Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Dystrybucja wody ksylemu w roślinach drzewiastych wizualizowana za pomocą krioskaningowego mikroskopu elektronowego

8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59154

⸱

20 czerwca 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Plant Ecology, Forestry and Forest Products Research Institute (FFPRI), 2Kansai Research Center, Forestry and Forest Products Research Institute (FFPRI), 3Department of Wood Properties and Processing, Forestry and Forest Products Research Institute (FFPRI), 4Faculty of Agriculture, Kyushu University, 5Department of Bacteriology, University of Wisconsin, 6Research Faculty of Agriculture, Hokkaido University

W tym artykule

Podsumowanie

Obserwacja rozkładu wody w ksylemie dostarcza istotnych informacji na temat dynamiki przepływu wody w roślinach drzewiastych. W tym badaniu demonstrujemy praktyczne podejście do obserwacji dystrybucji wody ksylemu in situ przy użyciu kriostatu i krio-SEM, co eliminuje sztuczne zmiany stanu wody podczas przygotowywania próbki.

Streszczenie

Zainstalowany w skaningowym mikroskopie elektronowym krio-unit (cryo-SEM) umożliwia obserwację próbek w temperaturach poniżej zera i jest używany do badania dystrybucji wody w tkankach roślinnych w połączeniu z technikami wiązania zamrażania przy użyciu ciekłego azotu (LN2). Jednak w przypadku gatunków drzewiastych przygotowania do obserwacji powierzchni cięcia poprzecznego ksylemu wiążą się z pewnymi trudnościami ze względu na orientację włókien drzewnych. Ponadto wyższe napięcie w słupie wody w przewodach ksylemowych może czasami powodować sztuczne zmiany w dystrybucji wody, zwłaszcza podczas utrwalania i pobierania próbki. W tym badaniu demonstrujemy skuteczną procedurę obserwacji dystrybucji wody w ksylemie roślin drzewiastych in situ przy użyciu kriostatu i krio-SEM. Na początku, podczas pobierania próbki, pomiar potencjału wodnego ksylemu powinien określić, czy w przewodach ksylemu występuje wysokie napięcie. Gdy potencjał wodny ksylemu jest niski (< ok. −0,5 MPa), konieczna jest procedura relaksacji naprężeń, aby ułatwić lepsze zachowanie stanu wody w przewodach ksylemu podczas utrwalania próbki przez zamrożenie. Następnie wokół pnia drzewa mocuje się wodoszczelny kołnierz i wypełnia LN2 w celu zamrożenia stanu wody ksylemu. Po zbiorach należy dołożyć starań, aby zapewnić, że próbka jest zakonserwowana w stanie zamrożonym podczas wykonywania procedur przygotowania próbki do obserwacji. Kriostat służy do wyraźnego odsłonięcia powierzchni cięcia poprzecznego ksylemu. W obserwacjach krio-SEM wymagana jest korekta czasu dla trawienia przez zamrożenie, aby usunąć pył szronowy i zaakcentować krawędź ścian komórkowych na powierzchni widokowej. Nasze wyniki wskazują na możliwość zastosowania technik krio-SEM do obserwacji dystrybucji wody w ksylemie na poziomie komórkowym i subkomórkowym. Połączenie cryo-SEM z nieniszczącymi technikami obserwacji in situ znacznie poprawi badania dynamiki przepływu wody w roślinach drzewiastych.

Wprowadzenie

Dostępność zasobów wodnych (np. opadów, zawartości wody w glebie) ściśle determinuje śmiertelność i rozmieszczenie geograficzne gatunków roślin, ponieważ muszą one pobierać wodę z gleby i transportować ją do liści w celu produkcji fotosyntetycznej. Rośliny muszą utrzymywać swój system transportu wody w warunkach wahań w zaopatrzeniu w wodę. W szczególności rośliny drzewiaste generują wysokie napięcia w swoich przewodach wzdłuż strumieni transpiracji, ponieważ w niektórych przypadkach muszą utrzymywać swoją koronę na wysokości ponad ~100 m nad ziemią. Aby utrzymać słupy wody pod tak wysokim podciśnieniem, przewody ksylemu składają się z kontinuum komórek rurkowych ze sztywnymi i hydrofobowo zdrewniałymi ścianami komórkowymi1. Podatność przewodów ksylemu na dysfunkcję ksylemu u każdego gatunku jest dobrym wyznacznikiem przetrwania gatunku przy zmiennym zaopatrzeniu w wodę2. Ponadto badanie stanu wody w przewodach ksylemowych jest ważne dla oceny stanu zdrowotnego poszczególnych drzew poddanych stresom abiotycznym lub biotycznym. Pomiar przepływu soków lub potencjału wodnego może zapewnić oszacowanie stanu wody w roślinach drzewiastych dzięki zintegrowanej funkcji hydraulicznej przewodów ksylemu. Co więcej, wizualizacja rozkładu wody w komórkach ksylemu może wyjaśnić stan poszczególnych elementów układu hydraulicznego ksylemu.

Istnieje kilka technik wizualizacji stanu wody w kanałach ksylemowych3. Klasyczne i użyteczne metody obserwacji ścieżek wodnych w tkance drzewiastej polegają na barwieniu słupa wody poprzez zanurzanie końców ściętych gałęzi w barwniku lub wstrzykiwanie barwnika w stojące pnie drzew4. Miękka fotografia rentgenowska umożliwia również wizualizację rozkładu wody w pokrojonych dyskach drewnianych ze względu na różnicową intensywność absorpcji promieniowania rentgenowskiego wilgoci w xylem5,6. Metody te dostarczają jednak tylko śladów ruchu wody lub pokazują makroskopowy rozkład wody. Ostatnio techniki obserwacji nieniszczącej, takie jak rentgenowska tomografia komputerowa z mikroogniskowaniem (μCT)7,8,9,10i obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (MRI)11,12, zostały znacznie ulepszone, aby umożliwić obserwację wody w przewodach ksylemu w nienaruszonych sadzonkach. Te nieniszczące metody mają wielką zaletę, ponieważ możemy obserwować stan wody w ksylemie bez sztucznych efektów cięcia, a także możemy śledzić dynamikę przepływu wody poprzez sekwencyjne obrazowanie lub wprowadzenie środka kontrastowego10. Musimy jednak użyć dostosowanego rezonansu magnetycznego do obrazowania roślin lub specjalistycznego urządzenia do synchrotronowego μCT, aby uzyskać obrazy, które mogą zidentyfikować zawartość wody na poziomie komórkowym. Ponadto, mimo że synchrotronowy system μCT umożliwił uzyskanie precyzyjnych obrazów o wysokiej rozdzielczości przestrzennej, która jest porównywalna z mikroskopią świetlną7,8,9, żywe komórki mogą zostać uszkodzone przez promieniowanie promieniowania rentgenowskiego o wysokiej energii13,14. Zastosowanie skaningowego mikroskopu elektronowego, w którym zainstalowane są kriojednostki (cryo-SEM), jest bardzo przydatną metodą precyzyjnego lokalizowania wody w ksylemie na poziomie komórkowym, chociaż wymaga to destrukcyjnego pobrania próbki do obserwacji. Aby utrwalić wodę w przewodach ksylemu, część łodyg (tj. gałązek, gałęzi lub łodyg) jest zamrażana in situ przez ciekły azot (LN2). Obserwacje powierzchni przyciętych, zamrożonych próbek za pomocą cryo-SEM dostarczają bardzo powiększonych obrazów struktury ksylemu, na podstawie których możemy zidentyfikować wodę w przewodach ksylemu jako lód. Istotnym ograniczeniem tej metody jest to, że sekwencyjna obserwacja ruchomości wody w tej samej próbce jest niemożliwa. Jednak zastosowanie μCT lub MRI do sekwencyjnej obserwacji drzew żyjących na polu jest niezwykle trudne, ponieważ instrumenty te nie są przenośne. W przeciwieństwie do tego, cryo-SEM ma potencjał do wykorzystania tej techniki na dużych drzewach w eksperymentach terenowych, aby wyraźnie zobrazować zawartość wody nie tylko na poziomie komórkowym, ale także na drobniejszym poziomie struktury, np. woda w dołach międzynaczyniowych15, woda w przestrzeniach międzykomórkowych16, lub bąbelki w kolumnie wody17.

Wiele badań z udziałem wody ksylemowej za pomocą cryo-SEM zostało zgłoszonych 5,12,18,19,20,21,23. Utsumi i in. (1996) początkowo ustalili protokół obserwacji ksylemu in situ poprzez zamrażanie żywego pnia poprzez napełnienie LN2 pojemnikiem ustawionym na trzonie21. Temperatura próbki była utrzymywana poniżej -20 °C podczas pobierania próbki i podczas przygotowywania krio-SEM, aby uniknąć stopienia lodu w przewodach ksylemu. Metoda ta została wykorzystana do obserwacji wody w ksylemie w celu wyjaśnienia rozkładu wody pod wpływem zmieniającego się reżimu wodnego11,12,24,25,26,27,28, sezonowa zmiana dystrybucji wody21,29,30, efekt cykli zamrażania i rozmrażania17,31,32, rozkład wody w mokrym drewnie5, zmiany w dystrybucji wody podczas przejścia z bieli na twardziel20, sezonowy przebieg aktywności kambialnej i zróżnicowanie naczyń33oraz kawitacja wywołana pewnymi stresami biotycznymi23,34. Przewodność hydrauliczna i podatność przewodów na kawitację zostały również zweryfikowane za pomocą cryo-SEM35,36. Cryo-SEM wyposażony w spektrometrię rentgenowską z dyspersją energii (EDX lub EDS) został wykorzystany do badania rozkładu pierwiastków na powierzchni próbki zawierającej wodę37.

Zamrożenie żywego pnia, które zawiera przewody pod wysokim napięciem hydraulicznym, czasami powoduje sztuczne kawitacje, które są obserwowane przez cryo-SEM jako pęknięte kryształki lodu w świetle przewodów38,39. W szczególności gatunki liściaste z dłuższymi i szerszymi przewodami są podatne na artefakty wywołane napięciem, takie jak kawitacja spowodowana cięciem próbki, nawet jeśli jest prowadzona pod wodą3,40. Artefakty kawitacji stają się widoczne po pobraniu próbki z drzewa transpirującego (tj. próbkowaniu w ciągu dnia) lub w warunkach ciężkiej suszy i mogą prowadzić do przeszacowania występowania kawitacji3,38,39. W związku z tym naprężenie działające w przewodach musi zostać zwolnione, aby uniknąć sztucznej kawitacji3,12,39.

Technika zamrażania i pękania za pomocą noża zainstalowanego w komorze na próbki jest często stosowana do wystawiania powierzchni próbki do obserwacji kriogenicznej. Jednak popękane przez zamrożenie płaszczyzny zdrewniałych tkanek roślinnych, zwłaszcza przekroje poprzeczne wtórnego ksylemu, są zbyt szorstkie, aby wyraźnie zaobserwować cechy anatomiczne i wodę w tkance6. Zastosowanie kriostatu do przycinania próbki pozwala na szybkie i wysokiej jakości przygotowanie powierzchni próbki20,23. Ogólnym celem tej metody jest dostarczenie dowodów na rozkład wody w różnych rodzajach komórek ksylemu in situ za pomocą mikroskopii elektronowej bez występowania artefaktów próbkowania. Wprowadzamy naszą zaktualizowaną procedurę, która jest stale ulepszana od czasu jej pierwszego przyjęcia, dotyczącą pobierania próbek, przycinania i czyszczenia powierzchni próbki w celu uzyskania wysokiej jakości mikrofotografii elektronowych krioutrwalonych próbek ksylemu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Schemat ideowy tego protokołu jest pokazany w Rysunek 1.

1. Pobieranie próbek: Rozluźnienie napięcia w słupie wody przewodów ksylemowych

UWAGA: Przed zastosowaniem LN2 zaleca się następujący zabieg rozluźniania napięcia, aby uniknąć zarówno zamarzania, jak i artefaktów wywołanych napięciem w dystrybucji wody ksylemu.

  1. Opasnąć gałąź i liście do pobierania próbek czarną plastikową torbą, aby zrównoważyć potencjał wodny między ksylemem a liśćmi na więcej niż dwie godziny przed pobraniem próbki.
  2. Oznaczyć potencjał wodny co najmniej dwóch liści z próbki za pomocą komory ciśnieniowej lub psychrometru. Gdy potencjał wodny jest wyższy niż ok. −0,5 MPa (tj. nie występuje napięcie lub występuje ono bardzo niskie), próbkę można pobrać po zamrożeniu (patrz rozdział 2: Utrwalanie przez zamrażanie). Gdy potencjał wodny jest niższy niż −0,5 MPa, konieczne jest leczenie relaksacyjne, jak opisano poniżej.
  3. Zamocuj wodoszczelny kołnierz wokół trzpienia, aby napełnić go wodą. Plastikowy kubek bez dna może służyć jako wodoszczelny kołnierz. Należy zadbać o szczelne uszczelnienie przestrzeni między trzpieniem a kołnierzem za pomocą taśmy klejącej, aby zapobiec wyciekom płynnych mediów, które są następnie używane. Aby zebrać elastyczne łodygi, takie jak cienkie gałęzie lub gałązki, zanurz część cięcia w wiadrze wypełnionym wodą, zginając łodygę. Tnij pod powierzchnią wody za pomocą sekatora lub piły. Przenieś próbkę do innego pojemnika z wodą tak szybko, jak to możliwe, aby zminimalizować wystawienie odciętego końca na działanie powietrza.
  4. Odcięty koniec próbki należy przechowywać pod wodą. W przypadku gatunków liściastych należy zapewnić, aby długość od miejsca, w którym zostanie pobrana kriopróbka do SEM, do krawędzi cięcia zebranej łodygi była dłuższa niż maksymalna długość naczynia próbki, aby zapobiec powstawaniu artefaktów spowodowanych naprężeniem w próbce kriogenicznej.
  5. Przykryj próbkę zawierającą liście czarną plastikową torbą, aby zmniejszyć transpirację. Trzymaj odcięty koniec próbki w wodzie i utrzymuj ten stan przez około 30 minut w celu rozluźnienia napięcia ksylemu. Unikaj dłuższego czasu relaksacji (>1 h) ze względu na możliwe sztuczne napełnianie kawitacyjnych przewodów12.
  6. Ponownie zmierzyć potencjał wody, aby potwierdzić rozluźnienie napięcia ksylemu (prawie 0 MPa).
    UWAGA: Przed pobraniem próbek należy zbadać maksymalną długość naczynia krwionośnego gatunku docelowego lub określić ją za pomocą podobnych próbek metodą wtrysku powietrza. Podczas pobierania próbek z dużego drzewa lub dużej gałęzi trudno jest przeprowadzić opisane powyżej procedury rozluźniania napięcia. Dlatego próbki z dużych drzew muszą być pobierane w okresie przed świtem, kiedy potencjał wodny ksylemu jest wyższy.

2. Fiksacja zamrożenia za pomocą LN2

  1. Wytnij i otwórz jedną stronę wodoszczelnej obroży nożyczkami lub nożem uniwersalnym. Mocno przymocuj kołnierz wokół trzpienia za pomocą taśmy klejącej, trzymając otwór poziomo.
  2. Nosić rękawice izolacyjne/rękawice, ale upewnij się, że bezpiecznie trzymasz butelkę LN2 i włóż LN2 do kołnierza, aby napełnić ją LN2. Utrzymuj go napełnionym, stopniowo dodając LN2, aby całkowicie zamrozić wodę w ksylemie. Czas potrzebny do zamrożenia zależy od wielkości próbki; 1 minuta po zagotowaniu wylanego LN2 jest wystarczająca dla małej gałązki lub sadzonki, podczas gdy ponad 20 minut jest potrzebne dla pnia większego drzewa20. Dodawać LN2 w sposób ciągły podczas zamrażania, ponieważ szybko odparowuje z powodu dużych różnic temperatur między LN2 a temperaturami otoczenia.
  3. Odczepić kołnierz od zamrożonej części trzpienia próbki w celu usunięcia LN2 po upływie wystarczającego czasu zamrażania. Upewnij się, że nosisz rękawice izolacyjne, aby uniknąć kontaktu z potencjalnym rozlaniem LN2 spowodowanym odłączeniem obroży.
  4. Natychmiast zbierz próbkę za pomocą cienkiej piły ręcznej.
  5. Przykryj zamrożoną próbkę kawałkiem folii aluminiowej lub włóż ją do probówki z próbką, na której zapisane są numery identyfikacyjne próbki. Pobraną próbkę należy szybko umieścić w pojemniku wypełnionym LN2 lub zapakować do izolowanego pudełka wypełnionego suchym lodem.
  6. Próbki należy przechowywać w głębokiej zamrażarce do czasu obserwacji. Preferowana temperatura przechowywania wynosi −80 °C, aby zapobiec sublimacji lodu i jego rekrystalizacji podczas przechowywania.

3. Przygotowanie próbki

UWAGA: Do obserwacji, próbka musi być przycięta, a jej powierzchnia do obserwacji musi być strugana w temperaturze poniżej zera, aby utrzymać rozkład wody w ksylemie in situ. Mikrotom biologiczny z systemem kriostatu (kriostatu) jest idealny do przycinania i naświetlania powierzchni próbki w tego typu obserwacji za pomocą krio-SEM.

  1. Ustaw temperaturę komory na próbki kriostatu na -30 °C, która jest zwykle wystarczająco niska, aby utrzymać sok ksylemu większości roślin w stanie zamrożonym.
  2. Przytnij próbkę do małego kawałka (< ok. 2 cm wysokości i < ok. 1 cm szerokości lub średnicy), który można dostosować do uchwytu próbki cryo-SEM. Do przycinania używaj ostrego noża lub piły o drobnych zębach, aby zapobiec pękaniu lodu w próbce. W przypadku większej próbki, której nie można przeciąć nożem, należy ją szybko wstępnie przyciąć schłodzoną piłą w zamrażarce.
  3. Przymocuj przycięty element do uchwytu, uchwytu do kriostatu, montując go na podłożu do zamrażania tkanek (np. związku OCT) w celu kriosekcji. Następnie przymocuj uchwyt do uchwytu na próbkę mikrotomu kriostatu.
  4. Przyciąć powierzchnię, wielokrotnie goląc odcinki o grubości 5–7 μm. Przycinanie poprzez odcięcie od 1 000 do 2 000 μm na całkowitą głębokość od początkowej powierzchni podczas pobierania próbki jest przydatne do wyeliminowania uszkodzonej części próbki spowodowanej wstępnym cięciem nożem lub piłą, jak opisano w kroku 3.2.
  5. Po zgrubnym przycięciu powierzchni próbki, wyreguluj nieużywaną część ostrza mikrotomu nad powierzchnią próbki. Nie pozwól, aby ostrze dotykało próbki, co mogłoby przekroczyć ustawienie grubości.
  6. Przed pierwszym cięciem niewykorzystaną częścią ostrza należy nieznacznie poszerzyć odległość między powierzchnią próbki a ostrzem.
  7. Przeciąć powierzchnię próbki tylko raz lub dwa razy. Następnie ponownie przesuń ostrze, regulując nieużywaną część ostrza na powierzchni próbki.
  8. Powtórz kroki 3.6 i 3.7 trzy lub cztery razy. Jest to ważne w celu uzyskania czystej powierzchni bez "śladów noża" (Rysunek 4).
  9. Po ostatnim cięciu ustaw pozycję ostrza z dala od próbki, aby zapobiec przywieraniu pyłu do próbki.
  10. Odłącz uchwyt od uchwytu na próbkę i odłącz próbkę od uchwytu, usuwając zamrożone podłoże do zatapiania ostrym nożem. Upewnij się, że próbka jest umieszczona w komorze kriostatu, aby zapobiec jej struganej powierzchni przed pyłem mrozu.
  11. Umieścić próbkę w uchwycie na próbkę cryo-SEM z podłożem do zamrażania tkanek w komorze kriostatu.

4. Transfer do komory na próbki Cryo-SEM

UWAGA: Próbka przygotowana na powierzchnię musi być chroniona przed wzrostem temperatury lub gromadzeniem szronu podczas przenoszenia z komory kriostatu do etapu obserwacji w komorze próbek cryo-SEM.

  1. Utrzymuj temperaturę zimnego etapu w komorze na próbki cryo-SEM na poziomie niższym niż –120 °C z LN2 zgodnie z instrukcją obsługi urządzenia.
  2. Umieścić uchwyt próbki z przygotowaną próbką w pojemniku izolacyjnym wypełnionym LN2 w komorze kriostatu.
  3. Trzymaj uchwyt próbki z prętem do wymiany próbek pod LN2. Jeśli to możliwe, unikaj wystawiania uchwytu na próbkę na działanie powietrza.
  4. Szybko ustaw uchwyt próbki w komorze wstępnej ewakuacji komory próbek cryo-SEM, gdy tylko rozpocznie się opróżnianie komory wstępnej ewakuacji. Następnie umieść uchwyt próbki na zimnym etapie po całkowitym odprowadzeniu powietrza. Chociaż nie da się uniknąć odrobiny szronu, procedura "trawienia przez zamrożenie" (krok 6) może go usunąć.

5. Ustawienie w SEM

UWAGA: Typowe ustawienie dla obserwacji jest opisane poniżej. Wymagane są pewne modyfikacje w zależności od warunków próżni lub wiązki elektronów.

  1. Ustaw parametry SEM dla obserwacji w następujący sposób:
    Napięcie przyspieszenia: 3–5 kV
    Temperatura etapu pobierania próbki: < −120 °C
    Detektor: Emisja wtórna

6. Trawienie przez zamrażanie

UWAGA: Trawienie przez zamrożenie to procedura uwydatniania krawędzi ścian komórkowych próbki poprzez lekką sublimację kryształów lodu. Trawienie przez mrożenie polega również na usuwaniu pyłów szronowych z powierzchni.

  1. Włącz napięcie przyspieszenia pistoletu elektrycznego podczas trawienia przez zamrażanie. Lepiej jest przeprowadzić trawienie przez zamrożenie podczas obserwacji próbki.
  2. Podnieść temperaturę stopnia pobierania próbki do −100 °C.
  3. Odczekaj kilka minut, aż pył szronu zostanie usunięty, a poziom powierzchni lodu w komórkach ksylemu nieznacznie się obniży w porównaniu ze ścianami komórkowymi.
  4. Obniżyć temperaturę stopnia pobierania próbki do -120 °C.
    UWAGA: Jeśli nie ma zainstalowanego regulatora temperatury dla stolika na próbkę, przytrzymaj próbkę za pomocą pręta wymiennika i odłącz ją od stolika na próbkę na kilka minut. Obserwuj próbkę kilka razy podczas tego procesu zamrażania, aby zweryfikować status sublimacji próbki.

7. Powłoka metalowa (opcjonalnie)

UWAGA: Ostatnie ulepszenia instrumentu SEM i przetwarzania obrazów mogą dostarczyć wysokiej jakości obrazy próbek izolacji elektrycznej bez powłoki metalowej. Jednak próbki nieprzewodzące, takie jak materiały biologiczne, są czasami płatne; wyższa jasność w określonych pozycjach próbki ze względu na akumulację elektronów ("ładowanie"). Wystawienie próbki na działanie wiązek elektronów przez dłuższy czas lub w dużym powiększeniu zwiększa efekty ładowania. Pokrycie powierzchni próbki materiałami metalowymi przewodzącymi prąd elektryczny zapobiega powstawaniu ładunków. Użyj systemu powlekania próżniowego, który jest zainstalowany w jednostce cryo-SEM, aby zapobiec wzrostowi temperatury próbki podczas powlekania.

  1. Upewnij się, że materiał powłokowy jest zainstalowany na wyznaczonej głowicy parownika systemu powlekania.
  2. Utrzymać temperaturę fazy zimnej w systemie powłokowym poniżej −170 °C.
  3. Umieścić uchwyt próbki na zimnym etapie systemu powlekania po wystarczającym wytrawieniu przez zamrożenie.
  4. Otwórz przegrodę między zimnym stopniem a głowicą parownika.
  5. Ustaw wartość prądu i wartość napięcia głowicy parownika odpowiednio na ok. 30 mA i ok. 5 V.
  6. Odparować materiał powlekający przez ok. 30 s w celu pokrycia powierzchni próbki.
  7. Ustaw zarówno wartości prądu, jak i napięcia głowicy parownika na zero i zamknij przegrodę.
  8. Umieścić uchwyt próbki na zimnym stoliku komory próbki w celu obserwacji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Reprezentatywne obrazy powierzchni przekrojów poprzecznych ksylemu drzew iglastych i liściastych, obserwowane za pomocą cryo-SEM, przedstawiono na Rysunku 2. Przy małym powiększeniu czarny obszar na obrazach wskazuje jamy, z których woda znika całkowicie lub częściowo, a obszar szary wskazuje ściany komórek ksylemu, cytoplazmę i wodę (Rysunek 2A). Przy dużym powiększeniu widoczne jest, że woda nie znika całkowici...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Metody obserwacji cryo-SEM przedstawione w tym artykule są praktyczne do wyraźnej wizualizacji dystrybucji wody w skali komórkowej. Dzięki tej metodzie badanie zmian w dystrybucji wody w ksylemie może potencjalnie pomóc w wyjaśnieniu mechanizmu tolerancji gatunków drzew na stres abiotyczny (niedobór wody lub zamarzanie) lub stres biotyczny (choroba drzew).

Najważniejszym krokiem w tej metodzie jest zachowanie rozkładu wody charakterystycznego dla rodzimego stanu wody podczas pobierania próbki ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez JSPS KAKENHI (nr 20120009, 20120010, 19780129, 25292110, 23780190, 23248022, 15H02450, 16H04936, 16H04948, 17H03825, 18H02258)

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
materiał powłokowyJOEL Ltd., JaponiaZłoty drut, 0,50 × 1000 mm, 99,99 %, Nr części 125000499 
krioskaningowy mikroskop elektronowyJOEL Ltd., JaponiaJSM-6510 zainstalowany z kriostatem MP-Z09085T / MP-51020ALS
Thermo ScientificCryoStar NX70
JednorazowemikrotomuHP35 ULTRA,
pożywka do zamrażania tkanekŻywicado zatapiania Thermo Scientific Shandon Cryomatrix,
Ostrze mikrotomu ostrza Thermo Scientific 3153735 6769006

Bibliografia

  1. Tyree, M. T., Zimmermann, M. H. Xylem structure and the ascent of sap. , Springer-Verlag Berlin Heidelberg. Berlin, Heidelberg. (2002).
  2. Choat, B., Jansen, S., et al. Global convergence in the vulnerability of forests to drought. Nature. 491 (7426), 752-755 (2012).
  3. Klein, T., Zeppel, M. J. B., et al. Xylem embolism refilling and resilience against drought-induced mortality in woody plants: processes and trade-offs. Ecological Research. 33 (5), 839-855 (2018).
  4. Sano, Y., Okamura, Y., Utsumi, Y. Visualizing water-conduction pathways of living trees: selection of dyes and tissue preparation methods. Tree Physiology. 25 (3), 269-275 (2005).
  5. Sano, Y., Fujikawa, S., Fukazawa, K. Detection and features of wetwood in Quercusmongolica var. grosseserrata. Trees - Structure and Function. 9 (5), 261-268 (1995).
  6. Utsumi, Y., Sano, Y. Freeze stabilization and cryopreparation technique for visualizing the water distribution in woody tissues by X-ray imaging and cryo-scanning electron microscopy. Electron Microscopy. (Chapter 30), 677-688 (2014).
  7. Brodersen, C. R., McElrone, A. J., Choat, B., Matthews, M. A., Shackel, K. A. The dynamics of embolism repair in xylem: in vivo visualizations using high-resolution computed tomography). Plant Physiology. 154 (3), 1088-1095 (2010).
  8. Brodersen, C. R., McElrone, A. J., Choat, B., Lee, E. F., Shackel, K. A., Matthews, M. A. In vivo visualizations of drought-induced embolism spread in Vitis vinifera. Plant Physiology. 161 (4), 1820-1829 (2013).
  9. Choat, B., Badel, E., Burlett, R. E. G., Delzon, S., Cochard, H., Jansen, S. Noninvasive measurement of vulnerability to drought-induced embolism by X-ray microtomography. Plant Physiology. 170 (1), 273-282 (2016).
  10. Pratt, R. B., Jacobsen, A. L. Identifying which conduits are moving water in woody plants: a new HRCT-based method. Tree Physiology. 38 (8), 1200-1212 (2018).
  11. Fukuda, K., Kawaguchi, D., et al. Vulnerability to cavitation differs between current-year and older xylem: nondestructive observation with a compact MRI of two deciduous diffuse-porous species. Plant, Cell and Environment. 38 (12), 2508-2518 (2015).
  12. Ogasa, M. Y., Utsumi, Y., Miki, N. H., Yazaki, K., Fukuda, K. Cutting stems before relaxing xylem tension induces artefacts in Vitis coignetiae, as evidenced by magnetic resonance imaging. Plant, Cell and Environment. 39 (2), 329-337 (2016).
  13. Petruzzellis, F., Pagliarani, C., et al. The pitfalls of in vivo imaging techniques: evidence for cellular damage caused by synchrotron X-ray computed micro-tomography. New Phytologist. 220 (1), 104-110 (2018).
  14. Savi, T., Miotto, A., et al. Drought-induced embolism in stems of sunflower: A comparison of in vivo micro-CT observations and destructive hydraulic measurements. Plant Physiol Biochem. 120, 24-29 (2017).
  15. Choat, B., Jansen, S., Zwieniecki, M. A., Smets, E., Holbrook, N. M. Changes in pit membrane porosity due to deflection and stretching: the role of vestured pits. Journal of Experimental Botany. 55 (402), 1569-1575 (2004).
  16. Nakaba, S., Hirai, A., et al. Cavitation of intercellular spaces is critical to establishment of hydraulic properties of compression wood of Chamaecyparis obtusa seedlings. Annals of Botany. 117 (3), 457-463 (2016).
  17. Utsumi, Y., Sano, Y., Funada, R., Fujikawa, S., Ohtani, J. The progression of cavitation in earlywood vessels of Fraxinus mandshurica var japonica during freezing and thawing. Plant Physiology. 121 (3), 897-904 (1999).
  18. McCully, M., Canny, M. J., Huang, C. X. Cryo-scanning electron microscopy (CSEM) in the advancement of functional plant biology. Morphological and anatomical applications. Functional Plant Biology. 36 (2), 97-124 (2009).
  19. Canny, M. J. Vessel contents of leaves after excision - A test of Scholander's assumption. American Journal of Botany. 84 (9), 1217-1222 (1997).
  20. Kuroda, K., Yamashita, K., Fujiwara, T. Cellular level observation of water loss and the refilling of tracheids in the xylem of Cryptomeria japonica during heartwood formation. Trees - Structure and Function. 23 (6), 1163-1172 (2009).
  21. Utsumi, Y., Sano, Y., Ohtani, J., Fujikawa, S. Seasonal changes in the distribution of water in the outer growth rings of Fraxinus mandshurica var. Japonica: A study by cryo-scanning electron microscopy. IAWA Journal. 17 (2), 113-124 (1996).
  22. Ohtani, J., Fujikawa, S. Cryo-SEM observations on vessel lumina of a living tree: Ulmus davidiana var. japonica. IAWA Journal. 11 (2), 183-194 (1990).
  23. Yazaki, K., Takanashi, T., et al. Pine wilt disease causes cavitation around the resin canals and irrecoverable xylem conduit dysfunction. Journal of Experimental Botany. 69 (3), 589-602 (2018).
  24. Tyree, M. T., Salleo, S., Nardini, A., Lo Gullo, M. A., Mosca, R. Refilling of embolized vessels in young stems of laurel. Do we need a new paradigm? Plant Physiology. 120 (1), 11-21 (1999).
  25. Melcher, P. J., Goldstein, G., et al. Water relations of coastal and estuarine Rhizophora mangle: xylem pressure potential and dynamics of embolism formation. Oecologia. 126 (2), 182-192 (2001).
  26. Yazaki, K., Sano, Y., Fujikawa, S., Nakano, T., Ishida, A. Response to dehydration and irrigation in invasive and native saplings: osmotic adjustment versus leaf shedding. Tree Physiology. 30 (5), 597-607 (2010).
  27. Yazaki, K., Kuroda, K., et al. Recovery of physiological traits in saplings of invasive Bischofia tree compared with three species native to the Bonin Islands under successive drought and irrigation cycles. PLoS ONE. 10 (8), e0135117(2015).
  28. Umebayashi, T., Morita, T., et al. Spatial distribution of xylem embolisms in the stems of Pinus thunbergii at the threshold of fatal drought stress. Tree Physiology. 36 (10), 1210-1218 (2016).
  29. Utsumi, Y., Sano, Y., Funada, R., Ohtani, J., Fujikawa, S. Seasonal and perennial changes in the distribution of water in the sapwood of conifers in a sub-frigid zone. Plant Physiology. 131 (4), 1826-1833 (2003).
  30. Utsumi, Y., Sano, Y., Fujikawa, S., Funada, R., Ohtani, J. Visualization of cavitated vessels in winter and refilled vessels in spring in diffuse-porous trees by cryo-scanning electron microscopy. Plant Physiology. 117 (4), 1463-1471 (1998).
  31. Ball, M. C., Canny, M. J., Huang, C. X., Egerton, J. J. G., Wolfe, J. Freeze/thaw-induced embolism depends on nadir temperature: the heterogeneous hydration hypothesis. Plant, Cell and Environment. 29 (5), 729-745 (2006).
  32. Mayr, S., Cochard, H., Ameglio, T., Kikuta, S. B. Embolism formation during freezing in the wood of Picea abies. Plant Physiology. 143 (1), 60-67 (2007).
  33. Kudo, K., Utsumi, Y., et al. Formation of new networks of earlywood vessels in seedlings of the deciduous ring-porous hardwood Quercus serrata in springtime. Trees - Structure and Function. 32 (3), 725-734 (2018).
  34. Crews, L., McCully, M., Canny, M. J., Huang, C., Ling, L. Xylem feeding by spittlebug nymphs: Some observations by optical and cryo-scanning electron microscopy. American Journal of Botany. 85 (4), 449-460 (1998).
  35. Hukin, D., Cochard, H., Dreyer, E., Le Thiec, D., Bogeat-Triboulot, M. B. Cavitation vulnerability in roots and shoots: does Populus euphratica Oliv., a poplar from arid areas of Central Asia, differ from other poplar species? Journal of Experimental Botany. 56 (418), 2003-2010 (2005).
  36. Mayr, S., Cochard, H. A new method for vulnerability analysis of small xylem areas reveals that compression wood of Norway spruce has lower hydraulic safety than opposite wood. Plant, Cell and Environment. 26 (8), 1365-1371 (2003).
  37. Kuroda, K., Yamane, K., Itoh, Y. Cellular level in planta analysis of radial movement of artificially injected caesium in Cryptomeria japonica xylem. Trees - Structure and Function. 100 (8), 1-13 (2018).
  38. Cochard, H., Bodet, C., Ameglio, T., Cruiziat, P. Cryo-scanning electron microscopy observations of vessel content during transpiration in walnut petioles. Facts or artifacts? Plant Physiology. 124 (3), 1191-1202 (2000).
  39. Umebayashi, T., Ogasa, M. Y., Miki, N. H., Utsumi, Y., Haishi, T., Fukuda, K. Freezing xylem conduits with liquid nitrogen creates artifactual embolisms in water-stressed broadleaf trees. Trees - Structure and Function. 30 (1), 305-316 (2016).
  40. Wheeler, J. K., Huggett, B., Tofte, A. N., Rockwell, F. E., Holbrook, N. M. Cutting xylem under tension or supersaturated with gas can generate PLC and the appearance of rapid recovery from embolism. Plant, Cell and Environment. 36 (11), 1938-1949 (2013).
  41. Canny, M. J., Huang, C. X. The cohesion theory debate continues. Trends In Plant Science. 6 (10), 454-456 (2001).
  42. Suuronen, J. -P., Peura, M., Fagerstedt, K., Serimaa, R. Visualizing water-filled versus embolized status of xylem conduits by desktop x-ray microtomography. Plant Methods. 9 (1), 11(2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Krio SEMpomiar potencja u wodyprocedura relaksacji napi ciafiksacja mro eniowasekcjonowanie w kriotomietrawienie mro enioweciek y azotdynamika transportu wodyartefakty kawitacyjne
Dystrybucja wody ksylemu w roślinach drzewiastych wizualizowana za pomocą krioskaningowego mikroskopu elektronowego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.