określenia gęstości wysiewu w liniowym zakresie testu. Na koniec obliczono procentowy współczynnik zmienności wewnątrzpłytkowej (% CV) między trzema powtórzeniami, aby odzwierciedlić odtwarzalność uzyskanych wyników. Metoda ta umożliwia prostą i szybką hodowlę komórkową 3D oraz łatwy pomiar aktywności proteazy przy minimalnym przetwarzaniu próbki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie składników hydrożelu

  1. Zsyntetyzuj fluorescencyjne peptydy degradowalne przez proteazę, jak opisano w innym miejscu8, wykorzystując fluoresceinę jako cząsteczkę fluorescencyjną i dabcyl jako środek wygaszający. Rozpuść peptyd w DMSO do stężenia 10 mM i przechowuj w zamrażarce o temperaturze -80 °C w małych (~30 μL) porcjach, aby uniknąć powtarzających się cykli zamrażania i rozmrażania.
    UWAGA: Peptydy te można również kupić komercyjnie. Protokół ten wymaga C-końcowej cysteiny w sekwencji peptydowej, aby umożliwić kowalencyjne włączenie do sieci polimerowej hydrożelu.
  2. Przygotuj 8 ramion 40 kDa poli(glikol etylenowy) amina (PEG)-norbornen (NB) zgodnie z opisem17. Sprawdź funkcjonalizację grupy końcowej większą niż 90% przy użyciu 1H NMR. Rozpuścić PEG-NB w sterylnym buforze fosforanowym soli fizjologicznej (PBS) o stężeniu 25% w/v i przechowywać w zamrażarce w temperaturze -80 °C w (~300 μL) podwielokrotnościach.
    UWAGA: PEG funkcjonalizowany norbornenem można również kupić komercyjnie.
  3. Zsyntetyzuj fotoinicjator 2,4,6 trimetylobenzoilofosfinianu litu (LAP), jak opisano w innym miejscu18. Rozpuścić LAP w sterylnej wodzie do stężenia 68 mM i przechowywać w zamrażarce o temperaturze -80 °C w (~300 μL) podwielokrotnościach.
    UWAGA: Alternatywnie jako fotoinicjator można zastosować Irgacure (2-hydroksy-4′-(2-hydroksyetoksy)-2-metylopropiofenon). LAP i Irgacure można kupić w sprzedaży.
  4. Rozpuść ulegający degradacji MMP peptyd sieciujący (KCGPQG↓IWGQCK) i peptyd adhezyjny komórek (CRGDS) w sterylnej wodzie do stężenia odpowiednio 200 mM i 100 mM i przechowuj je w zamrażarce o temperaturze -80 °C odpowiednio w podwielokrotnościach (~300 μL i ~30 μL).

2. Przygotowanie podłoża testowego

  1. Przygotować inaktywowaną termicznie, pozbawioną węgla drzewnego płodową surowicę bydlęcą (FBS) do testu MMP:
    UWAGA: Proteazy w FBS mogą wytwarzać wysoki sygnał tła za pomocą testu MMP; dlatego zaleca się inaktywację termiczną i usuwanie FBS węglem drzewnym na pożywkę testową.
    1. Dezaktywować 100 ml FBS przez ogrzewanie przez 30 minut w temperaturze 55 °C.
      UWAGA: Wykorzystano tutaj 100 ml FBS do porcjowania i przechowywania w temperaturze -20 °C do wykorzystania w przyszłości. W razie potrzeby można użyć mniejszych objętości.
    2. Dodaj 0,25% w/v węgla aktywnego i 0,025% w/v dekstranu do niewielkiej ilości FBS (około 5 ml) i mieszaj, aż powstanie zawiesina. Następnie dodać resztę FBS i mieszać przez 30 minut w temperaturze 55 °C.
    3. Wirować przy 1,962 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Następnie przenieść supernatant do innego naczynia.
    4. Powtórzyć krok 2.1.2, ale w temperaturze 37 °C, a następnie krok 2.1.3. Wysterylizuj supernatant za pomocą filtra 0,45 μm, a następnie filtra 0,2 μm.
  2. Przygotować pożywkę testową, używając pożywki uzupełnionej 1% FBS pozbawionym węgla drzewnego, 2 mM L-glutaminy, 10 U/ml penicyliny, 10 μg/ml streptomycyny.
    UWAGA: Zalecane są podłoża bez czerwieni fenolowej, ponieważ mają one mniejsze zakłócenia fluorescencji. Inne dodatki do pożywki testowej, takie jak insulina, czynniki wzrostu itp., mogą być dodawane, o ile piki widma absorbancji i fluorescencji nie nakładają się na czujnik (494 nm/521 nm).
  3. Rozcieńczyć bakteryjny enzym kolagenazy typu I w stężeniach 10 i 1 000 μg/ml w pożywce testowej jako kontrolę pozytywną.

3. Przygotowanie hydrożelu i enkapsulacja komórek

  1. Przygotować roztwór prekursora hydrożelu.
    1. Dodaj odczynniki do probówki o pojemności 1,5 ml w następującej kolejności, wirując po dodaniu każdego składnika: 20 mM 8 arm 40 kDa PEG-NB, 12,75 mM peptyd sieciujący MMP, 17,8 mM NaOH, 1 mM CRGDS, 2 mM LAP i 0,25 mM fluorogeniczny peptyd degradowalny MMP.
      UWAGA: Tabela 1 przedstawia zawartość roztworu prekursora hydrożelu, stężenia podstawowe, stężenia robocze, wzory obliczania objętości oraz wymagane objętości potrzebne do wytworzenia 120 μl roztworu prekursora hydrożelu, co jest wystarczające do przeprowadzenia doświadczenia z 10 hydrożelami. Aby uwzględnić utratę roztworu hydrożelu w wyniku pipetowania, należy zwiększyć całkowitą objętość o 20%. Dostępne w handlu peptydy są często dostarczane w postaci kwaśnego roztworu chlorowodoru; w związku z tym dodaje się NaOH w celu uzyskania końcowego pH 7. pH roztworu końcowego powinno zostać potwierdzone przez użytkownika.
    2. Podziel roztwór prekursora hydrożelu na wiele probówek o pojemności 1,5 ml, po jednej probówce na badany stan.
      UWAGA: Sugerowanych jest kilka warunków kontrolnych, w których hydrożele są przygotowywane bez dodatku komórek. W przypadku kontroli ujemnej, w celu uwzględnienia niespecyficznej degradacji czujnika fluorogenicznego, jeżeli nie występują warunki poddania działaniu substancji, można inkubować jeden warunek hydrożelu z samą kontrolą nośnika lub pożywką doświadczalną. W celu kontroli pozytywnej i kalibracji między eksperymentami, hydrożele mogą być inkubowane z proteazą, o której wiadomo, że rozszczepia czujnik fluorogeniczny. Na przykład zastosowano tutaj dwa stężenia kolagenazy bakteryjnej.
  2. Kapsułkuj komórki w hydrożelach.
    1. Przygotować zawiesinę jednokomórkową odpowiednią dla rodzaju używanej komórki. Na przykład umyj 10-centymetrowe naczynie z komórkami czerniaka A375 za pomocą 10 ml PBS. Trypsynizować komórki za pomocą 0,05% trypsyny i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 3 minuty. Policz komórki za pomocą hemocytometru, aby określić całkowitą liczbę komórek.
    2. Odwirować roztwór komórkowy przy 314 x g przez 3 minuty, odessać pożywkę hodowlaną, a następnie ponownie zawiesić komórki w PBS przy około trzykrotnie wyższej gęstości wysiewu wymaganej dla eksperymentu. Na przykład zastosowano tutaj zawiesinę komórek o gęstości 21 x 106 komórek, aby uzyskać końcową gęstość kapsułkowaną 7 x 106 komórek/ml.
    3. Policz komórki ponownie, aby zapewnić dokładne stężenie komórek.
    4. Dodaj zawieszone komórki i PBS do każdej probówki roztworu prekursora hydrożelu zgodnie z wymaganą gęstością wysiewu (0,25, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6 i 7 x 106 komórek/ml w tym przykładzie). Dodaj PBS do warunków, w których nie ma żadnych komórek, zamiast zawieszonych komórek.
      UWAGA: Wszystkie warunki powinny mieć taką samą końcową objętość roztworu prekursora hydrożelu, aby zapewnić stały stosunek między składnikami hydrożelu a PBS. Nie należy wirować probówek, w których znajdują się komórki, energicznie pipetować w górę iw dół, nie tworząc pęcherzyków w celu wymieszania roztworu prekursora.
    5. Dozować 10 μl roztworu prekursora hydrożelu do sterylnej czarnej 96-dołkowej płytki z okrągłym dnem, upewniając się, że końcówka jest wyśrodkowana na środku każdej studzienki podczas dozowania.
    6. Polimeryzować roztwór prekursora hydrożelu, wystawiając płytkę na działanie światła ultrafioletowego (UV) o mocy 4 mW/cm2 przez 3 min.
      UWAGA: Lampa UV (ręczna lampa UVL-56, UVP, Upland, CA) wytwarza światło UV-A o długiej długości fali UV (365 nm), które nie wpływa na żywotność komórek.
    7. Dodać 150 μl pożywki do oznaczania do wszystkich studzienek, z wyjątkiem warunków kontroli dodatniej bez zamkniętych komórek. Do kontroli pozytywnych dodać 150 μl roztworu enzymu kolagenazy.
    8. Dodać 150 μl PBS do zewnętrznych studzienek płytki, aby zmniejszyć parowanie podczas inkubacji.

4. MMP i pomiar aktywności metabolicznej

  1. Zmierz fluorescencję natychmiast po enkapsulacji, aby ustalić podstawowy pomiar fluorescencji i zapewnić jednorodność polimeryzacji hydrożelowej. Odczytać płytkę za pomocą czytnika mikropłytek fluorescencyjnych z wykorzystaniem nieprzezroczystego protokołu 96-dołkowej płytki z ustawieniem skanowania obszaru na 494 nm/521 nm (wzbudzenie/emisja). Będzie to odczyt 0 godzin.
  2. Inkubować płytkę w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 18 godzin.
  3. Dodać odczynnik aktywności metabolicznej (rezazurynę) w stosunku 1:10 (v/v) dla każdego dołka.
  4. Inkubować płytkę w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez dodatkowe 6 godzin
    UWAGA: Ten czas inkubacji może się różnić w zależności od typu komórki.
  5. Zmierz fluorescencję po 24 godzinach od enkapsulacji. Odczytaj płytkę za pomocą czytnika mikropłytek fluorescencyjnych wykorzystującego nieprzezroczysty protokół 96-dołkowej płytki z ustawieniem skanowania obszaru na 494 nm/521 nm (wzbudzenie/emisja) dla aktywności MMP i 560 nm/590 nm (wzbudzenie/emisja) dla aktywności metabolicznej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecny test został zaadaptowany z wcześniej opracowanego i scharakteryzowanego systemu hodowli hydrożelu 3D, funkcjonalizowanego za pomocą fluorogenicznego czujnika rozszczepialnego MMP8. Zastosowany tutaj fluorogeniczny czujnik MMP składa się z sekwencji peptydowej, GPLAC(pMeOBzl)↓WARKDDK(AdOO)C (↓ wskazuje miejsce cięcia), która została wcześniej zoptymalizowana pod kątem rozszczepienia przez MMP-14 i MMP-1119. Peptyd jest znakowany cząste...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hodowla komórkowa 3D in vitro podsumowuje wiele ważnych aspektów środowiska in vivo. Jednak hodowla 3D sprawia również, że ocena funkcji komórek i sygnalizacji jest trudna, ponieważ wiele testów biologicznych wymaga pobrania komórek i dużej liczby komórek. W związku z tym opracowanie prostego systemu hodowli 3D, który umożliwia pomiar funkcji komórek bez dalszego przetwarzania próbek, znacznie zwiększyłoby użyteczność systemów hodowli 3D. Opisany tutaj system 3D można dostosować do wielu różnych zastosowań. Sekwencja czu...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować Ohio Cancer Research (OCR), OH, USA za sfinansowanie tej pracy, a także Uniwersytetowi Króla Sauda (KSU), Rijad, KSA za sponsorowanie pierwszego autora. Masa cząsteczkowa czujnika peptydów fluorescencyjnych została zmierzona za pomocą spektrometrii mas wspomaganej matrycą, laserowej desorpcji-jonizacji, czasu przelotu (MALDI-TOF) z pomocą Campus Chemical Instrument Center Mass Spectrometry and Proteomics Facility na Uniwersytecie Stanowym Ohio.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1X Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiFisher Scientific10-010-049
Węgiel aktywowany Sigma-AldrichC3345
96-dołkowa płytka z okrągłym dnemBrand-Tech89093-600
Peptyd adhezyjny komórek (CRGDS)GenScript USA Inc.na zamówienie enzym
kolagenazy typu I Life Technologies17100-017
DextranSigma-AldrichD4876
DMEM Pożywka o wysokiej zawartości glukozyInvitrogen11965118
Płodowa surowica bydlęca (FBS) Seradigm1500-500
Czytnik mikropłytek fluorescencyjnych Hemocytometr BioTekCytation 3
Hausser Scientific Co.3200
L-glutaminaLife Technologies25030-081
Usieciowanie peptydowe degradowalne MMP (KCGPQG↓ IWGQCK)GenScript USA Inc.na
NaOHFisher ScientificS318500
Penicylina / streptomycynaLife Technologies15140-122
Resazurin (Alamar Blue)Life TechnologiesDAL1100
światło UV UVP95-0006-02
zamówienie

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension - how 3D culture microenvironments alter cellular cues. Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).
  2. Duval, K., et al. Modeling Physiological Events in 2D vs. 3D Cell Culture. Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).
  3. Hoarau-Véchot, J., Rafii, A., Touboul, C., Pasquier, J. Halfway between 2D and Animal Models: Are 3D Cultures the Ideal Tool to Study Cancer-Microenvironment Interactions. International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), (2018).
  4. Lee, S. -H., Miller, J. S., Moon, J. J., West, J. L. Proteolytically Degradable Hydrogels with a Fluorogenic Substrate for Studies of Cellular Proteolytic Activity and Migration. Biotechnology Progress. 21 (6), 1736-1741 (2005).
  5. DeForest, C. A., Polizzotti, B. D., Anseth, K. S. Sequential click reactions for synthesizing and patterning three-dimensional cell microenvironments. Nature Materials. 8 (8), 659-664 (2009).
  6. Chalasani, A., et al. Live-Cell Imaging of Protease Activity: Assays to Screen Therapeutic Approaches. Methods in Molecular Biology. 1574, Clifton, N.J. 215-225 (2017).
  7. Jedeszko, C., Sameni, M., Olive, M., Moin, K., Sloane, B. F. Visualizing Protease Activity in Living Cells: From Two Dimensions to Four Dimensions. Current Protocols in Cell Biology. 04, Unit-4.20 (2008).
  8. Leight, J. L., Alge, D. L., Maier, A. J., Anseth, K. S. Direct measurement of matrix metalloproteinase activity in 3D cellular microenvironments using a fluorogenic peptide substrate. Biomaterials. 34 (30), 7344-7352 (2013).
  9. Nagase, H., Visse, R., Murphy, G. Structure and function of matrix metalloproteinases and TIMPs. Cardiovascular Research. 69 (3), 562-573 (2006).
  10. Tokito, A., Jougasaki, M., Tokito, A., Jougasaki, M. Matrix Metalloproteinases in Non-Neoplastic Disorders. International Journal of Molecular Sciences. 17 (7), 1178(2016).
  11. Visse, R., Nagase, H. Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases: structure, function, and biochemistry. Circulation Research. 92 (8), 827-839 (2003).
  12. Vihinen, P., Kähäri, V. -M. Matrix metalloproteinases in cancer: Prognostic markers and therapeutic targets. International Journal of Cancer. 99 (2), 157-166 (2002).
  13. Yodkeeree, S., Garbisa, S., Limtrakul, P. Tetrahydrocurcumin inhibits HT1080 cell migration and invasion via. downregulation of MMPs and uPA1. APHS Acta Pharmacologica Sinica. 29 (7), 853-860 (2008).
  14. Yodkeeree, S., Chaiwangyen, W., Garbisa, S., Limtrakul, P. Curcumin, demethoxycurcumin and bisdemethoxycurcumin differentially inhibit cancer cell invasion through the down-regulation of MMPs and uPA. The Journal of Nutritional Biochemistry. 20 (2), 87-95 (2009).
  15. Mabry, K. M., Schroeder, M. E., Payne, S. Z., Anseth, K. S. Three-Dimensional High-Throughput Cell Encapsulation Platform to Study Changes in Cell-Matrix Interactions. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (34), 21914-21922 (2016).
  16. Sridhar, B. V., Doyle, N. R., Randolph, M. A., Anseth, K. S. Covalently tethered TGF-β1 with encapsulated chondrocytes in a PEG hydrogel system enhances extracellular matrix production. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 102 (12), 4464-4472 (2014).
  17. Sridhar, B. V., et al. Development of a cellularly degradable PEG hydrogel to promote articular cartilage extracellular matrix deposition. Advanced Healthcare Materials. 4 (5), 702-713 (2015).
  18. Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility. Biomaterials. 30 (35), 6702-6707 (2009).
  19. Mucha, A., et al. Membrane Type-1 Matrix Metalloprotease and Stromelysin-3 Cleave More Efficiently Synthetic Substrates Containing Unusual Amino Acids in Their P1' Positions. Journal of Biological Chemistry. 273 (5), 2763-2768 (1998).
  20. Chai, S. C., Goktug, A. N., Chen, T. Assay Validation in High Throughput Screening - from Concept to Application. Drug Discovery and Development. , (2015).
  21. Iversen, P. W., et al. HTS Assay Validation. Assay Guidance Manual. , http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK83783/ (2004).
  22. Leight, J. L., Tokuda, E. Y., Jones, C. E., Lin, A. J., Anseth, K. S. Multifunctional bioscaffolds for 3D culture of melanoma cells reveal increased MMP activity and migration with BRAF kinase inhibition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (17), 5366-5371 (2015).
  23. Patterson, J., Hubbell, J. A. Enhanced proteolytic degradation of molecularly engineered PEG hydrogels in response to MMP-1 and MMP-2. Biomaterials. 31 (30), 7836-7845 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Hydro ele 3Daktywno metaloproteinaz macierzytest aktywno ci metabolicznejsensor fluorescencyjnyczytnik mikrop ytekroztw r prekursora hydro eluenkapsulacja kom rekpolimeryzacja UVintensywno fluorescencjikom rki czerniaka A375

Powiązane artykuły