W warunkach klinicznych, biopsja wątroby jest używana do oceny etapów niealkoholowego stłuszczeniowego zapalenia wątroby (stłuszczenie, stan zapalny, balonowanie hepatocytów i zwłóknienie). W tym miejscu ilustrujemy biopsję wątroby u myszy, która może być wykorzystana do analiz histologicznych, aby umożliwić ocenę środków terapeutycznych w sposób bardziej zgodny z badaniami klinicznymi.
Artykuł metodologiczny
Włączenie procedury biopsji wątroby, która daje się przeżyć, u myszy w celu oceny ustąpienia niealkoholowego stłuszczeniowego zapalenia wątroby (NASH)
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Badania kliniczne oceniające terapie w leczeniu niealkoholowego stłuszczeniowego zapalenia wątroby (NASH) obejmują początkową i końcową biopsję wątroby oraz ocenę poprawy punktów końcowych choroby, często odzwierciedlanych jako procent każdej grupy leczenia, która uległa poprawie, pogorszeniu lub pozostała niezmieniona. Tradycyjne przedkliniczne badania na gryzoniach dotyczące przypuszczalnych terapii NASH są często ograniczone ze względu na brak wiedzy na temat poziomu choroby wątroby/NASH obecnego na początku interwencji terapeutycznej, zamiast randomizacji grup leczonych na podstawie łatwych do zmierzenia punktów końcowych, takich jak masa ciała, stan metaboliczny itp. W tym miejscu opisujemy technikę biopsji wątroby w mysim modelu NASH wywołanym dietą, w celu oceny wyjściowej choroby wątroby w celu wykluczenia myszy, które nie wykazują zwłóknienia i równomiernego rozmieszczenia zwierząt z podobnym zwłóknieniem między grupami leczenia. Poziomy te można następnie porównać z końcowymi poziomami po interwencji, aby lepiej zrozumieć efekty farmakologiczne in vivo, a tym samym dokładniej odzwierciedlić strategie projektowania badań klinicznych. Mysz jest odpowiednio znieczulona i przygotowana do zabiegu w sterylnych warunkach. Wykonuje się małe nacięcie w górnej części brzucha i odsłania lewy boczny płat wątroby. Klin wątroby jest usuwany chirurgicznie, a na jego miejsce umieszcza się kawałek wchłanialnej żelatyny o podobnej wielkości, aby zatrzymać krwawienie. Mysz jest chirurgicznie zszywana i zszywana na krótko i wraca do normy w ciągu 1 dnia. Cały proces trwa 5-10 minut na mysz. Tutaj ilustrujemy użyteczność tej procedury, wykorzystując biopsję przed badaniem do oceny wpływu liraglutydu agonisty receptora glukagonopodobnego peptydu-1 (GLP-1) na punkty końcowe NASH u myszy.
Wprowadzenie
Niealkoholowe stłuszczeniowe zapalenie wątroby (NASH) jest postępującą chorobą wątroby i cięższą formą niealkoholowej stłuszczeniowej choroby wątroby (NAFLD), która staje się coraz bardziej powszechna ze względu na jej związek z otyłością i cukrzycą typu 2. Nie ma zatwierdzonych terapii NAFLD/NASH ani zatwierdzonych biomarkerów do łatwej oceny postępu choroby. NASH diagnozuje się histologicznie, oceniając stan zapalny, nadmiar lipidów w wątrobie (stłuszczenie), balonowanie hepatocytów i zwłóknienie1,2,3,4. W badaniach klinicznych te punkty końcowe są oceniane przed badaniem w próbce wątroby pobranej za pomocą biopsji oraz w drugiej biopsji wątroby po pewnym okresie leczenia. W związku z tym skuteczność badanego czynnika ocenia się poprzez zmianę patologii wątroby u osób z wcześniej zidentyfikowanym/określonym ilościowo (tj. potwierdzonym biopsją) NASH, którzy są losowo przydzielani do grup leczonych. Te same histologiczne punkty końcowe są często stosowane w modelach gryzoni oceniających potencjalne terapie NASH w badaniach przedklinicznych, ale tylko w tkance końcowej myszy poddanych eutanazji, a zatem bez zrozumienia stopnia skuteczności na początku badania i niemożności kontrolowania różnic w wyjściowym stanie choroby między grupami leczonymi.
Chociaż u 25% dorosłych z NAFLD zakłada się NASH na podstawie podwyższonego poziomu aminotransferaz w surowicy, nie ma innych ostatecznych metod potwierdzenia NASH niż dowody histologiczne4. Metody nieinwazyjne, takie jak metody radiologiczne (ultrasonografia, tomografia komputerowa i rezonans magnetyczny) zostały opracowane w celu wykrycia stłuszczenia wątroby, ale metody te nie mogą zdiagnozować NASH ani określić stadium zwłóknienia. Elastografia przejściowa oferuje obiecującą nieinwazyjną metodę pomiaru sztywności wątroby. Wykazano, że jest dokładny w różnicowaniu etapów zwłóknienia. Jednak dokładność zmniejsza się wraz z wyższym wskaźnikiem masy ciała (BMI) i tkanką tłuszczową. 5 Jest to problematyczne, ponieważ większość pacjentów z NASH jest otyła. Poza klinicznym znaczeniem tych podejść, żadna z tych modalności nie jest wykorzystywana w badaniach przedklinicznych.
Aby temu zaradzić, grupa badawcza dr Jonathana Rotha jako pierwsza wdrożyła procedurę biopsji wątroby w mysim modelu Amylin NASH (AMLN) NASH6,7,8. Opisali trafność predykcyjną biopsji ze stopniem choroby NASH i korelacją z chorobą metaboliczną. W tym artykule szczegółowo opisano procedurę biopsji wątroby w modelu AMLN NASH i jej przydatność w warunkach terapeutycznych, w szczególności w celu oceny skuteczności liraglutydu.
Protokół
Wszystkie eksperymenty in vivo zostały przeprowadzone zgodnie z zasadami Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) MedImmune, LLC oraz zgodnie z Przewodnikiem po opiece i użytkowaniu zwierząt laboratoryjnych, wydanie 8 (2011). Samce myszy C57BL6J zostały wprowadzone na dietę AMLN o wysokiej zawartości tłuszczu, fruktozy i cholesterolu. Biopsje wątroby wykonano po 26 tygodniach diety, 3 tygodnie przed rozpoczęciem interwencji farmakologicznej.
1. Zdobądź i przygotuj materiały chirurgiczne
- Sterylne narzędzia w autoklawie (małe nożyczki ze spiczastą końcówką, kleszczyki z końcówką, waciki, kwadraty z gazy, zszywki 7 mm/spinki do ran i zszywacz).
- Otrzymać, jałowy szew do zamykania ściany brzucha (odpowiedni jest powlekany szew wchłanialny 5-0 z igłą PC-1), wchłanialną żelatynową gąbkę prasowaną (do stosowania do celów hemostatycznych), sterylne zasłony i rękawiczki, peeling na bazie jodu i waciki/chusteczki 70% etanolu, buprenorfinę (0,05-0,1 mg/kg dawki na mysz; co najmniej 3 dawki na mysz) oraz maść/lubrykant chirurgiczny do oczu.
- Przygotuj waporyzator do znieczulenia, napełniając go izofluranem.
- Włącz sterylizator koralików, aby szybko sterylizować narzędzia między zwierzętami.
- Włącz powierzchnię grzewczą lub poduszkę grzewczą, która ma być używana do odzyskiwania zwierząt.
- Załóż odpowiednie środki ochrony osobistej (PPE) (tj. maskę, fartuch, czepek do włosów, rękawiczki).
2. Przygotowania przedoperacyjne
- Umieść mysz w komorze indukcyjnej z 2-3% przepływem izofluranu.
- Obserwuj mysz, aż brak reakcji na uszczypnięcie palca u nogi potwierdzi, że głębokość znieczulenia jest odpowiednia.
- Użyj maści do oczu, aby zapobiec suchości rogówki związanej ze znieczuleniem.
- Buprenorfinę podawać podskórnie (0,05-0,1 mg/kg).
- Ogolić miejsce operacyjne natychmiast doogonowo wyrostka mieczykowatego za pomocą maszynek do strzyżenia zwierząt.
- Przesuń mysz na rozgrzaną powierzchnię (37 °C) po ogoleniu pola operacyjnego. Umieść mysz w taki sposób, aby powierzchnia grzbietowa była skierowana w dół, a brzuch odsłonięty. Włóż nos myszy do stożka nosowego do znieczulenia, aby ułatwić dostarczanie izofluranu z szybkością przepływu 2-3%.
- Oczyść miejsce operacyjne naprzemiennie wacikami z betadyny i 70% etanolu (3 razy).
- Otwórz i ustaw sterylne narzędzia chirurgiczne.
- Zdejmij rękawiczki i zastąp je sterylnymi rękawicami chirurgicznymi.
3. Zabieg chirurgiczny
- Wykonaj podłużne nacięcie nożyczkami (1-2 cm), bezpośrednio doogonowo wyrostka mieczykowatego i lekko po lewej stronie myszy, w skórze brzucha.
- Tępo wypreparuj skórę z dala od ściany brzucha za pomocą kleszczy i nożyczek.
- Odsłoń ścianę brzucha i uwidocznij wątrobę pod spodem.
- Za pomocą sterylnego ostrza skalpela wykonaj nacięcie (1-2 cm) w ścianie brzucha, aby uwidocznić lewy płat boczny (LLL) wątroby.
nuta: Bądź konsekwentny przez cały czas trwania badania. Inne popularne płaty będące przedmiotem zainteresowania to prawy płat przyśrodkowy (RML) i lewy płat przyśrodkowy (love my life). - Uzewnętrznij lewy płat boczny przez nacięcie.
- Opcja 1: Delikatnie masuj brzuch kciukiem i palcem wskazującym, aby odsłonić część LLL.
- Opcja 2: Umieść sterylny bawełniany wacik pod LLL, aby delikatnie wyciągnąć porcję, która ma być odsłonięta.
- Umieść sterylny kawałek gazy nasączony solą fizjologiczną pod LLL, aby umożliwić sterylną i uwodnioną powierzchnię, na której wątroba może się położyć.
- Wytnij kawałek wątroby w kształcie klina z LLL, wykonując dwa nacięcia sterylnymi nożyczkami.
nuta: Przybliżona wielkość usuwanej wątroby wynosi 30-50 mg (<5% wątroby u myszy). - Wytnij kawałek gąbki żelatynowej podobnej wielkości do ćwiartkowego kawałka wątroby. Włóż gąbkę do wyciętej części wątroby za pomocą kleszczy.
- Przytrzymaj gąbkę na miejscu za pomocą kleszczy i utrzymuj kontakt z wątrobą, aż przylgnie do powierzchni wątroby i uzyskasz hemostazę.
- Umieść fragment biopsji wątroby w odpowiedniej probówce (tj. zamrożonej, utrwalającej itp.).
- Delikatnie umieść wątrobę z powrotem w jamie brzusznej, uważając, aby nie naruszyć gąbki.
- Zszyj ścianę brzucha wchłanialnym szwem powlekanym 5-0, zaczynając i kończąc pełnym węzłem kwadratowym.
- Zamknij skórę za pomocą 7-milimetrowych klipsów (lub zszywek).
- Sprawdź klipsy do ran, aby upewnić się, że nacięcie jest całkowicie zamknięte.
- Wyjmij mysz ze stożka nosowego i umieść ją w czystej klatce na rozgrzanej powierzchni.
- Umieść narzędzia w sterylizatorze perełkowym między myszami na 10-20 s. Upewnij się, że cały materiał organiczny został usunięty z narzędzi za pomocą sterylnej soli fizjologicznej przed umieszczeniem w sterylizatorze szklanych kulek.
4. Opieka pooperacyjna
- Monitoruj mysz, aż odzyska przytomność i będzie mogła się wyprostować.
- Zapisuj obserwacje pooperacyjne i codziennie sprawdzaj myszy pod kątem rozejścia się.
- Drugą i trzecią dawkę buprenorfiny (0,05-0,1 mg/kg mc.) należy podać podskórnie 6-8 godzin po operacji i ponownie 24 godziny po operacji.
- Usuń klipsy do ran po 7-10 dniach od zabiegu.
Wyniki
W badaniu tym myszy zostały randomizowane do grup terapeutycznych (n = 12/grupa) na podstawie stopnia włóknienia w biopsji wykonanej przed badaniem oraz masy ciała. Myszy otrzymywały nośnik (PBS) lub liraglutyd (5 nmol/kg) przez 42 dni (nośnik lub związek podawano podskórnie, raz dziennie, w objętości dawki 10 mL/kg). W 42. dniu myszy zostały uśpione (poprzez inhalację CO2) w stanie niena czczo, a następnie wycięto wątroby i poddano je obróbce histologicznej.
Biopsaty oraz końcowe fragmenty wątroby utrwalano przez noc w 10% formalinie, a następnie zatapiano w parafinie i przetwarzano w celu przeprowadzenia barwienia hematoksyliną i eozyną oraz Sirius Red zgodnie ze standardowymi protokołami9. Przekroje tkankowe były oceniane w sposób zaślepiony przez patologa zgodnie z systemem NASH Activity Scoring (NAS)1,2. Wskaźnik NAS odzwierciedla stopień zaawansowania choroby w zakresie stłuszczenia, zapalenia lobularnego i balonowania hepatocytów (każdy parametr oceniany w skali 0-3), zgodnie z wcześniejszym opisem9.
Włączenie biopsji wątroby do projektu tego badania pozwoliło na ustalenie bazowego (przed biopsją) stopnia włóknienia. Łącznie wykonano biopsje u 118 myszy po 26 tygodniach diety NASH, a następnie dla każdej biopsji oceniono stopień włóknienia i stłuszczenia wątroby (Rysunek 1). Z tej grupy 118 myszy wykluczono 49 osobników ze względu na niskie włóknienie (wynik 0), wysokie włóknienie (wynik 4, wykazujący nieprawidłową patologię) oraz nieprawidłową utratę masy ciała lub gojenie ran. Kryteria wykluczenia te pozwoliły na pozostawienie 69 myszy do przydzielenia do grup badawczych w celu oceny poprawy fenotypu NASH po leczeniu (Rysunek 1).
Myszy otrzymywały nośnik lub agonistę GLP-1R, liraglutyd (5 nmol/kg), przez 6 tygodni. W grupie traktowanej nośnikiem u 1 myszy stwierdzono nasilenie włóknienia, a u 4 myszy pogorszenie wyniku NAS (Rycina 2A-B). Leczenie liraglutydem wiązało się z ogólną poprawą stopnia włóknienia (Rycina 2C) – u 17% zwierząt w grupie leczonej nastąpiła poprawa, a u 83% stan pozostał bez zmian. Podobnie, leczenie liraglutydem poprawiło ogólny wynik NAS (Rycina 2D); u 66% osobników w grupie odnotowano poprawę wyniku NAS, natomiast u 33% nie stwierdzono zmian.
Dodatkowo leczenie liraglutydem poprawiło stan zapalny; u 75% osobników z tej grupy odnotowano niższy wskaźnik stanu zapalnego, a u 25% pozostał on bez zmian (Rysunek 3B). Leczenie nośnikiem pogorszyło stan zapalny; u 17% osobników z tej grupy odnotowano wyższy wskaźnik stanu zapalnego, a u 83% pozostał on bez zmian (Rysunek 3A). Ocena stłuszczenia nie uległa zmianie od początku do końca badania zarówno w grupie leczonej nośnikiem, jak i liraglutydem (Rysunek 3A, B). Przedstawiono również porównania biopsji przed i po zabiegu dla poszczególnych myszy w odniesieniu do parametrów stanu zapalnego oraz obrzęku komórkowego (Rysunek 3C-F).
Rycina 1: Wyniki włóknienia i wskaźnik NAS w biopsji wątroby przed przesiewaniem. (A) Przedstawienie wszystkich 118 myszy, u których przeprowadzono badania przesiewowe w kierunku włóknienia za pomocą biopsji wątroby. (B i C) przedstawiają odpowiednio bazowy stopień włóknienia oraz wskaźnik NAS po przydzieleniu kwalifikujących się myszy do grup badawczych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 2: Stopień włóknienia i wynik NAS, przed biopsją i po interwencji. Analiza procentowa osób odpowiadających na leczenie dla myszy traktowanych nośnikiem (A, C) lub liraglutydem (B, D), mierzona od wyjściowej biopsji wątroby do próbki wątroby na koniec badania dla stadium włóknienia (A, B) oraz NAS (C, D). Dla każdej grupy zmiana od biopsji przed badaniem do biopsji po badaniu jest zaznaczona linią. Punkty na każdym etapie oceny są lekko przesunięte, aby umożliwić wizualne rozdzielenie zwierząt; służy to wyłącznie celom wizualizacyjnym i nie odzwierciedla żadnej różnicy w wyniku. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 3: Stłuszczenie, stan zapalny i balonowanie przed biopsją i po interwencji. Analiza odsetka osób odpowiadających na leczenie dla myszy otrzymujących nośnik (A, C, E) lub liraglutyd (B, D, F), zmierzona od wyjściowej biopsji wątroby do próbki wątroby na koniec badania dla oceny stłuszczenia (A, B), stanu zapalnego (C, D) i balonowania (E, F). Dla każdej grupy zmiana między biopsją przed badaniem a po badaniu jest zaznaczona linią. Punkty na każdym etapie oceny są lekko przesunięte, aby umożliwić wizualne rozdzielenie zwierząt; służy to wyłącznie celom wizualizacyjnym i nie odzwierciedla żadnej różnicy w ocenie. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Dyskusja
Tutaj szczegółowo opisujemy procedurę biopsji wątroby myszy opisaną po raz pierwszy przez Clappera i wsp.10 i ilustrujemy jej użyteczność w mysim modelu NASH, podobnie jak w poprzednich raportach 6,9. Procedura biopsji wątroby jest cennym narzędziem do oceny fenotypu NASH przed i po leczeniu, w sposób podobny do tego, który jest wykonywany w klinicznych badaniach terapeutycznych. Biopsja pozwala na bezpośrednie porównanie dla każdego pacjenta, tj. te same myszy mogą być użyte w obu punktach czasowych. Pokazujemy również jego potencjał translacyjny. W badaniu klinicznym z udziałem pacjentów z potwierdzonym biopsją NASH, liraglutyd wywołał 39% odsetek odpowiedzi (pacjenci z poprawą) w NAS, podczas gdy w naszym badaniu zaobserwowaliśmy 66% odsetek odpowiedzi na poprawę NAS. Ponadto u 26% pacjentów nastąpiła poprawa wyniku zwłóknienia przy 9% pogorszeniu, w porównaniu z odpowiednio 14% i 36% w grupie placebo11. W naszym badaniu zaobserwowaliśmy 17% poprawę po leczeniu liraglutydem. Porównania te podkreślają moc wyjściowej biopsji wątroby i potwierdzają potencjalne zrozumienie translacyjne, przynajmniej dla tej klasy terapii.
Bardzo ważne jest, aby podczas procedury biopsji pobrać wystarczająco duży fragment tkanki wątroby, aby prawidłowo przeanalizować cechy histologiczne, ale także nie za duży kawałek wątroby, aby zagrozić funkcji wątroby. Zaobserwowaliśmy zerowy wskaźnik śmiertelności podczas tej operacji, a zwierzęta wydawały się w pełni wyleczone w ciągu 1 dnia wraz ze wznowieniem normalnych zachowań żywieniowych. W związku z tym czas między biopsją a rozpoczęciem badania interwencyjnego nie jest ograniczony przez powrót do zdrowia zwierząt, ale prawdopodobnie przez czas potrzebny na przetworzenie próbki, analizę i późniejszą randomizację.
Wykorzystanie procedury biopsji wątroby jako metody potwierdzenia zwłóknienia przed interwencją pomogło zmniejszyć zmienność w naszym badaniu, pozwalając nam wykluczyć myszy, które nie rozwinęły w pełni pewnego stopnia zwłóknienia wątroby w wyniku diety indukującej AMLN NASH. Co więcej, zwiększyło to naszą zdolność do lepszego zrozumienia wpływu możliwych interwencji poprawiających NASH, w przeciwieństwie do posiadania tylko końcowej próbki wątroby i wyniku NASH. Dopóki nowe nieinwazyjne techniki nie zostaną dalej zbadane i powszechnie zaakceptowane, biopsja wątroby jest jedynym sprawdzonym sposobem określenia NASH.
Oświadczenia
S.O. i C.R. są obecnymi pracownikami i/lub akcjonariuszami MedImmune/AstraZeneca. JLT był pracownikiem i akcjonariuszem MedImmune/AstraZeneca w czasie przeprowadzania tych eksperymentów.
Podziękowania
Autorzy dziękują za pomoc Sally Lee i Holly Koelkebeck za ekspertyzę w zakresie przetwarzania tkanek i immunohistochemii. Autorzy dziękują również Donnie Goldsteen i personelowi Laboratorium Zasobów Zwierzęcych (MedImmune, Gaithersburg, MD) za pomoc w procedurach technicznych oraz hodowli i opiece nad zwierzętami.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Isoflurane | Henry Schein | 29405 | |
| 5-0 szew | Ethicon | J834G | |
| 7 mm Klipsy do ran | Reflex | 203-1000 | |
| Wchłanialna gąbka żelatynowa (GelFoam) | Pfizer | 09-0353-01 | Kompresyjna, dowolny rozmiar |
| Podkładka nasączona do przygotowania alkoholu | VWR | 75856-902 | |
| Maszynki do strzyżenia zwierząt | Oster | 78005010002 | Rozmiar 40 |
| Sztuczne łzy | Henry Schein | 048272 | rurka |
| Buprenorfina (Buprenex) | Reckitt Benckiser | NDC 12496-0757-5 | |
| Wkładki do przygotowania jodu | Nice Pak Products | C12400 | |
| Sterylne serwety | Stoelting | 50981 | |
| Rękawice chirurgiczne | Medline | 54720 |
Bibliografia
- Brunt, E. M., et al. Nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) activity score and the histopathologic diagnosis in NAFLD: distinct clinicopathologic meanings. Hepatology. 53 (3), 810-820 (2011).
- Brunt, E. M. Pathology of nonalcoholic fatty liver disease. Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. 7 (4), 195-203 (2010).
- Kleiner, D. E., et al. Design and validation of a histological scoring system for nonalcoholic fatty liver disease. Hepatology. 41 (6), 1313-1321 (2005).
- Diehl, A. M., Cause Day, C. Pathogenesis, and Treatment of Nonalcoholic Steatohepatitis. New England Journal of Medicine. 377 (21), 2063-2072 (2017).
- Golabi, P., et al. Current complications and challenges in nonalcoholic steatohepatitis screening and diagnosis. Expert Reviews of Gastroenterology and Hepatology. 10 (1), 63-71 (2016).
- Roth, N. C., et al. Prediction of histologic alcoholic hepatitis based on clinical presentation limits the need for liver biopsy. Hepatology Communications. 1 (10), 1070-1084 (2017).
- Kristiansen, M. N., et al. Obese diet-induced mouse models of nonalcoholic steatohepatitis-tracking disease by liver biopsy. World Journal of Hepatology. 8 (16), 673-684 (2016).
- Trevaskis, J. L., et al. Glucagon-like peptide-1 receptor agonism improves metabolic, biochemical, and histopathological indices of nonalcoholic steatohepatitis in mice. American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology. 302 (8), G762-G772 (2012).
- Tolbol, K. S., et al. Metabolic and hepatic effects of liraglutide, obeticholic acid and elafibranor in diet-induced obese mouse models of biopsy-confirmed nonalcoholic steatohepatitis. World Journal of Gastroenterology. 24 (2), 179-194 (2018).
- Clapper, J. R., et al. Diet-induced mouse model of fatty liver disease and nonalcoholic steatohepatitis reflecting clinical disease progression and methods of assessment. American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology. 305 (7), G483-G495 (2013).
- Armstrong, M. J., et al. Liraglutide safety and efficacy in patients with non-alcoholic steatohepatitis (LEAN): a multicentre, double-blind, randomised, placebo-controlled phase 2 study. Lancet. 387 (10019), 679-690 (2016).
Przedruki i uprawnienia
