Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Mysi model ostrej choroby podobnej do wirusowego zapalenia mózgu wywołanej wirusem dengi

6.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59132

⸱

28 kwietnia 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Graduate Institute of Medical Sciences, College of Medicine, Taipei Medical University, 2Department of Microbiology and Immunology, School of Medicine, College of Medicine, Taipei Medical University, 3Center of Infectious Disease and Signaling Research, National Cheng Kung University

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół tworzenia immunokompetentnego mysiego modelu infekcji ośrodkowego układu nerwowego ICR (Institute of Cancer Research), aby pokazać rozwój neuropatii. Monitorowanie ostrych wirusowych zaburzeń encefalitycznych za pomocą identycznych wyników choroby można przeprowadzić w celu wykazania neuropatii wywołanej wirusem dengi in vivo.

Streszczenie

Wirus dengi (DENV), wirus przenoszony przez stawonogi przenoszony przez komary, może powodować ciężką chorobę znaną jako gorączka krwotoczna denga, która charakteryzuje się śmiertelnymi powikłaniami spowodowanymi wyciekiem osocza, wodobrzuszem, wysiękiem opłucnowym, niewydolnością oddechową, ciężkim krwawieniem i upośledzeniem narządów. W kilku przypadkach zakażenia DENV występują objawy neurologiczne; jednak w badaniach nie analizowano dalej neuropatogenezy indukowanej przez DENV. W tym badaniu przedstawiamy protokół wykorzystania immunokompetentnej myszy niekrewniaczej ICR (Institute of Cancer Research) do badania indukcji zakażenia ośrodkowego układu nerwowego (OUN) DENV, a następnie progresji ostrej choroby podobnej do wirusowego zapalenia mózgu.

Wprowadzenie

DENV, przenoszony przez stawonogi wirus z rodziny Flaviviridae, zawiera genom RNA o pozytywnym sensie, który koduje trzy białka strukturalne wirusa (kapsyd, premembrana i otoczka) oraz siedem wirusowych białek niestrukturalnych (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B i NS5). Cztery serotypy DENV (DENV1-4), które zarażają około 390 milionów ludzi rocznie, powodują globalne obciążenie, mimo że rządy skierowały znaczne wysiłki na wektory komarów i kontrolę chorób1. Obecnie opracowywane są szczepionki ochronne i terapeutyczne leki przeciwwirusowe, które wymagają dalszej długoterminowej walidacji2. W praktyce klinicznej, mimo że pacjent z dengą z zakażeniem OUN jest rzadki, należy go dalej badać, aby zrozumieć różnorodność rozwoju choroby denga3. Potrzebne są dalsze badania i walidacja; Warto zauważyć, że Światowa Organizacja Zdrowia (WHO) uwzględniła udział zaburzeń OUN, takich jak upośledzenie funkcji poznawczych, drgawki, encefalopatia i zapalenie mózgu, w klasyfikacji ciężkiej gorączki denga3,4. Konstruowanie zwierzęcych modeli zakażenia DENV jest niezbędne do zbadania neuropatogenezy zakażenia DENV.

W celu wywołania infekcji OUN przez DENV, kilka badań przeprowadziło różne drogi infekcji DENV, w tym (1) inokulację domózgową myszy C57BL/6, które otrzymały 4 x 103 jednostki tworzące płytkę miażdżycową (PFU) nieprzystosowanego DENV35,6, (2) inokulacja dootrzewnowa myszy BALB/c, które otrzymały 7 x 104 PFU in vitro neuroadaptowanego DENV47, (3) inokulacja śródmózgowa myszy szwajcarskich, które otrzymały 1 x 105 PFU neuroadaptacji in vivo DENV18, oraz (4) domózgowe i dootrzewnowe jednoczesne inokulowanie myszy ssących ICR, które otrzymały 1 x 106 PFU nieprzystosowanego DENV29. Zgodnie z wynikami tych badań5,6,7,8,9, zakażenie DENV u myszy powoduje replikację wirusa w mózgu, prowadząc do zespołów podobnych do wirusowego zapalenia mózgu, zmian w zachowaniu, którym towarzyszy paraliż kończyn i niestabilność postawy, neurotoksyczność i stan zapalny OUN, ogólny i miejscowy wyciek osocza przez bariera krew-mózg (BBB) i śmiertelność. Wszystkie wyniki tych badań5,6,7,8,9 wykazały zdolność DENV do infekowania OUN i indukcji ostrej choroby wirusowej podobnej do zapalenia mózgu po zakażeniu.

Na podstawie naszych aktualnych ustaleń9,10,11,12,13,14,15, stworzyliśmy mysi model infekcji DENV jako platformę in vivo do badania skuteczności terapeutycznej ukierunkowanych środków/czynników przeciwko replikacji wirusa, a także neurotoksyczność. W tym miejscu przedstawiamy protokół wykorzystany do stworzenia immunokompetentnej, niekrewniaczej myszy ICR do badania infekcji OUN i monitorowania rozwoju neuropatii o różnym nasileniu spowodowanych przez DENV. Wyniki wskazują na znaczny postęp choroby podobnej do zapalenia mózgu u myszy zakażonych DENV w sposób zależny od czasu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Eksperymentalne protokoły badań na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowników Narodowego Centrum Medycznego Obrony (numer IACUC: 16-261), zgodnie z wytycznymi ustalonymi przez Ministerstwo Nauki i Technologii na Tajwanie.

1. Procedura infekcji

  1. Przygotuj nieprzystosowany DENV2 (szczep PL046) stocks9 (pierwotnie uzyskany z Centers for Disease Control na Tajwanie, w zakresie od 2,5 x 107 do 1 x 109 PFU/ml).
  2. Rozcieńczyć zapas wirusa do 1 x 106 PFU za pomocą pożywki Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 do całkowitej objętości 40 μl.
  3. Napełnić jedną strzykawkę o pojemności 0,3 ml wyposażoną w igłę 30 G 10 μl (2,5 x 105 PFU) rozcieńczonego wirusa, a następnie napełnić kolejną strzykawkę o pojemności 0,3 ml wyposażoną w igłę 30 G 30 μl (7,5 x 105 PFU) rozcieńczonego wirusa.
  4. Przytrzymaj 7-dniową mysz ssącą ICR i wykonaj następujące czynności.
    1. W przypadku wstrzyknięcia domózgowego przytrzymaj mysz w pozycji leżącej, naciskając małżowinę uszną między palcem wskazującym a kciukiem, a następnie wstrzyknij domózgowo 10 μl rozcieńczonego wirusa w obszar lambda, punkt na przecięciu szwu strzałkowego i lambdoidalnego16.
    2. Po wstrzyknięciu domózgowym należy przytrzymać mysz w pozycji leżącej na plecach za pomocą palca wskazującego i kciuka, a następnie delikatnie wstrzyknąć dootrzewnowo 30 μl rozcieńczonego wirusa w jamę brzuszną myszy.
      UWAGA: Aby uniknąć kanibalizmu, stosuje się 75% alkoholu, aby spowodować tymczasową utratę czucia węchowego matki. Dodatkowo sugeruje się przykrywanie miotów stolcem i moczem matki.
  5. Połóż ssące myszy z powrotem w klatkach i odczekaj 5 minut, aby sprawdzić ich bezpieczeństwo po stymulacji z zachłannością myszy, w tym chodzeniem i ssaniem mleka matki.
    nuta: Najczęściej myszy wykazują normalną aktywność po stymulacji i wydaje się, że nie ma żadnych szkodliwych skutków po wyzwaniu technicznym. Podczas tego eksperymentu zwierzęta były utrzymywane przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowników Narodowego Centrum Medycznego Obrony na Tajwanie.
  6. Oceń dzienny postęp myszy pod względem masy ciała (przy użyciu wagi mikrogramowej), ostrej choroby podobnej do wirusowego zapalenia mózgu (według oceny choroby opisanej w sekcji 2) oraz wskaźnika przeżycia9,10,11,12,13,14,15.

2. Punktacja choroby

  1. Monitoruj stopień ostrych chorób podobnych do wirusowego zapalenia mózgu. Przypisz wynik 0 zdrowym myszom; 1 dla myszy z niewielkimi objawami chorobowymi, w tym utratą masy ciała, ograniczoną mobilnością i garbatą orientacją ciała; 2 dla myszy, które wykazują napad limbiczny; 3 u myszy wykazują osłabienie limbiczne, w tym trudności w poruszaniu się i osłabienie kończyn przednich lub tylnych; 4 na paraliż; 5 za śmierć.
    nuta: Gdy wynik osiągnie 3, uważa się, że objawy choroby szybko ewoluują.
  2. Wykreśl punktację choroby, zgodnie z krokiem 2.1, dla każdego dnia jako liczbę opartą na krzywej, używając średniej ± SD dziennych wyników testów w każdej grupie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W literaturze dotyczącej patogenezy dengi opisano ciężkie powikłania neurologiczne związane z zapaleniem mózgu i opon mózgowych u pacjentów4. Choć przypadki te są rzadkie w praktyce klinicznej, stworzenie immunokompetentnego mysiego modelu zakażenia DENV może służyć nie tylko do badania immunopatogenezy, ale także do analizy zakażeń OUN, neurozapalenia, neurotoksyczności oraz ostrego stanu chorobowego przypominającego wirusowe zapalenie mózgu. W niniejszym badaniu,...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Zakażenie DENV wykryto w OUN u pacjentów z ciężką postacią gorączki denga 3,17, co sugeruje, że podczas patogenezy dengi mogła wystąpić ostra wirusowa choroba zapalenia mózgu. W tym miejscu przedstawiamy mysi model zakażenia DENV in vivo w celu zbadania udziału dysfunkcji OUN w ciężkiej gorączce denga, szczególnie ze szczególnym uwzględnieniem chorób podobnych do ostrego wirusowego zapalenia mózgu wywołanych przez DENV. W porównaniu z poprzednimi modelami, szczeg...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez granty z Ministerstwa Nauki i Technologii (MOST107-2321-B-038-001) oraz finansowanie stacjonarne 106TMU-CIT-01-2, Tajpej, Tajwan.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Roswell Park Memorial Institute 1640 podłoże (RPMI)Gibco11875-085Rozcieńczanie wirusa
0,3 ml Strzykawka insulinowa BD Ultra-Fine­II328838Mikrowaga do wstrzykiwań domózgowych i dootrzewnowych
AL104METTLER TOLEDONieprzystosowana
DENV2 (szczep PL046)Centra Kontroli Chorób Tajwanu-Infekcjamyszy
Instytut Badań nad Rakiem (ICR)ssie BioLASCO Taiwan Co.,Ltd-Naszmysi model
Mysz LabX firmy

Bibliografia

  1. Guzman, M. G., Gubler, D. J., Izquierdo, A., Martinez, E., Halstead, S. B. Dengue infection. Nature Reviews Disease Primers. 2, 16055(2016).
  2. Katzelnick, L. C., Coloma, J., Harris, E. Dengue: knowledge gaps, unmet needs, and research priorities. Lancet Infectious Diseases. 17 (3), e88-e100 (2017).
  3. Carod-Artal, F. J., Wichmann, O., Farrar, J., Gascon, J. Neurological complications of dengue virus infection. Lancet Neurology. 12 (9), 906-919 (2013).
  4. Geneva: World Health Organization. Dengue: Guidelines for Diagnosis, Treatment, Prevention and Control: New Edition. , WHO Guidelines Approved by the Guidelines Review Committee (2009).
  5. Amaral, D. C., et al. Intracerebral infection with dengue-3 virus induces meningoencephalitis and behavioral changes that precede lethality in mice. Journal of Neuroinflammation. 8, 23(2011).
  6. de Miranda, A. S., et al. Dengue-3 encephalitis promotes anxiety-like behavior in mice. Behavioural Brain Research. 230 (1), 237-242 (2012).
  7. Velandia-Romero, M. L., Acosta-Losada, O., Castellanos, J. E. In vivo infection by a neuroinvasive neurovirulent dengue virus. Journal of Neurovirology. 18 (5), 374-387 (2012).
  8. Despres, P., Frenkiel, M. P., Ceccaldi, P. E., Duarte Dos Santos, C., Deubel, V. Apoptosis in the mouse central nervous system in response to infection with mouse-neurovirulent dengue viruses. Journal of Virology. 72 (1), 823-829 (1998).
  9. Tsai, T. T., et al. Microglia retard dengue virus-induced acute viral encephalitis. Scientific Reports. 6, 27670(2016).
  10. Cheng, Y. L., et al. Activation of Nrf2 by the dengue virus causes an increase in CLEC5A, which enhances TNF-alpha production by mononuclear phagocytes. Scientific Reports. 6, 32000(2016).
  11. Ho, M. R., et al. Blockade of dengue virus infection and viral cytotoxicity in neuronal cells in vitro and in vivo by targeting endocytic pathways. Scientific Reports. 7 (1), 6910(2017).
  12. Jhan, M. K., et al. Anti-TNF-alpha restricts dengue virus-induced neuropathy. Journal of Leukocyte Biology. 104 (5), 961-968 (2018).
  13. Kao, J. C., et al. The antiparasitic drug niclosamide inhibits dengue virus infection by interfering with endosomal acidification independent of mTOR. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (8), e0006715(2018).
  14. Tsai, T. T., Chen, C. L., Tsai, C. C., Lin, C. F. Targeting heat shock factor 1 as an antiviral strategy against dengue virus replication in vitro and in vivo. Antiviral Research. 145, 44-53 (2017).
  15. Jhan, M. K., et al. Dengue virus infection increases microglial cell migration. Scientific Reports. 7 (1), 91(2017).
  16. Benskey, M. J., Manfredsson, F. P. Intraparenchymal Stereotaxic Delivery of rAAV and Special Considerations in Vector Handling. Methods in Molecular Biology. , 199-215 (2016).
  17. Fong, C. Y., et al. Mild encephalitis/encephalopathy with reversible splenial lesion (MERS) due to dengue virus. Journal of Clinical Neuroscience. 36, 73-75 (2017).
  18. Sarathy, V. V., et al. A lethal murine infection model for dengue virus 3 in AG129 mice deficient in type I and II interferon receptors leads to systemic disease. Journal of Virology. 89 (2), 1254-1266 (2015).
  19. Schul, W., Liu, W., Xu, H. Y., Flamand, M., Vasudevan, S. G. A dengue fever viremia model in mice shows reduction in viral replication and suppression of the inflammatory response after treatment with antiviral drugs. The Journal of Infectious Diseases. 195 (5), 665-674 (2007).
  20. Tyler, K. L. Acute Viral Encephalitis. New England Journal of Medicine. 379 (6), 557-566 (2018).
  21. Yauch, L. E., Shresta, S. Mouse models of dengue virus infection and disease. Antiviral Research. 80 (2), 87-93 (2008).
  22. Assir, M. Z., Jawa, A., Ahmed, H. I. Expanded dengue syndrome: subacute thyroiditis and intracerebral hemorrhage. BMC Infectious Diseases. 12, 240(2012).
  23. Kumar, R., Prakash, O., Sharma, B. S. Intracranial hemorrhage in dengue fever: management and outcome: a series of 5 cases and review of literature. Surgical Neurology. 72 (4), 429-433 (2009).
  24. Simanjuntak, Y., Liang, J. J., Lee, Y. L., Lin, Y. L. Repurposing of prochlorperazine for use against dengue virus infection. Journal of Infectious Diseases. 211 (3), 394-404 (2015).
  25. Rocha, B. A. M., et al. Dengue-specific serotype related to clinical severity during the 2012/2013 epidemic in centre of Brazil. Infectious Disease Poverty. 6 (1), 116(2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Zapalenie m zgu wywo ane wirusem dengiimmunokompetentny model mysiwstrzykni cie wewn trzm zgowewstrzykni cie doszpikoweocena progresji chorobypomiar masy cia aocena postawy zgarbionejmonitorowanie napad w limbicznychbarwienie hematoksylin i eozyntest tworzenia plamyk w
Mysi model ostrej choroby podobnej do wirusowego zapalenia mózgu wywołanej wirusem dengi
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.