Artykuł metodologiczny

Wysokoprzepustowy test do oceny i ilościowego określania tworzenia pułapek zewnątrzkomórkowych w neutrofilach

12.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59150

⸱

29 stycznia 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Nephrology, Leiden University Medical Center

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje wysoce czuły i wysokoprzepustowy test pułapki zewnątrzkomórkowej neutrofili (NET) do półautomatycznego oznaczania ilościowego tworzenia ex vivo NET za pomocą immunofluorescencji trójwymiarowej mikroskopii konfokalnej. Protokół ten może być wykorzystany do oceny powstawania i degradacji NET po różnych bodźcach i może być wykorzystany do badania potencjalnych terapii ukierunkowanych na NET.

Streszczenie

Pułapki zewnątrzkomórkowe (NET) to immunogenne zewnątrzkomórkowe struktury DNA, które mogą być uwalniane przez neutrofile na wiele różnych sposobów. Wykazano, że NET służą jako ważny mechanizm obronny gospodarza, który wyłapuje i zabija mikroorganizmy. Z drugiej strony są one związane z różnymi ogólnoustrojowymi chorobami autoimmunologicznymi. NET są immunogennymi i toksycznymi strukturami, które zawierają pulę odpowiednich autoantygenów, w tym przeciwciała cytoplazmatyczne przeciwko neutrofilom (ANCA), zapalenie naczyń związane (AAV) i toczeń rumieniowaty układowy (SLE). W zależności od bodźca można indukować różne formy NET. Ilość NET można określić ilościowo za pomocą różnych technik, w tym pomiaru uwalniania DNA w supernatantach, pomiaru DNA skompleksowanego z cząsteczkami NET, takimi jak mieloperoksydaza (MPO) lub elastaza neutrofilowa (NE), pomiaru obecności cytrulinowanych histonów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej lub cytometrycznego wykrywania składników NET, z których wszystkie mają różne cechy pod względem ich specyficzności, czułości, obiektywności i ilości. Oto protokół ilościowego określania powstawania NET ex vivo w bardzo czuły i wysokoprzepustowy sposób przy użyciu trójwymiarowej immunofluorescencyjnej mikroskopii konfokalnej. Protokół ten może być stosowany do rozwiązywania różnych pytań badawczych dotyczących powstawania i degradacji NET w zdrowiu i chorobie.

Wprowadzenie

Tworzenie zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili (NET) to proces, w którym neutrofile uwalniają swoje DNA w zewnątrzkomórkowej trójwymiarowej (3D) strukturze przypominającej sieć, skompleksowanej z szeroką gamą przeciwbakteryjnych i niebezpiecznych cząsteczek, granularnych i cytoplazmatycznych enzymów, peptydów i białek. Te immunogenne i toksyczne struktury odgrywają ważną rolę fizjologiczną we wrodzonej obronie immunologicznej zdrowych osób poprzez wychwytywanie i zabijanie zakaźnych patogenów1. Wykazano jednak również, że są one zaangażowane w zakrzepicę2 i różne ogólnoustrojowe choroby autoimmunologiczne, w tym zapalenie naczyń związane z przeciwciałami cytoplazmatycznymi przeciwko neutrofilom (ANCA) (AAV)3, toczeń rumieniowaty układowy (SLE)4,5, zespół antyfosfolipidowy (APS)2,6, reumatoidalne zapalenie stawów (RZS), łuszczyca, oraz Podagryczka7,8,9.

Powstawanie NET in vitro było szeroko badane za pomocą związku chemicznego 12-mirystynianu 13-octanu forbolu (PMA), który indukuje masowe tworzenie NET. Jednak większość bodźców fizjologicznych indukuje znacznie niższy poziom powstawania NET10. Aby zbadać wyzwalacze NET na przykład w przypadku choroby autoimmunologicznej, potrzebny jest standaryzowany, czuły, wysokoprzepustowy test ilościowy do wykrywania i ilościowego określania powstawania NET. Kwantyfikacja NET okazała się trudna i jest obecnie przeprowadzana różnymi metodami, z których każda ma swoje zalety i ograniczenia11. Powszechnie stosowaną metodą jest wykrywanie DNA w supernatantach12, która jest obiektywna, ale nie rozróżnia pochodzenia DNA (apoptotyczne, nekrotyczne, NET), a zatem nie jest bardzo specyficzna dla NETs. Po drugie, testy immunoenzymatyczne (ELISA) DNA skompleksowanego z białkami specyficznymi dla NET, na przykład mieloperoksydazą (MPO) lub elastazą neutrofilową (NE), są bardziej specyficznym podejściem do wykrywania NET i wykazano, że dobrze korelują z cytrulinowanymi NETs dodatnimi histonami-3 (CitH3)13. Nie wiadomo jednak, czy ta metoda jest wystarczająco czuła, aby wychwycić wszystkie sieci NET (np. ujemne sieci MPO, NE i CitH3). Trzecim podejściem jest mikroskopia immunofluorescencyjna, która służy do wykrywania kolokalizacji cząsteczek związanych z NET (NE, MPO, CitH3) z zewnątrzkomórkowym DNA w celu ilościowego określenia NET. Metoda ta jest ogólnie specyficzna dla sieci NET, ale nie może być stosowana jako metoda o wysokiej przepustowości i nie jest obiektywna ze względu na stronniczość obserwatora. Ponadto metoda ta nie uwzględnia ujemnych sieci NET MPO, NE, CitH3, które są często obecne w zależności od użytego NET-trigger14,15. Metody cytometrii przepływowej wykrywają NET poprzez zmienione rozproszenie do przodu/na boki (FSC/SSC) wskazujące na pęcznienie jądra w neutrofilach NET-ting16. Metoda ta nie uwzględnia różnych form powstawania NET, które zostały zidentyfikowane, które mogą nie wiązać się z pęcznieniem jądra, takich jak tworzenie żywotnej sieci NET17. Wreszcie, immunofluorescencyjna mikroskopia konfokalna została zastosowana do wizualizacji i ilościowego określenia powstawania NET poprzez bezpośrednie barwienie zewnątrzkomórkowego DNA nieprzepuszczalnym dla komórek barwnikiem, który barwi zewnątrzkomórkowe DNA12,18. Ogólnie rzecz biorąc, ręcznie wybiera się i ocenia od 5 do 10 pól o dużej mocy, które pokrywają 1-5% każdego dołka 96-dołkowej płytki11,17. Ręczny wybór obrazów nie zawsze jest obiektywny, podatny na stronniczość i nieatrakcyjny dla analizy o wysokiej przepustowości. Niedawno opracowano zautomatyzowany, wysokoprzepustowy test kwantyfikacyjny NET, w ramach którego zobrazowano 11% studni w sposób 3D obejmujący 13 μm za pomocą immunofluorescencyjnej mikroskopii konfokalnej z warstwą Z, co doprowadziło do uzyskania bardzo czułej techniki oceny NET w porównaniu z konwencjonalnymi metodami10. Bieżący raport opisuje najnowszy protokół ilościowego określania powstawania NET za pomocą zautomatyzowanego, bardzo czułego testu przy użyciu mikroskopii konfokalnej 3D, który osiąga całkowitą zobrazowaną powierzchnię 45% każdego dołka i obejmuje 27 μm przez stosy Z. Protokół ten jest odpowiedni do ilościowego określania, z wysoką czułością, niskich poziomów powstawania NET w sposób obiektywny i bezstronny.

Protokół

Wszyscy pacjenci i zdrowi z grupy kontrolnej wyrazili zgodę na udział w biobanku LUMC. Oba badania biobankowe zostały zatwierdzone przez komisję etyczną LUMC.

1. Izolacja zdrowych neutrofili

  1. Uzyskaj 20 ml krwi obwodowej od zdrowego dawcy w dwóch probówkach pokrytych EDTA o pojemności 10 ml.
  2. Umieść 10 ml krwi w sterylnej probówce o pojemności 50 ml i dodaj sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) do 32,5 ml.
  3. Dodaj gradient gęstości (np. Ficoll-amidotrizoaat) pod komórkami.
    1. Pobrać 14 ml gradientu gęstości za pomocą pipety 10 ml i kontrolera pipety.
    2. Umieścić pipetę na dnie probówki o pojemności 50 ml.
    3. Zdjąć kontroler pipety z pipety, pozwalając, aby gradient gęstości wypłynął z pipety grawitacyjnie, aż do osiągnięcia maksimum przez efekt kapilarny (pozostanie 1-2 ml), bez użycia silnika.
    4. Pipetę należy wyjąć, kładąc kciuk na jej wierzchu, zapobiegając w ten sposób wyciekaniu gradientu gęstości podczas wyjmowania pipety.
  4. Obracaj rurki przez 20 minut przy 912 x g i temperaturze pokojowej (RT) bez przyspieszania i hamowania.
    nuta: Czerwone krwinki (RBC) i neutrofile mają dużą gęstość i znajdują się na dnie probówki o pojemności 50 ml. Jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC) są oddzielone i znajdują się na szczycie gradientu gęstości jako biały pierścień. Osocze rozcieńczone PBS będzie znajdować się powyżej PBMC. W razie potrzeby PBMC można wyizolować, przenosząc biały pierścień do nowej probówki o pojemności 50 ml z dodatkowymi etapami płukania PBS.
  5. Ostrożnie usuń najpierw biały pierścień zawierający PBMC, następnie usuń plazmę rozcieńczoną PBS, a na końcu warstwę gradientu gęstości tak bardzo, jak to możliwe.
  6. Aby wyizolować neutrofile z mieszaniny neutrofili/erytrocytów, należy poddać erytrocyty lizie za pomocą zimnej, sterylnej wody destylowanej.
    1. Weź z lodówki zimną, sterylną butelkę na wodę destylowaną i 10x skoncentrowaną kolbę PBS.
    2. Pracuj szybko nad tym krokiem. Dodaj 36 ml zimnej, sterylnej wody destylowanej bezpośrednio na wierzch granulki i dokładnie wymieszaj. Dodaj 4 ml 10x PBS po 20 s, aby uzyskać roztwór izotoniczny. Dokładnie wymieszaj raz.
    3. Wirować rurkę przez 5 minut przy 739 x g i 4 °C (w celu usunięcia erytrocytów). Neutrofile będą znajdować się w białym granule.
    4. Ostrożnie wyrzucić supernatant. Wykonaj ponownie krok 1.6.2 i upewnij się, że pellet jest prawidłowo zawieszony.
    5. Wirować rurkę przez 5 minut w temperaturze 328 x g i 4 °C.
    6. Ostrożnie usunąć sklarowany osad i ponownie zawiesić osad w 5 ml PBS. Policz neutrofile i trzymaj je na lodzie.
      nuta: Oczekiwana wydajność z 1 probówki krwi (10 ml) wynosi około 15-75 milionów neutrofili.

2. Znakowanie neutrofili krwinkami fluorescencyjnymi na czerwono

  1. Wykonać zawiesinę neutrofili 10-20 milionów neutrofili w 2 ml PBS w probówce o pojemności 15 ml.
  2. Przygotować roztwór 2 ml PBS z 4 μl łącznika komórek czerwonej fluorescencji 2 μM (patrz tabela materiałów) w innej probówce o pojemności 15 ml. Dodaj go delikatnie do zawiesiny neutrofili i dokładnie wymieszaj.
  3. Inkubować w ciemności dokładnie przez 25 minut w temperaturze 37 °C, aby oznaczyć neutrofile łącznikiem komórek czerwonej fluorescencji.
  4. Dezaktywuj oznakowanie, dodając pożywkę RPMI 1640 zawierającą 10% inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej (FCS) w temperaturze pokojowej do 15 ml i dokładnie wymieszaj. Upewnij się, że osad jest ostrożnie ponownie zawieszony, jeśli uformował się pellet.
  5. Wiruj rurkę przez 5 minut przy 328 x g i RT.
  6. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 5 ml pożywki RPMI 1640 wolnej od czerwieni fenolowej zawierającej 2% FCS i 10% P/S w temperaturze pokojowej. Policz neutrofile.
    nuta: Utrata komórek o 50% może wystąpić po znakowaniu komórek metodą czerwonej fluorescencji.

3. Indukcja tworzenia pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili

  1. Wykonać zawiesinę komórek 0,42 x 106 komórek/ml w pożywce RPMI 1640 wolnej od czerwieni fenolowej zawierającej 2% FCS i 10% P/S.
  2. Dodaj 37 500 neutrofili w 90 μl na studzienkę w czarnej 96-dołkowej płytce z płaskim dnem.
  3. Dodać 10 μl wybranego bodźca (np. surowicy pacjenta) w trzech egzemplarzach, aby osiągnąć stężenie 10% w studzience. Należy zawsze dołączyć kontrolę ujemną (pożywkę) w trzech egzemplarzach.
  4. Inkubować w ciemności w temperaturze 37 °C przez żądany czas, od 30 minut do 2, 4 lub 6 godzin. Zaleca się inkubację przez 4 godziny.
  5. Obliczyć objętość potrzebną do dodania 25 μl 5 μM nieprzepuszczalnego barwnika DNA (patrz tabela materiałów), aby osiągnąć końcowe stężenie 1 μM w studzience. W razie potrzeby rozcieńczyć wstępnie w pożywce RPMI 1640 zawierającej 2% FCS i 10% P/S, aby uzyskać stężenie 5 μM.
  6. Dodać 25 μl 5 μM nieprzepuszczalnego barwnika DNA na 15 minut przed końcem czasu inkubacji. Kontynuować inkubację przez kolejne 15 minut w temperaturze 37 °C w ciemności.
  7. Usunąć supernatant (~125 μL) bardzo ostrożnie i przechowywać w razie potrzeby. Dodać 100 μl 4% paraformaldehydu (PFA). Trzymaj się w ciemności i natychmiast przejdź do kroku 4.

4. Wizualizacja NET z mikroskopią konfokalną 3D o wysokiej zawartości i wysokiej rozdzielczości

  1. Skonfiguruj ustawienia w immunofluorescencyjnym mikroskopie konfokalnym, klikając Ustawienia akwizycji.
    1. Kliknij kartę Konfiguruj.
    2. Wybierz obiektyw i kamerę. Wybierz obiektyw 10X Apo Lambda z trybem akwizycji konfokalnego otworka 60 μm.
    3. Kliknij na Talerz i wybierz 96-dołkową plastikową płytkę. Wybierz witryny, które chcesz odwiedzić, i wybierz ustaloną liczbę witryn. Wypełnij 3 kolumny i 3 rzędy bez zachodzenia na siebie (0 μm), które pokrywają łącznie 45% studni.
    4. Kliknij Przejęcie. Wybierz opcję Włącz ustawianie ostrości na podstawie lasera. W razie potrzeby wybierz opcję Uzyskaj serię Z/szereg czasowy.
    5. Kliknij Autofokus witryny.
      1. Kliknij Skoncentruj się na dnie płyty | Przesunięty o grubość dna. Aby początkowa studnia znalazła próbkę, wybierz pierwszą zdobytą studnię. Dla autofokusa witryny wybierz wszystkie witryny.
    6. Kliknij Długości fal.
      1. Jako liczbę długości fal wybierz 2. Jako poziom zagęszczenia korekcji cieniowania TL wybierz 2.
      2. W polu Wavelength 1 (Długość fali 1) wybierz opcję Texas Red.
        1. Jako opcje autofokusa wybierz laser z przesunięciem Z, po przesunięciu lasera 1,1 μm. Użyj stosu Z z niestandardowym zakresem 200-10.
      3. W polu Wavelength 2 (Długość fali 2) wybierz opcję FITC.
        1. Jako opcje autofokusa wybierz laser z przesunięciem Z od w1 0 μm. Użyj stosu Z z niestandardowym zakresem 200-10.
        2. Jako opcje akwizycji wybierz Seria Z i maksimum obrazu projekcji 2D. Jako opcje akwizycji wybierz opcję Korekcja cieniowania | Wył.
    7. Wybierz opcję Z Series (Seria Z). Wybierz liczbę kroków: 10. Wybierz rozmiar kroku: 3 μm (całkowity zakres wyniesie 27 μm).
  2. Umieść płytkę w immunofluorescencyjnym mikroskopie konfokalnym.
    1. Kliknij kartę Uruchom.
      1. Wypełnij nazwę i opis tablicy rejestracyjnej i wybierz miejsce przechowywania.
      2. Wybierz studnie, które chcesz zdobyć.
  3. Wybierz czas ekspozycji dla Texas Red i FITC.
  4. Kliknij na Zdobądź Płytę, aby rozpocząć akwizycję, która zajmie około 1 godziny na płytę.

5. Analiza powstawania sieci

  1. Użyj programu do przetwarzania obrazów przeznaczonego do analizy naukowych obrazów wielowymiarowych (patrz Tabela materiałów) do analizy powstawania NET.
  2. Przenieś uzyskane dane obrazu na osobny dysk twardy.
  3. Wybierz narzędzie do dodawania kolorów.
    1. Wybierz w1 i wybierz folder na dysku twardym, w którym przechowywane są dane.
    2. Wybierz w2 i wybierz folder na dysku twardym, w którym przechowywane są dane.
      nuta: Użyj standardowego makra, które używa w1 w nazwie pliku, aby dodać czerwony kolor do obrazów Texas Red i używa w2, aby dodać zielony kolor do obrazów FITC.
  4. Wybierz opcję Makro analizy.
    1. Wybierz w1, wybierz wartość progową (próg intensywności), która zwykle wynosi 10. Wybierz żądaną wartość piksela (próg rozmiaru, np. 100).
    2. Wybierz w2, wybierz wartość progową (próg intensywności), która zwykle wynosi 10. Wybierz żądaną wartość piksela (próg rozmiaru, np. 500).
    3. Wybierz miejsce docelowe dla pliku arkusza kalkulacyjnego, uruchom analizę, a następnie zapisz pliki dziennika.
  5. Analizowanie danych w arkuszu kalkulacyjnym.

Wyniki

Powstawanie pozakomórkowych pułapek neutrofilowych (NET) jest ilościowo określane w sposób trójwymiarowy poprzez pomiar barwionego pozakomórkowego DNA w 10 płaszczyznach Z-stack z odstępem 3 µm, zaczynając od płaszczyzny ogniskowej w każdej studni. Dzięki pomiarowi powierzchni skumulowanej zwiększa się czułość testu (Rycina 1A). Izolowane neutrofile mają średnią czystość na poziomie 98,7% z odchyleniem standardowym (SD) wynoszącym 1,10%, zmierzoną w 14 różnych próbkach z różnych izolacji. Średni procent erytrocytów wynosi 1,04% ± 1,1% SD, a średni procent monocytów to 0,085% ± 0,17% SD (dane nie zostały przedstawione). Całkowita powierzchnia obrazowanych barwionych neutrofili jest ilościowo określana wyłącznie w płaszczyźnie ogniskowej w każdej studni, co istotnie koreluje z całkowitą liczbą neutrofili w każdej studni, przy współczynniku korelacji Pearsona wynoszącym 0,99 (95% przedział ufności [CI] 0,985-0,997, p < 0,0001) (Rycina 1B). Reprezentatywny wynik ilościowego określenia powstawania NET w neutrofilach stymulowanych 10% surowicą pacjentów z AAV lub medium (MED) jako kontrolą ujemną, wyrażony jako skumulowana powierzchnia barwionego pozakomórkowego DNA w 10 płaszczyznach Z-stack na obrazowany neutrofil (Rycina 1C). Przedstawiono migawki reprezentatywnych obrazów niestymulowanych neutrofili (Rycina 2A) oraz NET w neutrofilach stymulowanych AAV (Rycina 2B).

Skumulowana powierzchnia DNA w funkcji stosów Z, wykres rozrzutu powierzchni komórki w funkcji liczby komórek, analiza wykresu słupkowego powierzchni DNA/komórki.
Rysunek 1: Ilościowe określenie tworzenia NET poprzez pomiar zewnątrzkomórkowego DNA i liczby neutrofili. (A) Powierzchnia została skwantyfikowana skumulowanie w 10 stosach Z dla każdej studni dla neutrofili niestymulowanych (MED) oraz dla neutrofili stymulowanych 10% surowicą pacjentów z zapaleniem naczyń związanym z ANCA (AAV) (n = 4) przy użyciu programu do przetwarzania obrazów. Każdy bodziec testowano w trzech powtórzeniach, każdy punkt reprezentuje wartość mediany. (B) Powierzchnia komórek znakowanych czerwoną fluorescencją oraz liczba komórek zostały skwantyfikowane w płaszczyźnie ogniskowej każdej studni przez program do przetwarzania obrazów (R2 = 0,99, p < 0,0001). (C) Tworzenie NET wyrażono jako skumulowaną powierzchnię na jeden obrazowany neutrofil (powierzchnia komórki). Wykreślono średnią ± błąd standardowy średniej (SEM) dla każdego powtórzenia w zależności od bodźca. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej przedstawiające test żywotności komórek z czerwonymi i zielonymi markerami do analizy.
Rycina 2: Zrzuty ekranu z analizy ilościowej NET. Neutrofile znakowane fluorescencyjnie przedstawiono na czerwono, a barwione zewnątrzkomórkowe DNA na zielono. Obiektyw 10x Plan Apo Lambda. (A) Neutrofile niestymulowane. (B) Neutrofile stymulowane surowicą AAV. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Najbardziej krytyczną częścią tego testu jest konieczność użycia świeżo wyizolowanych neutrofili w każdym eksperymencie, ponieważ neutrofile są krótkotrwałe i giną po zamrożeniu. Wymaga to za każdym razem zdrowego dawcy, co może wiązać się z pewnymi zmianami wynikającymi z cech dawcy. Jedną z tych różnic jest stan aktywacji neutrofili. Neutrofile mogą być aktywowane już in vivo przed izolacją. Ponadto neutrofile mogą być aktywowane na wszystkich etapach izolacji, zwłaszcza podczas lizy erytrocytów, dlatego wymagany jest doświadczony opiekun neutrofili, aby zminimalizować aktywację neutrofili. Ogólnie rzecz biorąc, izolację neutrofili należy przeprowadzić jak najszybciej po pobraniu krwi, a eksperyment nie powinien być przerywany, aby uniknąć nadmiernej spontanicznej aktywacji. Po drugie, należy unikać nieostrożnego obchodzenia się z neutrofilami. W związku z tym godną uwagi zaletą opisanego protokołu jest minimalna liczba interwencji w pipetowanie po zasianiu neutrofili na 96-dołkowej płytce. Co ważne, stan aktywacji neutrofili najlepiej ocenia się w stanie niestymulowanym, w którym test ten może z czułością wykryć niski poziom tworzenia NET. Innym czynnikiem, który może mieć wpływ na test, jest zastosowanie FCS w pożywce. Odsetek FCS został zmniejszony z 10% do 2%, aby uniknąć możliwego zahamowania tworzenia NET przez aktywność przeciwutleniającą19,20 lub możliwej aktywacji neutrofili pomimo inaktywacji cieplnej. Nie próbowano hodowli bez FCS lub z użyciem różnych rodzajów pożywek. Podczas wykonywania testu zawsze zabiera się niestymulowaną lub pożywkę kontrolną, aby wskazać sygnał tła (np. stan aktywacji neutrofili). Wzrost krotności dla każdego bodźca w porównaniu z próbką niestymulowaną jest wyświetlany w celu osiągnięcia spójnych wyników w różnych eksperymentach z użyciem tego samego bodźca.

Ważnym czynnikiem dla możliwego wysokiego tła jest barwienie zewnątrzkomórkowego DNA, które nie jest związane z procesem tworzenia NET. Niniejszy test ma na celu zmniejszenie tego zjawiska poprzez usunięcie zewnątrzkomórkowego barwienia DNA natychmiast po krótkim okresie inkubacji wynoszącym 15 minut oraz poprzez analizę płytki bezpośrednio po utrwaleniu. Dlatego ważne jest, aby użyć zaawansowanego mikroskopu konfokalnego, który ma wystarczającą prędkość i moc analityczną, aby uchwycić 96-dołkową płytkę w ciągu 1 do 2 godzin. Zalecane jest automatyczne ustawienie czasu naświetlania i ostrości. W związku z tym ustawienie mikroskopu może się różnić w zależności od próbki i eksperymentu w odniesieniu do progu intensywności koloru, który jest niezbędny do uzyskania optymalnej jakości obrazu. To ostatnie wpływa na ostateczną zdolność do prawidłowego oznaczania ilościowego neutrofili i NET, dlatego optymalne ustawienie powinno zostać potwierdzone przy użyciu wielu próbek kontrolnych (np. surowicy zdrowych osób z grupy kontrolnej). Podczas analizy przechwyconych obrazów, zastosowanie progu pikseli i progu rozmiaru w programie do analizy pozwala na lepszy wybór formacji NET.

Zewnątrzkomórkowe DNA pochodzące z tworzenia NET może być wynikiem różnych ścieżek śmierci, w tym NETozy, nekroptozy, pyroptozy, ferroptozy, a nawet nielitycznego procesu tworzenia się niezbędnej NET1. W związku z tym ograniczeniem niniejszego testu jest to, że barwienie tylko dla zewnątrzkomórkowego DNA nie jest możliwe różnicowanie między tworzeniem NET a innymi istotnymi szlakami śmierci komórki. Możliwe jest osiągnięcie tego poprzez zastosowanie selektywnych inhibitorów różnych szlaków śmierci w celu rozróżnienia różnych form leżących u podstaw powstawania NET lub potwierdzenia przez oddzielne barwienia immunologiczne obecności specyficznych markerów NET, takich jak citH3 i NE, zlokalizowanych jednocześnie z DNA. Kolokalizacja zewnątrzkomórkowego DNA z citH3 i NE została niedawno potwierdzona dla tego testu10. Zaletą unikania markerów specyficznych dla NET w tym teście jest to, co pozwala ocenić wszystkie formy powstawania NET prowadzące do ekstruzji DNA przez neutrofile w sposób jak najbardziej kompletny i obiektywny, z potencjałem wysokoprzepustowych badań przesiewowych. Przydatność tego protokołu wykazano w badaniu niskiego poziomu indukcji NET za pośrednictwem kompleksów immunologicznych w chorobie autoimmunologicznej, w której zdolność do wykrywania różnic jakościowych i ilościowych może być ważniejsza niż rodzaj zaangażowanego procesu 10,21,22. To pokazuje, że ten nowatorski test kwantyfikacyjny NET może stanowić wartość dodaną dla różnych badaczy w celu zbadania różnych aspektów powstawania NET. Niewielkie korekty w teście można łatwo wdrożyć: dostosowanie okresu stymulacji, użycie ulubionego markera NET w celu skupienia się na jednej konkretnej ścieżce śmierci prowadzącej do powstania NET, zastosowanie innego powiększenia lub zastosowanie różnych kryteriów NET w kwantyfikacji i analizie.

Podsumowując, dostarczony protokół jest wysoce czułym, szeroko stosowanym testem do półautomatycznego oznaczania ilościowego powstawania NET w celu oceny indukcji ex vivo NET pod wpływem różnych bodźców.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Praca Eline J. Arends i Y.K. Onno Teng jest wspierana przez Holenderską Fundację Nerek (17OKG04), Clinical Fellowship od Holenderskiej Organizacji Badań Naukowych (90713460). Praca Laury S. van Dam jest wspierana przez Fundację Badań nad Reumatologią (FOREUM).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Aqua Sterile H2OB. Braun, Melsungen, Niemcy12604052
Płodowa surowica bydlęca (FCS)Bodinco, Alkmaar, HolandiaStosowany w wysokich stężeniach może wpływać na tworzenie SIATKI
Ficoll 5,7% - amidotrizoaat o gęstości 9% 1,077 g/mlLUMC, Leiden, Holandia97902861
Immunofluorescencyjny mikroskopkonfokalnyImage Xpress Micro Confocal (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)
Neutralizacja PBS (10x)Gibco, Paisley, Wielka Brytania70011-036
Penicylina/streptomycyna (p/s)Gibco, Paisley, Wielka Brytania15070063
Wolny od czerwieni fenolowej RPMI 1640 (1x)Gibco, Paisley, Wielka Brytania11835-063Czerwień fenolowa może zakłócać sygnał immunofluorescencyjny
Bufor fosforanowy sól fizjologiczna (PBS)B. Braun, Melsungen, Niemcy174628062
PKH26 2 μ M Łącznik komórek fluorescencyjnych RedSigma Aldrich Saint-Louis, MO, USAPKH26GL-1KTPKH to opatentowane barwniki fluorescencyjne i technologia znakowania komórek nazwana na cześć ich odkrywcy Paula Karla Horana
Program do naukowej analizy obrazów wielowymiarowychImageJ, Oddział Usług Badawczych, Narodowy Instytut Zdrowia Psychicznego, Bethesda, Maryland, USA
RPMI medium 1640 (1x)Gibco, Paisley, Wielka Brytania52400-025
Sytox green 5 mM Nieprzepuszczalny barwnik DNAGibco, Paisley, Wielka Brytania57020
Trypanowa niebieska plama 0,4%Sigma Aldrich, Niemcy17942E
96 studzienka,, płaskie dno, płytka poddana kulturze tkankowejFalcon, NY, USA353219

Bibliografia

  1. Jorgensen, I., Rayamajhi, M., Miao, E. A. Programmed cell death as a defence against infection. Nature Reviews Immunology. 17 (3), 151-164 (2017).
  2. Rao, A. N., Kazzaz, N. M., Knight, J. S. Do neutrophil extracellular traps contribute to the heightened risk of thrombosis in inflammatory diseases? World Journal of Cardiology. 7 (12), 829-842 (2015).
  3. Kessenbrock, K., et al. Netting neutrophils in autoimmune small-vessel vasculitis. Nature Medicine. 15 (6), 623-625 (2009).
  4. Garcia-Romo, G. S., et al. Netting neutrophils are major inducers of type I IFN production in pediatric systemic lupus erythematosus. Science Translational Medicine. 3 (73), 73ra20(2011).
  5. Lande, R., et al. Neutrophils activate plasmacytoid dendritic cells by releasing self-DNA-peptide complexes in systemic lupus erythematosus. Science Translational Medicine. 3 (73), 73ra19(2011).
  6. Meng, H., Yalavarthi, S., et al. In Vivo Role of Neutrophil Extracellular Traps in Antiphospholipid Antibody-Mediated Venous Thrombosis. Arthritis & Rheumatology. 69 (3), 655-667 (2017).
  7. Desai, J., et al. Particles of different sizes and shapes induce neutrophil necroptosis followed by the release of neutrophil extracellular trap-like chromatin. Scientific Reports - Nature. 7 (1), 15003(2017).
  8. Desai, J., et al. PMA and crystal-induced neutrophil extracellular trap formation involves RIPK1-RIPK3-MLKL signaling. European Journal of Immunology. 46 (1), 223-229 (2016).
  9. Apel, F., Zychlinsky, A., Kenny, E. F. The role of neutrophil extracellular traps in rheumatic diseases. Nature Reviews Rheumatology. , (2018).
  10. Kraaij, T., et al. A novel method for high-throughput detection and quantification of neutrophil extracellular traps reveals ROS-independent NET release with immune complexes. Autoimmunity Reviews. 15 (6), 577-584 (2016).
  11. Masuda, S., et al. NETosis markers: Quest for specific, objective, and quantitative markers. Clinica Chimica Acta. 459, 89-93 (2016).
  12. Brinkmann, V., Goosmann, C., Kuhn, L. I., Zychlinsky, A. Automatic quantification of in vitro NET formation. Frontiers in Immunology. 3, 413(2012).
  13. Nakazawa, D., et al. Enhanced formation and disordered regulation of NETs in myeloperoxidase-ANCA-associated microscopic polyangiitis. Journals of the American Society of Nephrology. 25 (5), 990-997 (2014).
  14. Konig, M. F., Andrade, F. A Critical Reappraisal of Neutrophil Extracellular Traps and NETosis Mimics Based on Differential Requirements for Protein Citrullination. Frontiers in Immunology. 7, 461(2016).
  15. Kenny, E. F., et al. Diverse stimuli engage different neutrophil extracellular trap pathways. Elife. 6, (2017).
  16. Zhao, W., Fogg, D. K., Kaplan, M. J. A novel image-based quantitative method for the characterization of NETosis. Journal of Immunological Methods. 423, 104-110 (2015).
  17. Pilsczek, F. H., et al. A novel mechanism of rapid nuclear neutrophil extracellular trap formation in response to Staphylococcus aureus. The Journal of Immunology. 185 (12), 7413-7425 (2010).
  18. Tanaka, K., et al. In vivo characterization of neutrophil extracellular traps in various organs of a murine sepsis model. PLoS One. 9 (11), e111888(2014).
  19. Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. Journal of Cell Biology. 176 (2), 231-241 (2007).
  20. von Köckritz-Blickwede, M., Chow, O., Nizet, V. Fetal calf serum contains heat-stable nucleases that degrade neutrophil extracellular traps. Blood. 114 (25), 5245-5246 (2009).
  21. Kraaij, T., et al. Excessive neutrophil extracellular trap formation in ANCA-associated vasculitis is independent of ANCA. Kidney International. , (2018).
  22. Kraaij, T., et al. The NET-effect of combining rituximab with belimumab in severe systemic lupus erythematosus. Journal of Autoimmunity. , (2018).
  23. Hahn, J., Schauer, C., et al. Aggregated neutrophil extracellular traps resolve inflammation by proteolysis of cytokines and chemokines and protection from antiproteases. The FASEB Journal. (Aug 21), (2018).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Zewn trzkom rkowe pu apki neutrofilowetest tworzenia NETwysokoprzepustowa kwantyfikacja NETtr jwymiarowa immunofluorescencjamikroskopia konfokalnaizolacja neutrofiliwirowanie w gradiencie g sto ciczerwony fluorescencyjny cznik kom rkowynieprzenikalny barwnik DNAanaliza stosu Z Z stack
Wysokoprzepustowy test do oceny i ilościowego określania tworzenia pułapek zewnątrzkomórkowych w neutrofilach
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.