Artykuł metodologiczny

Wysokoprzepustowy test bakteriobójczy specyficzny dla Shigella

DOI:

10.3791/59164

⸱

27 lutego 2019

 ,  ,  , 
1Department of Enteric Infections, Bacterial Diseases Branch, Walter Reed Army Institute of Research, 2University of Alabama at Birmingham

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół pomiaru aktywności Shigellacidal przeciwciał w surowicy. Surowicę miesza się z bakteriami i egzogennym dopełniaczem, inkubuje, a mieszaninę reakcyjną posiewa się na płytkach agarowych. Żywe bakterie tworzą kolonie, które są zliczane za pomocą automatycznego enumeratora kolonii i wykorzystywane do określenia miana bakteriobójczego.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Testy bakteriobójcze (SBA) mierzą aktywność funkcjonalną przeciwciał i są stosowane od wielu dziesięcioleci. SBA bezpośrednio mierzą aktywność zabijania przeciwciał, oceniając zdolność przeciwciał w surowicy do wiązania się z bakteriami i aktywacji dopełniacza. Ta aktywacja dopełniacza powoduje lizę i zabicie docelowych bakterii. Testy te są cenne, ponieważ wykraczają poza ilościowe określenie produkcji przeciwciał, aby wyjaśnić funkcje biologiczne, jakie pełnią te przeciwciała, umożliwiając naukowcom zbadanie roli, jaką przeciwciała mogą odgrywać w zapobieganiu infekcji. SBA były wykorzystywane do badania odpowiedzi immunologicznej na wiele ludzkich patogenów, ale obecnie nie ma powszechnie akceptowanej metodologii dla Shigella. Historycznie rzecz biorąc, SBA były bardzo pracochłonne, wymagały wielu czasochłonnych kroków w celu dokładnego ilościowego określenia bakterii, które przeżyły. Protokół ten opisuje prosty, solidny i wysokoprzepustowy test, który mierzy funkcjonalne przeciwciała specyficzne dla Shigella w surowicy in vitro. Opisana tutaj metoda ma wiele zalet w porównaniu z tradycyjnymi SBA, w tym wykorzystanie zamrożonych zapasów bakteryjnych, 96-dołkowych płytek testowych, systemu mikrohodowli i automatycznego liczenia kolonii. Wszystkie te modyfikacje sprawiają, że test ten jest mniej pracochłonny i ma większą przepustowość. Protokół ten jest prostszy i szybszy do wykonania niż tradycyjne SBA, a jednocześnie wykorzystuje proste technologie i łatwo dostępne odczynniki. Protokół został z powodzeniem zastosowany w wielu niezależnych laboratoriach, a test jest solidny i powtarzalny. Test może być stosowany do oceny odpowiedzi immunologicznej zarówno w badaniach przedklinicznych, jak i klinicznych. Ilościowe określenie miana przeciwciał przeciwko kwasowi shigelacidalnemu zarówno przed, jak i po ekspozycji na antygen (zarówno przez immunizację, jak i zakażenie) pozwala na szersze zrozumienie, w jaki sposób generowane są funkcjonalne odpowiedzi przeciwciał i ich wkład w odporność ochronną. Opracowanie tego ustandaryzowanego, dobrze scharakteryzowanego testu może znacznie ułatwić projektowanie szczepionki Shigella.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Serotypy Shigella, Shigella flexneri 2a, S. flexneri 3a i S. sonnei, wykazują globalne rozpowszechnienie epidemiologiczne. Choroba biegunkowa wywoływana przez te gatunki Shigella dotyka wojsko, podróżników1 i jest główną przyczyną zgonów z powodu biegunki wśród dzieci poniżej 5 roku życia w krajach rozwijających się2. Obecnie nie ma licencjonowanych szczepionek chroniących przed Shigella, jednak istnieje wiele potencjalnych szczepionek na różnych etapach rozwoju. Wiele z tych szczepionek i innych środków profilaktycznych, które są obecnie opracowywane, koncentruje się na przeciwciałach wytwarzanych przeciwko lipopolisacharydowi Shigella (LPS). LPS jest atrakcyjnym kandydatem na szczepionkę, ponieważ jest głównym antygenem powierzchniowym, a naturalne zakażenie Shigella indukuje przeciwciała specyficzne dla LPS, które mogą chronić przed ponownym zakażeniem w sposób specyficzny dla serotypu. Dlatego skuteczna szczepionka Shigella prawdopodobnie będzie musiała być wielowalentna i ukierunkowana na 3-4 serotypy Shigella, aby wywołać odporność przeciwko 70-80% globalnie krążących szczepów3,4,5,6. Wymaga to, aby testy oceniające kandydatów na szczepionkę Shigella były specyficzne dla wielu różnych serotypów.

Obecne testy immunologiczne do oceny kandydatów na szczepionki koncentrują się na ilościowym określaniu poziomów mian przeciwciał, ale istnieje niewiele dobrze scharakteryzowanych testów do oceny funkcjonalnych przeciwciał. Badanie zdolności funkcjonalnej przeciwciał jest ważne, ponieważ przeciwciała specyficzne dla patogenu są odpowiedzialne za zwalczanie infekcji poprzez szereg mechanizmów funkcjonalnych, w tym wiązanie antygenów powierzchniowych bakterii oraz zapobieganie adhezji i infekcji komórek nabłonkowych, celowanie w komórki bakteryjne lub opsonizację i fagocytozę oraz bezpośrednie zabijanie patogenów poprzez wiązanie i inicjowanie kaskady dopełniacza. Bezpośrednie zabijanie bakterii przez przeciwciała następuje, gdy przeciwciała wiążą się ze składnikami powierzchniowymi bakterii docelowych i inicjują kaskadę dopełniacza, prowadząc do aktywacji wielu zymogenów, które ostatecznie prowadzą do tworzenia się porów w komórce bakteryjnej, co powoduje lizę i śmierć bakterii. To bezpośrednie zabijanie bakterii przez krążące przeciwciała i dopełniacz może być kluczową wczesną linią obrony podczas infekcji.

Osoby, które są naturalnie zakażone, mają przeciwciała o działaniu kwasowo-szigowym w swoich surowicach. Te specyficzne dla Shigella przeciwciała wykryto za pomocą tradycyjnych testów zabijania za pośrednictwem dopełniacza 7,8. Wskazuje to, że przeciwciała bakteriobójcze mogą odgrywać rolę w ochronie przed Shigella. Tradycyjne testy bakteriobójcze są proste w wykonaniu: surowica jest inaktywowana termicznie (w celu zniszczenia endogennej aktywności dopełniacza) i mieszana z interesującymi bakteriami. Egzogenny dopełniacz dodaje się do tej mieszaniny w określonym stężeniu. Mieszaninę reakcyjną inkubuje się, aby umożliwić zabicie bakterii, a następnie posiewa w celu potwierdzenia jednostek tworzących kolonie (CFU). Po zliczeniu CFU można obliczyć 50% wskaźnik zabijania (KI) i określić miano SBA. Chociaż procedura ta jest stosunkowo prosta, testy te mogą być pracochłonne i czasochłonne, a wyniki mogą być bardzo zmienne. Oprócz tych ograniczeń, obecnie nie istnieją dobrze scharakteryzowane testy funkcjonalne dla Shigella. Dlatego z powodzeniem opracowaliśmy i zakwalifikowaliśmy prosty, wysokoprzepustowy test do pomiaru aktywności bakteriobójczej Shigella dla trzech najbardziej istotnych klinicznie szczepów9. Protokół ten opisuje SBA z modyfikacjami, które poprawiają wydajność i odtwarzalność testu. Pierwszą z tych modyfikacji jest zastosowanie mrożonych zapasów bakteryjnych. Produkcja zapasów jednorazowego użytku eliminuje potrzebę hodowli świeżych bakterii dla każdego testu, jednocześnie zmniejszając zmienność między testami. Kolejną zaletą tego protokołu pozwalającą zaoszczędzić czas i pracę, jest zastosowanie 96-dołkowego formatu testu płytkowego. Pozwala to na seryjne rozcieńczanie próbek, dzięki czemu można badać zakres stężeń. Pozwala również na stosowanie pipet wielokanałowych do posiewu próbek na kwadratowych szalkach Petriego. Kiedy te kwadratowe szalki Petriego są używane w połączeniu z systemem hodowli, który wytwarza mikrokolonie, liczba płytek agarowych wymaganych do testu jest zmniejszona. To, w połączeniu z ogólnodostępnym oprogramowaniem do zliczania kolonii, pierwotnie opracowanym dla pneumokokowego multipleksowanego testu zabijania opsonofagocytów (MOPA)10, pozwala na szybkie, zautomatyzowane i niezawodne liczenie kolonii. Wszystkie te ulepszenia znacznie skracają czas wykonywania testów i tworzą system o wysokiej przepustowości, który umożliwia jednoczesne uruchamianie wielu płytek.

Chociaż ten protokół został zoptymalizowany dla trzech najbardziej istotnych klinicznie serotypów Shigella, opisany tutaj SBA może być łatwo zastosowany do wielu innych patogenów bakteryjnych. Oprócz potencjalnego zastosowania tego protokołu w odniesieniu do innych bakterii, protokół ten ma potencjał, aby rozszerzyć się poza stosowanie wyłącznie surowicy jako materiału wyjściowego, co może obejmować analizę przeciwciał w innych istotnych typach próbek, takich jak próbki błony śluzowej, w tym próbki śliny i kału. Zastosowanie tego testu do zbadania odpowiedzi immunologicznych po szczepieniu może dać szerszy wgląd w odpowiedzi immunologiczne generowane przez szczepienie, prowadząc do racjonalnego projektowania szczepionek i pomóc w zrozumieniu, w jaki sposób rozwija się naturalna odporność.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół jest zgodny z wytycznymi Rady Ochrony Człowieka WRAIR. Próbki użyte w tym badaniu są próbkami ludzkiej surowicy pobranymi w ramach protokołu WRAIR nr 1328, zgodnie ze wszystkimi przepisami instytucjonalnymi i federalnymi regulującymi ochronę ludzi. Próbki zostały pozbawione elementów pozwalających na identyfikację, a wykorzystanie tych anonimowych próbek zostało sklasyfikowane przez UAB IRB (numer protokołu N150115001) jako badania z udziałem ludzi.

1. Przygotuj odczynniki do oznaczania

  1. Przygotuj 1% żelatyny, dodając 1 g żelatyny do 100 ml wody. Autoklaw i przechowywać w temperaturze pokojowej.
  2. Przygotować 100 mg/ml roztworu podstawowego TTC (chlorek 2,3,5-trifenylotetrazolu) (1,000x) przez dodanie 5 g TTC do 40 ml wody. Gdy TTC całkowicie się rozpuści, dostosuj objętość do 50 ml za pomocą wody i sterylnego filtra za pomocą filtra 0,2 μm. Przechowywać roztwór w temperaturze 4 °C i chronić przed światłem.
    nuta: TTC barwi kolonie bakterii i sprawia, że są one znacznie łatwiejsze do policzenia. Roztwór TTC ma lekko żółty kolor. Jeśli roztwór TTC zmieni kolor na czerwony, wyrzuć i przygotuj świeży.
  3. Przygotować 10% roztwór podstawowy azydeku sodu (NaN3) (100x), dodając 5 g NaN3 do 40 ml wody. Po całkowitym rozpuszczeniu dodaj wodę do 50 ml. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
    ostrożność: Azydek sodu jest trucizną i może być toksyczny w przypadku spożycia lub wchłonięcia przez skórę lub oczy. Może reagować z ołowiem i miedzią, tworząc wysoce wybuchowe azydki metali. Po usunięciu odczynników zawierających azydek sodu przepłukać dużą ilością wody, aby zapobiec gromadzeniu się azydku lub wyrzucić do worka na zagrożenie biologiczne.
  4. Przygotować płytkę LBA (płytkę agarową LB), dodając 35 g agaru LB do 1 l wody i autoklawu. Dodaj 25 ml do każdej kwadratowej szalki Petriego (120 x 120 mm2). Inkubować płytki w temperaturze pokojowej przez 10-20 minut, aby agar zastygł. Umieść talerze z powrotem w plastikowych torebkach i przechowuj w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca.
  5. Przygotuj agar nakładkowy, dodając 7,5 g agaru do 1,000 ml wody i autoklawu. Inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 56 °C do momentu, gdy będzie potrzebna. Bezpośrednio przed użyciem dodać 1 ml 100 mg/ml TTC i 10 ml 10% NaN3 i dobrze wymieszać.
    nuta: Każda płytka LBA wymaga 25 ml agaru do nakładki. Agar nakładkowy można przygotować z miesięcznym wyprzedzeniem i stopić w kuchence mikrofalowej lub na gorącej płycie, w zależności od potrzeb do testu. Upewnij się, że temperatura agaru wynosi ~55 °C przed nałożeniem na płytki LBA.
  6. Przygotuj bufor testowy, dodając 5 ml 10x zbilansowanego roztworu soli Hanksa (HBSS) z Ca2+/Mg2+ i 5 ml 1% żelatyny do 40 ml wody. Przechowywać w temperaturze pokojowej.

2. Przygotowanie dopełniacza i docelowej bakterii

  1. Przygotuj dopełnienie dla małego królika (BRC)
    nuta: Szczegółowe kryteria wyboru partii uzupełniającej można znaleźć tutaj: https://www.vaccine.uab.edu/uploads/mdocs/UAB-MOPA.pdf
    1. Uzyskaj zamrożony BRC i rozmrozić pod bieżącą zimną wodą. Fizycznie mieszaj BRC co ~10-20 minut, aż do całkowitego rozmrożenia. Nie poddawaj BRC powtarzającym się cyklom zamrażania i rozmrażania.
    2. Podczas rozmrażania BRC oznacz probówki wirówkowe o pojemności 1.5 ml, 5 ml lub 15 ml. Umieść oznaczone rurki na lodzie, aby wstępnie ostygły. Porcję odpowiedniej objętości BRC do wstępnie schłodzonych probówek wirówkowych (po napełnieniu natychmiast zawróć każdą probówkę do lodu). Porcje należy przechowywać w zamrażarce w temperaturze ≤ -70 °C.
      nuta: Na każdą płytkę testową potrzeba około 1 ml dopełniacza. Podwielokrotności dopełniacza są przeznaczone do jednorazowego użytku i powinny być podawane w objętościach odpowiednich dla układów testów.
    3. Aby przygotować inaktywowany termicznie BRC, rozmrozić jedną porcję aktywnego BRC. Przygotować łaźnię wodną o temperaturze 56 °C. Po całkowitym rozmrożeniu BRC przenieść go do łaźni wodnej i inkubować przez 30 minut.
    4. Po inkubacji usunąć inaktywowany termicznie BRC z łaźni wodnej i pozostawić do ostygnięcia w temperaturze pokojowej przez 10-15 minut. Energicznie wymieszać i poddzielić ~150 μL do 1,5 ml mikrowirówek. Porcje przechowywać w temperaturze ≤ -10 °C.
  2. Przygotuj zapas bakterii docelowych
    nuta: Poniższa procedura jest stosowana do przygotowania 48 podwielokrotności docelowych bakterii; Jeśli potrzebnych jest więcej porcji, protokół można skalować w górę.
    1. Wyjąć fiolkę z preparatem Bacteria Master z zamrażarki i zeskrobać zamrożoną powierzchnię bakteryjną, aby usunąć niewielką ilość lodu z fiolki na płytkę z agarem z krwią. Natychmiast umieścić główną fiolkę z zapasem w zamrażarce.
    2. Rozłóż tę małą porcję wywaru bakteryjnego na płytkę z agarem z krwią i przykryj pokrywką płytki. Inkubować płytkę do góry nogami przez noc w inkubatorze o temperaturze 37 °C/5% CO2 .
    3. Przenieś ~ 10 izolowanych gładkich kolonii do probówki o pojemności 50 ml zawierającej 30 ml bulionu LB. Inkubować przez 3-5 godzin w temperaturze 37 °C, delikatnie wstrząsając, aż bulion hodowlany osiągnie OD600 ~0,6-0,7.
    4. Zbierz górne 12,5 ml kultury i przenieś do świeżej probówki o pojemności 50 ml. Odwirować kulturę przy 15 000 x g przez 2 minuty za pomocą mikrowirówki stołowej. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 25 ml 15% sterylnego glicerolu-LB.
    5. Dobrze wymieszaj i dozuj 0,5 ml porcji do sterylnych 1,5 ml mikroprobówek wirówkowych (~48 probówek). Porcje należy przechowywać w temperaturze ≤ -70 °C w zamrażarce.
    6. Przed użyciem potwierdzić tożsamość bakterii za pomocą testu aglutynacji.
  3. Określenie optymalnego współczynnika rozcieńczenia dla bakterii docelowych stock
    nuta: Każda partia docelowych bakterii musi być miareczkowana w warunkach testowych w celu określenia rozcieńczenia niezbędnego do uzyskania ~120 CFU/plamkę na płytkach LB.
    1. Zaopatrzyć się w płytkę do mikromiareczkowania (płytkę rozcieńczającą) i dodać 135 μl buforu do testu do studzienki 1A. Dodać 120 μl masła do teczki 1B-1H.
    2. Wyjmij fiolkę z zamrożonymi bakteriami docelowymi z zamrażarki i rozmroź w temperaturze pokojowej. Dodaj 15ul rozmrożonego wywaru bakteryjnego do studzienki 1A, aby uzyskać 10-krotne rozcieńczenie bulionu bakteryjnego.
    3. Przenieść 30 μl roztworu bakteryjnego ze studzienki 1A do studzienki 1B, aby przeprowadzić 5-krotne seryjne rozcieńczenie. Kontynuować 5-krotne seryjne rozcieńczenia do dołka 1H, co daje w sumie 8 rozcieńczeń (1:10; 1:50; 1:250; 1:1 250; 1:6 250; 1: 31 250; 1: 156 250; 1:781 250).
    4. Weź kolejną płytkę do mikromiareczkowania (płytkę testową) i dodaj 20 μl buforu do testu do wszystkich studzienek w kolumnach 1 i 2 na płytce testowej.
    5. Przenieść 10 μl rozcieńczonych bakterii z każdej studzienki w kolumnie 1 płytki rozcieńczającej do odpowiednich studzienek w kolumnach 1 i 2 płytki do oznaczania. 10 μl bakterii przenosi się z dołka 1A płytki rozcieńczającej do studzienki 1A i 2A na płytce do oznaczania itd.
    6. Kontynuuj test zgodnie z opisem w Test bakteriobójczy surowicy (SBA) poniżej dla kontroli A i kontroli B, kroki 3.6-3.12.
    7. Po inkubacji płytek na lodzie za pomocą pipety wielokanałowej z 8 końcówkami do pipet narysować 10 μl z dołków w kolumnie 1 na płytkę LBA. Zauważ również studzienki od kolumny 2 na płycie LBA.
    8. Kontynuuj test zgodnie z opisem poniżej w krokach 3.14-4.6.
    9. Określ rozcieńczenie bakterii, które daje ~ 120 CFU/plamkę w kontroli B, to rozcieńczenie zostanie użyte w teście.

3. Test bakteriobójczy surowicy (SBA)

UWAGA: Procedura opisana poniżej dotyczy jednej płytki testowej, ale liczba płytek testowych może zostać zwiększona.

  1. Próbki do badań inaktywowane termicznie przez inkubację próbek w łaźni wodnej o temperaturze 56 °C przez 30 min.
    nuta: Badane próbki muszą być inaktywowane termicznie przed badaniem w celu zniesienia wszelkiej endogennej aktywności dopełniacza. Można to zrobić przed badaniem, a inaktywowane próbki można ponownie zamrozić lub przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu badania.
  2. Weź płytkę testową i dodaj 20 μl buforu do testu do kolumn od 1 do 12 w wierszach od A do G. Dodaj 20 μl buforu do testu do kolumn 1 i 2 wiersza H, patrz tabela 1.
  3. Załadować 30 μl każdej badanej próbki, w dwóch egzemplarzach, do rzędu H płytki do oznaczania. Na przykład dozować 30 μl próbki 1 do studzienek 3H i 4H, a 30 μl próbki 2 do studzienek 5H i 6H itd.
  4. Wykonać 3-krotne seryjne rozcieńczenia badanych próbek za pomocą pipety wielokanałowej.
    1. Usunąć 10 μ próbki z dołków 3H-12H i przenieść do odpowiednich studzienek w rzędzie G i wymieszać próbkę studzienkę, pipetując w górę i w dół 8-10 razy.
    2. Następnie usunąć 10 μ z dołków 3G-12G i przenieść do odpowiednich studzienek w rzędzie F i dobrze wymieszać.
    3. Kontynuować te seryjne rozcieńczenia przez rząd A. Po wymieszaniu studzienek w rzędzie A wyjąć i wyrzucić 10 μl z dołków 3A-12A, tak aby wszystkie studzienki zawierały 20 μl.
      nuta: Ponieważ stosuje się 20 μl surowicy w całkowitej objętości testu wynoszącej 80 μl, w teście stosuje się 4-krotne dodatkowe rozcieńczenie. Rozcieńczenie to musi być uwzględnione przy obliczaniu miana SBA poprzez pomnożenie rozcieńczenia surowicy przez 4. Na przykład, jeżeli stosuje się początkowe rozcieńczenie 1:2, rzeczywiste badane rozcieńczenie wynosi 1:8.
  5. Wyjąć jedną fiolkę z zamrożonym bulionem z bakterii docelowych i rozmrozić w temperaturze pokojowej. Rozcieńczyć bakterie w 20 ml buforu do oznaczania zgodnie z wcześniej ustalonym optymalnym współczynnikiem rozcieńczenia (ten współczynnik rozcieńczenia określono w sekcji 2.3). Dodać 10 μl rozcieńczonych bakterii do każdego dołka płytki testowej za pomocą pipety wielokanałowej.
  6. Wyjąć jedną fiolkę zamrożonego BRC i jedną fiolkę zamrożonego BRC inaktywowanego termicznie, rozmrozić w temperaturze pokojowej pod bieżącą zimną wodą lub umieścić na ruszcie szafy bezpieczeństwa biologicznego z nadmuchem powietrza w celu szybkiego rozmrożenia.
  7. Przygotować 20% roztwór inaktywowanego termicznie BRC. Zmieszać 100 μl inaktywowanego termicznie BRC z 400 μl buforu do oznaczania. Dodać 50 μl tego 20% inaktywowanego termicznie roztworu BRC do wszystkich studzienek w kolumnie 1 (studzienki kontrolne A).
    nuta: Inaktywowany termicznie BRC jest stosowany jako kontrola do monitorowania niespecyficznego zabijania (NSK) w teście.
  8. Przygotuj 20% roztwór natywnego BRC. Wymieszaj 1 ml natywnego BRC z 4 ml buforu testowego. Dodać 50 μl tej mieszaniny do wszystkich studzienek w kolumnach od 2 do 12 (studzienki kontrolne B i studzienki na próbki testowe).
    nuta: Końcowe stężenie BRC w mieszaninie reakcyjnej wynosi 12,5%.
  9. Krótko wymieszać płytkę testową, delikatnie potrząsając przez 10-15 s na wytrząsarce do płytek lub mieszając, pipetując 8 razy w górę i w dół za pomocą pipety wielokanałowej.
  10. Umieścić płytkę testową w inkubatorze mikrobiologicznym o temperaturze 37 °C na 2 godziny (bez wstrząsania).
  11. Wysuszyć 2 płytki LBA, zdejmując pokrywki i umieszczając płytki ekranem do góry w komorze bezpieczeństwa biologicznego na 40-60 minut.
  12. Po zakończeniu 2-godzinnej inkubacji przenieś płytkę testową na mokry lód i inkubuj przez 10-20 minut, aby zatrzymać reakcję.
  13. Za pomocą pipety 12-kanałowej wymieszać studzienki w rzędzie H i umieścić płytkę 10 μl mieszaniny reakcyjnej na dnie płytki LBA. Natychmiast przechyl płytkę i pozwól plamom przebiec przez ~1,5-2 cm. Powtórz tę procedurę dla rzędów G, F i E, dostrzegając je powyżej poprzedniego rzędu na płytce LBA. Rzędy E, F, G i H są narysowane na jednej tabliczce LBA, a rzędy A, B, C i D są narysowane na drugiej tabliczce LBA w ten sam sposób, patrz Rysunek 1.
  14. Inkubować płytki LBA w temperaturze pokojowej, aż roztwór zostanie zaadsorbowany na płytkach LBA (10-15 min). Umieść pokrywki na płytkach LBA i umieść płytki LBA w inkubatorze mikrobiologicznym do góry nogami, aby inkubować przez noc (~16-18 godzin). Inkubować S. flexneri 2a i 3a w temperaturze 29 °C, a inkubować S. sonnei w temperaturze 26 °C.
    nuta: W tych temperaturach powstają mniejsze "mikrokolonie" o rozmiarach odpowiednich do dokładnego liczenia przez licznik kolonii9.
  15. Po całonocnej inkubacji dodać 25 ml agaru Overlay (w temperaturze ~55 °C) zawierającego 100 μg/ml TTC i 0,1% NaN3 do każdej płytki LBA.
  16. Inkubować płytki LBA w temperaturze 37 °C przez 2 godziny, aby bakterie, które przeżyły, mogły rozwinąć czerwony kolor, patrz Rysunek 1 poniżej.
  17. Sfotografuj płyty za pomocą aparatu cyfrowego i prześlij obrazy do komputera, na którym zainstalowano oprogramowanie NIST Integrated Colony Enumerating Software (NICE), patrz Rysunek 2.
    nuta: Oprogramowanie NICE do liczenia kolonii jest dostępne bezpłatnie. Zobacz Listę materiałów, aby uzyskać szczegółowe informacje i instrukcje instalacji.

4. Policz kolonie bakterii

  1. Otwórz oprogramowanie NICE i wprowadź nazwę operatora, informacje o eksperymencie i wszelkie uwagi dotyczące testu w puste pola. Po wprowadzeniu tych danych kliknij przycisk Gotowe.
  2. Zaimportuj sfotografowane płyty, klikając przycisk Otwórz i wybierając odpowiednie pliki z komputera.
  3. Dostosuj parametry testu, ustawiając liczbę wierszy na 4, a liczbę kolumn na 12. Dostosuj ustawienie tła do -3 sigma, a rozdzielczość do niskiej. Zobacz Rysunek 2.
  4. Przesuwaj obszary zainteresowania (ROI), klikając i przeciągając, tak aby każdy zwrot roboczy znajdował się bezpośrednio nad jednym miejscem próbki. Upewnij się, że wszystkie kolonie bakteryjne znajdują się wewnątrz ROI i nie nakładają się na siebie. Gdy jedna płyta jest gotowa, kliknij dwukrotnie następną płytę na liście Zapisane obrazy danych i dostosuj ROI. Zobacz Rysunek 2.
  5. Po wyregulowaniu wszystkich płyt kliknij zielony przycisk Policz, patrz Rysunek 2 i Rysunek 3. Po zakończeniu inwentaryzacji kliknij przycisk Eksportuj, aby wyeksportować dane w formacie .xls/.xlsx. Nazwij i zapisz plik .xls/.xlsx na potrzeby analizy danych.
  6. Ułóż wyeksportowane dane w formacie tabeli, tak aby zliczenia były zorganizowane w tabeli reprezentującej 96-dołkową płytkę testową, patrz Tabela 2.

5. Obliczanie miana SBA (KI) i niespecyficznego zabijania (NSK)

UWAGA: Miano SBA, czyli wskaźnik zabijania (KI) jest definiowany jako odwrotność rozcieńczenia surowicy, która zabija 50% docelowych bakterii.

  1. Obliczyć wartość odcięcia 50% wskaźnika zabijania (KI), uśredniając CFU studzienek kontrolnych aktywnego dopełniacza (kontrola B) i dzieląc przez 2. Obliczyć średnią jtk dla każdego rozcieńczenia każdej próbki, która została zbadana w dwóch egzemplarzach, zob. tabela 3.
  2. Ponieważ rozcieńczenie surowicy rzadko daje dokładnie taką wartość 50% KI, można je interpolować z dwóch sekwencyjnych rozcieńczeń surowicy, jednego, który zabija mniej niż 50%, a drugiego, który zabija więcej niż 50%, patrz Rysunek 4. Wzór na obliczenie interpolowanego SBA KI pokazano poniżej:
    figure-protocol-1
    nuta: Miano bakteriobójcze (KI) może być również obliczane automatycznie za pomocą oprogramowania Opsotiter opracowanego przez UAB. Aby poprosić o Opsotiter, skontaktuj się z dr Moon Nahmem lub panem Robem Burtonem. Zobacz https://www.vaccine.uab.edu, aby uzyskać informacje kontaktowe.
  3. Obliczyć wartość NSK, biorąc 1 minus średnią z kontroli B podzieloną przez średnią z kontroli A.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Układ płytki 96-dołkowej używany w typowym teście jest pokazany w Tabeli 1. W tym układzie znajdują się studzienki kontrolne aktywnego dopełniacza (kontrola B), studzienki kontrolne dopełniacza inaktywowane termicznie (kontrola A) oraz pięć próbek w dwóch egzemplarzach. Próbki są seryjnie rozcieńczane 3-krotnie w górę płytki od rzędu H do rzędu A, co pozwala na jednoczesne badanie 8 rozcieńczeń każdej próbki. Rysunek 1 pokazuje dwie płytki LBA po całonocnej inkubacji i nałożeniu na nie dodanie. Nastąpił rozwój koloru i wszystkie kolonie, które przeżyły, są widoczne na czerwono. Zabijanie bakteryjne jest wyraźnie widoczne dla wszystkich próbek badanych w pierwszych trzech rozcieńczeniach (rzędy F-H), a gdy próbki są rozcieńczane w dalszej części płytki, obserwuje się spadek zabijania bakterii tam, gdzie surowica jest mniej skoncentrowana. Interfejs oprogramowania NICE można zobaczyć w Rysunek 2. Zliczanie mikrokolonii z oprogramowania NICE można zobaczyć w Rysunek 3, a te zliczenia zostały zorganizowane w Tabeli 2. Oblicza się średnią liczbę jtk dla każdego rozcieńczenia każdej próbki, a wartość 50% KI oblicza się w tabeli 3. Ta 50% wartość KI może być zastosowana do uśrednionych CFU dla każdego rozcieńczenia surowicy w celu określenia wartości potrzebnych do obliczenia SBA KI zgodnie ze wzorem opisanym w Rysunek 4. Ostateczny wynik testu przedstawiono w tabeli 4.

1cyfra arabska3456789101112
ZAKontrola AKontrola BRozcieńczenie 8Rozcieńczenie 8Rozcieńczenie 8Rozcieńczenie 8Rozcieńczenie 8Rozcieńczenie 8Rozcieńczenie 8Rozcieńczenie 8Rozcieńczenie 8Rozcieńczenie 8
WKontrola AKontrola BRozcieńczenie 7Rozcieńczenie 7Rozcieńczenie 7Rozcieńczenie 7Rozcieńczenie 7Rozcieńczenie 7Rozcieńczenie 7Rozcieńczenie 7Rozcieńczenie 7Rozcieńczenie 7
ZKontrola AKontrola BRozcieńczenie 6Rozcieńczenie 6Rozcieńczenie 6Rozcieńczenie 6Rozcieńczenie 6Rozcieńczenie 6Rozcieńczenie 6Rozcieńczenie 6Rozcieńczenie 6Rozcieńczenie 6
DKontrola AKontrola BRozcieńczenie 5Rozcieńczenie 5Rozcieńczenie 5Rozcieńczenie 5Rozcieńczenie 5Rozcieńczenie 5Rozcieńczenie 5Rozcieńczenie 5Rozcieńczenie 5Rozcieńczenie 5
EKontrola AKontrola BRozcieńczenie 4Rozcieńczenie 4Rozcieńczenie 4Rozcieńczenie 4Rozcieńczenie 4Rozcieńczenie 4Rozcieńczenie 4Rozcieńczenie 4Rozcieńczenie 4Rozcieńczenie 4
ZKontrola AKontrola BRozcieńczenie 3Rozcieńczenie 3Rozcieńczenie 3Rozcieńczenie 3Rozcieńczenie 3Rozcieńczenie 3Rozcieńczenie 3Rozcieńczenie 3Rozcieńczenie 3Rozcieńczenie 3
ZKontrola AKontrola BRozcieńczenie 2Rozcieńczenie 2Rozcieńczenie 2Rozcieńczenie 2Rozcieńczenie 2Rozcieńczenie 2Rozcieńczenie 2Rozcieńczenie 2Rozcieńczenie 2Rozcieńczenie 2
HKontrola AKontrola BRozcieńczenie 1Rozcieńczenie 1Rozcieńczenie 1Rozcieńczenie 1Rozcieńczenie 1Rozcieńczenie 1Rozcieńczenie 1Rozcieńczenie 1Rozcieńczenie 1Rozcieńczenie 1
Próbka 1 Próbka 2Próbka 3Próbka 4Próbka 5

Tabela 1: Układ płytki testowej. Kolumny 1 i 2 zawierają studzienki kontrolne dopełniacza. Kontrola A znajduje się w kolumnie 1 i jest kontrolną dopełniaczką inaktywowaną termicznie, zawierającą bufor SBA, bakterie i dopełniacz inaktywowany termicznie. Kontrola B znajduje się w kolumnie 2 i jest aktywną kontrolą dopełniacza, zawierającą bufor SBA, bakterie i dopełniacz. Kolumny 3-12 zawierają próbki surowicy. Każdą próbkę bada się w dwóch egzemplarzach i seryjnie rozcieńcza 3-krotnie od rzędu H do rzędu A

figure-results-1
Rysunek 1: Płytki LBA po wywołaniu koloru. Reprezentatywne mikrokolonie bakteryjne S. flexneri 3a urosły z dnia na dzień do odpowiednich rozmiarów. Dodano agar nakładkowy, a kolonie rozwinęły czerwony kolor przez redukcję związku TTC w agarze nakładkowym. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Interfejs oprogramowania NIST Integrated Colony Enumerator (NICE). Graficzna reprezentacja interfejsu oprogramowania NICE. Regiony zainteresowania (ROI) są wyśrodkowane nad koloniami dla każdego miejsca przed zliczeniem. Dane można eksportować bezpośrednio z okna NICE. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Tabliczki LBA zliczane w oprogramowaniu NICE. Kolorowe obrazy fotograficzne są ładowane do oprogramowania NICE, a jednostki tworzące kolonie (CFU) są zliczane automatycznie. Na tym zdjęciu przedstawiono dwie reprezentatywne płytki LBA wraz z informacjami o liczbie ich kolonii. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

szt. Rozdział Rozdział szt. Rozdział szt. szt. Rozdział Rozdział Rozdział SZT. Rozdział szt. szt.
185 Rozdział 185Rozdział 167Rozdział 145151122 Rozdział 122134Rozdział 119Rozdział 142124Rozdział 115Rozdział 113123 Rozdział 1231:17496Rozcieńczenie 8
Rozdział 186152 Rozdział 152Rozdział 145Rozdział 138Rozdział 132135 Rozdział 135Rozdział 108Rozdział 116100Rozdział 119105Rozdział 1091:5832Rozcieńczenie 7
Rozdział 179160Rozdział 145135 Rozdział 135Rozdział 10912054 Rozdział 545571 Rozdział 717579Rozdział 891:1944Rozcieńczenie 6
193Rozdział 153146 Rozdział 146Rozdział 138Rozdział 871055669Rozdział 19Rozdział 301:648Rozcieńczenie 5
184 Rozdział 184129 Rozdział 129Rozdział 121143 Rozdział 14367011111Godzina 1:216Rozcieńczenie 4
180Rozdział 14522 Rozdział 2224cyfra arabska3311000Godzina 1:72Rozcieńczenie 3
Rozdział 207129 Rozdział 12910cyfra arabskacyfra arabska104101Godzina 1:24Rozcieńczenie 2
Z numerem 20114000001110441:8Rozcieńczenie 1
Kontrola A Kontrola BPróbka 1Próbka 2Próbka 3Próbka 4Próbka 5

Tabela 2: Liczba kolonii bakteryjnych. Zliczanie CFU jest eksportowane z oprogramowania NICE do formatu Excel. Liczby te można ułożyć w tabelę przedstawiającą liczbę bakterii dla wszystkich zduplikowanych próbek i studzienek kontrolnych.

szt. Rozdział szt. Rozdział
Kontrola A Kontrola BRozdział 148Rozdział 128131 Rozdział 131120Rozdział 1181:17496Rozcieńczenie 8
Rozdział 189Rozdział 147Rozdział 142134Rozdział 112Rozdział 110Rozdział 1071:5832Rozcieńczenie 7
NSK (1-CtrB/CtrA): 22%140Rozdział 1155573 Rozdział 73Rozdział 841:1944Rozcieńczenie 6
50% KI (CtrB/2): 73 Rozdział 14296 Rozdział 9668251:648Rozcieńczenie 5
Rozdział 1327111Godzina 1:216Rozcieńczenie 4
233cyfra arabska10Godzina 1:72Rozcieńczenie 3
1cyfra arabska131Godzina 1:24Rozcieńczenie 2
001141:8Rozcieńczenie 1
Próbka 1Próbka 2Próbka 3Próbka 4Próbka 5

Tabela 3: Obliczanie wartości granicznej 50% KI i zduplikowanych średnich próbek. Wartość odcięcia 50% KI obliczono, biorąc średnią ze wszystkich odwiertów kontrolnych B i dzieląc ją przez 2. Średnie duplikatów obliczono dla każdego rozcieńczenia każdej próbki, która została przeprowadzona w dwóch egzemplarzach. Obliczana jest również wartość NSK.

figure-results-4
Rysunek 4: Schemat interpolacji liniowej. Liczba bakterii, które przeżyły (oś y) przy każdym rozcieńczeniu badanej surowicy (oś x) jest wykreślana (czarne romby), a poszczególne punkty są łączone cienką, przerywaną czarną linią. Ciągłe i przerywane linie poziome wskazują odpowiednio 0% i 50% zabójstw. Rozcieńczenia surowicy powyżej (Rozcieńczenie 5) i poniżej (Rozcieńczenie 4) 50% linii zabijania są połączone czerwoną linią i wskazane jest miano bakteriobójcze (KI). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

SZT.
SBA KI (Biblioteka SBA)
Próbka 172 Rozdział 72
Próbka 2Rozdział 216
Próbka 3Rok 1994
Próbka 4Rok 1994
Próbka 5648

Tabela 4: Wyniki SBA pokazujące miano bakteriobójcze (KI). Końcowe wartości SBA KI zostały określone dla każdej próbki i są pokazane. Wartości te są obliczane przy użyciu średnich CFU, wartości odcięcia 50% KI i wzoru na interpolację liniową.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany tutaj protokół demonstruje funkcjonalny test immunologiczny w celu oceny aktywności kwasowo-shigellacidowej przeciwciał w surowicy. W teście wykazanym dla tego protokołu zastosowano przeciwciała monoklonalne specyficzne dla S. flexneri 3a9 wraz z surowicami ludzkimi z poprzedniego badania szczepionki Shigella 11. Źródło surowicy badanej w tym teście może się znacznie różnić od przedklinicznych próbek zwierzęcych do ludzkich próbek klinicznych, a na aktywność kwasowo-shigellacidową próbki surowicy będą miały wpływ szczepienia i ekspozycje, których doświadczyła dana osoba. Można spodziewać się pewnej reaktywności krzyżowej między blisko spokrewnionymi serotypami, w szczególności S. flexneri 2a i S. flexneri 3a, ale w tych szczepach zaobserwowano niewielką reaktywność krzyżową w porównaniu z S. sonnei9. Podstawa SBA koncentruje się na aktywacji kaskady dopełniacza poprzez wiązanie przeciwciało-antygen. Dlatego obchodzenie się z odczynnikiem BRC jest jednym z wielu krytycznych kroków związanych z wykonaniem tego protokołu. BRC został wybrany do zastosowania w tym teście ze względu na jego stałą wydajność i niski poziom NSK w innych testach bakteriobójczych 12,13,14. Aktywność BRC jest wrażliwa na temperaturę i należy podjąć odpowiednie środki w celu zapewnienia, że cykle zamrażania i rozmrażania są zminimalizowane, że BRC jest rozdzielany na objętości jednorazowego użytku oraz że podwielokrotności BRC są szybko rozmrażane, bezpośrednio przed użyciem w teście. Spójność aktywności dopełniacza będzie miała wpływ na odtwarzalność tego testu. Kolejnym krytycznym krokiem, który ma wpływ na odtwarzalność testu, jest produkcja i rozcieńczanie zapasów bakterii. Ważne jest, aby przed rozpoczęciem badania określić odpowiednie rozcieńczenie stad bakterii, ponieważ powodzenie testu zależy od konsekwentnego wytwarzania kontroli A i B, w których liczba CFU wynosi średnio ~120 CFU na plamkę. Aby uzyskać plamy, które są policzalne przez oprogramowanie, konieczne jest również, aby technika stosowana do płytki bakterii została pomyślnie wykonana. Osadzanie roztworu bakteryjnego i przechylanie płytki tak, aby plamki przebiegały na ~2-3 cm, ma kluczowe znaczenie dla wytworzenia kolonii o odpowiedniej wielkości i prawidłowym rozmieszczeniu w celu dokładnego zliczenia przez oprogramowanie NICE. Opanowanie wszystkich tych kroków zapewni, że ten protokół zapewni dokładne, spójne wyniki

Nawet jeśli wszystkie krytyczne kroki zostaną wykonane prawidłowo, nadal mogą wystąpić przypadki, w których konieczna będzie modyfikacja lub rozwiązanie problemów z tym protokołem. Modyfikacje tego protokołu w celu oceny innych bakterii mogą wymagać optymalizacji temperatury inkubacji płytki LBA przez noc, aby zapewnić tworzenie mikrokolonii. Inne szczepy bakterii lub źródła przeciwciał, inne niż surowica, mogą wymagać optymalizacji stężenia dopełniacza. Wartości NSK i KI surowic kontrolnych powinny być również monitorowane, aby upewnić się, że test działa prawidłowo. NSK nie powinna wzrosnąć powyżej 70%. KI surowic kontrolnych nie powinno różnić się więcej niż średnia ± 2SD. Aby osiągnąć pomyślne i spójne wyniki podczas korzystania z tego protokołu, konieczne będzie wykonanie wszystkich kroków zgodnie z opisem tutaj, ze szczególnym uwzględnieniem krytycznych kroków opisanych powyżej.

Chociaż protokół ten zaspokaja ważną potrzebę w społeczności badawczej Shigella , nie jest pozbawiony ograniczeń. Protokół ten opiera się na materiale biologicznym i dlatego zawsze będzie istniała pewna zmienność, którą trudno kontrolować. Różnice w aktywności dopełniacza z różnych partii i źródeł mogą przyczyniać się do zmienności testów. Aby temu zapobiec, ważne jest, aby odpowiednio obchodzić się z uzupełnieniem i testować nowe partie suplementu pod kątem aktywności przed zakupem. Pomocne może być również utworzenie puli partii dopełniacza o znanej aktywności, aby mieć jednorodną podaż. Protokół ten jest prosty z założenia i nie wymaga żadnego specjalistycznego sprzętu, a oprogramowanie do automatycznego liczenia kolonii jest swobodnie dostępne. Chociaż ta prostota jest zaletą, pozwalającą na stosowanie tego protokołu w praktycznie każdym laboratorium, nadal wymaga on inkubacji przez noc. Opisano ostatnie testy, które mają znacznie krótszy czas inkubacji, ale wymagają specjalistycznych, przygotowawczych odczynników15. Innym ograniczeniem tego testu jest to, że w swojej obecnej formie jest on w stanie badać tylko jeden gatunek bakterii na raz. W dziedzinie Shigella istnieje pragnienie stworzenia szczepionki wielowalentnej, a posiadanie testów immunologicznych, które mogą oceniać patogeny w sposób multipleksowy, ma wielką wartość. Test ten może zostać zmodyfikowany w przyszłości, aby zaspokoić tę potrzebę, ale w obecnej formie jest to test single-plex.

Chociaż test ten ma pewne ograniczenia, nadal ma wiele zalet w porównaniu z istniejącymi lub alternatywnymi metodami. Zalety te obejmują wiele ulepszeń, które sprawiają, że wykonanie tej metody jest znacznie mniej pracochłonne i ma większą przepustowość niż tradycyjne SBA. Zastosowanie zamrożonych szczepów bakteryjnych, format testu z 96 dołkami, posiew na większych kwadratowych szalkach Petriego, zabarwienie kolonii, które pozwala na fotografowanie i automatyczne liczenie kolonii, wszystko to pomaga zmniejszyć ilość materiałów i czas potrzebny do wykonania tego testu. Test ten ma również zalety w porównaniu z innymi metodami wysokoprzepustowymi, ponieważ nie wymaga żadnych specjalistycznych odczynników ani sprzętu. Opisany protokół może być wykonywany przy użyciu podstawowych odczynników i ogólnodostępnego oprogramowania, co pozwala na jego zastosowanie w każdych warunkach laboratoryjnych.

Wszystkie zalety, jakie zapewnia ten protokół, przemawiają za jego wykorzystaniem w wielu przyszłych badaniach. Test idealnie nadaje się do badania odpowiedzi immunologicznej po szczepieniu lub naturalnej infekcji. To zastosowanie pozwala SBA być cennym narzędziem w badaniach nad szczepionką Shigella i zostało już wykorzystane do oceny immunogenności szczepionki w bioskoniugowanych szczepionkach Shigella , gdzie wykazano zdolność tych szczepionek do indukowania produkcji funkcjonalnych przeciwciał16. Protokół ten został gruntownie przetestowany przez wiele laboratoriów i wykazano, że daje wiarygodne, powtarzalne wyniki9. Protokół ten daje również porównywalne wyniki, gdy te same próbki są testowane przy użyciu innych testów bakteriobójczych17. Spójność danych generowanych przez ten test i jego kompatybilność z innymi starszymi metodami sprawiają, że jest to solidne narzędzie do dokładnej oceny aktywności bakteriobójczej w próbkach surowicy. Test można również łatwo dostosować do oceny dodatkowych typów próbek. Podczas gdy surowica jest łatwo dostępna w badaniach klinicznych dla dorosłych, uzyskanie wystarczającej ilości surowicy w badaniach koncentrujących się na niemowlętach i małych dzieciach może być trudne; jedną z ostatecznych populacji docelowych szczepionek przeciwko Shigella . W tych badaniach krew pełna jest rutynowo pobierana na bibułę filtracyjną i suszona. Osiągnięto pewne wstępne sukcesy z tego typu formatem próbki przy użyciu SBA. Oprócz krwi pełnej, próbki błony śluzowej (takie jak ślina, ekstrakty kałowe i mocz) są również celem, który jest istotny w badaniach nad szczepionką Shigella . Obecnie protokół ten został oceniony pod kątem trzech najbardziej istotnych klinicznie serotypów Shigella , ale można go również dostosować do dodatkowych Shigella spp., a także innych patogenów bakteryjnych. Przyszłe prace będą koncentrować się na produkcji testu multipleksowego o wielu takich samych cechach, jak test opisany w niniejszym protokole. Test multipleksowy pozwoli na jednoczesną ocenę wielu serotypów Shigella , co jeszcze bardziej pozwoli zaoszczędzić objętość próbki i czas testu. Trwają również prace nad przeniesieniem tego testu do laboratoriów na całym świecie. Te globalne oceny wygenerują więcej danych w celu zakwalifikowania testu na większą skalę badawczą, jednocześnie zwiększając liczbę laboratoriów mikrobiologicznych i immunologicznych, które mają dostęp do tego SBA w celu oceny bakterii i próbek surowicy pobranych z różnych lokalizacji endemicznych. Opisany tutaj test jest prosty i wysokoprzepustowy i może poprawić ocenę immunologiczną w dziedzinie Shigella , a także szersze zastosowania do oceny innych patogenów bakteryjnych.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

R.W.K. jest pracownikiem rządu Stanów Zjednoczonych i w związku z tym poglądy wyrażone w tej publikacji są poglądami autorów i niekoniecznie odzwierciedlają oficjalną politykę lub stanowisko Departamentu Armii, Departamentu Obrony ani rządu USA.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została sfinansowana z grantu od PATH dla M.H.N. Badanie to zostało przeprowadzone w ramach umowy o współpracy badawczo-rozwojowej między Instytutem Badawczym Armii Waltera Reeda a Uniwersytetem Alabamy w Birmingham.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
ŻelatynaSigmaG9391Typ B, proszek, Bioodczynnik, odpowiedni do hodowli komórkowych
TTC (chlorek 2,3,5-trifenylotetrazolu)SigmaT8877≥ 98,0% (HPLC)
Azydek sodu (NaN3)SigmaS2002≥ 99,5%
Mały królikPelFreez31061-33-4 tygodniowy
HBSS z Ca2+/Mg2+Invitrogen14065-56Bez czerwieni fenolowej
LB Agar (Lennox)SigmaL2897Proszek pożywka do wzrostu mikroorganizmów
Bacto AgarBD214010Sproszkowany, (C12H18O9)n
GlycerolSigmaG5516Dla biologii molekularnej, ≥ 99%
LB Rosół (Lennox)SigmaL3022Proszek do wzrostu drobnoustrojów
Kwadratowa szalkaPetriego SigmaZ617679-240EA120 mm x 120 mm
Costar379996-dołkowa płyta dolna w kształcie litery U z pokrywką
NICE SoftwareUniversity of Alabama w Birminghamftp://ftp.nist.gov/pub/physics/mlclarke/NICE/
Płytka testowa

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Riddle, M. S., Sanders, J. W., Putnam, S. D., Tribble, D. R. Incidence, etiology, and impact of diarrhea among long-term travelers (US military and similar populations): a systematic review. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 74 (5), 891-900 (2006).
  2. Tickell, K. D., et al. Identification and management of Shigella infection in children with diarrhoea: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Global Health. 5 (12), e1235-e1248 (2017).
  3. Livio, S., et al. Shigella isolates from the global enteric multicenter study inform vaccine development. Clinical Infectious Diseases. 59 (7), 933-941 (2014).
  4. Barry, E. M., et al. Progress and pitfalls in Shigella vaccine research. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 10 (4), 245-255 (2013).
  5. Noriega, F. R., et al. Strategy for cross-protection among Shigella flexneri serotypes. Infection and Immunity. 67 (2), 782-788 (1999).
  6. Levine, M. M., Kotloff, K. L., Barry, E. M., Pasetti, M. F., Sztein, M. B. Clinical trials of Shigella vaccines: two steps forward and one step back on a long, hard road. Nature Reviews Microbiology. 5 (7), 540-553 (2007).
  7. Sayem, M. A., et al. Differential host immune responses to epidemic and endemic strains of Shigella dysenteriae type I. Journal of Health Population and Nutrition. 29 (5), 429-437 (2011).
  8. Rahman, M. J., et al. Effects of zinc supplementation as adjunct therapy on the systemic immune responses in shigellosis. The American Journal of Clinical Nutrition. 81 (2), 495-502 (2005).
  9. Nahm, M. H., et al. interlaboratory evaluations, and application of a simple, high-throughput Shigella serum bactericidal assay. mSphere. 3 (3), (2018).
  10. Burton, R. L., Nahm, M. H. Development and validation of a fourfold multiplexed opsonization assay (MOPA4) for pneumococcal antibodies. Clinical and Vaccine Immunology. 13 (9), 1004-1009 (2006).
  11. Tribble, D., et al. Safety and immunogenicity of a Shigella flexneri 2a Invaplex 50 intranasal vaccine in adult volunteers. Vaccine. 28 (37), 6076-6085 (2010).
  12. Kim, H. W., Kim, K. H., Kim, J., Nahm, M. H. A high throughput serum bactericidal assay for antibodies to Haemophilus influenzae type b. BMC Infectious Diseases. 16, 473(2016).
  13. Maslanka, S. E., et al. Standardization and a multilaboratory comparison of Neisseria meningitidis serogroup A and C serum bactericidal assays. The Multilaboratory Study Group. Clinical Diagnostic Laboratory Immunology. 4 (2), 156-167 (1997).
  14. Jang, M. S., Sahastrabuddhe, S., Yun, C. H., Han, S. H., Yang, J. S. Serum bactericidal assay for the evaluation of typhoid vaccine using a semi-automated colony-counting method. Microbial Pathogeneis. 97, 19-26 (2016).
  15. Necchi, F., Saul, A., Rondini, S. Development of a high-throughput method to evaluate serum bactericidal activity using bacterial ATP measurement as survival readout. PLoS One. 12 (2), e0172163(2017).
  16. Riddle, M. S., et al. Safety and immunogenicity of a candidate bioconjugate vaccine against Shigella flexneri 2a administered to healthy adults: a single blind, randomized phase I study. Clinical and Vaccine Immunology. , (2016).
  17. Shimanovich, A. A., et al. Functional and Antigen-Specific Serum Antibody Levels as Correlates of Protection against Shigellosis in a Controlled Human Challenge Study. Clinical and Vaccine Immunology. 24 (2), (2017).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Shigella Bactericidal AssaySerum Bactericidal AssayHigh throughput AssaySerial DilutionColony CountingComplement ActivationBacterial KillingMicro culture SystemAutomated Colony CountingFrozen Bacterial Stock

Powiązane artykuły