To badanie informuje o próbkach krwi z żyły ogonowej u myszy przy użyciu systemu probówek do ekstrakcji próżniowej z lupą okularową. Nasza metoda jest łatwa do przećwiczenia i może być stosowana do powtórnego pobierania próbek krwi u myszy.
Artykuł metodologiczny
Zmodyfikowane pobieranie krwi z żył ogonowych myszy nieznieczulonych za pomocą próżniowego systemu pobierania krwi i lupy okularowej
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Pobieranie próbek krwi jest podstawą eksperymentalnych badań na zwierzętach. Istotne jest uzyskanie odpowiednich próbek krwi do różnych celów badawczych. Żyły ogonowe myszy są małe i czasami trudno jest uzyskać wymaganą objętość krwi konwencjonalnymi metodami nakłuwania. W badaniu tym zbadano wyższość wielokrotnego pobierania próbek krwi z żył ogonowych myszy przy użyciu próżniowego systemu pobierania krwi i lupy okularowej (grupa eksperymentalna) w porównaniu z konwencjonalnymi metodami pobierania krwi (grupa konwencjonalna), wykonywanymi odpowiednio przez początkujących i ekspertów. Za pomocą lupy okularowej końcówka igły motylkowej jest wprowadzana do żyły ogonowej każdej myszy w grupie eksperymentalnej. Po pomyślnym przebiciu żyły próbka krwi jest pobierana do probówki próżniowej poprzez włożenie gumowej końcówki igły motylkowej do probówki do pobierania krwi. Tłok jest następnie używany do pobierania krwi bez pomocy lupy okularowej w grupie konwencjonalnej. Wykazano, że wskaźniki powodzenia pobierania próbek krwi przez początkujących i ekspertów wynoszą 70% w porównaniu ze 100% (p < 0,01) w grupie eksperymentalnej i 35% w porównaniu z 85% (p < 0,01) w grupie konwencjonalnej. Zarówno w przypadku początkujących, jak i ekspertów, czas nakłucia wymagany do uzyskania wymaganej próbki krwi był znacznie krótszy w grupie eksperymentalnej w porównaniu z grupą konwencjonalną (2,40 ± 0,75 vs. 2,90 ± 0,31, p < 0,05; 1,15 ± 0,37 vs. 1,55 ± 0,76, p < 0,05). Podsumowując, przedstawiona technika pobierania krwi jest wykonalna i łatwa do przećwiczenia oraz umożliwia częste pobieranie próbek odpowiedniej objętości krwi od myszy nieznieczulonych.
Wprowadzenie
Pobieranie próbek krwi od zwierząt biorących udział w eksperymentach jest podstawową techniką badawczą. Istnieje kilka dostępnych technik pobierania krwi od myszy, w tym obcinanie ogona i nakłuwanie serca, splotu zaoczodołowego, żyły szyjnej, żyły ogonowej i żyły głównej. Idealnie byłoby, gdyby krew była pobierana w sposób minimalnie inwazyjny, przy minimalnym wpływie na zdrowie zwierzęcia. Jednak najczęściej stosowane techniki często powodują stres u zwierząt i mogą wpływać na wyniki badań1. Pobranie krwi ze splotu zaoczodołowego może być wykorzystane do uzyskania wystarczającej objętości krwi od myszy2. Może jednak spowodować poważne uszkodzenie tkanek i nie pozwala na wielokrotne pobieranie krwi w krótkich odstępach czasu3.
Żyła ogonowa jest doskonałym miejscem do pobierania krwi, co powoduje minimalne szkody u myszy. Jednak żyły ogonowe myszy są cienkie i czasami trudno jest uzyskać wystarczającą ilość krwi za pomocą konwencjonalnej techniki nakłuwania. W niektórych przypadkach konieczne jest wielokrotne nakłuwanie w celu uzyskania pożądanej objętości krwi. Znieczulenie jest również powszechnie zalecane w celu ułatwienia pobierania próbek krwi z żył ogonowych myszy. Ponadto może być potrzebny skalpel, brzytwa o prostej krawędzi lub ostre nożyczki do usunięcia końców ogonów w celu uzyskania wymaganych próbek krwi4. Wcześniej informowaliśmy o udanym pobraniu krwi z żył ogonowych szczurów nieznieczulonych za pomocą próżniowego systemu pobierania próbek krwi, co zmniejszyło ryzyko zanieczyszczenia krwi i uniknęło konieczności wielokrotnego nakłuwania5. Badanie to donosi o podobnej metodzie pobierania krwi u myszy nieznieczulonych.
Protokół
1. Hodowla
- Użyj 12-tygodniowych myszy Kunming.
UWAGA: Użyliśmy myszy (n = 40, 20 samców, 37-46 g, średnio 42,38 ± 2,39 g) z Centrum Zwierząt Doświadczalnych Tongji Medical College. - Trzymaj myszy w standardowych warunkach ze swobodnym dostępem do jedzenia i wody pitnej. Trzymaj dwie myszy w klatce o długości 530cm2 z drewnianą ściółką do golenia.
- Utrzymuj temperaturę w pomieszczeniu w zakresie 21–23 °C.
- Karm myszy normalną dietą solną (0,3% NaCl) przez cały czas trwania badania.
2. Pobieranie próbek krwi
- Przygotuj następujący sprzęt: rurkę próżniową (1 ml), igłę motylkową, lupę do okularów i plastikowy uchwyt przytrzymujący. Umieść je na sterylnej powierzchni (Rysunek 1).
- Umieść mysz w plastikowym uchwycie przytrzymującym i umyj jej ogon ciepłą wodą (20–30 °C). Przetrzyj ogon wacikami nasyconymi 70% etanolem, aby rozszerzyć żyłę. Wybierz prawą lub lewą żyłę ogonową do pobrania krwi. Delikatnie chwyć dolną część ogona i trzymaj ogon prosto podczas pobierania próbki krwi.
- Zbierz krew. W przypadku porównywania metod należy pobrać krew w dwóch grupach: grupie "eksperymentalnej" za pomocą opracowanej przez nas procedury, przedstawionej poniżej, oraz grupie "konwencjonalnej" przy użyciu metody konwencjonalnej, również przedstawionej poniżej.
- Kolekcja eksperymentalna:
- Noś lupę okularową, aby poprawić widoczność pod kątem przebicia żyły ogonowej. Wprowadzić końcówkę igły motylkowej 22 G do jednej z bocznych żył ogonowych w miejscu mniej więcej w połowie odległości dystalnie od końca ogona pod kątem około 10°, przesuwając się w kierunku podstawy ogona w przypadku wielu próbek.
- Włóż gumową końcówkę igły motylkowej do probówki próżniowej do pobierania krwi, aby pobrać krew ( Rysunek 2).
UWAGA: Jeśli krew przestanie wypływać podczas pobierania krwi, należy szybko wyregulować kąt igły. Aby uniknąć krzepnięcia krwi w igle, należy wybrać inną pozycję nakłucia, jeśli krew przestaje wypływać po 15 sekundach.
- Metoda konwencjonalna:
- Wprowadzić igłę połączoną ze strzykawką do jednej z żył bocznych w odległości około jednej trzeciej odległości dystalnie od końca ogona.
- Gdy w piaście pojawi się krew, powoli odciągnij tłok, aby zebrać krew (Rysunek 3)7.
UWAGA: Aby dokładniej wyjaśnić skutki różnych doświadczeń z pobieraniem krwi, wybrano początkującego i eksperta, którzy pobierali próbki krwi jednocześnie metodami eksperymentalnymi i konwencjonalnymi.
- Kolekcja eksperymentalna:
- Po pobraniu krwi wyjmij igłę i naciśnij punkt nakłucia, aby zatrzymać krwawienie. Następnie zwolnij mysz z plastikowego uchwytu przytrzymującego i umieść mysz z powrotem w klatce.
UWAGA: Doniesiono, że do 10% całkowitej objętości krwi może być bezpiecznie pobrane od zdrowego zwierzęcia w odstępach 2-tygodniowych8, więc za każdym razem pobierano około 175 μL krwi zgodnie z zasadami etycznymi. - Do pobrania osocza należy użyć probówek z EDTA, a do pobrania surowicy należy użyć probówek bez antykoagulantów. Delikatnie odwróć rurkę kilka razy i połóż je pionowo na lodzie.
- Odwirować probówki do pobierania próbek krwi w wirówce z chłodzeniem o sile 1 000 x g przez 10 minut w celu oddzielenia osocza i surowicy.
UWAGA: Za udane pobranie krwi uznaje się uzyskanie za każdym razem objętości 175 μL. Nie należy podejmować więcej niż trzech prób nakłucia, a nieudane pobranie krwi definiuje się jako całkowitą objętość krwi mniejszą niż 175 μl po trzecim nakłuciu. Czas pobierania próbek określa się jako czas od nakłucia żyły ogonowej do wyjęcia igły po pobraniu krwi. - Pobieraj krew dwa razy w odstępach 2 tygodni8.
3. Analiza statystyczna
- Korzystaj z dostępnego na rynku oprogramowania statystycznego do analizy. Przedstaw dane jako wartość średnią ± odchylenie standardowe, przyjmując p < 0,05 jako punkt odcięcia dla istotności statystycznej.
Wyniki
Masa ciała, objętości pobranej krwi i czas trwania pobierania próbek w dwóch grupach
Próbki krwi pobierano od 20 myszy (10 samców) dwukrotnie w odstępach 2 tygodni w każdej grupie. Średnia masa ciała myszy była podobna między grupą eksperymentalną a konwencjonalną odpowiednio dla początkujących i ekspertów (42.40 g ± 1.42 g vs. 42.65 g ± 1.14 g, p > 0.05; 42.55 g ± 2.91 g vs. 43.20 g ± 2.69 g, p > 0.05). Pobrane objętości krwi i czas trwania pobierania były podobne między obiema grupami u ekspertów (184.25 µL ± 11.95 µL vs. 171.75 µL ± 25.61 µL, p > 0.05; 1.85 min ± 0.68 min vs. 2.17 min ± 0.80 min, p > 0.05). Jednak w grupie początkujących zaobserwowano większe objętości pobranej krwi i krótszy czas trwania pobierania w grupie eksperymentalnej w porównaniu z grupą konwencjonalną (172.00 µL ± 15.17 µL vs. 148.50 µL ± 30.22 µL, p < 0.01; 3.11 min ± 0.44 min vs. 4.08 min ± 0.61 min, p < 0.01). W porównaniu z początkującymi, eksperci pobrali większe objętości krwi i wykazali krótszy czas pobierania przy zastosowaniu metod eksperymentalnej i konwencjonalnej (184.25 µL ± 11.95 µL vs. 172.00 µL ± 15.17 µL, p < 0.01; 171.75 µL ± 25.61 µL vs. 148.50 µL ± 30.22 µL, p < 0.05; 1.85 min ± 0.68 min vs. 3.11 min ± 0.44 min, p < 0.01; 2.17 min ± 0.80 min vs. 4.08 min ± 0.61 min, p < 0.05) (Tabela 1).
Wskaźniki sukcesu i czasy nakłuć w obu grupach
Porównanie wskaźników sukcesu pomiędzy początkującymi a ekspertami wyniosło 70% (14/20) vs. 100% (20/20) (p < 0.01) w grupie eksperymentalnej oraz 35% (7/20) vs. 85% (17/20) (p < 0.01) w grupie konwencjonalnej. Wyższe wskaźniki sukcesu u początkujących odnotowano również w grupie eksperymentalnej w porównaniu z grupą konwencjonalną [70% (14/20) vs. 35% (7/20), p < 0.05]. Zarówno u początkujących, jak i u ekspertów, liczba nakłuć była istotnie niższa w grupie eksperymentalnej w porównaniu z grupą konwencjonalną (2.40 ± 0.75 vs. 2.90 ± 0.31, p < 0.05; 1.15 ± 0.37 vs. 1.55 ± 0.76, p < 0.05). W porównaniu z początkującymi, u ekspertów zaobserwowano krótsze czasy nakłuć przy zastosowaniu metod eksperymentalnej i konwencjonalnej (1.15 ± 0.37 vs. 2.40 ± 0.75, p < 0.01; 1.55 ± 0.76 vs. 2.90 ± 0.31, p < 0.01) (Tabela 1).
Rycina 1: Sprzęt. Przedstawiono próżniowe probówki do pobierania krwi o pojemności 1 mL i igłę motylkową 22 G (po lewej), lupę okularową (w środku) oraz plastikowy uchwyt stabilizujący (po prawej). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 2: Pomyślne pobranie krwi w grupie eksperymentalnej. Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.
Rycina 3: Pomyślne pobranie krwi w grupie konwencjonalnej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
| Grupa eksperymentalna | Grupa konwencjonalna | |||
| początkujący | ekspert | początkujący | ekspert | |
| Masa ciała (g) | 42.4±1.42 | 42.55±2.91 | 42.65±1.14 | 43.20±2.69 |
| Objętość pobranej krwi (µL) | 172.00±15.17 | 184.25±11.95## | 148.50±30.22** | 171.75±25.61# |
| Czas trwania próbkowania (min) | 3.11±0.44 | 1.85±0.68## | 4.08±0.61** | 2.17±0.80## |
| Czasy pobierania krwi | 20 | 20 | 20 | 20 |
| Średnia liczba nakłuć | 2.40±0.75 | 1.15±0.37## | 2.90±0.31* | 1.55±0.76##* |
| Jednorazowe nakłucie | 3 | 17 | 0 | 12 |
| Podwójna punkcja | 6 | 3 | 2 | 5 |
| Potrójne nakłucie | 5 | 0 | 5 | 0 |
| Niepowodzenie | 6 | 0 | 13 | 3 |
| Wskaźnik sukcesu | 70% | 100%## | 35%* | 85%## |
Tabela 1: Porównanie wyników między grupą eksperymentalną a konwencjonalną. *p < 0.05, **p < 0.01, metoda eksperymentalna vs. metoda konwencjonalna. #p < 0.05, ##p < 0.01, początkujący vs. ekspert.
Dyskusja
Niniejsze badanie opisuje łatwą do nauczenia się metodę pobierania krwi u myszy, która jest lepsza od konwencjonalnych technik. Po pierwsze, metodę można łatwo opanować z wysokim wskaźnikiem sukcesu. Po drugie, opiera się na zasadzie podciśnienia próżniowego i pozwala na ciągłe pobieranie krwi przy zmniejszonym ryzyku bezpośredniej ekspozycji na krew, co również zmniejsza ryzyko zanieczyszczenia i hemolizy9. Po trzecie, metoda ta jest możliwa do częstego pobierania próbek krwi o odpowiedniej objętości od myszy w krótkim okresie czasu do różnych celów badawczych. Co więcej, procedura wyrządza myszom tylko minimalne obrażenia, a pobieranie krwi można przeprowadzić bez użycia środków znieczulających; W ten sposób można uniknąć wpływu reakcji na stres i środków znieczulających na próbki krwi.
Żyła ogonowa jest lepszym miejscem do pobierania próbek krwi zgodnie z zatwierdzonym protokołem7. Jednak nie zawsze łatwo jest uzyskać wystarczającą objętość krwi z cienkich żył ogonowych o niskim przepływie krwi. W takim przypadku skóra jest zwykle rozcinana, a żyła jest penetrowana lancetem lub koniec ogona jest szybko usuwany za pomocą brzytwy.
Protokół ten ma na celu ulepszenie metodologii pobierania krwi od myszy za pomocą próżniowego systemu pobierania krwi, który wymaga próżniowej probówki do pobierania próbek krwi, igły motylkowej i lupy okularowej. Ten próżniowy system pobierania próbek krwi jest zwykle używany do pobierania próbek krwi od pacjentów w codziennej praktyce klinicznej10. Za pomocą lupy okularowej łatwiej jest zlokalizować idealny punkt nakłucia żyły ogonowej. Gdy końcówka igły zostanie wprowadzona do żyły ogonowej, krew automatycznie wpłynie do rurki próżniowej z powodu podciśnienia. Po wyjęciu igły z żyły ogonowej krew, która jest zablokowana w cewniku, wpłynie do rurki próżniowej z powodu podciśnienia.
Poniższe wskazówki są ważne dla pomyślnego zastosowania tej metody. Po pierwsze, masa ciała każdej myszy powinna wynosić 40 g lub więcej, aby zmniejszyć trudności w nakłuwaniu i pozyskiwaniu wystarczającej ilości krwi. Po drugie, w przypadku nieudanego pobrania krwi, eksperymentatorzy powinni starać się powoli wycofywać igłę, aż krew będzie nadal wypływać. Po trzecie, ważne jest, aby wyprostować ogon, aby uniknąć jakiegokolwiek ruchu podczas pobierania krwi. Delikatne trzymanie igły może pomóc w utrzymaniu końcówki igły w żyle podczas ruchu ogona myszy. Po czwarte, jeśli krew przestanie wypływać podczas pobierania krwi, kąt igły należy wyregulować w odpowiednim czasie. Aby uniknąć krzepnięcia krwi w igle, należy wybrać inną pozycję nakłucia, jeśli krew przestaje wypływać po 15 sekundach. Wreszcie, przy użyciu tej techniki do pobierania krwi od myszy zalecana jest współpraca dwóch operatorów.
Krótko mówiąc, przyjęta metoda próżniowego pobierania krwi do stosowania u myszy jest bezpieczna, wykonalna i łatwa do przećwiczenia. Metoda ta umożliwia częste pobieranie próbek krwi o odpowiedniej objętości krwi od myszy nieznieczulonych.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez grant Fundacji Nauki o Naturze z prowincji Hubei, Chiny [Grant nr 2018CFB761].
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Igła dwustronna | Shanghai Kang Nong medical instrument co., LTD, Chiny | 20163151718 22G (0,7 mm x 25 mm) | |
| Lupa | Vergroberung | 1,5x | |
| Normalna dieta solna dla myszy | Myszy otrzymywały normalną dietę solną (0,3% NaCl) przez cały czas trwania badania. | ||
| Plastikowy uchwyt | Shanghai Kang Nong medical instrument co., LTD, Chiny | 35-45 g rat hoder | |
| Oprogramowanie SPSS do analizy statystycznej | SPSS Inc, Chicago; Wersja USA | 17.0. | |
| Strzykawka | Shandong wego Medical polymer products co. LTD., Chiny | 20160911A | 1 ml (pasujący rozmiar igły: 0,45 razy; 16RW LB) |
| Próżniowy system pobierania krwi | Wuhan Zhi Yuan, medical science and technology co., LTD, Chiny | 20171222 | 1 ml (Φ 12,4 razy; L75) |
Bibliografia
- Grouzmann, E., et al. Blood sampling methodology is crucial for precise measurement of plasma catecholamines concentrations in mice. European Journal of Physiology. 447 (2), 254-258 (2003).
- Heimann, M., Roth, D. R., Ledieu, D., Pfister, R., Classen, W. Sublingual and submandibular blood collection in mice: a comparison of effects on body weight, food consumption and tissue damage. Lab Animal. 44 (4), 352-358 (2010).
- Heimann, M., Kasermann, H. P., Pfister, R., Roth, D. R., Burki, K. Blood collection from the sublingual vein in mice and hamsters: a suitable alternative to retrobulbar technique that provides large volumes and minimizes tissue damage. Lab Animal. 43 (3), 255-260 (2009).
- Hoff, J. Methods of blood collection in the mouse. Lab Animal. 29 (10), 47-53 (2000).
- Zou, W., et al. Repeated Blood Collection from Tail Vein of Non-Anesthetized Rats with a Vacuum Blood Collection System. Journal of Visualized Experiments. (130), (2017).
- Kilkenny, C., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: ARRIVE-ing at a solution. Lab Animal. 44 (4), 377-378 (2010).
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. Journal of Pharmacology and Pharmacotherapeutics. 1 (2), 87-93 (2010).
- Diehl, K. H., et al. A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. Journal of Applied Toxicology. 21 (1), 15-23 (2001).
- Wollowitz, A., Bijur, P. E., Esses, D., John Gallagher, E. Use of butterfly needles to draw blood is independently associated with marked reduction in hemolysis compared to intravenous catheter. Academic Emergency Medicine. 20 (11), 1151-1155 (2013).
- Eder, J. M., Cutter, G. R. A new device for collecting cord blood. Obstetrics and Gynecology. 86 (5), 850-852 (1995).
Przedruki i uprawnienia
