Artykuł metodologiczny

Analiza cytometryczna przepływowa pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z pożywek kondycjonowanych komórkowo

DOI:

10.3791/59128

⸱

12 lutego 2019

 ,  ,  , 
1Cellular and Molecular Cardiology Laboratory, Cardiocentro Ticino Foundation, Switzerland, 2Molecular Cardiology Institute, Dept. of Cardiology, University of Zürich, 3Faculty of Biomedical Science, Università Svizzera Italiana, Switzerland

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół opisuje powtarzalną metodę przeznaczoną do użycia z supernatantami do hodowli komórkowych do wykrywania epitopów powierzchniowych na małych pęcherzykach zewnątrzkomórkowych (EV). Wykorzystuje specyficzną immunoprecypitację EV za pomocą kulek sprzężonych z przeciwciałami, które rozpoznają antygen powierzchniowy CD9, CD63 i CD81. Metoda jest zoptymalizowana pod kątem analizy za pomocą cytometrii przepływowej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cytometria przepływowa (FC) jest metodą z wyboru do półilościowego pomiaru markerów antygenowych na powierzchni komórki. Ostatnio technika ta została wykorzystana do analiz fenotypowych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV), w tym egzosomów (Exo) we krwi obwodowej i innych płynach ustrojowych. Niewielkie rozmiary EV wymuszają stosowanie dedykowanych przyrządów o progu detekcji około 50-100 nm. Alternatywnie, EV może być związany z mikrogranulkami lateksowymi, które mogą być wykryte przez FC. Mikrogranulki, sprzężone z przeciwciałami, które rozpoznają markery związane z EV / Cluster of Differentiation CD63, CD9 i CD81 mogą być używane do wychwytywania EV. Egzo wyizolowany z CM może być analizowany ze wstępnym wzbogacaniem lub bez niego przez ultrawirowanie. Podejście to jest odpowiednie dla analiz EV przy użyciu konwencjonalnych instrumentów FC. Nasze wyniki wskazują na liniową korelację między wartościami średniej intensywności fluorescencji (MFI) a stężeniem EV. Zakłócenie EV poprzez sonikację radykalnie zmniejszyło MFI, co wskazuje, że metoda ta nie wykrywa resztek membrany. Podajemy dokładną i wiarygodną metodę analizy antygenów powierzchniowych EV, którą można łatwo wdrożyć w każdym laboratorium.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki wydzielają pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) o różnych rozmiarach, w tym mikropęcherzyki (MV) i egzosomy (Exo). Te ostatnie można odróżnić od MV zarówno pod względem wielkości, jak i subkomórkowego przedziału, z którego pochodzą. MV (o wielkości 200–1000 nm) są uwalniane z komórek rodzicielskich poprzez wydalanie z błony komórkowej. I odwrotnie, egzo (30–150 nm) pochodzą z błon endosomalnych i są uwalniane do przestrzeni zewnątrzkomórkowej, gdy ciała wielopęcherzykowe (MVB) łączą się z błoną komórkową1,2.

EV są coraz częściej używane jako biomarkery diagnostyczne, a także, potencjalnie, narzędzia terapeutyczne w wielu dziedzinach, w tym onkologii, neurologii, kardiologii i chorobach układu mięśniowo-szkieletowego3,4,5. Zdecydowana większość trwających badań z wykorzystaniem EV jako środków terapeutycznych wykorzystuje izolację pęcherzyków z pożywki kondycjonowanej komórkowo (CM) komórek hodowanych in vitro. Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) wywierają korzystne działanie w kilku kontekstach, a EV pochodzące z MSC wykazały korzyści w modelach uszkodzenia niedokrwiennego mięśnia sercowego/reperfuzyjnego6 i uszkodzenia mózgu7. EV pochodzące z MSC wykazują również aktywność immunomodulacyjną, którą można wykorzystać w leczeniu odrzucenia immunologicznego, jak wykazano w modelu opornej na terapię choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi8. Komórki macierzyste płynu owodniowego (hAFS) aktywnie wzbogacają CM w MV i Exo, niejednorodnie rozmieszczone pod względem wielkości (50–1000 nm), które pośredniczą w kilku efektach biologicznych, takich jak proliferacja zróżnicowanych komórek, angiogeneza, hamowanie zwłóknienia i kardioprotekcja4. Niedawno wykazaliśmy, że EV, a w szczególności Exo, wydzielane przez ludzkie komórki progenitorowe pochodzące z serca (Exo-CPC), zmniejszają rozmiar zawału mięśnia sercowego u szczurów5,9.

Exo mają wspólny zestaw białek na swojej powierzchni, w tym tetraspaniny (CD63, CD81, CD9) i główny kompleks zgodności tkankowej klasy I (MHC-I). Oprócz tego wspólnego zestawu białek, Exo zawiera również białka specyficzne dla podzbioru EV typu komórki producenta. Markery egzologiczne zyskują na znaczeniu, ponieważ odgrywają kluczową rolę w komunikacji międzykomórkowej, regulując w ten sposób wiele procesów biologicznych5,10. Ze względu na ich niewielkie rozmiary, znalezienie łatwego sposobu analizy EV za pomocą klasycznej cytometrii przepływowej (FC) pozostaje trudnym zadaniem.

Tutaj prezentujemy uproszczony protokół analizy EV za pomocą FC, który może być zastosowany do wstępnie wzbogaconych próbek uzyskanych przez ultrawirowanie lub bezpośrednio do CM (Rysunek 1). W metodzie wykorzystuje się kulki pokryte specyficznym przeciwciałem, które wiąże kanoniczne epitopy powierzchniowe związane z egzowirusem (CD63, CD9, CD81) bez dodatkowych płukań. Analizy FC można wykonywać przy użyciu konwencjonalnego cytometru bez konieczności regulacji przed pomiarami. Metody charakterystyki antygenów na pojedynczych małych cząstkach za pomocą cytometrów przepływowych zostały opisane przez inne grupy w odniesieniu do różnych zastosowań11,12,13. W tym przypadku użyliśmy funkcjonalizowanych kulek magnetycznych do wychwytywania małych cząstek i Exo, a następnie fenotypowania wychwyconych cząstek za pomocą FC. Chociaż metoda ta może być stosowana do scharakteryzowania składu antygenowego małych pęcherzyków uwalnianych przez dowolny typ komórek in vitro, tutaj przedstawiliśmy określone warunki hodowli komórkowej, które mają zastosowanie do hodowli ludzkich komórek progenitorowych serca (CPC) i najbardziej odpowiednie środowisko do produkcji EV przez te komórki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Gromadzenie i przetwarzanie kondycjonowanych mediów

  1. Pokryj 55 cm2 szalki Petriego 0,02% żelatyną ze skóry świń w PBS.
  2. Talerz CPC (8 000 / cm2) w wstępnie powlekanych naczyniach z 7 ml zmodyfikowanego podłoża Dulbecco firmy Iscove (IMDM) uzupełnionego 20% FBS (płodowa surowica bydlęca) i 1% penicyliny/streptomycyny (P/S).
    nuta: Termin "CPC" odnosi się do ludzkich komórek pochodzących z eksplantacji, które zostały opisane gdzie indziej14. CM można pobrać z różnych typów komórek hodowanych w określonych warunkach hodowli. Nosić rękawice i pracować pod kapturem biologicznym.
  3. Gdy komórki osiągną około 80% konfluencji, usuń pożywkę hodowlaną, umyj komórki dwukrotnie PBS (PBS) Dulbecco bez Ca i Mg i zastąp je 10 ml pożywki do egzoprodukcji bez surowicy (Dulbecco's Modified Eagle's Medium [DMEM] High Glucose, 4,5 g / ml).
    nuta: Kontynuuj stopniowe zmniejszanie stężenia surowicy w pożywce hodowlanej, aby stopniowo przystosować komórki do stanu wolnego od surowicy (SF). W przypadku komórek, które są wrażliwe na pożywkę niezawierającą surowicy, należy przygotować pożywkę zawierającą FBS, ale pozbawioną EV. Przygotuj podłoże uzupełnione wszystkimi składnikami odżywczymi oraz 10%–20% (v/v) FBS. Odwirować pożywkę przez noc w temperaturze 100 000 × g, 4 °C. Należy pamiętać, że ta procedura nie gwarantuje 100% usunięcia EV pochodzącego z FBS.
  4. Po 7 dniach zbierz CM do probówek wirówkowych z polipropylenu.
    nuta: Czas kondycjonowania pożywki zależy od typu ogniwa. W przypadku komórek, które są wrażliwe na pożywkę bezsurowicową, należy zwiększyć początkową objętość pożywki i skrócić czas pobierania pożywki do 24-48 godzin.
  5. Usunąć CM z resztek komórkowych za pomocą wirówki o sile 3 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4–10 °C. Zebrać supernatant w probówce filtracyjnej wirówki o stężeniu 100 kDa.
  6. Koncentrat oczyszczony CM poprzez obracanie probówki w temperaturze 2 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4–10 °C.
    nuta: Ten etap zmniejszy początkową objętość CM, umożliwiając użycie probówek o małej objętości do etapów wirówki o dużej prędkości i przyczyni się do wyeliminowania małych agregatów białkowych.
  7. Zebrać koncentrat do probówki do mikrowirówki. Wirować przy 10 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4–10 °C.
  8. Zebrać supernatant i przejść do sekcji 2 (Wzbogacanie EV). Jeśli ultrawirówka nie jest dostępna, przejdź bezpośrednio do sekcji 3 (Kwantyfikacja analizy śledzenia nanocząstek (NTA)).
    nuta: Wstępne wzbogacenie frakcji EV poprawia końcowy odczyt intensywności fluorescencji (patrz reprezentatywne wyniki i Rysunek 4). Oczyszczony CM (z punktu 1.8) może być przechowywany w temperaturze 4 °C nie dłużej niż 1-2 dni lub alternatywnie w temperaturze -80 °C przez kilka miesięcy. 5 CM powinno być wstępnie oczyszczone, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia komórkowe przed przechowywaniem w temperaturze -80°C, aby upewnić się, że w procesie zamrażania i rozmrażania nie powstają resztki wielkości egzosomu.

2. Wzbogacanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą ultrawirówki (opcjonalnie)

  1. Umieścić supernatant z kroku 1.8 w grubościennej probówce ultrawirówkowej z poliwęglanu. Napełnij probówkę 1x solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS), aż osiągnie maksymalną pojemność (3,2 ml).
  2. Załaduj próbki do tytanowego wirnika o stałym kącie nachylenia (8 x 3,2 ml, współczynnik k 13). Załaduj wirnik do ultrawirówki stołowej. Ultrawirować przy 100 000 x g przez 3 godziny w temperaturze 4–10 °C.
  3. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 100 μl 1x PBS.

3. Kwantyfikacja analizy śledzenia nanocząstek (NTA)

  1. Rozcieńczyć 1 μl próbki (z etapu 2.3 lub 1.8) w 999 μl 1x PBS. Załaduj próbkę do strzykawki o pojemności 1 ml, unikając tworzenia się pęcherzyków. Załadować strzykawkę do otworu wlotowego komory badawczej.
  2. Włącz laser. Otwórz aparat za pomocą przycisku Przechwyć. Dostosuj ostrość.
  3. Nagraj co najmniej 3 różne klatki po 60 s każda.
  4. Przeanalizuj 3 różne akwizycje za pomocą opcji Proces wsadowy w oprogramowaniu.
    nuta: Jeżeli technologia NTA nie jest dostępna, należy przeprowadzić kwantyfikację białka za pomocą testu Bradforda (1 x 108 cząstek odpowiada 1–2 μg całkowitego białka po ultrawirowaniu lub 50–60 μg białka całkowitego, jeśli oznaczanie ilościowe jest przeprowadzane bezpośrednio dla CM, ponieważ obejmuje ono zanieczyszczenia białkami inne niż EV; patrz Tabela 1)5.

4. Przygotowanie próbki

  1. Przygotuj pulę 3 rodzajów koralików wychwytujących (koraliki CD9, koraliki CD63 i koraliki CD81 w stosunku 1:1:1; patrz Tabela materiałów) i vortex.
    nuta: Basen został przetestowany pod kątem stabilności przez 1 miesiąc. Można zastosować pojedynczy rodzaj kulki wychwytującej, co pozwoli na wykrycie subpopulacji EV, które nie są rozróżniane za pomocą puli kulek. Dzięki zastosowaniu pojedynczych kulek wychwytujących antygen możliwe będzie współczesne wykazanie obecności białek tetraspaniny, takich jak CD9, CD81 lub CD63, oraz antygenu będącego przedmiotem zainteresowania wykrywanego przez przeciwciało fluorescencyjne. W handlu dostępne są również alternatywne kulki lateksowe aldehydo-siarczanowe. Kulki te mają hydrofobową powierzchnię do adsorpcji MV i EV.
  2. Do probówki z okrągłym dnem dodać objętość odpowiadającą 1 x 108 cząstek plus 1 μl puli kulek, co odpowiada łącznie 1,2 x 105 kulek (dla każdego badania).
  3. Przygotować probówkę zawierającą 1 μl kulek bez EV, które będą służyć jako kontrola ujemna, zwanych dalej "kulkami".
  4. Dostosuj objętość do 100 μl za pomocą 1x PBS. Umieść probówkę w termomikserze i wstrząsaj z prędkością 400 obr./min przez noc w temperaturze 4–10 °C.
  5. Następnego dnia przenieś próbki na 96-dołkową płytkę z okrągłym dnem (lub probówki FC).
  6. Dodać przeciwciało (10 μg/ml CD9_FITC, 10 μg/ml CD63_PE i 5 μg/ml CD81_PE).
  7. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 4–10 °C.
  8. Dodaj 100 μl 1x PBS do każdej studzienki.
  9. Przejdź do przejęcia.

5. Akwizycja

  1. Otwórz oprogramowanie do akwizycji i uruchom instrument (Cytometer > System Startup Program). Otwórz nowy eksperyment.
  2. Utwórz szablon eksperymentalny, a następnie wybierz opcję Blacha, a następnie Dodaj blachę. Wybierz położenie próbek na płycie, a następnie naciśnij przycisk Ustaw jako studnię próbki.
  3. Wprowadź przykładową nazwę (np. CPC#1_CD9FITC) w polu Reguły nazewnictwa. Otwórz zakładkę Kanał i włącz kanały FITC i PE.
  4. Załaduj płytkę do instrumentu.
  5. Naciśnij przycisk Wykres punktowy i utwórz nowy wykres punktowy (P1). Ustaw przedni obszar rozproszenia (FSC-A) i boczny obszar rozproszenia (SSC-A).
  6. Wybierz opcję Inicjalizuj, aby uruchomić laser i fluidykę. Naciśnij przycisk Pobierz, aby rozpocząć pobieranie.
  7. Dostosuj skalę, aby pokazać populację w środku P1. W P1 narysuj bramę "KORALIKI" wokół całej populacji (bez gruzu) (Rysunek 2A). Naciśnij przycisk Stop.
  8. Naciśnij przycisk Wykres punktowy i utwórz nowy wykres punktowy (P2). Ustaw wysokość rozproszenia do przodu (FSC-H) w stosunku do FSC-A. Bramka na nowym wykresie kropkowym na "KORALIKACH". W P2 narysuj nową bramę wokół większej populacji i nazwij ją "SINGLETS" (Rysunek 2A).
    nuta: Strategia ta została opracowana w celu uniknięcia w jak największym stopniu uwzględniania agregacji koralików zarówno na etapie pozyskiwania, jak i analizy.
  9. Naciśnij Dot Plot i utwórz dwa różne wykresy kropkowe: jeden FITC kontra SSC-A i jeden PE kontra SSC-A. Bramka nowego wykresu kropkowego na "SINGLETS".
  10. Wybierz liczbę zdarzeń do nagrania (np. 20 000). Wybierz pozycję Nagraj i rozpocznij eksperyment.

6. Analiza danych

  1. Załaduj pliki akwizycji do oprogramowania analitycznego.
    nuta: Poniższe kroki należy zastosować do każdej próbki, w tym samych kulek, i każdej nieznanej próbki.
  2. Otwórz nowy protokół i utwórz wykresy kropkowe, postępując zgodnie z tą samą strategią opisaną w kroku 5.
  3. Ustaw wszystkie osie rozproszenia na skalę liniową, a wszystkie osie fluorescencji na skalę logarytmiczną.
  4. Pokaż średnią geometryczną fluorescencji (X-Gmean-MFI) w kanałach FITC i PE.
  5. Obliczyćstosunek średniej X-G próbek /średniej X-G kulek barwionych przeciwciałem bez egzosomu.
  6. Porównaj MFI zmiany składania w różnych przygotowaniach do EV.

7. Miareczkowanie liczby pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

UWAGA: Sekcje od 7 do 10 mogą być wykonane w celu ustawienia liczby cząstek, stężenia przeciwciał i swoistości, ale można je pominąć, jeśli typ komórki, z której pochodzą EV, oraz przeciwciała pozostają takie same.

  1. Rozcieńczone cząstki, otrzymane z kroku 2.3, w 1x PBS w celu otrzymania serii zawiesin w zakresie od 5 x 105 do 2,5 x 108 cząstek.
  2. Do każdej zawiesiny dodać rurkę z okrągłym dnem 1 μl puli kulek wychwytujących.
  3. Postępuj zgodnie z protokołem z kroku 4.3.

8. Miareczkowanie przeciwciał

UWAGA: Miareczkowanie przeciwciał jest zwykle wykonywane przez dodanie pojedynczego przeciwciała do każdej probówki.

  1. Utrzymuj stałą liczbę EV (całkowita zawartość cząstek lub białek) we wszystkich próbkach.
    nuta: Odpowiednią liczbę określa się empirycznie, jak opisano powyżej w sekcji 7.
  2. Postępuj zgodnie z protokołem z kroków od 4.1 do 4.5.
  3. Przetestuj zakres stężeń przeciwciał powyżej i poniżej ilości zalecanej przez dostawcę. Na przykład dla przeciwciała o sugerowanym stężeniu 10 μg/ml na test, test 1, 2, 5, 10, 20 i 50 μg/ml. Dołączyć próbkę z "samymi kulkami", dodając najwyższe stężenie przeciwciała.
  4. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 4–10 °C.
  5. Dodać 100 μl 1x PBS do każdej próbki.
  6. Zdobądź próbki.

9. Czas inkubacji

  1. Sprawdź czas inkubacji, wykonując akwizycje w różnych punktach czasowych (np. 1 godzina, 2 godziny i 5 godzina).
  2. Postępuj zgodnie z protokołem, zaczynając od sekcji 4.
  3. Próbki należy inkubować w temperaturze 4–10 °C przez 1 godzinę.
  4. Pobieranie próbek.
  5. Próbki inkubować w temperaturze 4–10 °C przez 3 godziny.
  6. Pobieranie próbek.

10. Walidacja protokołu

  1. Wiązanie EV
    1. W probówce z okrągłym dnem dodać ilość objętości odpowiadającą cząstkom 1 x 108 lub odpowiednią ilość białka ogółem.
    2. Dostosuj objętość do 100 μl za pomocą 1x PBS.
    3. Przerwać membranę EV za pomocą sonikacji (alternatywnie można zastosować etap szoku termicznego) zgodnie z instrukcjami producenta. Ustaw częstotliwość i intensywność. Okres sonikacji można ustalić empirycznie, ustalając eksperyment z kursem czasowym (tj. 0 s, 30 s, 1 min, 5 min itd.).
    4. Dodać 1 μl puli kulek.
    5. Postępuj zgodnie z protokołem, zaczynając od kroku 4.4.
  2. Swoistość przeciwciał
    1. Przygotować jedną probówkę dla każdej IgG sprzężonej z fluorochromem i dodać kompleks kulek-EV zgodnie z opisem w kroku 4.6.
      nuta: Izotyp sprzężony z fluorochromem musi być zgodny z IgG zastosowanego przeciwciała.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Całkowita liczba cząstek do pojedynczego barwienia

Ponieważ pojedynczy koralik może związać więcej niż jedną cząstkę, przetestowaliśmy różne warunki, aby ustalić najmniejszą ilość całkowitego EV (pojedynczego przeciwciała na rurkę), aby osiągnąć wczesną fazę wykładniczą krzywej MFI. Zastosowano stałe stężenie przeciwciała, podczas gdy całkowita liczba cząstek wahała się od 5 x 105 do 2,5 x 108

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Konwencjonalna technika FC pozostaje najprostszą metodą analityczną do charakteryzowania markerów wyrażonych na powierzchni EV. W związku z tym wybór najodpowiedniejszego protokołu ma kluczowe znaczenie dla uzyskania użytecznych informacji na temat poszczególnych frakcji cząstek będących przedmiotem zainteresowania poprzez uniknięcie ograniczeń wynikających z czułości instrumentu. Opisaliśmy metodę wykorzystującą cząstki magnetyczne sprzężone z przeciwciałami, które rozpoznają antygeny powierzchniowe Exo i małe EV, które...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie ma nic do zadeklarowania.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L.B. był wspierany przez granty badawcze Helmut Horten Stiftung i Velux Stiftung, Zurych (Szwajcaria). G.V. był wspierany przez granty badawcze Swiss National Science Foundation, Cecilia-Augusta Foundation, Lugano, oraz SHK Stiftung für Herz- und Kreislaufkrankheiten (Szwajcaria)

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
IMDMGibco12440061
Amicon Ultra-15, PLHK Ultracel-PL Membrana, 100  kDa MilliporeUFC910024
- CytoFlex - Platforma cytometru przepływowegoBeckman CoulterCytoFlex
DMEM, wysoka glukoza, HEPES, bez czerwieni fenolowejGibco21063045
Dulbecco's PBS (PBS) Zestaw do wychwytywania Ca i Mg DulbeccoBE17-512F
ExoCap CD63JSR Life SciencesEx-C63-SP
ExoCap CD81 Capture ZestawJSR Life SciencesEx-C81-SP
ExoCap CD9 Zestaw wychwytującyJSR Life SciencesEx-C9-SP
FBS zubożony w egzosomyThermofisherA2720801
Suplement FBS zubożony w egzosomySBIEXO-FBS-250A-1
FBS-Płodowa surowica bydlęcaGibco10270106
FITC przeciwciało anty-ludzkie CD9Legenda biologiczna312104                    RRID: Oprogramowanie do
Beckman CoulterKaluza
NanoSight LM10MalvernNanoSight LM10
Oprogramowanie NanoSightMalvernNTA 2.3
Optima Max-XPBeckman Coulter393315
PE anty-ludzkie przeciwciało CD63 Biolegend353004                    RRID:AB_10897809
PE przeciwciało anty-ludzkie CD81 (TAPA-1) Biolegend349505                    RRID:AB_10642024
Wirniki penicyliny-streptomycynyGibco15140122
Thermomixer CEppendorf5382 000 015
TLA-110Beckman CoulterTLA-110
analizy cytometru przepływowego AB_2075894 Wirniki

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Barile, L., Vassalli, G. Exosomes: Therapy delivery tools and biomarkers of diseases. Pharmacology & Therapeutics. , (2017).
  2. Thery, C. Exosomes: secreted vesicles and intercellular communications. Molecular Biology Reports. 3, 15(2011).
  3. Yadav, D. K., et al. Liquid biopsy in pancreatic cancer: the beginning of a new era. Oncotarget. 9, 26900-26933 (2018).
  4. Balbi, C., et al. First Characterization of Human Amniotic Fluid Stem Cell Extracellular Vesicles as a Powerful Paracrine Tool Endowed with Regenerative Potential. Stem Cells Translational Medicine. 6, 1340-1355 (2017).
  5. Andriolo, G., et al. Exosomes From Human Cardiac Progenitor Cells for Therapeutic Applications: Development of a GMP-Grade Manufacturing Method. Frontiers in Physiology. 9, (2018).
  6. Lai, R. C., et al. Exosome secreted by MSC reduces myocardial ischemia/reperfusion injury. Stem Cell Research. 4, (2009).
  7. Doeppner, T. R., et al. Extracellular Vesicles Improve Post-Stroke Neuroregeneration and Prevent Postischemic Immunosuppression. Stem Cells Translational Medicine. 4, 1131-1143 (2015).
  8. Kordelas, L., et al. MSC-derived exosomes: a novel tool to treat therapy-refractory graft-versus-host disease. Leukemia. 28, 970-973 (2014).
  9. Barile, L., et al. Extracellular vesicles from human cardiac progenitor cells inhibit cardiomyocyte apoptosis and improve cardiac function after myocardial infarction. Cardiovascular Research. 103, 530-541 (2014).
  10. Longatti, A., et al. High affinity single-chain variable fragments are specific and versatile targeting motifs for extracellular vesicles. Nanoscale. 10, 14230-14244 (2018).
  11. Menck, K., Bleckmann, A., Schulz, M., Ries, L., Binder, C. Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood. Journal of Visualized Experiments. , (2017).
  12. Inglis, H., Norris, P., Danesh, A. Techniques for the analysis of extracellular vesicles using flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. , (2015).
  13. Arakelyan, A., et al. Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles. Journal of Visualized Experiments. , (2017).
  14. Chimenti, I., et al. Isolation and expansion of adult cardiac stem/progenitor cells in the form of cardiospheres from human cardiac biopsies and murine hearts. Methods Molecular Biology. 879, 327-338 (2012).
  15. van der Vlist, E. J., Nolte-'t Hoen, E. N., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J., Wauben, M. H. Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry. Nature Protocols. 7, 1311-1326 (2012).
  16. Pospichalova, V., et al. Simplified protocol for flow cytometry analysis of fluorescently labeled exosomes and microvesicles using dedicated flow cytometer. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 25530(2015).
  17. van der Pol, E., et al. Particle size distribution of exosomes and microvesicles determined by transmission electron microscopy, flow cytometry, nanoparticle tracking analysis, and resistive pulse sensing. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12, 1182-1192 (2014).
  18. Witwer, K. W., et al. Updating the MISEV minimal requirements for extracellular vesicle studies: building bridges to reproducibility. Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1396823(2017).
  19. Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cellular Biology. , Chapter 3, Unit 3.22 (2006).
  20. Suarez, H., et al. A bead-assisted flow cytometry method for the semi-quantitative analysis of Extracellular Vesicles. Scientific Reports. 7, 11271(2017).
  21. Sodar, B. W., et al. Low-density lipoprotein mimics blood plasma-derived exosomes and microvesicles during isolation and detection. Scientific Reports. 6, 24316(2016).
  22. Sluijter, J. P. G., et al. Extracellular vesicles in diagnostics and therapy of the ischaemic heart: Position Paper from the Working Group on Cellular Biology of the Heart of the European Society of Cardiology. Cardiovascular Research. 114, 19-34 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Flow CytometryCardiac Progenitor CellsUltracentrifugationNanoparticle TrackingAntibody ConjugationMean Fluorescence IntensityCD63 CD9 CD81Bead based Capture

Powiązane artykuły