Method Article

Analiza ilościowa składu komórkowego w zaawansowanych zmianach miażdżycowych myszy śledzących linię komórek mięśni gładkich

DOI:

10.3791/59139

⸱

February 20th, 2019

 ,  ,  , 
1Heart, Lung, Blood and Vascular Medicine Institute, University of Pittsburgh, 2Robert M. Berne Cardiovascular Research Center, University of Virginia, 3Department of Biochemistry and Molecular Genetics, University of Virginia, 4Division of Cardiology, University of Pittsburgh School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proponujemy ustandaryzowany protokół do scharakteryzowania składu komórkowego późnych zmian miażdżycowych u myszy, w tym systematyczne metody preparacji zwierząt, osadzania tkanek, cięcia, barwienia i analizy tętnic ramienno-głowowych od myszy śledzących linię komórek mięśni gładkich w atheroprone.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Miażdżyca pozostaje główną przyczyną zgonów na całym świecie i, pomimo niezliczonych badań przedklinicznych opisujących obiecujące cele terapeutyczne, nowe interwencje pozostają nieuchwytne. Jest to prawdopodobnie częściowo spowodowane poleganiem na przedklinicznych modelach prewencji badających wpływ manipulacji genetycznych lub leczenia farmakologicznego na rozwój miażdżycy, a nie na ustaloną chorobę. Ponadto wyniki tych badań są często mylące ze względu na stosowanie powierzchownych analiz zmian chorobowych i brak charakterystyki populacji komórek uszkodzonych. Aby pomóc w pokonaniu tych przeszkód translacyjnych, proponujemy większe poleganie na modelach interwencyjnych, które wykorzystują badanie zmian w składzie komórkowym na poziomie pojedynczej komórki za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego i mikroskopii konfokalnej. W tym celu opisujemy protokół testowania przypuszczalnego środka terapeutycznego w mysim modelu interwencji, w tym systematyczne podejście do sekcji zwierząt, osadzania, cięcia, barwienia i kwantyfikacji zmian w tętnicy ramienno-głowowej. Ponadto, ze względu na różnorodność fenotypową komórek w późnym stadium zmian miażdżycowych, opisujemy znaczenie stosowania specyficznych dla komórek, indukowalnych systemów śledzenia linii myszy i jak można to wykorzystać do bezstronnej charakterystyki populacji komórek zmian miażdżycowych. Razem te strategie mogą pomóc biologom naczyniowym w dokładniejszym modelowaniu interwencji terapeutycznych i analizie choroby miażdżycowej i, miejmy nadzieję, przełożą się na wyższy wskaźnik sukcesu w badaniach klinicznych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Miażdżyca jest główną przyczyną zachorowalności i śmiertelności na całym świecie, leżącą u podstaw większości chorób wieńcowych, chorób tętnic obwodowych i udaru mózgu. Późne stadium miażdżycy tętnic wieńcowych może prowadzić do poważnych powikłań, w tym zawału mięśnia sercowego, odpowiadającego za prawie 16% śmiertelności populacji światowej1,2. Ze względu na jego niszczycielski wpływ na zdrowie publiczne, podjęto znaczne wysiłki w celu rozszyfrowania mechanizmów kierujących postępem miażdżycy, a także opracowania nowych strategii terapeutycznych. Jednak wskaźnik prawdopodobieństwa zatwierdzenia (LOA) badań klinicznych dotyczących chorób sercowo-naczyniowych jest jednym z najniższych w porównaniu z innymi dziedzinami klinicznymi (tylko 8,7% dla fazy I)3. Można to częściowo wytłumaczyć wieloma barierami, jakie miażdżyca stwarza dla skutecznego opracowywania leków, w tym jej niemal wszechobecnym charakterem, klinicznie cichym postępem i znaczną różnorodnością choroby. Co więcej, nieoptymalna konstrukcja przedklinicznych badań na zwierzętach może być również odpowiedzialna za brak powodzenia w translacji klinicznej. W szczególności uważamy, że konieczne jest przeprowadzenie badań interwencyjnych, gdy tylko jest to możliwe, w celu zbadania skuteczności strategii terapeutycznych. Istnieje również pilna potrzeba przeprowadzenia ustandaryzowanych procedur analizy zmian chorobowych, w tym zaawansowanej charakterystyki składu komórkowego późnych stadiów zmian miażdżycowych poprzez mapowanie losu i fenotypowanie.

Zdecydowana większość badań nad miażdżycą skupia się na modelach zapobiegania miażdżycy, polegających na leczeniu farmakologicznym lub manipulacji genami (knockout lub knock-in) u zdrowych, młodych myszy, przed rozpoczęciem i progresją choroby. Badania te ujawniły dużą liczbę genów i cząsteczek sygnałowych, które odgrywają rolę w rozwoju miażdżycy. Jednak większość z tych celów nie przełożyła się na skuteczne terapie u ludzi. Rzeczywiście, trudno jest ekstrapolować wpływ terapii na zdrowe młode myszy na starszych pacjentów z zaawansowanymi zmianami miażdżycowymi. W związku z tym wdrożenie badań interwencyjnych w przedklinicznym procesie eksperymentalnym prawdopodobnie zapewni dokładniejszy obraz znaczenia i skuteczności nowego środka terapeutycznego. Pomysł ten jest wspierany przez uderzająco rozbieżne efekty hamowania prozapalnej cytokiny Interleukina-1β (IL-1β) przy zastosowaniu profilaktyki4,5,6 lub strategia interwencji7. Różnice między badaniami prewencyjnymi i interwencyjnymi sugerują, że różne procesy komórkowe zachodzą w różnych fazach rozwoju miażdżycy i podkreślają fakt, że badania prewencyjne są prawdopodobnie niewystarczające, aby odpowiednio modelować scenariusz kliniczny.

Amerykańskie Towarzystwo Kardiologiczne niedawno opublikowało naukowe oświadczenie, w którym szczegółowo opisuje zalecenia dotyczące prawidłowego projektowania eksperymentów, standaryzacji procedur, analizy i raportowania badań nad miażdżycą na zwierzętach8. Podkreśla korzyści i ograniczenia dominujących technik stosowanych w tej dziedzinie. Na przykład barwienie aorty en face Sudan IV jest często wykonywane jako pierwszy odczyt. Chociaż barwienie osadów lipidowych en face Sudan IV jest odpowiednią metodą oceny globalnego obciążenia blaszką miażdżycową, nie jest w stanie odróżnić zmian smugowych we wczesnym stadium od bardziej zaawansowanych zmian w późnym stadium. W związku z tym interpretacja barwienia en face jest często niejednoznaczna i powierzchowna9. Dokładna analiza przekrojów poprzecznych tkanek przy użyciu parametrów morfologicznych naczynia, zmiany chorobowej i wielkości światła oraz kwantyfikacja wskaźników stabilności zmiany zapewnia dokładniejsze zrozumienie efektu eksperymentu.

Na koniec, badania histopatologiczne na ludziach sugerują, że skład komórkowy jest lepszym predyktorem pęknięcia niż sama wielkość zmiany, przy czym zmiany ubogie w komórki mięśni gładkich (SMC) i bogate w makrofagi są bardziej podatne na pęknięcie10,11. Obserwacje te opierały się na barwieniu markerów klasycznie stosowanych do identyfikacji komórek (tj. ACTA2 dla SMC i LGALS3 lub CD68 dla makrofagów). Jednak ekspresja tych markerów nie jest ściśle ograniczona do pojedynczego typu komórek w zmianach miażdżycowych ze względu na plastyczność wielu linii, w tym SMC, komórek śródbłonka i komórek szpikowych12. W szczególności jednoznaczna identyfikacja SMC w obrębie zmiany miażdżycowej była praktycznie niemożliwa aż do ostatniej dekady ze względu na właściwość tych komórek do deróżnicowania i tłumienia genów markerowych specyficznych dla linii (proces określany jako przełączanie fenotypowe) w uszkodzonych lub chorych naczyniach13. To ograniczenie w identyfikacji SMC zostało ominięte przez rozwój śledzenia linii7,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24. Polega ona na trwałym znakowaniu SMC i ich potomstwa w celu śledzenia ich losu i ewolucji fenotypowej podczas progresji miażdżycy przy użyciu kombinacji ekspresji rekombinazy Cre napędzanej przez promotory specyficzne dla SMC (tj. Myh117,15,17,18,19,20,21,22,23,24, Acta225,26 i, SM22α14,16) oraz aktywacja reporterów (np. białek fluorescencyjnych, β-galaktozydazy) [recenzja w Bentzon i Majesky 201827]. W jednym z pierwszych badań wykorzystujących śledzenie linii SMC poza środowiskiem embriogenezy, Speer i wsp.14 dostarczyli dowodów na to, że SMC może modulować swój fenotyp i transróżnicować się w komórki chondrogenne podczas zwapnienia naczyń krwionośnych przy użyciu modelu śledzenia linii SM22α Cre R26R LacZ. Chociaż badania te zapoczątkowały śledzenie linii SMC, były one częściowo niejednoznaczne, ponieważ każdy dany pojazd niewyrażający SM22α w otoczeniu choroby byłby znakowany przez osobę zgłaszającą. Ograniczenie to zostało ominięte dzięki opracowaniu i zastosowaniu induplikowanego tamoksyfenem Cre ERT/LoxP, co pozwala na czasową kontrolę znakowania komórek. Znakowanie komórek zachodzi wyłącznie podczas dostarczania tamoksyfenu i będzie ograniczone do komórki wykazującej ekspresję promotora specyficznego dla typu komórki napędzającego ekspresję Cre ERT w czasie ekspozycji na tamoksyfen, unikając śledzenia alternatywnych typów komórek aktywujących Cre w warunkach progresji choroby. Do śledzenia linii SMC w miażdżycy, indukowany tamoksyfenem transgen Myh11-Cre/ERT2 związany z reporterami fluorescencyjnymi (eYFP7,15,17,18,21, mTmG19,25, Confetti20,22,23 dla badań nad ekspansją klonalną) wykazał niezwykłą skuteczność i specyficzność w znakowaniu SMC i został wykorzystany do mapowania losów populacji SMC w zmianach miażdżycowych w ostatnich badaniach. Co ważne, badania te wykazały, że: 1) 80% SMC w zaawansowanych zmianach miażdżycowych nie wykazuje ekspresji żadnych konwencjonalnych markerów SMC (ACTA2, MYH11) stosowanych w analizie immunohistologicznej, a zatem zostałoby błędnie zidentyfikowane bez śledzenia linii17; 2) podzbiory markerów ekspresji SMC alternatywnych typów komórek, w tym markery makrofagów lub markery mezenchymalnych komórek macierzystych16,17,19; oraz 3) SMC inwestuje i wypełnia zmianę miażdżycową poprzez ekspansję oligoklonalną, a klony SMC zachowują plastyczność, aby przejść do fenotypowo różnych populacji20,23. Podsumowując, jest teraz jasne, że komórki mięśni gładkich wykazują niezwykłą różnorodność fenotypową w zmianach miażdżycowych i mogą odgrywać korzystną lub szkodliwą rolę w patogenezie zmian w zależności od charakteru ich przemian fenotypowych. Odkrycia te stanowią niezwykłą nową drogę terapeutyczną ukierunkowaną na przemiany fenotypowe promujące miażdżycę SMC w późnym stadium miażdżycy.

Niniejszym proponujemy ustandaryzowany protokół analizy zmian miażdżycowych w późnym stadium u myszy, w tym systematyczne metody selekcji zwierząt, osadzania, cięcia, barwienia i kwantyfikacji zmian w tętnicy ramienno-głowowej. Aby określić wpływ inhibicji interleukiny-1β na los i fenotyp SMC, użyliśmy myszy śledzących linię SMC ApoE-/- karmionych zachodnią dietą przez 18 tygodni przed otrzymaniem cotygodniowych wstrzyknięć przeciwciała anty-IL1β lub kontroli IgG dopasowanej izotypem.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hodowla, postępowanie i procedury dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez University of Virginia i University of Pittsburgh Institutional Animal Care and Use Committee.

1. Generacja myszy śledzących pochodzenie SMC

  1. Krzyżuj samce Myh11-Cre/ERT228 (Jackson Laboratory; #019079) z samicami R26R-EYFP (Jackson Laboratory; #006148), aby uzyskać samce Myh11-Cre/ERT2+ R26R-EYFP+/+.
  2. Hoduj samce Myh11-Cre/ERT2+ R26R-EYFP+/+ z samicami myszy ApoE-/- (laboratorium Jacksona; #002052). Krzyżuj potomstwo i wybierz przez genotypowanie Myh11-Cre/ERT2+ R26R-EYFP+/+ ApoE-/- samce i R26R-EYFP+/+ ApoE-/- samice myszy jako ostateczne rozrodczynie. Obetnij ogony i wykonaj genotypowanie na rodzeństwie z miotu. Wszystkie myszy płci męskiej powinny mieć Myh11-Cre/ERT2+ R26R-EYFP+/+ ApoE-/- i mogą być używane jako myszy eksperymentalne (Rysunek 1A).
    UWAGA: Protokoły genotypowania można znaleźć na stronie internetowej Jackson Laboratory. Transgen Myh11 Cre/ERT2 znajduje się na chromosomie Y, co wyklucza stosowanie go u kobiet. Można stosować inne systemy śledzenia linii, ale ten system jest jak dotąd najbardziej niezawodną strategią śledzenia linii do mapowania losu SMC w miażdżycy.

2. Dieta i leczenie myszy śledzące linię komórek mięśni gładkich

  1. Niech samce myszy Myh11-Cre / ERT2 + R26R-EYFP +/+ ApoE-/- otrzymają serię zastrzyków 1 mg tamoksyfenu w wieku od sześciu do ośmiu tygodni, aby trwale oznaczyć Myh11 + SMC YFP i śledzić ich los (Rysunek 1A).
    1. Rozgrzej olej arachidowy w temperaturze 55 °C.
    2. Dodać tamoksyfen do podgrzanego oleju arachidowego, aby przygotować roztwór o stężeniu 10 mg/ml i inkubować w temperaturze 55 °C aż do całkowitego rozpuszczenia tamoksyfenu.
    3. Wykonać wstrzyknięcie dootrzewnowe z 0,1 ml roztworu tamoksyfenu 10 mg/ml w serii dziesięciu wstrzyknięć przez dwa tygodnie.
      UWAGA: Tamoksyfen stanowi zagrożenie biologiczne i należy obchodzić się z nim ostrożnie.
  2. Pięć do siedmiu dni po ostatnim wstrzyknięciu tamoksyfenu, zastąp dietę karm dietą wysokotłuszczową (np. dieta zachodnia; 42% kcal z tłuszczu; 0,2% cholesterolu całkowitego) przez okres 18 tygodni, aby umożliwić rozwój zaawansowanych zmian miażdżycowych, które konsekwentnie rozwijają się w wielu łożyskach naczyniowych, w tym w łuku aorty, korzeniu aorty, tętnicy ramienno-głowowej i aorcie brzusznej.
  3. Po 18 tygodniach karmienia dietą wysokotłuszczową rozpocznij interwencję terapeutyczną przez pożądany czas (Rysunek 1B).
    UWAGA: Na przykład wykonywaliśmy cotygodniowe wstrzyknięcia dootrzewnowe z przeciwciałem anty-IL1β lub kontrolą IgG dopasowaną izotypowo między 18 a 26 tygodniem diety wysokotłuszczowej.
  4. Usuń pokarm szybkim myszom na 8 do 16 godzin przed pobraniem tkanek, aby wykonać dokładne odczyty stężenia cholesterolu i trójglicerydów w osoczu.

3. Pobieranie tętnicy ramieniowo-głowowej (BCA)

  1. Eutanazja zwierząt powinna być zgodna z wymogami i przepisami Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania (ACUC). Poddaj eutanazji myszy eksperymentalne przez uduszenie CO2 przez około 5 minut i zweryfikuj śmierć przez uszczypnięcie palca u nogi.
  2. Zważ mysz i zbierz krew.
    1. Zważ mysz
    2. Spryskaj brzuszną stronę myszy 70% etanolem
    3. Wykonać nakłucie serca, wprowadzając igłę 25G podłączoną do strzykawki o pojemności 1 ml w komorze z lewej strony jamy klatki piersiowej. Można pobrać od 0,1 do 1 ml krwi.
    4. Przenieś krew do probówki próżniowej EDTA, przepłukując strzykawkę i umieść probówkę na wahaczu lub rotatorze na 10-15 minut.
    5. Przenieść krew do probówki o pojemności 1,5 ml i odwirować przez 10 minut 250 x g w temperaturze 4 °C. Ostrożnie pobrać górną fazę osocza za pomocą pipety i odpowiednich końcówek i przenieść do nowej probówki. Przechowywać w temperaturze -20 °C przed pomiarem cholesterolu i trójglicerydów.
      UWAGA: Krew pełna może być wykorzystana do dodatkowych badań, w tym morfologii krwi i innych składników krwi, w tym cytokin lub profilowania komórek odpornościowych.
  3. Wykonaj nacięcie o długości około 2 cm w skórze w środkowej części brzucha za pomocą nożyczek i pociągnij skórę, aby odsłonić jamę brzuszną. Przeciąć otrzewną aż do mostka, nie uszkadzając tkanek. Wykonaj dwa nacięcia na linii środkowej pachy przez klatkę piersiową, uważając, aby nie uszkodzić serca i płuc.
  4. Podnieś mostek pęsetą i przetnij przeponę, aby częściowo odsłonić serce. Jeśli serce nie jest łatwo dostępne, odetnij klatkę piersiową na tyle, aby dotrzeć do prawego przedsionka.
  5. Uruchom mysz za pomocą systemu perfuzji grawitacyjnej (Rysunek 2A). Zainstaluj system perfuzji grawitacyjnej w taki sposób, aby ciśnienie płynu perfuzyjnego było równoważne średniemu ciśnieniu krwi myszy (Rysunek 2B). System ten pozwala na spójność perfuzji i zarówno utrzymuje morfologię naczynia, jak i wypłukuje czerwone krwinki.
    UWAGA: Dla porównania, myszy C57Bl6 mają fizjologiczne ciśnienie krwi między 120 mmHg (średnie skurczowe ciśnienie krwi) a 70 mmHg (średnie rozkurczowe ciśnienie krwi)29,30. Średnie skurczowe i rozkurczowe ciśnienie krwi może się różnić w zależności od tła genetycznego myszy.
    1. Podłącz igłę motylkową 23 lub 25G do systemu perfuzji grawitacyjnej i przeprowadź przez igłę sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), aby usunąć powietrze z probówek. Wprowadzić igłę do lewej komory i zamocować igłę na miejscu. Za pomocą nożyczek do tęczówki wykonaj małe nacięcie (< 2 mm) w prawym przedsionku lub aorcie wstępującej.
    2. Uformować perfuzję z 5 ml PBS, następnie 10 ml 4% roztworu paraformaldehydu (PFA), a następnie 5 ml PBS. Stosować zarówno PBS, jak i 4% roztwór PFA w temperaturze otoczenia.
    3. Zebrać interesujące tkanki (np. wątrobę, płuca, śledzionę) i umieścić je w 4% roztworze PFA.
  6. Uwidocznij BCA
    1. Oczyść obszar szyi, usuwając skórę i gruczoły ślinowe.
    2. Wykonaj jedno cięcie w dół linii środkowej mostka przez manubrium za pomocą nożyczek. Uważaj, aby nożyczki trzymały się blisko tylnej części mostka, aby uniknąć uszkodzenia naczyń krwionośnych znajdujących się tuż pod mostkiem. Pociągnij obie strony klatki piersiowej kleszczami, aby całkowicie otworzyć jamę klatki piersiowej. Tętnice szyjne powinny być częściowo widoczne.
    3. Oczyść, ciągnąc mięśnie i tkankę łączną oraz usuwając tłuszcz za pomocą cienkiej pęsety, aż prawa tętnica szyjna, tętnica ramienno-głowowa, rozwidlenie podobojczykowe i łuk aorty zostaną oczyszczone i odizolowane od otaczającej tkanki łącznej i tłuszczu (Rysunek 2C).
  7. Usuń BCA
    1. Za pomocą kleszczy chwyć prawą tętnicę szyjną poniżej jej rozwidlenia i wykonaj wstępne cięcie nad kleszczami (Rysunek 2D).
    2. Wciąż trzymając tętnicę szyjną, wykonaj drugie przecięcie przez tętnicę podobojczykową. Ostatnie dwa cięcia przebiegają przez łuk aorty, po obu stronach tętnicy ramienno-głowowej (Ryc. 2D).
    3. Zbierz inne interesujące tkanki naczyniowe (np. aortę brzuszną, górną część serca zawierającą korzeń aorty).
    4. Umieść BCA i inne tkanki w 4% roztworze PFA na noc w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Czas utrwalenia powinien być spójny przez cały czas trwania badania.

4. Przetwarzanie i cięcie tkanek

  1. Usuń tkankę z 4% PFA i umieść w oznakowanej kasecie na chusteczki (Rysunek 3A). Użyj piankowych podkładek w kasecie, aby upewnić się, że tkanka zachowa swoją orientację i pozostanie w kasecie przez cały etap przetwarzania (Rysunek 3B). Zamknij kasety i zanurz w 70% etanolu do czasu obróbki tkanek (24 do 72 godzin).
    1. Przetwarzaj BCA i inne tkanki pobrane do barwienia histologicznego i immunofluorescencyjnego w następujący sposób (przykład rutynowej procedury nocnej przy użyciu procesora z penetracją próżniową): 10% neutralna buforowana formalina przez 30 min w temperaturze otoczenia (2x), 75% etanol przez 60 min w temperaturze 30 °C (1x), 90% etanol przez 60 min w 30 °C (1x), 95% etanol przez 60 min w 30 °C (1x), 100% etanol przez 60 min w 30 °C (3x), ksylen przez 60 min w 30 °C (3x), a parafina wosk przez 80 min w 62 °C (3x).
  2. Osadź BCA pionowo, tak aby łuk aorty znajdował się najbliżej powierzchni bloku (Rysunek 3C).
  3. Przeciąć blok parafiny na obrotowym mikrotomie (o grubości 10 μm) aż do dotarcia do osadzonej tkanki.
  4. Gdy tkanka jest widoczna, zbadaj wycinek pod mikroskopem, aby określić pozycję. Jeśli łuk aorty jest nadal widoczny, usuń jednorazowo do dziesięciu odcinków 10 μm, badając odcinek w każdym odstępie.
  5. Gdy łuk aorty zostanie przecięty i widoczna jest tętnica ramienno-głowowa, dostosuj orientację bloku, aby ustawić tkankę całkowicie prostopadle do ostrza mikrotomu.
  6. Wytnij BCA o grubości przekroju 10 μm. W tym momencie wszystkie sekcje są zbierane szeregowo z trzema sekcjami na slajd. Zbieraj aż do osiągnięcia rozwidlenia podobojczykowego (Rysunek 3D).
    UWAGA: Ważne jest, aby ciąć BCA o grubości przekroju 10 μm w celu późniejszej akwizycji obrazu konfokalnego ze stosem z i zliczania pojedynczych komórek. Grubość ta pozwoli na rygorystyczną i niewspółtworzącą ocenę związku między pojedynczym jądrem a barwieniem cytoplazmatycznym lub błonowym na głębokości przekroju poprzecznego.

5. Barwienie immunofluorescencyjne

UWAGA: Pełna charakterystyka zmian miażdżycowych obejmuje ocenę parametrów morfologicznych i wskaźników stabilności lub niestabilności płytki miażdżycowej oraz składu komórkowego, które nie będą przedmiotem niniejszego protokołu. Morfologia zmian, zawartość kolagenu i krwotok śródnazębny mogą być analizowane za pomocą Movat7,17, PicroSirius Red 7,31, Ter119 barwienie 7,18, odpowiednio. W tym miejscu opiszemy protokół analizy składu komórkowego zmian chorobowych.

  1. Inkubować szkiełka w następujących roztworach w temperaturze pokojowej pod kapturem chemicznym: ksylen przez 5 min (2x), 100% etanol przez 5 min (2x), 95% etanol przez 5 min (2x), 70% etanol przez 5 min (2x) i dejonizowany H2O (diH2O) przez 5 min (2x).
  2. Inkubować szkiełka w roztworze do pobierania antygenu zgodnie z instrukcją producenta.
    1. Roztworem demaskującym antygen na bazie kwasu cytrynowego (patrz Tabela materiałów) rozcieńczyć 3 ml roztworu w 320 ml diH2O. Umieścić szkiełka w zbiorniku barwiącym i napełnić do góry przygotowanym roztworem do pobierania antygenu.
    2. Wypełnij puste szczeliny w stojaku na prowadnice pustymi prowadnicami, aby zapewnić równomierne ogrzewanie. Przykryj pojemnik pokrywką, aby roztwór do pobierania antygenu mógł się zagotować bez parowania.
    3. Podgrzej szkiełka w kuchence mikrofalowej przez 20 minut z mocą około 675-700 watów. Regularnie sprawdzaj szkiełka i zastępuj odparowaną ciecz diH2O, tak aby sekcje pozostały przez cały czas zanurzone w roztworze demaskującym.
    4. Pozostawić szkiełka do ostygnięcia w roztworze przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  3. Rozpuścić 6 g żelatyny ze skór ryb (FSG) w 1 l PBS. PBS/FSG jest używany jako bufor myjący. Przygotować blokujący roztwór 10% normalnej surowicy w PBS/FSG.
    UWAGA: Żelatyna ze skóry ryb jest używana do przygotowania buforu blokującego. FSG nie zawiera białek surowicy, które mogą reagować krzyżowo z przeciwciałami ssaków, minimalizując szum tła. Jednak inna opcja blokowania powinna być preferowana w przypadku systemów wykrywania biotyny, ponieważ FSG zawiera endogenną biotynę. Rodzaj użytej normalnej surowicy opiera się na zastosowanym przeciwciałie drugorzędowym. W przypadku stosowania przeciwciał drugorzędowych osła, do blokowania i rozcieńczania przeciwciał należy wybrać normalną surowicę końską.
  4. Inkubować szkiełka w PBS przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Zakreśl skrawki tkanek za pomocą hydrofobowego pisaka. Przykryj skrawki buforem blokującym PBS/FSG/normalną surowicą przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Przygotuj pierwszorzędowy roztwór przeciwciała w PBS/FSG/normalnej surowicy podczas tego etapu, gdy tkanki są zablokowane.
  5. Inkubować z pierwszorzędowymi przeciwciałami rozcieńczonymi w PBS/FSG/normalnej surowicy przez noc w temperaturze 4 °C w komorze wilgotnościowej. Jedna sekcja na szkiełko powinna być inkubowana z mieszanką przeciwciał kontrolnych IgG w tym samym stężeniu, co przeciwciała pierwszorzędowe w celu kontroli swoistości przeciwciał pierwszorzędowych.
  6. Umyj szkiełka w następujący sposób w temperaturze pokojowej: PBS/FSG przez 5 min (3x), następnie PBS przez 5 min (1x).
  7. Inkubować z przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z fluoroforem (patrz tabela materiałów) i diamidyno-2-fenyloindolem (DAPI) do barwienia przeciwstawnego jądra, rozcieńczonym w PBS/FSG/normalnej surowicy przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Chroń slajdy przed światłem.
  8. Umyj szkiełka zgodnie z opisem w kroku 5.6.
  9. Zamontuj szkiełka za pomocą nośników montażowych odpowiednich do fluorescencji (patrz Tabela materiałów).

6. Mikroskopia konfokalna

UWAGA: Użycie mikroskopu konfokalnego i akwizycji z-stack jest kluczowe dla liczenia pojedynczych komórek.

  1. Ustaw parametry akwizycji, które będą używane przez całe badanie: rozdzielczość obrazu (1024x1024 lub 2048x2048 pikseli); Droga optyczna i liczba kanałów, które są funkcją wybranej kombinacji przeciwciał drugorzędowych; szybkość skanowania (zalecana prędkość skanowania: 7-8); i kanał różnicowego kontrastu interferencyjnego (DIC).
  2. Używając skrawków wybarwionych przeciwciałami pierwszorzędowymi i kontrolą IgG, ustaw czułość detektora, moc lasera i przesunięcie dla każdego kanału z osobna. Kontrola IgG służy do minimalizacji sygnału tła.
  3. Ustaw górną i dolną pozycję do akwizycji z-stack. Określ z góry grubość i liczbę stosów do zdobycia. Parametry te powinny pozostać spójne przez cały czas trwania badania.
    UWAGA: Zalecamy obrazowanie od 8 do 10 stosów o grubości 1 μm. Zachowaj spójność w liczbie stosów zobrazowanych w całym badaniu.
  4. Obrazowanie skrawków tkanek wybarwionych pierwszorzędowymi przeciwciałami i kontrolą IgG dla wszystkich kanałów, w tym DIC.
  5. Oznacz co najmniej jeden obraz paskiem skali w celu kalibracji obrazu podczas zliczania pojedynczych komórek.

7. Liczenie pojedynczych komórek

  1. Zainstaluj i otwórz ImageJ. W razie potrzeby pobierz wtyczki w sekcji Pobieranie > Wejście/Wyjście strony internetowej ImageJ, aby otworzyć plik obrazu wygenerowany w zależności od formatu obrazów generowanych przez mikroskop konfokalny.
  2. Otwórz plik obrazu w ImageJ.
  3. Skalibruj obraz za pomocą referencyjnego paska skali, korzystając z obrazu wygenerowanego w 6.6.
  4. Wyznacz obszar zainteresowania, w którym będzie wykonywane zliczanie pojedynczych komórek za pomocą kanału DIC (Rysunek 4).
    UWAGA: Jednocześnie można wyznaczyć jeden region. W zależności od pytań doświadczalnych, zliczanie pojedynczych komórek może być przeprowadzone w całym obszarze zmiany (patrz 7.3.1) i/lub w podlokalizacji zmiany. Na przykład badanie obszaru czapeczki włóknistej (patrz 7.3.2) jest szczególnie istotne, ponieważ jej skład komórkowy jest ważnym wskaźnikiem skłonności zmiany do pękania.
    1. Zaznacz obszar zmiany, podążając za granicą światła (Rysunek 4A; białe strzałki) i wewnętrzną elastyczną blaszką (Rysunek 4A; żółte strzałki) widoczne na obrazie DIC.
    2. W celu analizy obszaru czapeczki włóknistej należy określić granicę odległą od światła w odległości 30 μm i prześledzić granicę ( Rysunek 4B-D).
      UWAGA: Obszar czapeczki włóknistej jest klasycznie zdefiniowany jako region wzbogacony w komórki ACTA2+ i kolagen leżący u podstaw światła (Rysunek 4B). Wzbogacenie w komórki ACTA2+ i kolagen odgrywa kluczową rolę w stabilności zmian. Wcześniejsze badania wykazały, że obszar włóknistej czapeczki bogatej w komórki ACTA2 + ma średnią grubość 30 μm od światła u myszy ApoE-/- śledzących linię SMC karmionych dietą wysokotłuszczową przez 18 do 26 tygodni (Figura 4C). W związku z tym niezwykle istotna jest skrupulatna charakterystyka wpływu manipulacji genetycznej lub leczenia farmakologicznego na skład komórkowy obszaru czapeczki włóknistej.
  5. Otwórz panel Narzędzia kanałów (Obraz > Kolor > Narzędzia kanałów) i pokoloruj pseudo-kolorowe różne kanały barwienia (Rysunek 5A; ramka 1).
  6. Scal kanały kolorów (Obraz > Kolor > Scal kolory) (Rysunek 5A; pole 2). Wszystkie kanały powinny być widoczne na tym samym obrazie (Rysunek 5B). Włączanie i wyłączanie poszczególnych kanałów kolorów za pomocą panelu Narzędzia kanałów (Rysunek 5A; ramka 1).
  7. Skonfiguruj narzędzie do liczenia.
    1. Kliknij prawym przyciskiem myszy ikonę Liczenie na pasku narzędzi (Rysunek 5C; pole 1) i wybierz Narzędzie Wielopunktowe.
    2. Kliknij dwukrotnie tę samą ikonę, aby otworzyć panel narzędzi punktowych (Rysunek 5C; ramka 2).
    3. Wybierz typ i rozmiar elementów używanych do zliczania komórek.
    4. Zaznacz opcję Pokaż wszystko.
  8. Włącz tylko kanał DAPI w panelu Narzędzia kanałów i wybierz kanał licznika 0 (Rysunek 5C; ramka 3). Kliknij na poszczególne jądra, które zostaną oznaczone (np. żółte kropki w Rysunek 5C-D). Przewiń stosy z, aby policzyć wszystkie jądra barwione w obszarze zainteresowania. Liczba zdarzeń jest wskazana poniżej kanału licznika w panelu Narzędzie punktu (Rysunek 5C; ramka 4).
  9. Włącz inny kanał barwienia (np. barwienie eYFP). Wybierz kanał licznika 1. Kliknij komórki, w których występuje kolokalizacja między DAPI a barwieniem. Do barwienia cytoplazmatycznego wybierz komórki, które mają barwienie otaczające jądro na całej głębokości jądra (sprawdź kilka stosów z).
  10. Powtórz tę czynność, modyfikując kombinacje barwienia i wybierając nowe kanały licznika, aby policzyć interesujące populacje komórek. Każdy kolor kropki reprezentuje inną populację komórek ( Rysunek 5D). Wyniki można wyrazić jako liczbę komórek do całkowitej liczby DAPI lub liczbę komórek do obszaru regionu.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Myh11-Cre/ERT2 R26R-EYFP Apoe-/- myszom wstrzyknięto tamoksyfen między szóstym a ósmym tygodniem życia, zanim zostały karmione dietą wysokotłuszczową. Po 18 tygodniach karmienia dietą wysokotłuszczową dwie grupy ośmiu myszy były leczone co tydzień mysim przeciwciałem monoklonalnym anty-IL-1β lub kontrolą IgG dopasowaną izotypowo w dawce 10 mg / kg przez 8 tygodni (Rysunek 1)7. Myszy uśmiercono i poddano perfuzji 4% roztworem ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pomimo dziesięcioleci badań i postępu technicznego w badaniu miażdżycy, dziedzina ta ma rozczarowującą historię przekładania wyników naukowych na terapie kliniczne34,35. Zjawisko to można częściowo wyjaśnić rozbieżnościami w modelach zwierzęcych, projektach eksperymentalnych i analizach zmian. W tym miejscu opisujemy eksperymentalny potok, który wykorzystaliśmy do analizy składu komórkowego w zaawansowanych zmianach miażdżycowych przy użyciu myszy śledzących lini...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Centrum Obrazowania Biologicznego (wspierane przez NIH 1S10OD019973-01) na Uniwersytecie w Pittsburghu za pomoc. Praca ta była wspierana przez Scientific Development Grant 15SDG25860021 od American Heart Association do D.G. R.A.B. był wspierany przez grant NIH F30 HL136188.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
16% wodny roztwór paraformaldehyduMikroskopia elektronowa SciencesRT 15710Perfuzja i utrwalanie tkanek
Igła motylkowa 23GFisherBD367342
Igła 25GFisher14-821-13D 
Mikroskop konfokalny A1Mikroskop konfokalnyfirmy Nikon
Przeciwciało ACTA2-FITC (mysz)Sigma AldrichF3777Przeciwciało pierwotne
Alexa-647 przeciw kozieInvitrogenA-21447Przeciwciało wtórne
Antygen Roztwór demaskujący, na bazie kwasu cytrynowegoVector LabsH-3300Roztwór do odzyskiwania antygenu
DietachowHarlan TekladTD.7012
Szkiełko nakrywkoweFisher12-544-14Dowolna szklanka nakrywkowa 50 x 24 mm
DAPI (4',6-Diamidino-2-fenyloindol, dichlorowodorek)InvitrogenD1306Jądro fluorescencyjne przeciwbarwiące
osioł Alexa-488 anty-królikInvitrogenA-21206Przeciwciało wtórne
Donkey Alexa-555 anty-szczuryAbcamab150154Przeciwciało drugorzędowe
DPBS 10X bez wapnia i magnezuGibco14200166PBS do rozcieńczania roztworu i przemywania roztworu. Rozcieńczyć do 1x w wodzie dejonizowanej
Kaseta do zatapianiaFisher15-182-701D Rura
próżniowa ETDAFisher02-685-2B
Etanol 200 proofDecon2701
Podkładka piankowaFisher22-222-012
Żelatyna ze skóry rybzimnowodnych Sigma AldrichG7765
Przeciwciało GFP (koza)abcamab6673Pierwszorzędowe przeciwciało
kozie IgG kontrolaVector LabsI-5000IgG kontrola
Dieta wysokotłuszczowaHarlan TekladTD.88137
ImageJNIHProgram komputerowy https://imagej.nih.gov/ij/ 
Przeciwciało LGALS3 (szczur)CedarlaneCL8942APPrzeciwciało pierwszorzędowe
Mikroskop konfokalny LSM700Mikroskop konfokalnyZeiss
Szkiełka mikroskopowe, Superfrost PlusOstrza12-550-15
Fisher30-538-35
MyszIgG Vector LabsI-2000IgG control
Oprogramowanie do obrazowania elementów NISNikonOprogramowanie do obrazowania do akwizycji obrazu z-stack
Normal Horse surowicaSigma AldrichH1270
Pap PenFisher50-550-221
Olej arachidowySigmaP2144
Prolong gold Antifade mocowanieInvitrogenP36930Medium montażowe 
Kontrola IgG królikaVector LabsI-1000Kontrola IgG
Kontrola IgGSzczura Vector LabsI-4000Kontrola IgG
Przeciwciało RUNX2 (królik)Abcamab192256z przeciwciałem pierwotnym
BD309628Strzykawka 1 ml
TamoksyfenSigmaT5648
KsylenFisherX55K-4
Oprogramowanie do obrazowania ZenOprogramowanie ZeissImaging do akwizycji obrazów z-stack
mikrotomu Fisher kontrola Strzykawka

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. GBD DALYs and HALE Collaborators. Global, regional, and national disability-adjusted life-years (DALYs) for 315 diseases and injuries and healthy life expectancy (HALE), 1990-2015: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2015. Lancet. 388 (10053), 1603-1658 (2016).
  2. Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2018 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 137 (12), 67-92 (2018).
  3. Hay, M., Thomas, D. W., Craighead, J. L., Economides, C., Rosenthal, J. Clinical development success rates for investigational drugs. Nature Biotechnology. 32 (1), 40-51 (2014).
  4. Bhaskar, V., et al. Monoclonal antibodies targeting IL-1 beta reduce biomarkers of atherosclerosis in vitro and inhibit atherosclerotic plaque formation in Apolipoprotein E-deficient mice. Atherosclerosis. 216 (2), 313-320 (2011).
  5. Isoda, K., et al. Lack of interleukin-1 receptor antagonist modulates plaque composition in apolipoprotein E-deficient mice. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 24 (6), 1068-1073 (2004).
  6. Kirii, H., et al. Lack of interleukin-1beta decreases the severity of atherosclerosis in ApoE-deficient mice. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 23 (4), 656-660 (2003).
  7. Gomez, D., et al. Interleukin-1β has atheroprotective effects in advanced atherosclerotic lesions of mice. Nature Medicine. 24, 1418-1429 (2018).
  8. Daugherty, A., et al. Recommendation on Design, Execution, and Reporting of Animal Atherosclerosis Studies: A Scientific Statement From the American Heart Association. Circulation Research. 121 (6), 53-79 (2017).
  9. Baylis, R. A., Gomez, D., Owens, G. K. Shifting the Focus of Preclinical, Murine Atherosclerosis Studies From Prevention to Late-Stage Intervention. Circulation Research. 120 (5), 775-777 (2017).
  10. Kolodgie, F. D., et al. Pathologic assessment of the vulnerable human coronary plaque. Heart. 90 (12), 1385-1391 (2004).
  11. Virmani, R., Kolodgie, F. D., Burke, A. P., Farb, A., Schwartz, S. M. Lessons from sudden coronary death: a comprehensive morphological classification scheme for atherosclerotic lesions. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 20 (5), 1262-1275 (2000).
  12. Gomez, D., Owens, G. K. Smooth muscle cell phenotypic switching in atherosclerosis. Cardiovascular Research. 95 (2), 156-164 (2012).
  13. Owens, G. K., Kumar, M. S., Wamhoff, B. R. Molecular regulation of vascular smooth muscle cell differentiation in development and disease. Physiological Reviews. 84 (3), 767-801 (2004).
  14. Speer, M. Y., et al. Smooth muscle cells give rise to osteochondrogenic precursors and chondrocytes in calcifying arteries. Circulation Research. 104 (6), 733-741 (2009).
  15. Gomez, D., Shankman, L. S., Nguyen, A. T., Owens, G. K. Detection of histone modifications at specific gene loci in single cells in histological sections. Nature Methods. 10 (2), 171-177 (2013).
  16. Feil, S., et al. Transdifferentiation of vascular smooth muscle cells to macrophage-like cells during atherogenesis. Circulation Research. 115 (7), 662-667 (2014).
  17. Shankman, L. S., et al. KLF4-dependent phenotypic modulation of smooth muscle cells has a key role in atherosclerotic plaque pathogenesis. Nature Medicine. 21, 628(2015).
  18. Cherepanova, O. A., et al. Activation of the pluripotency factor OCT4 in smooth muscle cells is atheroprotective. Nature Medicine. 22, 657(2016).
  19. Albarran-Juarez, J., Kaur, H., Grimm, M., Offermanns, S., Wettschureck, N. Lineage tracing of cells involved in atherosclerosis. Atherosclerosis. 251, 445-453 (2016).
  20. Chappell, J., et al. Extensive Proliferation of a Subset of Differentiated, yet Plastic, Medial Vascular Smooth Muscle Cells Contributes to Neointimal Formation in Mouse Injury and Atherosclerosis Models. Circulation Research. 119 (12), 1313-1323 (2016).
  21. Newman, A. A., et al. Irradiation abolishes smooth muscle investment into vascular lesions in specific vascular beds. JCI Insight. 3 (15), (2018).
  22. Dobnikar, L., et al. Disease-relevant transcriptional signatures identified in individual smooth muscle cells from healthy mouse vessels. Nature Communications. 9 (1), 4567(2018).
  23. Misra, A., et al. Integrin beta3 regulates clonality and fate of smooth muscle-derived atherosclerotic plaque cells. Nature Communications. 9 (1), 2073(2018).
  24. Majesky, M. W., et al. Differentiated Smooth Muscle Cells Generate a Subpopulation of Resident Vascular Progenitor Cells in the Adventitia Regulated by Klf4. Circulation Research. 120 (2), 296-311 (2017).
  25. Herring, B. P., Hoggatt, A. M., Burlak, C., Offermanns, S. Previously differentiated medial vascular smooth muscle cells contribute to neointima formation following vascular injury. Vascular Cell. 6, 21(2014).
  26. Sheikh, A. Q., Misra, A., Rosas, I. O., Adams, R. H., Greif, D. M. Smooth muscle cell progenitors are primed to muscularize in pulmonary hypertension. Science Translational Medicine. 7 (308), (2015).
  27. Bentzon, J. F., Majesky, M. W. Lineage tracking of origin and fate of smooth muscle cells in atherosclerosis. Cardiovascular Research. 114 (4), 492-500 (2018).
  28. Wirth, A., et al. G12-G13-LARG-mediated signaling in vascular smooth muscle is required for salt-induced hypertension. Nature Medicine. 14 (1), 64-68 (2008).
  29. Mattson, D. L. Comparison of arterial blood pressure in different strains of mice. American Journal of Hypertension. 14 (5), Pt 1 405-408 (2001).
  30. Whitesall, S. E., Hoff, J. B., Vollmer, A. P., D'Alecy, L. G. Comparison of simultaneous measurement of mouse systolic arterial blood pressure by radiotelemetry and tail-cuff methods. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286 (6), 2408-2415 (2004).
  31. Durgin, B. G., et al. Smooth muscle cell-specific deletion of Col15a1 unexpectedly leads to impaired development of advanced atherosclerotic lesions. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 312 (5), 943-958 (2017).
  32. Durham, A. L., Speer, M. Y., Scatena, M., Giachelli, C. M., Shanahan, C. M. Role of smooth muscle cells in vascular calcification: implications in atherosclerosis and arterial stiffness. Cardiovascular Research. 114 (4), 590-600 (2018).
  33. Lin, M. E., et al. Runx2 Deletion in Smooth muscle Cells Inhibits Vascular Osteochondrogenesis and Calcification but not Atherosclerotic Lesion Formation. Cardiovascular Research. , (2016).
  34. Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving Bioscience Research Reporting: The ARRIVE Guidelines for Reporting Animal Research. PLoS Biology. 8 (6), 1000412(2010).
  35. Landis, S. C., et al. A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research. Nature. 490 (7419), 187-191 (2012).
  36. Nishioka, T., et al. Contribution of inadequate compensatory enlargement to development of human coronary artery stenosis: An in vivo intravascular ultrasound study. Journal of the American College of Cardiology. 27 (7), 1571-1576 (1996).
  37. Pasterkamp, G., et al. Paradoxical Arterial-Wall Shrinkage May Contribute to Luminal Narrowing of Human Atherosclerotic Femoral Arteries. Circulation. 91 (5), 1444-1449 (1995).
  38. Galkina, E., et al. Lymphocyte recruitment into the aortic wall before and during development of atherosclerosis is partially L-selectin dependent. The Journal of Experimental Medicine. 203 (5), 1273-1282 (2006).
  39. Venegas-Pino, D. E., Banko, N., Khan, M. I., Shi, Y., Werstuck, G. H. Quantitative analysis and characterization of atherosclerotic lesions in the murine aortic sinus. Journal of Visual Experiments. (82), 50933(2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Atherosclerotic Lesion AnalysisSmooth Muscle Cell LineageImmunofluorescent StainingConfocal MicroscopyBrachiocephalic Artery HarvestTissue Sectioning ProtocolSingle Cell CountingImageJ AnalysisIL 1 Beta InhibitionGalectin 3 Positive Cells

Related Articles