Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Pomiar cytometryczny przepływu produkcji ROS w makrofagach w odpowiedzi na sieciowanie FcγR

15.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59167

⸱

7 marca 2019

 , 
1Division of Immunity and Pathogenesis, Burnett School of Biomedical Sciences, University of Central Florida

W tym artykule

Podsumowanie

To badanie demonstruje użycie cytometrii przepływowej do wykrywania produkcji reaktywnych form tlenu (ROS) wynikającej z aktywacji FcγR. Metoda ta może być stosowana do oceny zmian w funkcji sygnalizacji przeciwdrobnoustrojowej i redoks fagocytów w odpowiedzi na kompleksy immunologiczne, opsonizowane mikroorganizmy lub bezpośrednie sieciowanie FcγR.

Streszczenie

Wybuch oksydacyjny lub oddechowy jest używany do opisania szybkiego zużycia tlenu i generowania reaktywnych form tlenu (ROS) przez fagocyty w odpowiedzi na różne bodźce immunologiczne. ROS powstający podczas aktywacji immunologicznej wywiera silne działanie przeciwdrobnoustrojowe głównie poprzez zdolność ROS do uszkadzania DNA i białek, powodując śmierć mikroorganizmów. Możliwość powtarzalnego i łatwego pomiaru produkcji ROS jest niezbędna, aby ocenić wkład różnych szlaków i cząsteczek w ten mechanizm obrony gospodarza. W tym artykule demonstrujemy zastosowanie sond fluorescencyjnych i cytometrii przepływowej do wykrywania produkcji ROS. Chociaż szeroko stosowany, fluorescencyjny pomiar ROS jest notorycznie problematyczny, zwłaszcza w odniesieniu do pomiaru ROS indukowanego przez specyficzne, a nie mitogenne bodźce. Przedstawiono szczegółową metodykę wykrywania ROS powstających w wyniku specyficznej stymulacji FcγR, począwszy od generacji makrofagów, gruntowania, barwienia, sieciowania FcγR, a skończywszy na analizie cytometrii przepływowej.

Wprowadzenie

Reaktywne formy tlenu (ROS) to reaktywne cząsteczki lub wolne rodniki, które są produktami ubocznymi oddychania tlenowego (przejrzane w 1). Należą do nich między innymi anion ponadtlenkowy, nadtlenek, nadtlenek wodoru, rodnik hydroksylowy i jony hydroksylowe. W normalnych warunkach fizjologicznych ROS są wytwarzane głównie przez mitochondria i oksydazy fosforanu dinukleotydu nikotynamidoadeninowego (NADPH) i są szybko detoksykowane przez różne enzymy i białka, takie jak dysmutaza ponadtlenkowa i glutation. Nadmierna produkcja ROS lub defekt w zdolności do usuwania ROS może powodować stres oksydacyjny, w którym reaktywne formy tlenu sprzyjają uszkodzeniu białek, lipidów i DNA, prowadząc do stresu komórkowego lub śmierci i patologicznych stanów chorobowych. Jednak obecnie docenia się, że ROS może również działać jako cząsteczki sygnałowe (sygnalizacja redoks), a modyfikacja różnych cząsteczek i produktów pośrednich szlaku za pośrednictwem ROS może wpływać na metabolizm komórkowy, proliferację, przeżycie, sygnalizację zapalną i starzenie się2. W komórkach fagocytarnych ROS odgrywa zasadniczą rolę w zapewnianiu aktywności przeciwdrobnoustrojowej podczas tak zwanego "wybuchu oddechowego"1,3,4,5,6. Podczas odpowiedzi fagocytów na bodźce zewnętrzne składniki kompleksu oksydazy NADPH (p40phox, p47phox, p67phox) przemieszczają się z cytozolu do błony fagosomalnej zawierającej podjednostki gp91phox i p22phox i wraz z działaniem Rac1/2 tworzą w pełni funkcjonalny kompleks enzymatyczny oksydazy NADPH. Zmontowana oksydaza NADPH wykorzystuje następnie NADPH do redukcji tlenu do ponadtlenku w fagosomalnej wakuoli. Aniony ponadtlenkowe mogą bezpośrednio powodować uszkodzenia lub ulegać dysmutacji w nadtlenek wodoru. Zarówno nadtlenek wodoru, jak i nadtlenek wodoru mogą reagować z innymi cząsteczkami, tworząc wysoce reaktywne rodniki hydroksylowe. Uszkodzenie odbywa się za pośrednictwem reakcji tych ROS z klastrami żelazowo-siarkowymi na białkach lub poprzez utlenianie zasad DNA, co ostatecznie prowadzi do ograniczenia metabolizmu drobnoustrojów lub śmierci drobnoustroju5. Znaczenie kompleksu enzymatycznego oksydazy NADPH i ROS wytwarzanych podczas wybuchu oddechowego jest zilustrowane klinicznie u pacjentów z przewlekłą chorobą ziarniniakową (CGD)7,8,9,10. Osoby z CGD posiadają mutacje w gp91phox, co skutkuje brakiem produkcji ROS i podatnością na nawracające infekcje bakteriami i grzybami, które zwykle nie stanowią problemu u osób immunokompetentnych. Dlatego, niezależnie od tego, czy badasz stres oksydacyjny, sygnalizację redoks, czy obronę gospodarza, możliwość pomiaru produkcji ROS w czasie rzeczywistym jest użytecznym przedsięwzięciem.

Do pomiaru produkcji ROS lub wyników stresu oksydacyjnego wykorzystano wiele testów11,12,13. Wśród nich jednym z najczęściej stosowanych jest dioctan dichlorodihydrofluoresceiny 2',7' (DCFH2-DA)14. Cząsteczka ta jest bezbarwna i lipofilowa. Dyfuzja DCFH2-DA przez błonę komórkową pozwala na działanie na nią przez esterazy wewnątrzkomórkowe, które deacetylują go do DCFH2, czyniąc go nieprzepuszczalnym dla komórek. Działanie wielu rodzajów ROS (nadtlenek wodoru, nadtlenoazotyn, rodniki hydroksylowe, tlenek azotu i rodniki nadtlenowe) na DCFH2 utlenia go do DCF, który jest fluorescencyjny (zgłoszony Ex / Em: 485-500 nm / 515-530 nm) i może być wykryty za pomocą cytometru przepływowego wyposażonego w standardowy zestaw filtrów do fluoresceiny (kanał FL1). Ponadtlenek nie reaguje silnie z DCFH2, ale może reagować z inną sondą dihydroetydydą (DHE), aby otrzymać produkt fluorescencyjny 2-hydroksyyetyd (jak również inne fluorescencyjne produkty utleniania niezależne od ponadtlenków)15. Fluorescencyjne produkty utleniania DHE można wykrywać za pomocą długości fali wzbudzenia 518 nm i długości fali emisji 605 nm (kanał FL2). Chociaż stosunkowo proste w użyciu, wykorzystanie tych sond do wykrywania ROS wymaga wiedzy na temat ich ograniczeń i starannego włączenia procedur barwienia i kontroli do konkretnego wykonywanego testu, aby uzyskać ważne wyniki i wnioski eksperymentalne. Poniższy protokół demonstruje użycie dostępnego na rynku zestawu wykorzystującego te 2 sondy przeznaczone do pomiaru ROS za pomocą cytometrii przepływowej. Za pomocą tych sond barwimy makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego i indukujemy produkcję ROS poprzez sieciowanie FcγR. Przedstawiamy reprezentatywne dane uzyskane przy użyciu tego protokołu i podkreślamy odpowiednie środki ostrożności, które należy podjąć, aby eksperymenty zakończyły się sukcesem.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Protokół postępowania ze zwierzętami został zatwierdzony przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Centralnej Florydy.

1. Generacja makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego (BMDM)

  1. Przygotowanie pożywek hodowlanych
    1. Przygotuj podłoże bazowe D10F: Do zmodyfikowanego podłoża Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco dodaj 10% inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 1 mM pirogronianu sodu, 10 mM kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES) i 0,05 mM β-merkaptoetanolu.
      UWAGA: Chociaż najlepiej jest używać świeżych pożywek D10F, podłoża bazowe D10F można przygotować z wyprzedzeniem do dwóch tygodni, aby można je było wykorzystać do wielu eksperymentów w ciągu tygodnia. Na jedną mysz potrzeba około 175 ml pożywki bazowej D10F (25 ml do przepłukania kości i 150 ml do wytworzenia pożywki do różnicowania makrofagów)
    2. Przygotuj pożywkę wzrostową LADMAC: Do Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) dodaj 10% inaktywowanego termicznie FBS i 2 mM L-glutaminy. Przygotuj podłoże na świeżo, w dniu, w którym planujesz rozpocząć swoje kultury.
      UWAGA: Jeden litr pożywki wzrostowej LADMAC da około (19) 50 ml porcji pożywki kondycjonowanej przez LADMAC.
    3. Przygotuj kompletne podłoże DMEM: Do DMEM dodaj 10% inaktywowanego termicznie FBS i 1x Antybiotyk-Antybiotyk-Antybiotyk. Przygotuj pożywkę na świeżo, w dniu zbioru BMDM.
      UWAGA: Dla jednej myszy wymagane będzie około 100 ml kompletnego nośnika DMEM. Obejmuje to podłoża używane do gruntowania komórek.
  2. Przygotowanie pożywki kondycjonowanej LADMAC
    1. Hodować komórki LADMAC do zbiegu w 10-centymetrowym naczyniu, używając 10 ml pożywki wzrostowej LADMAC (określonej w 1.1.2). Inkubować komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
    2. U zbiegu odłącz komórki, mocno dozując pożywkę na komórki. Pasaż komórek, dodając 1 ml odłączonych komórek do kolb T-175 zawierających 100 ml pożywki wzrostowej LADMAC. Inkubować komórki aż do całkowitego zlania się w temperaturze 37 °C, 5% CO2 (około tygodnia). W ten sposób z jednej 10-centymetrowej płytki można uzyskać dziesięć kolb T-175 lub około 1 l kondycjonowanego podłoża.
    3. Gdy komórki są gotowe, zbierz kondycjonowane podłoże i odwiruj przy 350 x g przez 5 minut, aby osadzać niechciane komórki. Przefiltrować zebrane supernatanty przez filtr 0,2 μm i przechowywać 50 ml podwielokrotności w temperaturze -80 °C. Podwielokrotności pożywek kondycjonowanych przez LADMAC można przechowywać w temperaturze -80 °C przez wiele miesięcy przy minimalnej utracie aktywności.
      UWAGA: Jeśli przewiduje się duże eksperymenty, należy jednocześnie przygotować duże partie pożywek kondycjonowanych przez LADMAC, aby zapewnić spójność. Jeśli nie jest to możliwe, należy użyć podwielokrotności pochodzących z tej samej partii lub partii pożywek kondycjonowanych przez LADMAC dla każdego eksperymentu.
  3. Przygotowanie makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego
    1. W dniu eksperymentu należy przygotować świeże pożywki do różnicowania makrofagów, dodając 25% pożywki kondycjonowanej LADMAC do wcześniej przygotowanych pożywek D10F (1 część pożywki kondycjonowanej LADMAC na 3 części D10F). Nie przygotowuj tego podłoża z wyprzedzeniem! Przygotuj tylko tyle podłoża, ile jest potrzebne do hodowli BMDM.
    2. Dzień 1: Wyizoluj komórki szpiku kostnego myszy zgodnie z wcześniej opisanym protokołem16 z modyfikacją polegającą na płukaniu szpiku kostnego z kości udowych i piszczelowych za pomocą pożywki podstawowej D10F. Użyj 2,5 ml pożywki D10F, aby przepłukać każdy koniec (4) kości. Przepłucz komórki szpiku kostnego bezpośrednio do wstępnie zwilżonego sitka komórkowego o wielkości 40 μm umieszczonego na probówce o pojemności 50 ml. Pozostałą pożywkę (~5 ml) można wykorzystać do wypłukania sitka komórkowego.
    3. Odwirować pobrane komórki szpiku kostnego w dawce 350 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w łącznej ilości 30 ml pożywki do różnicowania makrofagów (na mysz).
    4. Przygotować i oznaczyć (6) sterylne 10 cm szalki Petriego. Wprowadzić 5 ml pożywki do różnicowania makrofagów do każdej na szalkę Petriego. Porcję 5 ml zawieszonych komórek szpiku kostnego w pożywce do różnicowania makrofagów do każdej szalki Petriego, co daje całkowitą objętość 10 ml na szalkę. Inkubować przez 5 dni w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
    5. Dzień 5: Odessać pożywkę z komórek. Przemyć raz 1-2 ml PBS i dodać 10 ml świeżo przygotowanej pożywki do różnicowania makrofagów. Inkubuj przez dodatkowe 3 dni.
    6. Dzień 8: Przystąp do zbierania BMDM zgodnie z poniższym opisem.

2. Zbiór, siew i kondycjonowanie BMDM

  1. Po 7 dniach hodowli BMDM w pożywce różnicującej makrofagi należy usunąć supernatant. Raz przemyj przylegające makrofagi 1-2 ml PBS. Zassać PBS.
  2. Dozuj 1 ml 0,25% trypsyny-EDTA do każdej płytki makrofagów i pozostaw je w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 5-10 minut, często stukając w celu odłączenia komórek. Dysocjuj trypsynizowane makrofagi, pipetując w górę iw dół za pomocą pipety P1000 i zbierz makrofagi w probówkach o pojemności 50 ml zawierających 10-15 ml kompletnych pożywek DMEM. Umyj płytkę dodatkowymi 2 ml kompletnej pożywki DMEM, aby zebrać wszelkie pozostałe makrofagi.
    UWAGA: Nie pozostawiaj makrofagów w trypsynie na dłużej niż 10 minut.
  3. Odwirować probówki o pojemności 50 ml o masie 350 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant. Delikatnie oddzielić osad i ponownie zawiesić komórki w 10 ml kompletnego podłoża DMEM. Policz makrofagi za pomocą hemocytometru w obecności barwnika żywotności, takiego jak błękit trypanowy, w następujący sposób:
    1. Na przykład zmieszaj 90 μl błękitu trypanowego z 10 μl komórek w celu rozcieńczenia 1:10.
    2. Z tej mieszaniny załaduj 10 μl do hemocytometru i policz centralny kwadrat (siatka 5 x 5). Całkowita liczba komórek = liczba x 104 x współczynnik rozcieńczenia (10) x objętość (10 ml).
  4. Dostosuj zawiesinę komórek do 1 miliona/ml w kompletnej pożywce DMEM i umieść 4 ml tej zawiesiny komórek w każdym naczyniu o średnicy 6 cm.
    UWAGA: Wymagane są co najmniej 3 płytki na eksperyment. Jedna płytka komórek pozostanie niestymulowana, drugi zestaw komórek zostanie pobudzony poprzez sieciowanie FcγR, a trzecia płytka komórek zostanie wykorzystana do wszystkich dodatkowych kontroli eksperymentalnych i cytometrycznych przepływowych.
  5. Inkubować płytki przez noc w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
  6. Następnego dnia odessać supernatant, przemyć komórki raz 1-2 ml PBS. Do każdej płytki dodać 4 ml kompletnej pożywki zawierającej 100 ng/ml mysiego IFN-γ. Inkubować płytki przez noc w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
  7. W razie potrzeby należy pobrać podwielokrotność komórek, aby ocenić odpowiednie wytwarzanie BMDM za pomocą cytometrii przepływowej. Użyć 1x106 komórek na test i przygotować probówki FAC z polistyrenu do następujących warunków: kontrola izotypu, barwiona F4/80 (lub alternatywnie barwiona CD11b).
  8. Przygotować bufor do barwienia cytometrii przepływowej, dodając 0,1% FBS do 1x PBS. Używaj tylko takiej ilości FBS, aby nie negować skutków głodu surowicy w późniejszych krokach.
  9. Podwielokrotność 1 x 106 komórek w probówce i wirować przy 750 x g przez 5 min.
  10. Przemyć raz przez dekantację lub zasysanie supernatantu i ponowne zawieszenie komórek w 2 ml buforu cytometrii przepływowej. Wirować przy 750 x g przez 5 min.
  11. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 100 μl buforu barwiącego cytometrii przepływowej. Dodać 1 μl przeciwciała blokującego CD16/32 Fc przeciwko myszom do każdej probówki. Inkubować na lodzie przez 5 minut.
  12. Bez przemywania dodać 2 μl FITC anty-mysiego F4/80 lub 1 μl anty-mysiego przeciwciała APC CD11b do "barwionych" probówek i podobną ilość odpowiedniego przeciwciała kontrolnego izotypu do probówek "izotypowych". Inkubować na lodzie, w ciemności, przez 30 minut.
  13. Umyj komórki, dodając 2 ml PBS bezpośrednio do komórek. Wirować przy 750 x g przez 5 min.
  14. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 150 μl PBS.
  15. Pobrać próbki na cytometrze przepływowym w warunkach zatrzymania 100 μl lub 10 000 zdarzeń na bramce zainteresowania i upewnić się, że kanały FSC, SSC, FL1 (FITC anti-mouse F4/80) lub FL4 (APC anti-mouse CD11b) są wybrane dla parametrów, które mają być analizowane.
  16. Korzystając z oprogramowania do cytometrii przepływowej, otwórz wykres punktowy dla FSC (na osi x) vs SSC (na osi y) i narysuj bramkę wokół interesujących komórek, z wyłączeniem martwych komórek i szczątków (martwe komórki i szczątki są znacznie mniejszymi zdarzeniami niż główna populacja komórek i pojawiają się w lewym dolnym rogu wykresu).
  17. Bramkując na interesujących komórkach, otwórz wykres histogramu z FL1 (FITC anty-mysz F4/80) lub FL4 (APC anty-mysz CD11b) na osi x.
  18. Uruchom próbkę "isotype". Wygeneruj bramkę znacznikową tak, aby większość zdarzeń próbki "izotypu" znajdowała się na lewo od bramki (<1% dodatni). Zastosuj ten szablon do poplamionego pliku próbki.
  19. Uruchom "poplamioną" próbkę. Pomyślne wygenerowanie BMDM spowoduje >95% ekspresję FITC anty-mysiego F4/80 lub anty-mysiego APC CD11b (Rysunek 1A), podczas gdy nieprawidłowe warunki hodowli mogą skutkować nieoptymalnym wytwarzaniem makrofagów ( Figura 1B).
    UWAGA: W przypadku generowania BMDM z wielu genotypów, należy zwrócić uwagę na ekspresję tych markerów dla każdej wytworzonej partii BMDM, w przypadku, gdy może to stanowić podstawę do wykluczenia próbki z analizy, gdy oceniane jest wytwarzanie ROS w odpowiedzi na bodziec.

3. Przygotowanie odczynnika i materiału do pomiaru ROS

  1. Rozpuść liofilizowany odczynnik do wykrywania stresu oksydacyjnego w 60 μl bezwodnego DMF w celu uzyskania roztworu podstawowego o stężeniu 5 mM. Delikatnie wymieszać przed użyciem.
    UWAGA: W instrukcji zestawu ROS-ID podano, że okres trwałości odczynnika po utworzeniu wynosi około 1 tygodnia w temperaturze -20 °C. Porcjowanie odczynnika natychmiast po rozpuszczeniu do małych, światłoszczelnych fiolek minimalizuje jego utlenianie i maksymalizuje okres trwałości w temperaturze -20 °C.
  2. Rozpuść liofilizowany odczynnik do wykrywania ponadtlenków w 60 μl bezwodnego DMF w celu uzyskania roztworu podstawowego o stężeniu 5 mM. Delikatnie wymieszać przed użyciem.
    UWAGA: Jak stwierdzono w instrukcji zestawu, należy traktować oba odczynniki wykrywające jako potencjalne mutageny, obchodzić się z każdym z nich ostrożnie i odpowiednio zutylizować.
  3. Rozpuść induktor ROS (piocyjaninę) w 20 μl bezwodnego DMF, aby otrzymać 50 mM roztwór podstawowy.
  4. Rozpuść inhibitor ROS (N-acetylo-L-cysteinę) w 123 μl wody dejonizowanej, aby uzyskać stężenie podstawowe 0,5 M.
  5. Oznaczyć okrągłe probówki polistyrenowe o pojemności 5 ml (probówki do cytometrii przepływowej) z kontrolami i warunkami doświadczalnymi. (Patrz 4. Warunki oznaczania i kontrole)
  6. Przygotuj DMEM o niskiej surowicy (bez czerwieni fenolowej), dodając 0,1% FBS do DMEM wolnego od czerwieni fenolowej.
  7. Podwielokrotność przeciwciała anty-BSA podzielić na małe porcje (w zależności od zastosowania) i przechowywać je w temperaturze -80 °C.
  8. Przygotować roztwór podstawowy 100 mg/ml BSA w HBSS (zrównoważony roztwór soli Hanksa) lub PBS. Podwielokrotność rozdzielić na 100 μl podwielokrotności i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  9. Przygotuj 2x roztwór sond ROS (2x roztwór sondy): na każde 10 ml DMEM o niskiej surowicy dodaj 4 μl odczynnika do wykrywania stresu oksydacyjnego (zielony barwnik) i 4 μl odczynnika do wykrywania ponadtlenków (pomarańczowy barwnik).
  10. Przygotuj 2x roztwory sondy zawierające tylko odczynnik do wykrywania stresu oksydacyjnego (2x roztwór sondy, tylko zielony) lub zawierające tylko odczynnik do wykrywania ponadtlenków (2x roztwór sondy, tylko pomarańczowy). Przygotuj tylko taką ilość odczynnika, jaka jest potrzebna do eksperymentu i zawsze przygotuj 2x roztwór bezpośrednio przed użyciem.
    UWAGA: Aby przygotować mniejsze objętości 2x roztworu detekcyjnego, użyj pośredniego rozcieńczenia 1:10 zarówno zielonych, jak i pomarańczowych odczynników wykrywających przed ostatecznym rozcieńczeniem w DMEM. Na przykład, aby przygotować 1 ml 2x roztworu detekcyjnego, rozcieńczyć 1 μl każdej sondy w 9 μl DMEM (rozcieńczenie pośrednie 1:10). Rozcieńczyć 4 μl tego pośredniego rozcieńczenia w stosunku 1:10 w 1 ml DMEM.

4. Warunki testu i kontrole

  1. Uwzględnij następujące kontrole eksperymentalne dla kompensacji cytometrii przepływowej dla każdego eksperymentu:
    a) Niebarwione i niestymulowane komórki.
    b) Komórki barwione wyłącznie odczynnikiem do wykrywania stresu oksydacyjnego (zielony odczynnik) i traktowane induktorem ROS.
    c) Komórki wybarwione wyłącznie odczynnikiem do wykrywania ponadtlenkowego (odczynnik pomarańczowy) i poddane działaniu induktora ROS.
  2. Dla każdej myszy lub repliki biologicznej należy uwzględnić następujące 6 warunków:
    a) Niebarwione i niestymulowane komórki
    b) Komórki barwione i niestymulowane
    c) Barwione komórki poddane działaniu dodatniego induktora
    d) Barwione komórki poddane działaniu dodatniego induktora i inhibitora ROS
    e) Barwione komórki aktywowane przez sieciowanie FcγR
    f) Wybarwione komórki aktywowane przez sieciowanie FcγR i potraktowane inhibitorem ROS
  3. Oblicz ilość potrzebnego roztworu 2x sondy na podstawie liczby myszy i warunków (200 μl roztworu 2x sondy zostanie użyte na każdy stan wymagający barwienia).
    UWAGA: W przypadku testu na 6 myszach potrzebnych będzie 5 warunków wymagających barwienia sondami na mysz. Daje to łączną liczbę warunków do 30. Zatem całkowita ilość potrzebnego roztworu 2x sondy wynosi co najmniej 6 ml (30*200 μL).

5. Przygotowanie komórek

  1. Po zasysaniu makrofagów przez noc należy odessać supernatant. Umyj komórki raz za pomocą PBS.
  2. Surowica głodzy komórki, zastępując pożywkę tą samą objętością niskiego DMEM w surowicy. Dla każdej myszy jedna płytka zostanie potraktowana anty-BSA IgG1 podczas głodu surowicy, podczas gdy druga pozostanie nieleczona. Dodaj tylko niską surowicę DMEM do nieleczonych płytek. Dodać DMEM o niskiej surowicy zawierającej 2,5 μg/ml mysiej anty-BSA IgG1 do podawanych płytek.
    UWAGA: Do każdego eksperymentu potrzebna jest jedna dodatkowa niepoddana działaniu cytometrii do kontroli kompensacji cytometrii przepływowej.
  3. Inkubować płytki przez 4 godziny w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
  4. Po głodzeniu surowicy zbierz komórki przez delikatne skrobanie lub przy użyciu 0,2 mM EDTA w PBS. Zebrać je w oznaczonych probówkach okrągłodennych o pojemności 5 ml i odwirować w sile 750 x g przez 5 minut. Śledź, które komórki były traktowane mysim anty-BSA IgG1.
  5. Umyj granulki komórek raz 2 ml PBS, aby pozbyć się wszelkich pozostałości anty-BSA z leczonych komórek.
  6. Zawiesić osad komórkowy w 600 μl DMEM o niskiej surowicy.
  7. Z zawiesiny komórek o objętości 600 μl podwielokrotność 200 μl do wstępnie oznakowanych probówek okrągłodennych o pojemności 5 ml w następujący sposób:
    1. Z nieleczonych komórek pobrać 200 μl dla probówek oznaczonych jako "niestymulowane", 200 μl dla probówek oznaczonych jako "dodatni induktor" i 200 μl dla probówek oznaczonych jako "dodatni induktor + inhibitor"
    2. Z komórek traktowanych anty-BSA IgG1 pobrać 200 μl dla probówek oznaczonych "FcγR crosslinking/FcγR XL" i 200 μL dla probówek oznaczonych "FcγR XL + inhibitor"
    3. Z niepoddanych działaniu substancji komórek, które mają być użyte do kontroli kompensacji, należy pobrać 200 μl dla probówki oznaczonej jako "niebarwiona, niestymulowana", 200 μl dla kontroli "zielony + induktor" i 200 μl dla kontroli "pomarańczowy + induktor".
      UWAGA: Jeżeli komórki z ppkt 5.7.1 i 5.7.3 pochodzą od tej samej myszy, te same "niebarwione, niestymulowane" komórki mogą być użyte do kontroli eksperymentalnej i kompensacyjnej. Jeśli nie, potrzebne będzie dodatkowe 200 μl komórek do "niebarwionej niestymulowanej" kontroli eksperymentalnej dla a).
  8. Trzymaj probówki na lodzie do czasu zabarwienia i stymulacji. Podczas głodu surowicy i wiązania IgG1 przygotuj sondy, określone bodźce i induktory, jak opisano poniżej.
    UWAGA: W przypadku wykonywania testu po raz pierwszy, jeśli nie jest dostępny żaden szablon lub nie jest dostępna kompensacja po fakcie na cytometrze przepływowym i odpowiednim oprogramowaniu, należy stymulować i barwić kontrole kompensacji i uruchamiać je na cytometrze przepływowym, aby wykonać ręczną kompensację przed dodaniem bodźców do próbek eksperymentalnych.

6. Przeprowadzanie testu

  1. Przygotować 2x dodatni roztwór induktora, rozcieńczając pyocyjaninę w stosunku 1:100 w 2x roztworze sondy (przygotowanym w kroku 3.9), aby uzyskać 2x stężenie 500 μM pyocyanin (końcowe stężenie wyniesie 250 μM). Również rozcieńczyć pyocyjaninę w stosunku 1:100 do każdej z probówek "2x roztwór sondy, tylko zielony" i "2x roztwór sondy, tylko pomarańczowy" przygotowanych w 3.10.
    UWAGA: Oba stany oznaczone jako "dodatni induktor" i "dodatni induktor + inhibitor" będą leczone dodatnim induktorem. Zaplanuj odpowiednio przy obliczaniu ilości 2x roztworu dodatniego induktora do przygotowania. Na przykład: Jeśli wykonujesz test na 3 myszach, 6 warunków (3 * 2) zostanie potraktowanych dodatnim induktorem, więc przygotuj 6 * 200 μL = 1,2 ml 2x dodatniego roztworu induktora.
  2. Przygotować 2x roztwór BSA, rozcieńczając roztwór podstawowy BSA w 2x roztworze sondy, aby uzyskać stężenie 2 μg/ml (końcowe stężenie wyniesie 1 μg/mL).
    UWAGA: Oba stany oznaczone jako "FcγR XL" i "FcγR XL + inhibitor" będą leczone roztworem 2x BSA. Zaplanuj odpowiednio przy obliczaniu ilości roztworu do przygotowania. Na przykład: Jeśli wykonujesz test na 3 myszach, 6 (3*2) stanów zostanie potraktowanych roztworem BSA, a więc potrzebne będzie 6*200 μl lub 1,2 ml 2x roztwór BSA.
  3. Przed rozpoczęciem specyficznej stymulacji (sieciowania FcγR) upewnij się, że wszystkie odczynniki i komórki są gotowe. Umieść rurki na lodzie w kolejności, w jakiej będą stymulowane.
  4. W przypadku cytometrów przepływowych z automatycznym samplerem należy zwrócić uwagę na czas, w którym cytometr analizuje jedną próbkę i przechodzi do następnej, w tym wszelkie etapy mieszania i mycia sondy (na przykład 3,5 min).
    UWAGA: Czas jest bardzo ważny dla tego testu. Aby każdy stan był dobrze kontrolowany, stymulacja musi być przeprowadzana dokładnie przez czas (30 minut) dla każdego stanu. Stymuluj komórki w kolejności i uwzględnij czas opóźnienia między pobraniem próbki za pomocą cytometru przepływowego. Na przykład, jeśli czas potrzebny cytometrowi na przeanalizowanie jednej próbki i przejście do następnej wynosi 3,5 minuty, stymuluj komórki w kolejności, w jakiej będą analizowane co 3,5 minuty.
  5. Jeśli w tym momencie wykonujesz kompensację ręczną, należy stymulować rurki kontrolne, które mają być użyte do kompensacji (krok 5.7.3). Dodać 200 μl "2x roztwór sondy, tylko zielony" zawierający induktor (z ppkt 6.1) do probówek oznaczonych "zielony + induktor" (krok 5.7.3). Dodać 200 μl "2x roztwór sondy, tylko pomarańczowy" zawierający induktor (krok 6.1) do probówek oznaczonych "pomarańczowy + induktor" (krok 5.7.3).
  6. Inkubować komórki przez 30 minut w temperaturze 37 °C, 5% CO2 w ciemności.
  7. Korzystając z oprogramowania do cytometrii przepływowej, wygeneruj i oznacz 3 pliki próbek dla próbek kontrolnych "niebarwionych, niepoddanych obróbce", "zielony+induktor" i "pomarańczowy+induktor", upewniając się, że wskazano kanały/parametry do analizy (FSC, SSC, FL1, FL2) i pożądane warunki zatrzymania (100 μL, 3 min itp.). Wygeneruj i oznacz podobny zestaw plików dla próbek eksperymentalnych.
  8. Uruchomić próbkę "niebarwioną, niepoddawaną obróbce". Otwórz wykres punktowy dla FSC (na osi x) vs SSC (na osi y) i narysuj bramkę wokół interesujących komórek, z wyłączeniem martwych komórek i szczątków (martwe komórki i szczątki są znacznie mniejszymi zdarzeniami niż główna populacja komórek i pojawiają się w lewym dolnym rogu wykresu).
  9. Korzystając z tej bramki "komórek", otwórz kolejny wykres punktowy FL1 (oś x) vs FL2 (oś y). Narysuj początkową bramkę kwadrantową. Dostosuj bramki kwadrantu tak, aby zdarzenia pojawiały się w lewym dolnym kwadrancie wykresu FL1 vs FL2.
  10. Uruchom próbkę "zielony+induktor". Dostosuj napięcie tak, aby zdarzenia pojawiały się w lewym i prawym dolnym kwadrancie wykresu FL1 vs FL2. Zastosuj tę macierz kompensacji do wszystkich 3 przykładowych plików.
  11. Uruchom próbkę "pomarańczowy + induktor". Dostosuj napięcie tak, aby zdarzenia pojawiały się w lewym górnym i dolnym kwadrancie wykresu FL1 vs FL2. Zastosuj tę macierz kompensacji do wszystkich 3 przykładowych plików.
  12. Sprawdź każdy plik kompensacji i upewnij się, że zdarzenia "niezabarwione, nieleczone" pojawiają się w lewym dolnym kwadrancie, zdarzenia "zielony+induktor" pojawiają się w lewym dolnym i prawym kwadrancie, a zdarzenia "pomarańczowy+induktor" pojawiają się w lewym górnym i dolnym kwadrancie wykresu FL1 vs FL2. Zastosuj macierz kompensacji do wszystkich eksperymentalnych plików próbek.
    1. Upewnij się, że odpowiednia kompensacja została zastosowana do wszystkich plików próbek kontrolnych przed zastosowaniem macierzy kompensacji do wszystkich plików próbek eksperymentalnych. Patrz Rysunek 2 dla reprezentatywnych danych pokazujących próbki nieskompensowane i prawidłowo skompensowane.
      UWAGA: Wiele cytometrów oznacza FL1 jako standardowy kanał FITC/GFP (wzbudzany przez niebieski laser 488 nm i wykrywany za pomocą zestawu filtrów 530/30) oraz FL2 jako standardowy kanał PE (wzbudzany przez niebieski laser 488 nm i wykrywany przez zestaw filtrów 585/40). Stosujemy tę samą konwencję, ale ostrzegamy nowych użytkowników cytometrii przepływowej, aby skonsultowali się ze swoim głównym menedżerem cytometrii przepływowej, aby upewnić się, że ich cytometr jest podobnie skonfigurowany i że odpowiednie kanały są używane do wykrywania tych sond. W zależności od modelu cytometru przepływowego i dołączonego oprogramowania możliwe może być wykonanie kompensacji przed lub po pobraniu próbek. Jeżeli możliwa jest kompensacja po fakcie, etap kompensacji można przeprowadzić po pobraniu wszystkich próbek doświadczalnych przez cytometr. W przypadku cytometrów o zakresie dynamiki, w przypadku których regulacja napięcia PMT nie jest potrzebna, eksperyment kompensacyjny można również przeprowadzić w innym dniu, a szablon eksperymentalny (w tym macierz kompensacji) można zapisać, aby skrócić czas potrzebny na wykonanie kompensacji ręcznej.
  13. Po wykonaniu ręcznej kompensacji i uzyskaniu szablonu doświadczalnego należy rozpocząć obróbkę próbek doświadczalnych. Przed leczeniem dodatnim induktorem lub stymulacją komórek FcγR należy zaznaczyć, które probówki otrzymują inhibitor ROS. Potraktuj te komórki inhibitorem ROS co najmniej 30 minut przed dodatnim induktorem lub stymulacją FcγR.
  14. Aby dodać inhibitor ROS, należy przygotować końcowe stężenie 5 mM, dodając 1 μL inhibitora do 200 μL zawieszonych komórek (bez anty-BSA IgG1).
  15. Potraktuj komórki bodźcem (lub dodatnim induktorem) i załaduj komórki sondami ROS w następujący sposób:
    1. W przypadku komórek niestymulowanych: dodać 200 μl 2x roztworu sondy bez żadnego bodźca do 200 μl zawiesiny komórkowej oznaczonej jako "barwiona, niestymulowana".
    2. W przypadku kontroli dodatnich: dodać 200 μl 2x roztworu induktora dodatniego (przygotowanego w kroku 6.1) do 200 μl zawiesiny komórkowej oznaczonej jako "dodatni induktor" lub "dodatni induktor + inhibitor".
    3. Dla komórek stymulowanych przez sieciowanie FcγR (bodziec specyficzny): dodać 200 μl 2x roztwór BSA (przygotowany w 6.2) do 200 μl zawiesiny komórkowej oznaczonej "Fcγr XL" lub "FcγR XL + inhibitor".
      UWAGA: Pamiętaj, aby uwzględnić czas opóźnienia między analizą próbki, dodając bodziec co x minut, gdzie x to czas opóźnienia między pobraniem jednej próbki a następną.
  16. Inkubować komórki przez 30 minut w temperaturze 37 °C, 5% CO2 w ciemności. Analizować próbki w kolejności, w jakiej zostały stymulowane, za pomocą cytometru przepływowego wyposażonego w automatyczny podajnik próbek. Należy skorzystać z szablonów analizy wygenerowanych podczas początkowych etapów wynagrodzeń. Nie myj komórek przed analizą.

7. Analiza danych cytometrii przepływowej i przewidywane wyniki

  1. W oprogramowaniu do cytometrii przepływowej otwórz wcześniej wygenerowane pliki analityczne dla próbek eksperymentalnych (szablony zostały wygenerowane w krokach 6.7-6.12, a próbki zostały uruchomione w kroku 6.16). Upewnij się, że macierz kompensacji z wykonania ręcznej kompensacji została prawidłowo zastosowana do próbek eksperymentalnych.
    UWAGA: W przypadku cytometrów przepływowych i oprogramowania do cytometrii przepływowej zdolnych do kompensacji po fakcie, jeśli matryca kompensacji nie została wcześniej zastosowana do plików próbek eksperymentalnych, należy ją zastosować w tym momencie.
  2. Podobnie jak w przypadku sprawdzania poprawności kompensacji ręcznej, upewnij się, że kontrole w próbkach eksperymentalnych zachowują się zgodnie z oczekiwaniami.
    1. Upewnij się, że zdarzenia "niezabarwione, nieleczone" pojawią się w lewym dolnym kwadrancie wykresu FL1 vs FL2, że zdarzenia "dodatniego induktora" wykazują zwiększoną fluorescencję w lewym górnym, prawym górnym i prawym dolnym kwadrancie wykresu FL1 vs FL2 oraz że zdarzenia "dodatni induktor + inhibitor ROS" wykazują zmniejszenie fluorescencji w lewym górnym rogu, prawy górny i prawy dolny kwadrant wykresu FL1 vs FL2 w porównaniu z fluorescencją obserwowaną dla próbki "dodatniego induktora".
    2. Jeżeli kontrole w próbkach doświadczalnych nie wykazują zwiększonej fluorescencji, należy sprawdzić, czy wykonano wszystkie etapy oznaczania, sprawdzić prawidłowe wytwarzanie i przygotowanie makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego (2.7-2.19) i powtórzyć eksperyment. Jeśli kontrole w próbkach eksperymentalnych wykazują oczekiwane trendy, przystąp do analizy próbek eksperymentalnych stymulowanych przez FcγR (Rysunek 3A).
  3. Sprawdź, czy bodziec specyficzny dla FcγR działa prawidłowo. Uruchom następujące próbki myszy C57BL/6J WT: "niebarwiony, niestymulowany", "barwiony, niestymulowany", "barwiony, stymulowany przez FcγR" i "barwiony, stymulowany przez inhibitor FcγR + ROS". Odpowiadają one próbkom 4.2a, 4.2b, 4.2e i 4.2f odpowiednio w sekcji 4.
    1. Upewnij się, że zdarzenia "niezabarwione, niestymulowane" pojawią się w lewym dolnym kwadrancie wykresu FL1 vs FL2, że zdarzenia "zabarwione, niestymulowane" pojawią się również w lewym dolnym kwadrancie wykresu FL1 vs FL2, że zdarzenia "zabarwione, stymulowane przez FcγR" wykazują zwiększoną fluorescencję w lewym górnym rogu, prawy górny i prawy dolny kwadrant wykresu FL1 vs FL2, a zdarzenia "barwione, stymulowane przez inhibitor FcγR + ROS" wykażą zmniejszoną fluorescencję w lewym górnym, prawym górnym i prawym dolnym kwadrancie wykresu FL1 vs FL2 w porównaniu z próbką "barwioną, stymulowaną przez FcγR" (Rysunek 3A).
    2. Jeżeli oczekiwania te nie zostaną spełnione, na przykład, próbka "barwiona, stymulowana przez FcγR" wykazuje minimalny lub żaden wzrost fluorescencji w porównaniu z próbką "barwioną, niestymulowaną" lub próbka "barwiona, niestymulowana" wykazuje już znacznie wyższy poziom fluorescencji w porównaniu z próbką "niebarwioną, niestymulowaną", sprawdzić, czy wszystkie etapy testu zostały wykonane prawidłowo, sprawdzić prawidłowe wytwarzanie, zalewanie i obchodzenie się z BMDM (2.7-2.19) i powtórzyć eksperyment. Jeśli te oczekiwania zostaną spełnione, przystąp do analizy pozostałych próbek eksperymentalnych.
      UWAGA: Komórki wytwarzające ROS, które reagują z zieloną sondą (nadtlenek wodoru, nadtlenoazotyn, rodniki hydroksylowe, tlenek azotu, rodniki nadtlenowe itp.) pojawią się w prawym górnym i prawym dolnym kwadrancie logarytmu FL1 (oś X) w porównaniu z logarytmem punktowym FL2 (oś Y). Komórki wytwarzające ROS, które reagują z pomarańczową sondą (w większości, ale nie wyłącznie, ponadtlenkiem), pojawią się w dwóch górnych kwadrantach wykresu kropkowego log FL1 (oś X) w porównaniu z logarytmem FL2 (oś Y).
  4. Wygeneruj indywidualne histogramy, bramkowane na interesujących komórkach, do analizy fluorescencji FL1 i FL2. Używając próbek "niebarwionych, niestymulowanych", wygeneruj marker histogramu tak, aby wszystkie zdarzenia "niezabarwione, niestymulowane" pojawiały się po lewej stronie tego znacznika. Zastosuj ten wykres ze znacznikiem do pozostałych próbek eksperymentalnych (Rysunek 3B).
  5. Przedstaw wyniki eksperymentu jako procent komórek dodatnich dla każdej z sond ROS lub pokazując średnią intensywność fluorescencji (MFI) stymulowanych próbek w porównaniu z kontrolą (Rysunek 3C).

8. Barwienie powierzchni komórek w połączeniu z analizą produkcji ROS metodą cytometrii przepływowej (Opcjonalnie)

UWAGA: Ten krok dostarcza protokół barwienia makrofagów markerem powierzchni komórki przed stymulacją pomiaru FcγR i ROS. Może to być przydatne w ocenie produkcji ROS w mieszanych populacjach komórek. Ważne jest, aby wybrać przeciwciało dla markera powierzchniowego makrofagów sprzężone z odpowiednim fluorem, które nie zakłóca fluorescencji z odczynników do wykrywania stresu oksydacyjnego lub ponadtlenkowego. W tym protokole stosuje się przeciwciało dla myszy F4/80 sprzężone z Alexa fluor 647.

  1. Wygeneruj BMDM, zbierz je i zagruntuj zgodnie z wcześniejszym opisem (sekcje 1 i 2).
    UWAGA: Potrzebne są co najmniej trzy płytki o średnicy 6 cm, aby przeprowadzić wszystkie kontrole doświadczalne i warunki opisane poniżej. Jedna płytka zostanie potraktowana anty-BSA IgG1 podczas głodu surowicy, podczas gdy pozostałe dwie płytki pozostaną nieleczone.
    1. Uwzględnij 4 kontrole eksperymentalne, które zostaną wykorzystane do kompensacji cytometrii przepływowej (na eksperyment):
      a) Niebarwione i niestymulowane komórki.
      b) Komórki poddane działaniu odczynnika do wykrywania stresu oksydacyjnego (zielony odczynnik) i induktora ROS.
      c) Komórki poddane działaniu odczynnika do wykrywania ponadtlenków (odczynnik pomarańczowy) i induktora ROS.
      d) Komórki barwione tylko anty-mysim F4 / 80 sprzężonym z Alexa 647.
    2. Dla każdej myszy lub repliki biologicznej należy uwzględnić następujące 3 warunki:
      a) przebarwiony F4/80 i pozostawiony bez stymulacji
      b) barwiony F4/80 i aktywowany przez FcγR
      c) barwione F4/80 i aktywowane przez FcγR i traktowane inhibitorem ROS
  2. Po zasysaniu makrofagów przez noc należy odessać supernatant. Umyj komórki raz 1-2 ml PBS. Surowica głodzy komórki, zastępując pożywkę tą samą objętością niskiego DMEM w surowicy. Dla każdej myszy jedna płytka zostanie potraktowana anty-BSA IgG1 podczas głodu surowicy, podczas gdy pozostałe dwie płytki pozostaną nieleczone. Inkubować płytki przez 4 godziny w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
  3. Po głodzeniu surowicy zbierz komórki przez delikatne skrobanie lub przy użyciu 0,2 mM EDTA w PBS. Zebrać każdą płytkę do oznaczonych okrągłodennych probówek o pojemności 5 ml i odwirować je przy 750 x g przez 5 minut. Śledź, które komórki były traktowane mysim anty-BSA IgG1.
  4. Umyj granulki komórek raz 1-2 ml PBS, aby pozbyć się wszelkich pozostałości anty-BSA z leczonych komórek.
  5. Zawiesić ponownie jedną z osadek komórkowych z płytki, która nie uzyskała anty-BSA IgG1 w 600 μl niskiej surowicy DMEM. Komórki te nie będą poddawane barwieniu powierzchni komórek. Użyj ich do kontroli kompensacji. Podwielokrotność 200 μl tej zawiesiny komórkowej do (3) probówek o okrągłym dnie o pojemności 5 ml oznaczonych a) niebarwiony, niestymulowany b) zielony odczynnik stresu oksydacyjnego + induktor ROS, c) pomarańczowy odczynnik do wykrywania ponadtlenków + induktor ROS.
  6. Zawiesić jedną z osadek komórkowych z płytki, która nie uzyskała anty-BSA IgG1, w 300 μl buforu barwiącego cytometrię przepływową (PBS + 0,1% FBS). Podać 100 μl tej zawiesiny komórek do (2) probówek okrągłodennych o pojemności 5 ml do barwienia za pomocą Alexa 647 anti-mouse F4/80.
  7. Zawiesić osady komórek z płytki, na którą nałożono anty-BSA IgG1 w 300 μl buforu barwiącego cytometrię przepływową. Podać 100 μl tej zawiesiny komórek do (2) probówek okrągłodennych o pojemności 5 ml do barwienia za pomocą Alexa 647 anti-mouse F4/80.
  8. Wybarwić komórki, które zostały podzielone na porcje w 8.6 i 8.7, 5 μl Alexa 647 anty-mysi F4/80 przez 30 minut na lodzie, w ciemności.
  9. Po barwieniu przemyć komórki, dodając 2 ml PBS i odwirować przy 750 x g, odessać supernatant i ponownie zawiesić każdą probówkę w 200 μl DMEM o niskiej surowicy bez czerwieni fenolowej. Odłóż na bok jedną nieleczoną probówkę, która posłuży jako pojedynczo barwiona kontrola FL4. Przygotować sondy, induktor, bodziec FcγR i inhibitory ROS zgodnie ze wskazaniami w punktach 3.9, 3.10, 6.1, 6.2 i 6.14.
    1. W przypadku komórek, które nie otrzymują anty-BSA IgG1, oznacz probówki następującymi informacjami: a) brak bodźca lub b) induktor ROS.
    2. W przypadku komórek, które otrzymały anty-BSA IgG1, oznaczyć następującymi informacjami: a) Fc XL lub b) inhibitorem Fc XL +.
  10. Stymulować próbki, które mają być użyte do kompensacji, zgodnie z ich odpowiednimi zabiegami, jak wskazano w ppkt 6.5-6.6, w kolejności, w jakiej zostaną odczytane na cytometrze przepływowym, uwzględniając czas opóźnienia między pobraniem jednej próbki a następną.
  11. Inkubować komórki przez 30 minut w temperaturze 37 °C, 5% CO2 w ciemności. Analizować próbki w kolejności, w jakiej zostały stymulowane, za pomocą cytometru przepływowego wyposażonego w automatyczny podajnik próbek.
  12. Przeprowadzić kompensację ręczną zgodnie z opisem w punktach 6.7-6.12 i analizę danych zgodnie z opisem w sekcji 7.
  13. Korzystając z oprogramowania do cytometrii przepływowej, wygeneruj i oznacz 4 pliki próbek dla próbek kontrolnych "niebarwione, niepoddane obróbce", "zielone + induktor", "pomarańczowe + induktor" i "barwione F4/80", upewniając się, że wskazano kanały/parametry do analizy (FSC, SSC, FL1, FL2, FL4) i pożądane warunki zatrzymania (100 μL, 3 min, itp.).
  14. Uruchom próbki i wygeneruj wykresy punktowe, aby wykonać ręczną kompensację.
    1. W przypadku barwienia powierzchni komórek wygeneruj dwa dodatkowe wykresy: FL1 (oś x) vs FL4 (oś y) i FL2 (oś x) vs FL4 (oś y). Dostosuj napięcia, aby upewnić się, że zastosowano odpowiednią kompensację, jak pokazano na Rysunek 7A. Po prawidłowym wykonaniu całej kompensacji zastosuj macierz kompensacji do wszystkich eksperymentalnych plików próbek.
  15. Po wykonaniu ręcznej kompensacji i uzyskaniu matrycy doświadczalnej należy rozpocząć obróbkę próbek doświadczalnych, jak wskazano w pkt 6.13-6.15.3 i pobrać próbki na cytometrze przepływowym, jak opisano w pkt 6.16.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Stosując opisany w pracy protokół, przedstawiamy reprezentatywne dane wykazujące detekcję produkcji ROS metodą cytometrii przepływowej w wyniku stymulacji BMDM myszy WT C57BL/6J poprzez FcγR. Zgodnie z oczekiwaniami, w komórkach niestymulowanych obserwujemy minimalne zmiany fluorescencji w kanałach FL1 lub FL2 powyżej poziomu tła (Rysunek 3A, porównać wykresy kropkowe „stained, unstimulated” i „unstained, unstimulated”). Obserwujemy wyraźny wzrost fluorescencji FL1 i FL2, gdy komórki zostaną...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Wykrywanie ROS oparte na DCFH,2-DA i DHE jest szeroko stosowaną techniką14,15. Łatwość użycia i zdolność adaptacji tych sond ROS do formatów kinetycznych mikropłytek, mikroskopii fluorescencyjnej lub analizy cytometrii przepływowej przyczyniły się do ich popularności. Jednak w naszych badaniach funkcji makrofagów, w których pośredniczy FcγR, nie wydaje się, aby istniał standardowy protokół wykonywania tego testu do analizy cytometrii przepływowej komór...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować innym członkom Laboratorium Tigno-Aranjuez, w tym Madelyn H. Miller, Omar Cardona, Andjie Jeudy i Roopin Singh za pomoc w utrzymaniu laboratorium i kolonii myszy. Wsparcie dla tych badań zostało zapewnione przez grant R00 HL122365 i fundusze na rozpoczęcie działalności dla J.T.T-A.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Innowacyjne badaniaanty-BSA IgG1IBSA9E2C2
Alexa Fluor 647 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl PrzeciwciałoBioLegend400626
Przeciwciało anty-mysie CD16/32BioLegend101302
Przeciwciało przeciw myszom F4/80 skoniugowane z Alexa Fluor 647BD Biosciences565853
Przeciwciało anty-mysie F4/80 sprzężone z FITCBioLegend123108
Przeciwciało anty-mysie/ludzkie CD11b sprzężone z Alexa Fluor 647 BioLegend101218
beta-merkaptoetanol (BME)SigmaM3148-100ml
Albumina surowicy bydlęcej (BSA) Frakcja VFisherBP1600-100
C57BL/6J Jackson labsNumer katalogowy 000664 CM-H2DCFDA
Sondy molekularneC6827Może być substytutem odczynnika do wykrywania stresu oksydacyjnego w zestawie Enzo
Sondy molekularneDihydroethidium (DHE)D11347Może być substytutem odczynnika do wykrywania ponadtlenków w zestawie Enzo
DMEM 1xCorning10-013-CV
DMEM bez czerwieni fenolowejGibco31053-028
DMF bezwodny Acros Organics61094-1000
Płodowa surowica bydlęca (FBS)VWR97068-085
FITC IgG2a szczura κ Isotype Ctrl PrzeciwciałoBioLegend400506
HEPES (1M)Gibco15630-080
L glutaminaGibco25030-081
Komórki LADMACATCCCRL-2420
MEMMysz Corning10-010-CV
IFN-gGoldBio1360-06-100
N-acetylo-L-cysteinaEMD Milipore106425Może być substytutem inhibitora/zmiatacza ROS w zestawie Enzo
Cytometr przepływowy Novocyte z autosampleremAcea2060R
Pyocyanin (induktor ROS)Kajman chemiczny10009594Może być substytutem induktora w zestawie Enzo
Zestaw do wykrywania całkowitego ROS/ponadtlenkowego ROS-IDENZOENZ-51010
Pirogronian sodu (100mM)Gibco11360-070
Trypsyna-EDTA (0,25%)Gibco25200-056

Bibliografia

  1. Winterbourn, C. C., Kettle, A. J., Hampton, M. B. Reactive Oxygen Species and Neutrophil Function. Annual Review of Biochemistry. 85, 765-792 (2016).
  2. Schieber, M., Chandel, N. S. ROS function in redox signaling and oxidative stress. Current Biology. 24 (10), R453-R462 (2014).
  3. Robinson, J. M. Reactive oxygen species in phagocytic leukocytes. Histochemistry and Cell Biology. 130 (2), 281-297 (2008).
  4. Thomas, D. C. The phagocyte respiratory burst: Historical perspectives and recent advances. Immunology Letters. 192, 88-96 (2017).
  5. Fang, F. C. Antimicrobial actions of reactive oxygen species. MBio. 2 (5), (2011).
  6. Iles, K. E., Forman, H. J. Macrophage signaling and respiratory burst. Immunologic Research. 26 (1-3), 95-105 (2002).
  7. Curnutte, J. T., Whitten, D. M., Babior, B. M. Defective superoxide production by granulocytes from patients with chronic granulomatous disease. New England Journal of Medicine. 290 (11), 593-597 (1974).
  8. Good, R. A., et al. Fatal (chronic) granulomatous disease of childhood: a hereditary defect of leukocyte function. Seminars in Hematology. 5 (3), 215-254 (1968).
  9. Holmes, B., Page, A. R., Good, R. A. Studies of the metabolic activity of leukocytes from patients with a genetic abnormality of phagocytic function. Journal of Clinical Investigation. 46 (9), 1422-1432 (1967).
  10. Windhorst, D. B., Page, A. R., Holmes, B., Quie, P. G., Good, R. A. The pattern of genetic transmission of the leukocyte defect in fatal granulomatous disease of childhood. Journal of Clinical Investigation. 47 (5), 1026-1034 (1968).
  11. Dikalov, S. I., Harrison, D. G. Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species. Antioxidants & Redox Signaling. 20 (2), 372-382 (2014).
  12. Held, P. An Introduction to Reactive Oxygen Species: Measurement of ROS in cells. White Paper. , (2015).
  13. Woolley, J. F., Stanicka, J., Cotter, T. G. Recent advances in reactive oxygen species measurement in biological systems. Trends in Biochemical Sciences. 38 (11), 556-565 (2013).
  14. Chen, X., Zhong, Z., Xu, Z., Chen, L., Wang, Y. 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein as a fluorescent probe for reactive oxygen species measurement: Forty years of application and controversy. Free Radical Research. 44 (6), 587-604 (2010).
  15. Zielonka, J., Kalyanaraman, B. Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth. Free Radical Biology and Medicine. 48 (8), 983-1001 (2010).
  16. Swamydas, M., Lionakis, M. S. Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments. Journal of Visualized Experiments. (77), e50586(2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Cytometria przepływowapomiar ROSaktywacja makrofagówreceptor Fc gammadetekcja stresu oksydacyjnegosondy fluorescencyjnemakrofagi pochodzące z szpiku kostnegokontrole kompensacjiinhibitor ROSstymulacja pyocyjaniną
Pomiar cytometryczny przepływu produkcji ROS w makrofagach w odpowiedzi na sieciowanie FcγR
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.