Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Obrazowanie rentgenowskie tomografii komputerowej z mikroogniskowaniem (microCT) Actinia equina (Cnidaria), Harmothoe sp. (Annelida) i Xenoturbella japonica (Xenacoelomorpha)

8.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59161

⸱

6 sierpnia 2019

 ,  ,  , 
1Mammalian Genetics Laboratory, National Institute of Genetics, 2Misaki Marine Biological Station, The University of Tokyo, 3Shimoda Marine Research Center, University of Tsukuba

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj szczegółowo wyjaśnione są protokoły wykonywania obrazowania mikrofokusowego tomografii komputerowej (mikroCT) trzech morskich bezkręgowców. W tym badaniu opisano takie etapy, jak utrwalanie próbki, barwienie, montaż, skanowanie, rekonstrukcja obrazu i analiza danych. Podano również sugestie, w jaki sposób protokół może być dostosowany do różnych próbek.

Streszczenie

Tradycyjnie, biolodzy musieli polegać na destrukcyjnych metodach, takich jak sekcje, aby badać wewnętrzne struktury nieprzezroczystych organizmów. Nieniszczące obrazowanie rentgenowskiej tomografii komputerowej (microCT) z mikroogniskowaniem stało się potężnym i rozwijającym się protokołem w biologii, ze względu na postęp technologiczny w metodach barwienia próbek i innowacje w sprzęcie do mikrotomografii komputerowej, komputerach przetwarzających i oprogramowaniu do analizy danych. Jednak protokół ten nie jest powszechnie stosowany, jak ma to miejsce w medycynie i przemyśle. Jednym z powodów tego ograniczonego zastosowania jest brak prostej i zrozumiałej instrukcji, która obejmuje wszystkie niezbędne kroki: pobieranie próbek, utrwalanie, barwienie, montaż, skanowanie i analizę danych. Innym powodem jest ogromna różnorodność metazoanów, zwłaszcza bezkręgowców morskich. Ze względu na zróżnicowane rozmiary, morfologie i fizjologię bezkręgowców morskich, kluczowe znaczenie ma dostosowanie warunków eksperymentalnych i konfiguracji sprzętu na każdym etapie, w zależności od próbki. W tym miejscu szczegółowo wyjaśniono metody obrazowania mikrotomografii komputerowej na przykładzie trzech filogenetycznie zróżnicowanych bezkręgowców morskich: Actinia equina (Anthozoa, Cnidaria), Harmothoe sp. (Polychaeta, Annelida) i Xenoturbella japonica (Xenoturbellida, Xenacoelomorpha). Podano również sugestie dotyczące wykonywania obrazowania mikrotomografią komputerową u różnych zwierząt.

Wprowadzenie

Badacze biologii zazwyczaj musieli tworzyć cienkie przekroje i prowadzić obserwacje za pomocą mikroskopii świetlnej lub elektronowej, aby zbadać wewnętrzne struktury nieprzezroczystych organizmów. Jednak metody te są destrukcyjne i problematyczne, gdy stosuje się je do rzadkich lub cennych okazów. Co więcej, kilka etapów metody, takich jak osadzanie i cięcie, jest czasochłonnych, a obserwacja próbki może zająć kilka dni, w zależności od protokołu. Co więcej, podczas obsługi wielu sekcji zawsze istnieje możliwość uszkodzenia lub zgubienia niektórych sekcji. Techniki oczyszczania tkanek są dostępne dla niektórych okazów1,2,3,4,5, ale nie mają jeszcze zastosowania do wielu gatunków zwierząt.

Aby przezwyciężyć te problemy, niektórzy biolodzy zaczęli korzystać z obrazowania mikrofokusowej tomografii komputerowej (microCT) rentgenowskiej tomografii komputerowej (microCT)6,7,8,9,10,11,12,13,14,15. W tomografii rentgenowskiej próbka jest naświetlana promieniami rentgenowskimi pod różnymi kątami, które są generowane przez źródło promieniowania rentgenowskiego poruszającego się wokół próbki, a przesyłane promienie rentgenowskie są monitorowane przez detektor, który również porusza się wokół próbki. Uzyskane dane transmisji promieniowania rentgenowskiego są analizowane w celu rekonstrukcji obrazów przekroju poprzecznego próbki. Metoda ta umożliwia obserwację struktur wewnętrznych bez niszczenia próbki. Ze względu na swoje bezpieczeństwo i łatwość stosowania jest powszechnie stosowany w zastosowaniach medycznych i dentystycznych, a systemy CT można znaleźć w szpitalach i centrach dentystycznych na całym świecie. Co więcej, przemysłowa tomografia rentgenowska jest często stosowana do obserwacji próbek niemedycznych do kontroli i metrologii w przemyśle napędowym. W przeciwieństwie do medycznej tomografii komputerowej, w której źródło promieniowania rentgenowskiego i detektory są ruchome, obie części są zamocowane w przemysłowej tomografii komputerowej, a próbka obraca się podczas skanowania. Przemysłowa tomografia komputerowa na ogół wytwarza obrazy o wyższej rozdzielczości niż medyczna tomografia komputerowa i jest określana jako mikroCT (rozdzielczość na poziomie mikrometrów) lub nanoCT (rozdzielczość na poziomie nanometrów). Ostatnio gwałtownie wzrosła liczba badań z wykorzystaniem mikrotomografii komputerowej w różnych dziedzinach biologii14,15,16,17,18,19,20,21,22,23, 24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34.

Badania biologiczne z użyciem tomografii komputerowej początkowo koncentrowały się na wewnętrznych strukturach, które głównie składają się z twardych tkanek, takich jak kości. Postępy w technikach barwienia przy użyciu różnych środków chemicznych umożliwiły wizualizację tkanek miękkich w różnych organizmach6,7,8,9,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30, 31,32,33,34. Spośród tych odczynników, środki kontrastowe na bazie jodu są stosunkowo bezpieczne, niedrogie i mogą być stosowane do wizualizacji tkanek miękkich w różnych organizmach7,14. Jeśli chodzi o bezkręgowce morskie, mikrotomografia komputerowa jest szeroko stosowana u takich zwierząt jak6,25,32,33, pierścienice18,19,20,28, oraz arthoropods21,23, 29,31. Pojawiło się jednak niewiele doniesień o innych typach zwierząt, takich jak mszywioły6, xenacoelomorphs26 i parzydełkowce24,30. Ogólnie rzecz biorąc, przeprowadzono mniej badań z zastosowaniem mikrotomografii komputerowej na bezkręgowcach morskich niż na kręgowcach. Jednym z głównych powodów tego ograniczonego stosowania u bezkręgowców morskich jest ogromna różnorodność obserwowana u tych zwierząt. Ze względu na ich zróżnicowane rozmiary, morfologie i fizjologie, każdy gatunek inaczej reaguje na różne procedury eksperymentalne. Dlatego tak ważne jest, aby podczas przygotowywania próbki wybrać najodpowiedniejszy odczynnik utrwalający i barwiący oraz ustalić warunki na każdym etapie, dostosowane do każdego gatunku. Podobnie, konieczne jest również ustawienie konfiguracji skanowania, takich jak metoda montażu, napięcie, prąd, powiększenie mechaniczne i moc rozdzielczości przestrzeni, odpowiednio dla każdej próbki. Aby przezwyciężyć ten problem, niezbędna jest prosta i zrozumiała instrukcja, która obejmuje wszystkie niezbędne kroki, wyjaśnia, w jaki sposób każdy krok można dostosować w zależności od próbki, i pokazuje szczegółowe przykłady z wielu próbek.

W niniejszym badaniu opisujemy krok po kroku protokół obrazowania mikrotomografią komputerową, od fiksacji próbki do analizy danych, na użyciu trzech gatunków morskich bezkręgowców. Okazy ukwiału Actinia equina (Anthozoa, Cnidaria) zostały zebrane w pobliżu Misaki Marine Biological Station, University of Tokyo. Miały one kuliste, miękkie ciało o średnicy około 2 cm (ryc. 1A-C). Próbki Harmothoe sp. (Polychaeta, Annelida) pobrano również w pobliżu Misaki Marine Biological Station. Były to smukłe robaki o długości około 1,5 cm, z twardymi chaetae obecnymi na całym ciele (Ryc. 1D). Okaz Xenoturbella japonica35 (Xenoturbellida, Xenacoelomorpha) został zebrany w pobliżu Shimoda Marine Research Center, University of Tsukuba, podczas 13th JAMBIO Coastal Organism Joint Survey. Był to robak o miękkim ciele, który miał około 0,8 cm długości (ryc. 1E). Szczegółowo wyjaśniono korekty dokonane dla warunków i konfiguracji każdej próbki. Nasze badanie zawiera kilka sugestii, jak wykonywać obrazowanie mikroCT na bezkręgowcach morskich i mamy nadzieję, że zainspiruje biologów do wykorzystania tego protokołu w swoich badaniach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Fiksacja

  1. W przypadku Actinia equina należy zrelaksować zwierzęta w wodzie morskiej o stężeniu 10% MgCl2 przez około 15 minut w temperaturze pokojowej. Przenieś do 70% etanolu i przechowuj w temperaturze pokojowej.
  2. W przypadku Harmothoe sp. znieczulij zwierzęta, umieszczając je w lodowatej wodzie morskiej na około 15 minut. Przenieś do 10% (v/v) roztworu formaliny z wodą morską i przechowuj w temperaturze pokojowej.
  3. W przypadku Xenoturbella japonica należy zrelaksować zwierzę, stosując 7% MgCl2 w słodkiej wodzie. Utrwal 4% paraformaldehydu (PFA) w przefiltrowanej wodzie morskiej przez noc. Umieścić w 70% etanolu i przechowywać w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: PFA jest niebezpieczny i należy obchodzić się z nim ostrożnie.

2. Barwienie

  1. Przenieść próbki do 50% etanolu i przechowywać w temperaturze pokojowej przez 15 godzin. Zastąp 50% etanolu 25% etanolem i przechowuj w temperaturze pokojowej przez 2 godziny
    UWAGA: Nie jest to konieczne w przypadku próbki Harmothoe sp. w 10% (v/v) roztworze formaliny z wodą morską.
  2. Zastąp roztwór wodą destylowaną (DW) i przechowuj próbki w DW w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Powtórz ten krok trzy razy.
  3. Przygotować 25% płyn Lugola, rozcieńczając roztwór podstawowy (poniżej) do 25% za pomocą DW. Roztwór podstawowy (100% płyn Lugola) zawiera 10 g KI i 5 g I2, dostosowany do 100 ml z DW.
    UWAGA: Lugol jest płyn wrażliwy na światło, dlatego należy go przechowywać i obchodzić się z nim w sposób chroniony przed światłem. Postępuj zgodnie z przepisami każdego kraju i instytucji dotyczącymi postępowania z jodem i utylizacji odpadów.
  4. Zdekantować DW z próbek i wlać 25% płyn Lugola. Bejcować przez 24 godziny w temperaturze pokojowej.

3. Montaż sceniczny

  1. Przygotować 0,5% agarozy, rozpuszczając 500 mg agarozy w 100 ml DW w kolbie stożkowej o pojemności 250 ml w kuchence mikrofalowej (800 W, około 1-3 min). Schłodzić do około 30-40 °C, utrzymując w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Nie przegrzewaj ani nie zamykaj całkowicie kolby podczas podgrzewania, aby zapobiec wykipieniu agarozy.
  2. Zamontuj duże próbki, takie jak A. equina, za pomocą probówki o pojemności 50 ml.
    UWAGA: Do mocowania dużych próbek, które nie mieszczą się w "niebieskiej" końcówce mikropipety o pojemności 1 000 μl, należy używać probówek o pojemności 50 ml.
    1. Umieść zabarwioną próbkę w naczyniu o średnicy 60 mm z DW, aby zmyć nadmiar roztworu barwiącego z powierzchni.
    2. Delikatnie wlej 5 ml 0,5% agarozy do probówki o pojemności 50 ml i utwardź agarozę na lodzie. Uważaj, aby w agarozie nie zrobiły się bąbelki.
    3. Delikatnie dodaj 20 ml 0,5% agarozy do probówki o pojemności 50 ml i umieść na lodzie, aż agaroza zacznie twardnieć. Umieść próbkę w 0,5% agarozie za pomocą kleszczy. Uważaj, aby w agarozie nie zrobiły się bąbelki.
    4. Dostosuj położenie i orientację próbki za pomocą kleszczy i utwardź agarozę na lodzie.
    5. Umieść glinę na etapie montażu mikrotomografii komputerowej i ustaw probówkę o pojemności 50 ml na glinie (Rysunek 2A).
  3. Zamontuj małe próbki, takie jak Harmothoe sp. i X. japonica, za pomocą "niebieskiej" końcówki mikropipety o pojemności 1 000 μl.
    UWAGA: W przypadku mniejszych próbek można użyć "żółtej" końcówki do mikropipet o pojemności 200 μl. W takim przypadku użyj 30 μl agarozy jako korka i dodaj 200 μl agarozy lub wody destylowanej.
    1. Pobrać 100 μl 0,5% agarozy do "niebieskiej" końcówki mikropipety o pojemności 1 000 μl i utwardzić agarozę, przytrzymując końcówkę nad lodem, tworząc zatyczkę w końcówce (Rysunek 2B-a).
    2. Przelać zabarwioną próbkę do naczynia o średnicy 60 mm bez użycia kleszczy.
    3. Delikatnie przenieś próbkę za pomocą pęsety pierścieniowej do innego naczynia o średnicy 60 mm z DW, aby zmyć nadmiar roztworu barwiącego z powierzchni.
    4. Dodać 1 000 μl 0,5% agarozy lub DW do zatkanej końcówki (krok 3.3.1) za pomocą mikropipety.
      UWAGA: Zaleca się stosowanie 0,5% agarozy, ale DW należy stosować do delikatnych lub cennych próbek, w których należy unikać agarozy.
    5. Delikatnie przenieś próbkę z naczynia o średnicy 60 mm do agarozy lub DW w zatkanej końcówce za pomocą pęsety pierścieniowej.
    6. Delikatnie dostosuj pozycję i orientację próbki za pomocą igły do ogonków liściowych lub precyzyjnej pęsety. Uważaj, aby nie zrobić bąbelków w podłożu montażowym. Upewnij się, że próbka jest stabilna między ściankami końcówki, gdy DW jest używany jako medium montażowe (Rysunek 2D-b). Umieść końcówkę na lodzie, aby utwardzić agarozę, jeśli jest używana jako medium montażowe.
    7. Odetnij końcówkę nowej "niebieskiej" końcówki mikropipety o pojemności 1 000 μl (Rysunek 2B-b,c) i włóż końcówkę zatkanej końcówki do nowej końcówki.
    8. Umieść glinę na etapie montażu mikrotomografii komputerowej i ustaw końcówki z próbką w środku na glinie (Rysunek 2C,D).
      UWAGA: Roztwór barwiący zacznie zmywać próbkę po umieszczeniu jej w DW, więc natychmiast przejdź do następnego kroku skanowania.

4. Badanie mikrotomografem komputerowym

  1. Włącz wiązkę promieniowania rentgenowskiego przy napięciu 80 kV, 100 μA.
  2. Obserwując obraz transmisji promieniowania rentgenowskiego na środku ekranu (Rysunek 3A), przesuń stolik tak, aby cała próbka była widoczna, klikając przyciski osi X i Z (Rysunek 3A) i ręcznie regulując pokrętło osi Y na stoliku montażowym (Rysunek 3B). Ustaw kontrast obrazu tak, aby można było obserwować struktury wewnętrzne, dostosowując warunki kontrastu (Rysunek 3A: Kontrast obrazu).
  3. Dostosuj orientację próbki, zmieniając kąt rurki/końcówki w glinie (Rysunek 2A). Obróć stolik o 90°, ustawiając oś obrotu (Rysunek 3A) na 90 i klikając przycisk ruchu względnego (Rysunek 3A). Wykonaj ten sam manewr cztery razy, aby wykonać pełny obrót.
    UWAGA: Ręcznie wyłączaj wiązkę promieniowania rentgenowskiego za każdym razem, gdy drzwiczki próbki są otwierane, chyba że system wyłączy ją automatycznie.
  4. Przesuń stolik tak, aby próbka znalazła się w środku widoku, klikając przycisk osi Z (Rysunek 3A) i ręcznie regulując pokrętło osi Y na stoliku montażowym (Rysunek 3B). Obróć scenę o 90° i zrób to samo. Obróć stolik o 360° i sprawdź, czy próbka znajduje się w środku view ze wszystkich kierunków.
  5. Przesuń stolik wzdłuż osi x w kierunku źródła wiązki promieniowania rentgenowskiego, klikając przycisk osi X ( Rysunek 3A), aby powiększyć próbkę i dostosować ją w razie potrzeby, aby pasowała do widoku ( Rysunek 3 C).
  6. Obróć stolik o 360° i dostosuj w razie potrzeby, aby próbka zmieściła się w polu widzenia ze wszystkich kierunków.
  7. Dostosuj warunki skanowania, jak pokazano w Tabeli 1.
  8. Rozpocznij skanowanie, które zajmie około 10 minut.

5. Rekonstrukcja obrazu

  1. Uruchom oprogramowanie akcesoriów systemu microCT (patrz tabela materiałów) i otwórz zeskanowane dane.
  2. Dostosuj różnice w osi obrotu próbki podczas skanowania, klikając przycisk automatycznego obliczania wartości przesunięcia (Rysunek 4A: zielone pole).
  3. Dostosuj orientację obrazu, obracając pomarańczowe strzałki (Rysunek 4B). Jeśli orientacja została zmieniona, powtórz krok 5.2.
  4. Kliknij zakładkę obszaru (Rysunek 4C: pole magenta) i przytnij obszary, w których nie ma próbek (Rysunek 4C: żółte pole).
  5. Kliknij na zakładkę rekonfiguracji (Rysunek 4D: pole magenta) i ustaw filtry w następujący sposób, aby usunąć szum. Filtr redukujący artefakty pierścienia: Filtr mediany -3; Filtr eliminacji szumów: Filtr średnia-1.
  6. Wykonaj rekonfigurację, klikając przycisk rekonfiguracji (Rysunek 4D: zielone pole).
  7. Dostosuj jasność i kontrast obrazu, ustawiając wartości czerni i bieli jako wartość czerni 0, wartość bieli 250 (Rysunek 4D: niebieskie pole).
  8. Zapisz zrekonstruowany zestaw danych obrazu TIFF jako 8-bitowy TIFF, klikając przycisk Zapisz. Zmień nazwy plików TIFF na następujące: Date_sample_resolution (μm)_number.tiff.
    UWAGA: Oryginalne zestawy danych mikrotomografii komputerowej z tego badania są dostępne w repozytorium Figshare, doi:10.6084/m9.figshare.767083736.

6. Analizy danych

  1. Uruchom oprogramowanie do analizy danych (patrz tabela materiałów) i włącz importowanie plików TIFF, klikając ikonę bazy danych (Rysunek 5A: pole magenta) i wyłączając pole pokazane w Rysunek 5B.
  2. Kliknij ikonę importu (Rysunek 5C: pole magenta), wybierz zestaw danych zapisany w sekcji 5 i kliknij przycisk Otwórz.
  3. Kliknij przycisk kopiowania linków (Rysunek 5D), aby zaimportować dane.
  4. Wyświetl przekrój 2D, klikając ikonę przeglądarki 2D (Rysunek 5C: niebieskie pole).
  5. Skalibruj zestaw danych, klikając zakładkę przeglądarki 3D (Rysunek 5E: pole magenta) i wprowadzając wartość rozdzielczości podczas skanowania (która w tym badaniu wynosiła 0,018 [Rysunek 5F]).
  6. Kliknij ikonę jasności/kontrastu (Rysunek 5E zielone pole). Dostosuj jasność i kontrast, przesuwając kursor wewnątrz wyświetlanego obrazu 2D i zmieniając poziom i szerokość okna (Rysunek 5G).
  7. Sprawdź inne obrazy przekrojów, przesuwając pasek przewijania (Rysunek 5G: pole).
  8. Zmień orientację przekroju, klikając ikonę orientacji (Rysunek 5E: niebieskie pole) i sprawdź obrazy we wszystkich orientacjach (Rysunek 5H).
  9. Kliknij na wyświetlony obraz i wybierz zakładkę eksportu, aby zapisać obrazy przekrojów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wykonano obrazowanie mikrotomografią komputerową (microCT) na osobnikach A. equina (Anthozoa, Cnidaria), Harmothoe sp. (Polychaeta, Annelida) oraz X. japonica (Xenoturbellida, Xenacoelomorpha) po ich barwieniu 25% roztworem Lugola. Barwienie skutecznie zwiększyło kontrast struktur wewnętrznych we wszystkich próbkach, umożliwiając obserwację miękkich tkanek wewnętrznych (Rycina 6). W połączeniu z wcześniejszymi doniesieniami6,

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Wiadomo, że utrwalacze wykorzystujące formalinę, takie jak 10% (v/v) roztwór formaliny w wodzie morskiej użyty w tym badaniu, zachowują morfologię różnych bezkręgowców morskich i są często używane do obrazowania mikrotomografii komputerowej 18,24,25,26,28,30,33. Jednak w ostatnich latach w n...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować Toshihiko Shiroishi za pomoc i zapewnienie środowiska badawczego podczas tego badania. Jesteśmy wdzięczni Kensuke Yanagi i Takato Izumi za porady dotyczące A. equina oraz Masaatsu Tanaka za porady dotyczące okazu Harmothoe sp. Chcielibyśmy podziękować personelowi Shimoda Marine Research Center, University of Tsukuba oraz Misaki Marine Biological Station, The University of Tokyo za pomoc w pobraniu próbek. Serdecznie dziękujemy firmie Editage (www.editage.jp) za redakcję w języku angielskim. Prace te były wspierane przez JSPS Grant-in-Aid for Young Scientists (A) (JP26711022) dla HN oraz JAMBIO, Japońskie Stowarzyszenie Biologii Morskiej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kolba Erlenmeyera 250 mlCorningCLS430183
5 ml Probówka do pobierania próbek ST-500BIO-BIK103010
50 ml Probówka polipropylenowaGreiner Bio One International227261
60 mm bez obróbkiIWAKI1010-060
AgarozaPromegaV3125
Końcówka ekologiczna (niebieska) 1000 &mikro; lBMBioBIO1000RF
EtanolWako Pure Chemical Industries057-00451
FormalinWako Pure Chemical Industries061-00416
JodWako Pure Chemical Industries094-05421
Sześciowodny chlorek magnezuWako Pure Chemical Industries135-00165
Przeglądarka OsiriX DICOMPixmeo SARLOsiriX MD v10.0https://www.osirix-viewer.com
ParaformaldehydWako Pure Chemical Industries163-25983
Igła PetiolateAS ONE2-013-01
Mikropipeta Pipetman P200GILSONF123601
Mikropipeta Pipetman P1000GILSONF123602
Jodek potasuWako Pure Chemical Industries166-03971
Pęseta precyzyjna 5DUMONT0302-5-PS
Końcówka QuickRack MultI fit (żółta) 200 ulSorenson10660
ŻyletkiFeatherFA-10
Pęseta pierścieniowaNAPOXA-26
Mikroskop stereoskopowyLeicaMZ95
System obrazowania rentgenowskiego Micro-CTComscantechnoScanXmate-E090S105

Bibliografia

  1. Susaki, E. A., Tainaka, K., Perrin, D., Yukinaga, H., Kuno, A., Ueda, H. R. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).
  2. Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: toward organism-level systems biology in mammals. Cell Chemical Biology. 23, 137-157 (2016).
  3. Silvestri, L., Costantini, I., Sacconi, L., Pavone, F. S. Clearing of fixed tissue: a review from a microscopist's perspective. Journal of Biomedical Optics. 21, 081205(2016).
  4. Greenbaum, A., et al. Bone CLARITY: clearing, imaging, and computational analysis of osteoprogenitors within intact bone marrow. Science Translational Medicine. 9, (2017).
  5. Konno, A., Okazaki, S. Aqueous-based tissue clearing in crustaceans. Zoological Letters. 4, 13(2018).
  6. Metscher, B. D. MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues. BMC Physiology. 9, 11(2009).
  7. Metscher, B. D. MicroCT for developmental biology: a versatile tool for high-contrast 3D imaging at histological resolutions. Developmental Dynamics. 238 (3), 632-640 (2009).
  8. Degenhardt, K., Wright, A. C., Horng, D., Padmanabhan, A., Epstein, J. A. Rapid 3D phenotyping of cardiovascular development in mouse embryos by micro-CT with iodine staining. Circulation Cardiovascular Imaging. 3 (3), 314-322 (2010).
  9. Metscher, B. D. X-ray microtomographic imaging of intact vertebrate embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 12, 1462-1471 (2011).
  10. Boistel, R., Swoger, J., Kržič, U., Fernandez, V., Gillet, B., Reynaud, E. G. The future of three-dimensional microscopic imaging in marine biology. Marine Ecology. 32, 438-452 (2011).
  11. Mizutani, R., Suzuki, Y. X-ray microtomography in biology. Micron. 43, 104-115 (2012).
  12. Merkle, A. P., Gelb, J. The ascent of 3D X-ray microscopy in the laboratory. Microscopy Today. 21, 10-15 (2013).
  13. Ziegler, A., Menze, B. H. Accelerated acquisition, visualization, and analysis of zooanatomical data. Computation for humanity. Information technology to advance society. Zander, J., Mosterman, P. J. , CRC Press. Boca Raton, USA. 233-260 (2013).
  14. Gignac, P. M., et al. Diffusible iodine-based contrast-enhanced computed tomography (diceCT): an emerging tool for rapid, high-resolution, 3-D imaging of metazoan soft tissues. Journal of Anatomy. 228 (6), 889-909 (2016).
  15. du Plessis, A., Broeckhoven, C., Guelpa, A., le Roux, S. G. Laboratory x-ray micro-computed tomography: a user guideline for biological samples. GigaScience. 6 (6), 1-11 (2017).
  16. Faulwetter, S., Vasileiadou, A., Kouratoras, M., Dailianis, T., Arvanitidis, C. Micro-computed tomography: Introducing new dimensions in taxonomy. ZooKeys. 263, 1-45 (2013).
  17. Staedler, Y. M., Masson, D., Schonenberger, J. Plant tissues in 3D via X-ray tomography: simple contrasting methods allow high resolution imaging. PLoS One. 8 (9), 75295(2013).
  18. Fernández, R., Kvist, S., Lenihan, J., Giribet, G., Ziegler, A. Sine Systemate Chaos? A Versatile Tool for Earthworm Taxonomy: Non-Destructive Imaging of Freshly Fixed and Museum Specimens Using Micro-Computed Tomography. PLoS One. 9 (5), 96617(2014).
  19. Paterson, G. L. J., et al. The pros and cons of using micro-computed tomography in gross and microanatomical assessments of polychaetous annelids. Memoirs of Museum Victoria. 71, 237-246 (2014).
  20. Faulwetter, S., Dailianis, T., Vasileiadou, K., Kouratoras, M., Arvanitidis, C. Can micro-CT become an essential tool for the 21st century taxonomist? An evaluation using marine polychaetes. Microscopy and Analysis. 28, 9-11 (2014).
  21. Sombke, A., Lipke, E., Michalik, P., Uhl, G., Harzsch, S. Potential and limitations of X-ray micro-computed tomography in arthropod neuroanatomy: a methodological and comparative survey. Journal of Comparative Neurology. 523, 1281-1295 (2015).
  22. Landschoff, J., Plessis, A., Griffiths, C. L. A dataset describing brooding in three species of South African brittle stars, comprising seven high-resolution, micro X-ray computed tomography scans. GigaScience. 4 (1), 52(2015).
  23. Keiler, J., Richter, S., Wirkner, C. S. The anatomy of the king crab Hapalogaster mertensii Brandt, 1850 (Anomura: Paguroidea: Hapalogastridae) - new insights into the evolutionary transformation of hermit crabs into king crabs. Contributions to Zoology. 84 (2), 149-165 (2015).
  24. Holst, S., Michalik, P., Noske, M., Krieger, J., Sötje, I. Potential of X-ray micro-computed tomography for soft-bodied and gelatinous cnidarians with emphasis on scyphozoan and cubozoan statoliths. Journal of Plankton Research. 38, 1225-1242 (2016).
  25. Moles, J., Wägele, H., Ballesteros, M., Pujals, Á, Uhl, G., Avila, C. The End of the Cold Loneliness: 3D Comparison between Doto antarctica and a New Sympatric Species of Doto (Heterobranchia: Nudibranchia). PLoS One. 11 (7), 0157941(2016).
  26. Nakano, H., et al. A new species of Xenoturbella from the western Pacific Ocean and the evolution of Xenoturbella. BMC Evolutionary Biology. 17, 245(2017).
  27. Tsuda, K., et al. KNOTTED1 Cofactors, BLH12 and BLH14, Regulate Internode Patterning and Vein Anastomosis in Maize. Plant Cell. 29 (5), 1105-1118 (2017).
  28. Parapar, J., Candás, M., Cunha-Veira, X., Moreira, J. Exploring annelid anatomy using micro-computed tomography: A taxonomic approach. Zoologischer Anzeiger. 270, 19-42 (2017).
  29. Akkari, N., Ganske, A. S., Komerički, A., Metscher, B. New avatars for Myriapods: Complete 3D morphology of type specimens transcends conventional species description (Myriapoda, Chilopoda). PLoS One. 13 (7), 0200158(2018).
  30. Gusmao, L. C., Grajales, A., Rodriguez, E. Sea anemones through X-rays: visualization of two species of Diadumene (Cnidaria, Actiniaria) using micro-CT. American Museum Novitates. 3907, (2018).
  31. Landschoff, J., Komai, T., du Plessis, A., Gouws, G., Griffiths, C. L. MicroCT imaging applied to description of a new species of Pagurus Fabricius, 1775 (Crustacea: Decapoda: Anomura: Paguridae), with selection of three-dimensional type data. PLoS One. 13 (9), 0203107(2018).
  32. Machado, F. M., Passos, F. D., Giribet, G. The use of micro-computed tomography as a minimally invasive tool for anatomical study of bivalves (Mollusca: Bivalvia). Zoological Journal of the Linnean Society. , (2018).
  33. Sasaki, T., et al. 3D visualization of calcified and non-calcified molluscan tissues using computed tomography. Biomineralization. Endo, K., Kogure, T., Nagasawa, H. , Springer. Singapore. 83-93 (2018).
  34. Maeno, A., Tsuda, K. Micro-computed Tomography to Visualize Vascular Networks in Maize Stems. Bio-protocol. 8 (1), 2682(2018).
  35. Nakano, H., et al. Correction to: A new species of Xenoturbella from the western Pacific Ocean and the evolution of Xenoturbella. BMC Evolutionary Biology. 18, 83(2018).
  36. Maeno, A., Kohtsuka, H., Takatani, K., Nakano, H. MicroCT files from 'Microfocus X-ray computed tomography (microCT) imaging of Actinia equina (Cnidaria), Harmothoe sp. (Annelida), and Xenoturbella japonica (Xenacoelomorpha)'. figshare. , (2019).
  37. Vickerton, P., Jarvis, J., Jeffery, N. Concentration-dependent specimen shrinkage in iodine-enhanced microCT. Journal of Anatomy. 223 (2), 185-193 (2013).
  38. Buytaert, J., Goyens, J., De Greef, D., Aerts, P., Dirckx, J. Volume shrinkage of bone, brain and muscle tissue in sample preparation for micro-CT and light sheet fluorescence microscopy (LSFM). Microscopy and Microanalysis. 20 (4), 1208-1217 (2014).
  39. Sasov, A., Liu, X., Salmon, P. L. Compensation of mechanical inaccuracies in micro-CT and nano-CT. Proceedings of SPIE. 7078, 70781(2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Bezkr gowce morskiemontowanie pr bekzatapianie w agaroziebarwienie Lugolemskanowanie rentgenowskierekonstrukcja 3Dmorfologia wewn trznaobrazowanie nieniszcz ce
Obrazowanie rentgenowskie tomografii komputerowej z mikroogniskowaniem (microCT) Actinia equina (Cnidaria), Harmothoe sp. (Annelida) i Xenoturbella japonica (Xenacoelomorpha)
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.