Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Przygotowanie i barwienie immunologiczne mielinizujących organotypowych kultur warstwowych móżdżku

11K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59163

⸱

20 marca 2019

 ,  ,  ,  , 
1Sorbonne Université, Inserm, CNRS, Institut du Cerveau et de la Moelle épinière, ICM-GH Pitié-Salpétrière

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy metodę przygotowania organotypowych kultur warstwowych z barwienia móżdżku myszy i osłonki mielinowej za pomocą immunohistochemii, odpowiednią do badania mechanizmów mielinizacji i remielinizacji w ośrodkowym układzie nerwowym.

Streszczenie

W układzie nerwowym, mielina jest złożoną strukturą błonową generowaną przez mielinizujące się komórki glejowe, która otacza aksony i ułatwia szybkie przewodnictwo elektryczne. Wykazano, że zmiany mielinowe występują w różnych chorobach neurologicznych, gdzie są związane z deficytami funkcjonalnymi. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy opis modelu ex vivo składającego się z mysich organotypowych wycinków móżdżku, które można przechowywać w hodowli przez kilka tygodni, a następnie znakować w celu wizualizacji mieliny.

Wprowadzenie

Neurony to wysoce spolaryzowane komórki, które składają się z komory somato-dendrytycznej, która otrzymuje dane wejściowe z otoczenia, oraz aksonu, który zapewnia generowanie i propagację impulsów elektrycznych do innych komórek. Szybkie propagowanie i terminowe dostarczanie informacji jest niezbędne do prawidłowego funkcjonowania układu nerwowego. U kręgowców jest to ułatwione przez mielinizację, która pozwala na zwiększenie prędkości przewodzenia aksonalnego1. Mielina jest wyspecjalizowaną strukturą utworzoną przez zagęszczone warstwy błony plazmatycznej wytwarzane przez mielinizujący glej, a mianowicie oligodendrocyty w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) i komórki Schwanna w obwodowym układzie nerwowym (PNS). Zarówno w OUN, jak i PNS, interakcje aksoglialne napędzają tworzenie wyspecjalizowanych domen aksonalnych: węzłów Ranviera i otaczających je domen, parawęzłów i juxtaparanodes2. Segmenty aksonalne izolowane mieliną lub międzywęźlami przeplatają się z węzłami Ranviera, które odpowiadają małym niezmielinizowanym domenom wzbogaconym w kanały sodowe bramkowane napięciem (Nav). Wysokie stężenie i szybka aktywacja kanałów Nav w węzłach Ranviera umożliwiają regenerację potencjałów czynnościowych, a wraz z właściwościami izolacyjnymi osłonek mielinowych zapewniają skuteczne i szybkie przewodzenie solne impulsu nerwowego wzdłuż aksonu3.

Oprócz swojej roli w przyspieszaniu prędkości przewodzenia impulsu nerwowego, mielinizacja gleju zapewnia metaboliczne wsparcie aksonowi, zachowując jego długoterminową integralność i uczestnicząc w jego przetrwaniu4,5. Co więcej, w ostatnich latach stało się jasne, że mielina jest dynamicznie modulowana przez całe życie, przypuszczalnie uczestnicząc w ten sposób w regulacji i plastyczności różnych funkcji układu nerwowego. Korekty rozkładu, liczby, długości i grubości osłonek mielinowych wzdłuż aksonów mogą zatem stanowić nowatorski sposób precyzyjnego dostrajania różnych sieci6,7,8. W związku z tym ewolucyjne nabywanie mieliny jest kluczowym procesem dla funkcji czuciowych, motorycznych i poznawczych, a zaburzenia interakcji między aksonami a glejem są coraz częściej uważane za przyczyniające się do rozwoju lub nabytych chorób neurologicznych9.

Scharakteryzowano skład mieliny, którego specyficzną cechą jest wysoki udział lipidów (70%) w porównaniu z białkami (30%) w przeciwieństwie do innych błon komórkowych10. Jednak w przeciwieństwie do lipidów mielinowych, większość białek mieliny jest specyficzna dla mieliny, w tym podstawowe białko mieliny (MBP), białko proteolipidowe (PLP), 2',3'-cykliczny nukleotyd 3'-fosfodiesterazy (CNP), glikoproteina związana z mieliną (MAG), glikoproteina mielinowo-oligodendrocytowa (MOG), PMP-22 i P010. Istnieją różne metody histologiczne barwienia mieliny w oparciu o jej skład lipidowy, takie jak Luxol fast blue11, Sudan Black B12, metoda hematyny kwasowej Bakera13, a także barwienie srebrem14. Niemniej jednak podejścia te nie zawsze pozwalają na odpowiedni kontrast i rozdzielczość do wizualizacji poszczególnych włókien. Alternatywnym podejściem do wykrywania mieliny jest immunohistochemia skierowana przeciwko białkom mieliny. Różne przeciwciała są ukierunkowane na antygeny specyficzne dla mieliny o wysokiej swoistości i mogą być rutynowo stosowane do wykrywania struktur mielinowych. Interakcja przeciwciało-antygen może być dalej ujawniona za pomocą przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z fluoroforem skierowanym przeciwko przeciwciału pierwszorzędowemu i uwidocznionego za pomocą odpowiedniej mikroskopii fluorescencyjnej. W tym miejscu opisujemy protokół immunochemiczny barwienia mieliny na wycinkach móżdżku ex vivo, model, który pozwala na dobre zachowanie architektury tkanki nerwowej. Ponadto organizacja i rozmiar komórek Purkinjego (jedyny zmielinizowany neuron móżdżku) sprawiają, że są one klasycznym modelem do badań elektrofizjologicznych i są podobnie idealne do wykonywania badań obrazowania stałego lub na żywo.

Warstwy móżdżku są generowane z myszy P9-P10, czas odpowiadający wczesnemu początkowi mielinizacji komórek Purkinjego, procesu, który najczęściej osiąga się przez jeden tydzień ex vivo (6-7 dni in vitro, DIV)15. Ponadto model ten jest przystosowany do badania zaburzeń demielinizacyjnych, takich jak stwardnienie rozsiane (SM), ponieważ rozległa demielinizacja może być indukowana w wycinkach móżdżku za pomocą związku mielinotoksycznego lizofosfatydylocholiny (lub lizolecytyny, LPC), po której następuje spontaniczna remielinizacja16,17. Endogenna remielinizacja odbywa się po dwóch dniach od usunięcia LPC z pożywki hodowlanej i jest prawie zakończona tydzień po zabiegu.

Ukończenie tego protokołu zajmuje około 3 tygodnie, w tym pół dnia na przygotowanie kultur móżdżku, tydzień na uzyskanie w pełni zmielinizowanych plastrów, następnie 2 dni na osiągnięcie szczytu demielinizacji i kolejny tydzień na ich pełną remielinizację. Ponadto immunohistochemię można wykonać w ciągu 2 dni. Opisany tutaj protokół jest dostosowany do standardowego miotu 6 młodych myszy i musi być dostosowany do liczby zwierząt wykorzystanych do planowanego eksperymentu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie prace związane ze zwierzętami były zgodne z instytucjonalnymi zasadami i wytycznymi ustanowionymi przez UPMC, INSERM oraz Dyrektywę Rady Francji i Wspólnoty Europejskiej 86/609/EWG.

1. Przygotowanie podłoża hodowlanego i wkładek do kultur (czas pracy ≈ 10–15 min)

UWAGA: Wykonaj ten krok w okapie do hodowli przepływowej w sterylnych warunkach.

  1. Przygotuj 40 ml pożywki hodowlanej, która składa się z 50% BME, 25% zbilansowanego roztworu soli Hanka (1x), 25% inaktywowanej termicznie surowicy końskiej, uzupełnionej 2 mM pochodną glutaminy, 100 j.m./ml penicyliny-streptomycyny i 4,5 mg/ml D-glukozy. Dostosować pH do 7,4.
  2. Przefiltruj i wysterylizuj pożywkę przez filtr 0,22 μm przystosowany do plastikowej strzykawki o pojemności 50 ml.
    nuta: Pożywkę hodowlaną można przechowywać w temperaturze 4 °C przez co najmniej tydzień.
  3. W przypadku standardowego miotu składającego się z 6 szczeniąt należy użyć dwóch sterylnych płytek 6-dołkowych. Na każdą płytkę zdejmij pokrywę i dodaj 1 ml pożywki do akwarium
    4. .
  4. Umieść jedną wkładkę hodowlaną w każdej studzience, przytrzymując plastikową krawędź sterylnymi kleszczami. Załóż pokrywę z powrotem na talerz.
    nuta: Plastry móżdżku pobrane od jednego młodego (6-8) mogą być wysyłane na dwie błony (3-4 plastry móżdżku na wkładkę błonową).

2. Przygotowanie podłoża preparacyjnego (czas ćwiczeń ≈ 5 min)

UWAGA: Wykonaj ten krok w kapturze do hodowli przepływowej w sterylnych warunkach.

  1. Przygotuj 100 ml pożywki preparyjnej, która składa się ze zbilansowanego roztworu soli Geya uzupełnionego 4,5 mg / ml D-glukozy i 1x penicyliny-streptomycyny (100 IU / ml każdy).
  2. Filtruj i sterylizuj medium przez jednostkę filtrującą 0,22 μm.
    nuta: Pożywka preparująca może być przechowywana w temperaturze 4 °C przez co najmniej miesiąc.
  3. Dodać 5 ml zimnej pożywki preparacyjnej do 60 mm szalek do hodowli komórkowych. Przygotuj jedno naczynie do hodowli komórkowych o średnicy 60 mm dla każdego młodego, które ma zostać poddane sekcji.
  4. Trzymaj naczynia do wycinki na lodzie do czasu użycia.

3. Przygotowanie materiału preparacyjnego (czas praktyczny ≈ 15 min)

  1. Wyczyść ławkę 100% etanolem.
  2. Wysterylizuj wszystkie narzędzia do preparowania, żyletkę i plastikową platformę rozdrabniacza tkanek 100% etanolem.
  3. Zamocuj żyletkę i plastikową platformę na rozdrabniaczu do tkanek i dostosuj grubość cięcia do 300 μm.
  4. Upewnij się, że cały etanol wyparował przed rozpoczęciem sekcji.

4. Presekcja móżdżku i przygotowanie sekcji (czas ćwiczeń ≈ 15–20 minut na zwierzę)

  1. Umieścić jedną z 60-milimetrowych szalek do hodowli komórkowych zawierających lodowatą pożywkę separacyjną pod mikroskopem dwuokularowym i zdjąć górną płytkę.
  2. Przetrzyj sierść głowy 70% etanolem (ostrożnie unikając dotykania oczu zwierzęcia) i odetnij głowę zwierzęcia dużymi ostrymi nożycami, zgodnie z zatwierdzoną procedurą.
    nuta: Plastry móżdżku są generowane z myszy P9-P10 bez określonego odchylenia płciowego lub szczepu.
  3. Użyj małych nożyczek, aby przeciąć skórę wzdłuż linii środkowej głowy, zaczynając od szyi i idąc w górę do pyska myszy.
  4. Aby przytrzymać głowę i odsłonić czaszkę, odchyl skórę brzusznie pod głową i ściśnij dwa fałdy skóry między palcami.
  5. Delikatnie włóż małe nożyczki do otworu wielkiego i przetnij czaszkę, wykonując jedno boczne nacięcie w bok, a następnie przetnij wokół czaszki głowy. Podczas cięcia trzymaj czubek nożyczek jak najbardziej równolegle i blisko czaszki, aby uniknąć uszkodzenia tkanki mózgowej.
  6. Odzyskaj grzbietową część czaszki za pomocą drobno prostych kleszczy. Ostrożnie unosząc grzbietową część czaszki, w razie potrzeby przetnij przylegające opony mózgowe (półprzezroczystą nawadnianą błonę otaczającą tkankę mózgową), aby uniknąć uszkodzenia tkanki mózgowej.
  7. Ostrożnie wprowadź drobno-proste kleszcze (lub alternatywnie użyj szpatułki) między brzuszną czaszkę a mózg, delikatnie odwróć mózg i przetnij nerwy wzrokowe i trójdzielne małymi nożyczkami.
  8. Pomóż mózgowi opaść grawitacyjnie do naczynia do hodowli komórkowych o średnicy 60 mm zawierającego lodowatą pożywkę do preparacji, obracając głowę do góry nogami tuż nad naczyniem i w razie potrzeby uwalniając ostatnie zrosty małymi nożyczkami.
  9. Za pomocą cienkich kleszczy zorientuj mózg tak, aby strona grzbietowa była skierowana w stronę badacza, a strona brzuszna leżała na dnie naczynia.
  10. Pod mikroskopem lornetkowym użyj cienkich, prostych kleszczy, aby unieruchomić mózg po stronie przodomózgowia i unikaj dotykania tyłomózgowia, ponieważ może dojść do uszkodzenia. Oddziel tyłomózgowie od reszty mózgu (przodomózgowie i śródmózgowie, patrz schemat na Rysunek 1Aa), używając drobno prostych kleszczy. Aby oddzielić móżdżek od reszty tyłomózgowia, użyj cienkich kleszczy, aby przeciąć szypułki móżdżku pod móżdżkiem (patrz schemat na rysunku 1Aa').
  11. Po wyizolowaniu móżdżku ostrożnie oderwij opony mózgowe za pomocą drobno prostych kleszczy (patrz schemat na rysunku 1Aa').
  12. Chwyć delikatnie móżdżek za pomocą cienkich zakrzywionych kleszczyków i umieść go grzbietem do góry na plastikowej platformie prostopadle do żyletki do rozdrabniacza (patrz schemat na Rysunek 1Bb).
  13. Nadmiar pożywki preparacyjnej wokół móżdżku należy odessać za pomocą sterylnej końcówki pipety z cienkim końcem dostosowanej do pipety o pojemności 1 ml (patrz schemat na rysunku 1Bb).
  14. Upewnij się, że móżdżek leży płasko, ale nie jest rozciągnięty, po umieszczeniu na platformie, aby uzyskać optymalne plastry strzałkowe podczas cięcia (patrz schemat na rysunku 1Bb).
  15. Pokrój strzałkowe odcinki móżdżku o grubości 300 μm za pomocą rozdrabniacza tkanek (patrz schemat na rysunku 1Bb'). Siła i prędkość ostrza muszą być zoptymalizowane na miejscu.
  16. Delikatnie dodaj kroplę pożywki preparacyjnej na pokrojony móżdżek. Używając końcówki pipety o szerokim otworze umieszczonej na pipecie o pojemności 1 ml, powoli odessać pokrojony móżdżek i przenieść go z powrotem do 60-milimetrowej płytki do hodowli komórkowej zawierającej lodowato zimne podłoże preparacyjne (patrz schemat na rysunku 1Bb'').
  17. Wyczyść plastikową platformę rozdrabniacza tkanek 100% etanolem między każdym krojeniem móżdżku. Pozwól, aby etanol odparował przed umieszczeniem następnego móżdżku na platformie.
  18. Użyj dwóch drobno prostych kleszczyków (lub alternatywnie tytanowych igieł), aby oddzielić poszczególne plastry i wybierz 6-8 plasterków z robaka (patrz schemat na rysunku 1Cc i 1Cc').
  19. Weź 6-dołkową płytkę z wkładkami hodowlanymi i przenieś do 4 wybranych wycinków na jedną wkładkę hodowlaną wraz z odrobiną pożywki preparcyjnej, używając końcówki pipety o szerokim otworze dostosowanej do pipety o pojemności 1 ml (patrz schemat na rysunku 1Cc').
  20. Umieść plastry na środku wkładki hodowlanej, używając pożywki do preparowania lub kleszczy, aby delikatnie popchnąć i pociągnąć je we właściwe miejsce, unikając ich kontaktu ze sobą (patrz schemat na rysunku 1Cc').
  21. Usuń nadmiar pożywki preparacyjnej wokół plastrów za pomocą cienkiej końcówki pipety. Upewnij się, że plastry leżą płasko na membranie (patrz schemat na rysunku 1Cc').
  22. Umieścić płytkę 6-dołkową w inkubatorze natychmiast po dodaniu plastrów do membrany.

5. Plastry Kultura i Demielinizacja (czas praktyczny ≈ 15–20 min)

UWAGA: Wykonaj ten krok w kapturze do hodowli przepływowej w sterylnych warunkach.

  1. Zastąp pożywkę hodowlaną 1 ml na studzienkę wstępnie podgrzanej i buforowanej świeżej pożywki hodowlanej co 3 dni po przygotowaniu plastrów.
  2. W przypadku demielinizacji należy usunąć całą pożywkę hodowlaną poniżej wkładek hodowlanych po 6 dniach in vitro (DIV) i zastąpić ją 1 ml na studzienkę wstępnie podgrzanej świeżej pożywki hodowlanej zawierającej 0,5 mg/ml LPC. Inkubować przez 15-17 godzin w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
  3. Po inkubacji umyć wkładki, umieszczając je na szalce Petriego o średnicy 25 mm zawierającej 1 ml wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej.
    nuta: Wkładki powinny stykać się z medium, ale nie powinny być nim przykryte.
  4. Natychmiast przenieść wkładki hodowlane na nową 6-dołkową płytkę zawierającą świeżą, wstępnie podgrzaną pożywkę hodowlaną.
  5. Zastąp pożywkę hodowlaną 1 ml wstępnie podgrzanej świeżej pożywki hodowlanej co 2-3 dni, aż do utrwalenia plastrów.

6. Immunohistochemia (czas praktyczny ≈ 1:30–2 h)

UWAGA: Wykonaj kroki od 6.1. do 6.3. pod wyciągiem. Unikaj narażenia na działanie paraformaldehydu (PFA) i zapoznaj się z kartą charakterystyki produktu w celu uzyskania odpowiednich manipulacji i ochrony.

  1. Użyj kleszczy, aby podnieść każdą wkładkę hodowlaną, przytrzymując plastikową krawędź i usuń pożywkę hodowlaną pod wkładkami membranowymi z każdej studzienki.
  2. Utrwal plastry móżdżku na 30 minut, dodając 2 ml 4% PFA w 1x PBS pH 7,4 na wkładki membranowe.
    nuta: Punkt czasowy utrwalenia zależy od stadium badanej mielinizacji: 4 DIV odpowiada początkowi mielinizacji, 7 DIV w pełni zmielinizowanym warstwom. W przypadku leczenia LPC, 9 DIV odpowiada pikowi demielinizacji, 11 DIV początkowi remielinizacji, a 14 DIV całkowicie zremielinizowanym warstwom.
  3. Umyj wkładki z plastrami trzy razy za pomocą 2 ml 1x PBS przez 10 min.
  4. Oddziel plastry od wkładek membranowych pod mikroskopem lornetkowym za pomocą powiększenia od 25x do 30x, delikatnie popychając je skalpelem lub szczotką. Alternatywnie, aby uniknąć ryzyka uszkodzenia plastrów podczas odłączania ich od membrany, użyj skalpela, aby przeciąć membranę z nadal przymocowanymi plastrami.
  5. Przenieś pływające plastry do dołków 4-dołkowej płytki zawierającej 1x PBS, za pomocą pędzla.
  6. Odessać PBS z każdej studzienki i inkubować plastry we wstępnie schłodzonym 100% etanolu w temperaturze -20 °C przez 15-20 minut. Ten etap ułatwia penetrację przeciwciał we włóknach mielinowych.
  7. Odessać 100% etanol i przemyć raz krótko 1x PBS, a następnie dwukrotnie w 1x PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  8. Odessać PBS i inkubować plastry przez 30 do 45 minut z roztworem zawierającym 1x PBS, 5% NGS, 0,3% niejonowego detergentu w temperaturze pokojowej w celu zablokowania niespecyficznych miejsc wiązania przeciwciał.
  9. Zassać roztwór blokujący. Nie jest konieczne pranie.
  10. Inkubować plastry przez noc z pierwszorzędowymi przeciwciałami rozcieńczonymi w roztworze blokującym w temperaturze 4 °C. Aby uwidocznić mielinę na organotypowych wycinkach móżdżku, użyj przeciwciał MBP (kurczak, 1/150 lub mysz IGg2b, Smi99, 1/200) lub PLP (szczur, hybrydoma, 1/5 do 1/10).
    nuta: Aby ujawnić ekspresję więcej niż jednego antygenu w tym samym wycinku, wykonaj procedurę podwójnego lub potrójnego barwienia (zobacz Rysunek 1 jako przykład). Aby przeprowadzić inkubację jednocześnie, upewnij się, że przeciwciała pierwotne są wytwarzane u różnych gatunków. Następnie użyj odpowiadających im przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z różnymi fluoroforami (patrz Tabela materiałów dla przeciwciał węzłowych i przywęzłowych marker18).
  11. Drugiego dnia umyj plastry trzy razy w 1x PBS przez 10 minut.
  12. Inkubować przez 3 godziny z przeciwciałami drugorzędowymi rozcieńczonymi w roztworze blokującym (rozcieńczenie 1/500) w ciemności w temperaturze pokojowej.
    nuta: Optymalizacja czasu rozcieńczania przeciwciał i inkubacji może być wymagana w przypadku stosowania innych przeciwciał niż opisane tutaj.
  13. Umyj plastry trzy razy w 1x PBS przez 10 minut w ciemności.
  14. Pod mikroskopem lornetkowym zamontuj plastry na szklanym szkiełku. Umieść 100 μl 1x PBS na szkiełku podstawowym i przenieś plastry do PBS za pomocą pędzla. W razie potrzeby rozłóż plastry i spłaszcz je na szkiełku. Usuń nadmiar PBS. W przypadku gdy znakowanie immunologiczne przeprowadza się z plastrami nadal przymocowanymi do błon, należy zamontować w taki sposób, aby plastry były skierowane w stronę szkiełka nakrywkowego, tak aby membrana znajdowała się na szkiełku podstawowym.
  15. Umieść kroplę podłoża montażowego bezpośrednio na szklanym szkiełku nakrywkowym i delikatnie przykryj plastry. Zamontowane szkiełka można przechowywać przez kilka miesięcy w temperaturze 4 °C w ciemności.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przykłady reprezentatywnych immunobarwień mieliny w organotypowych skrawkach móżdżku uzyskanych od myszy szczepu C57black6 typu dzikiego (WT) w wieku P9-P10 (Rycina 2A), a także od myszy transgenicznych PLP-GFP (Rycina 2B), wraz z barwieniem komórek Purkinjego. Skrawki móżdżku mielinizują od obszaru szlaków istoty białej skrawków w kierunku obwodu listków, a mielinizacja komórek Purkinjego zostaje w większości osiągnięta po 6 do ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym miejscu szczegółowo opisujemy protokół generowania modelu ex vivo odpowiadającego organotypowym kulturom plastrów móżdżku myszy, zaadaptowanym z wcześniej opublikowanych metod 15,16,19 i późniejszego barwienia mielinowego tych preparatów. Strategia ta daje możliwość wizualizacji składników mieliny w wysokiej rozdzielczości zarówno w stanie zdrowym, jak i patologicznym.

Organotypowe kultury warst...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Żaden z autorów nie ma sprzecznych interesów ani sprzecznych interesów.

Podziękowania

Dziękujemy dr Seanowi Freemanowi, dr Nathalie Sol-Foulon i dr Thomasowi Roux za cenne uwagi na temat manuskryptu. Praca ta została sfinansowana przez INSERM, ICM, ARSEP Grants R13123DD, ANR R17127DD (do A.D.) i FRM fellowship, SPF20110421435 (do A.D.), FDT20170437332 (do M.T.). Dziękujemy zakładowi hodowli komórkowych CELIS oraz platformie obrazowania icm.Quant.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
BME mediumThermoFisher Scientific41010026
Hank' s Zrównoważony roztwór soli (10x HBSS)ThermoFisher Scientific14180046
GlutaMAX (100x)ThermoFisher Scientific35050038
Inaktywowane termicznie serum dla koniThermoFisher Scientific26050088
Penicylina– Streptomycyna (10 000 j.m./ml)ThermoFisher Scientific15140122
Gey' s Zrównoważony roztwór soliSigma AldrichG9779-500ML
Roztwór D-glukozy (45%)Sigma AldrichG8769-100ML
Lizofosfatydylocholina (LPC)Sigma AldrichL4129-100MG
Paraformaldehyd (PFA)Mikroskopia elektronowa Sciences15714
Etanol absolutny (100% etanolu)VWR Chemicals20821.330Chłodzenie w temperaturze -20& C
Tryton® X-100Sigma AldrichX100-500ML
10% normalna surowica kozia (NGS)ThermoFisher Scientific500622
Roztwór buforowy fosforanowyEuroMEDEXET330-ApH 7,4
Przeciwciało anty-GFP (poliklonalne, kurczak)Merck Millipore06-896Rozcieńczenie 1/300
Przeciwciało przeciwko białku zasadowemu mieliny (MBP) (poliklonalne, kurczak)Merck MilliporeAB9348Rozcieńczenie 1/150
Przeciwciało przeciwko zasadowemu białku mieliny (MBP) (monoklonalne, mysie IgG2b)Merck MilliporeNE1019Rozcieńczenie 1/200
Przeciwciało anty-PLP (szczur, hybrydoma)Prezent od dr K. Ikenaka; Okasaki, JaponiaRozcieńczenie 1/5 do 1/10
Kanał antysodowy, przeciwciało Pan (monoklonalne, mysie IgG1, klon K58/35)Sigma AldrichS8809Rozcieńczenie 1/150
Przeciwciało anty-Caspr (poliklonalne, królik)Abcamab34151Rozcieńczenie 1/500
Przeciwciała drugorzędowe kozy sprzężone z Alexa Fluor 488, 594, 647 lub 405ThermoFisher ScientificRozcieńczenie 1/500
FluoromountSouthernBiotech0100-20
Rozdrabniacz do tkanekMcIlwain
Żyletki
Duże nożyczkiFST14101-14
Małe nożyczkiFST91500-09
Kleszczyki drobno-prosteFST91150-20
Kleszczyki zakrzywioneFST11297-00
Szalki do hodowli komórkowych (60 mm i 100 mm)TPP
4-, 6-dołkowe płytki do hodowliTPP
Wkładki do hodowli milikomórkowych (0,4 i mikro; m, średnica 30 mm)Merck MilliporePICM0RG50
Inkubator37° C, 5% CO2
Końcówki do pipet z drobnym końcemDutscher134000CL
Końcówki do pipet o szerokim otworzeThermoFisher Scientific2079G
Sterylna strzykawkaTerumo Europe20 lub 50 ml
Sterylne filtry strzykawkoweTerumo Europe0,22 i mikro;
m SkalpelSwann-Morton0510
Szczotka Szkiełka
mikroskopoweRS France76 mm x 26 mm x 1,1 mm
Szkiełka nakrywkoweRS France22 mm x 22 mm
Kimtech Sciences Wycieraczki do tkanekKimberly-Clark Professional5511
Mikroskoplornetkowy
do hodowli komórkowych

Bibliografia

  1. Monje, M. Myelin Plasticity and Nervous System Function. Annual Review Neuroscience. 41, 61-76 (2018).
  2. Desmazières, A., Sol-Foulon, N., Lubetzki, C. Changes at the nodal and perinodal axonal domains: a basis for multiple sclerosis pathology. Multiple Sclerosis Houndmills Basingstoke England. 18, 133-137 (2012).
  3. Waxman, S. G., Ritchie, J. M. Molecular dissection of the myelinated axon. Annals of Neurology. 33, 121-136 (1993).
  4. Fünfschilling, U., et al. Glycolytic oligodendrocytes maintain myelin and long-term axonal integrity. Nature. 485, 517-521 (2012).
  5. Lee, Y., et al. Oligodendroglia metabolically support axons and contribute to neurodegeneration. Nature. 487, 443-448 (2012).
  6. Chang, K. -J., Redmond, S. A., Chan, J. R. Remodeling myelination: implications for mechanisms of neural plasticity. Nature Neurosciences. 19, 190-197 (2016).
  7. Fields, R. D. A new mechanism of nervous system plasticity: activity-dependent myelination. Nature Reviews Neuroscience. 16, 756-767 (2015).
  8. Nave, K. -A., Werner, H. B. Myelination of the nervous system: mechanisms and functions. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 503-533 (2014).
  9. Nave, K. -A. Myelination and support of axonal integrity by glia. Nature. 468, 244-252 (2010).
  10. Baumann, N., Pham-Dinh, D. Biology of oligodendrocyte and myelin in the mammalian central nervous system. Physiological Reviews. 81, 871-927 (2001).
  11. Kluver, H., Barrera, E. A method for the combined staining of cells and fibers in the nervous system. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 12, 400-403 (1953).
  12. Meier, C. Some observations on early myelination in the human spinal cord. Light and electron microscope study. Brain Research. 104, 21-32 (1976).
  13. Hori, S. H. A SIMPLIFIED ACID HEMATEIN TEST FOR PHOSPHOLIPIDS. Stain Technology. 38, 221-225 (1963).
  14. Gallyas, F. Silver staining of myelin by means of physical development. Neurological Research. 1, 203-209 (1979).
  15. Dusart, I., Airaksinen, M. S., Sotelo, C. Purkinje cell survival and axonal regeneration are age dependent: an in vitro study. Journal of Neuroscience An Official Journal of the Society of Neuroscience. 17, 3710-3726 (1997).
  16. Birgbauer, E., Rao, T. S., Webb, M. Lysolecithin induces demyelination in vitro in a cerebellar slice culture system. Journal of Neuroscience Research. 78, 157-166 (2004).
  17. Zhang, H., Jarjour, A. A., Boyd, A., Williams, A. Central nervous system remyelination in culture--a tool for multiple sclerosis research. Experimental Neurology. 230, 138-148 (2011).
  18. Rasband, M. N., Peles, E. The Nodes of Ranvier: Molecular Assembly and Maintenance. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8, a020495(2015).
  19. Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neurosciences Methods. 37, 173-182 (1991).
  20. Hussain, R., et al. Progesterone and Nestorone facilitate axon remyelination: a role for progesterone receptors. Endocrinology. , 3820-3831 (2011).
  21. Wioland, L., et al. Epsilon toxin from Clostridium perfringens acts on oligodendrocytes without forming pores, and causes demyelination. Cellular Microbiology. 17, 369-388 (2015).
  22. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, 839-845 (2007).
  23. Medina-Rodríguez, E. M., et al. Promoting in vivo remyelination with small molecules: a neuroreparative pharmacological treatment for Multiple Sclerosis. Science Reports. 7, (2017).
  24. Spassky, N., et al. The early steps of oligodendrogenesis: insights from the study of the plp lineage in the brain of chicks and rodents. Developmental Neurosciences. 23, 318-326 (2001).
  25. Yuan, X., et al. Expression of the green fluorescent protein in the oligodendrocyte lineage: a transgenic mouse for developmental and physiological studies. Journal of Neuroscience Research. 70, 529-545 (2002).
  26. Gibson, E. M., et al. Neuronal activity promotes oligodendrogenesis and adaptive myelination in the mammalian brain. Science. 344, 1252304(2014).
  27. Tomassy, G. S., et al. Distinct profiles of myelin distribution along single axons of pyramidal neurons in the neocortex. Science. 344, 319-324 (2014).
  28. Wang, H., et al. Polarization sensitive optical coherence microscopy for brain imaging. Optics Letters. 41, 2213-2216 (2016).
  29. Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322, 1857-1861 (2008).
  30. Lim, H., et al. Label-free imaging of Schwann cell myelination by third harmonic generation microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 111, 18025-18030 (2014).
  31. Schain, A. J., Hill, R. A., Grutzendler, J. Label-free in vivo imaging of myelinated axons in health and disease with spectral confocal reflectance microscopy. Nature Medicine. 20, 443-449 (2014).
  32. Arancibia-Carcamo, I. L., Attwell, D. The node of Ranvier in CNS pathology. Acta Neuropathologia. (Berlin). 128, 161-175 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Immunobarwienie mielinysekcjonowanie tkanekizolacja m d kuprzygotowanie kultur plastr wdemielinizacja LPCprocedura immunohistochemicznaremielinizacja mielinyw ze Ranvieratransgeniczne PLP GFP
Przygotowanie i barwienie immunologiczne mielinizujących organotypowych kultur warstwowych móżdżku
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.