Zanieczyszczenie mikotoksynami przez rodzaje grzybów, Aspergillus, Fusarium, Penicillium i Alternaria jest głównym problemem roślin spożywczych i paszowych uprawianych na całym świecie1,2,3. Spośród tych grzybów fitopatogenicznych Aspergillus ma największy niekorzystny wpływ na wartość upraw oraz zdrowie ludzi i zwierząt. Aspergillus flavus (A. flavus) jest oportunistycznym patogenem roślin, który infekuje uprawy bogate w olej, takie jak kukurydza, nasiona bawełny i orzeszki ziemne, i wytwarza silne czynniki rakotwórcze, aflatoksyny, a także liczne toksyczne metabolity wtórne (SM). Kukurydza jest ważną rośliną spożywczą i pastewną uprawianą na całym świecie i jest bardzo podatna na zanieczyszczenie przez A. flavus. Ekonomiczny wpływ zanieczyszczenia aflatoksynami na straty i zmniejszenie wartości kukurydzy może wynosić nawet 686,6 miliona dolarów/rok w USA.2 Biorąc pod uwagę przewidywane zmiany klimatu na świecie, wpływ aflatoksyn może spowodować większe straty ekonomiczne w kukurydzy z szacunkami sięgającymi nawet 1,68 miliarda dolarów rocznie w najbliższej przyszłości2. Biorąc pod uwagę niekorzystne skutki ekonomiczne i zdrowotne aflatoksyn dla ludzi i zwierząt gospodarskich, zwalczanie aflatoksyn w kukurydzy przed zbiorami może być najskuteczniejszym sposobem zapobiegania zanieczyszczeniu aflatoksynami w produktach spożywczych i paszowych.
Głównym podejściem do kontroli odporności kukurydzy na aflatoksyny, które było szeroko stosowane w ciągu ostatnich kilku dekad, jest przede wszystkim hodowla, która wymaga znacznej ilości czasu4. Ostatnio biokontrola odniosła pewne sukcesy w redukcji aflatoksyn w zastosowaniach polowych na dużą skalę5,6. Oprócz kontroli biologicznej, zastosowanie najnowocześniejszych narzędzi molekularnych, takich jak "wyciszanie genów indukowane przez gospodarza" (HIGS) za pomocą RNAi i transgeniczna ekspresja białek związanych z opornością, odniosło pewne sukcesy w ograniczaniu wzrostu A. flavus i produkcji aflatoksyn w badaniach laboratoryjnych i terenowych na małą skalę. Podejścia te są obecnie optymalizowane, a także identyfikowane są nowe potencjalne cele genów A. flavus do przyszłej manipulacji.
Oprócz genów, które są bezpośrednio zaangażowane w produkcję mykotoksyn jako potencjalne cele transgenicznych strategii kontroli, wykazano, że amylazy grzybowe odgrywają kluczową rolę w utrzymaniu skutecznej patogenezy i produkcji mykotoksyn we wczesnych stadiach infekcji roślin żywicielskich. Kilka przykładów to Pythium pleroticum (czynnik wywołujący zgniliznę kłącza imbiru), Fusarium solani (czynnik wywołujący więdnięcie kalafiora), gdzie zaobserwowano pozytywne korelacje między patogennością a ekspresją i aktywnością α-amylazy7,8. Hamowanie aktywności α-amylazy poprzez nokaut genów lub metody knockdown negatywnie wpływa na wzrost grzybów i produkcję toksyn. Mutant A. flavus z nokautem α-amylazy nie był w stanie wytworzyć aflatoksyn, gdy był uprawiany na podłożu skrobiowym lub rozkiełkowanych ziarnach kukurydzy9. Podobnie w Fusarium verticillioides szczep nokautujący α-amylazy nie był w stanie wytworzyć fumonizyny B1 (mikotoksyny) podczas infekcji ziaren kukurydzy10. W nowszym badaniu Gilbert i in. (2018) wykazali, że oparte na RNAi powalenie ekspresji A. flavus α-amylazy przez HIGS znacznie zmniejszyło wzrost A. flavus i produkcję aflatoksyny podczas infekcji ziarna kukurydzy11.
Specyficzne inhibitory aktywności α-amylazy również dały podobne wyniki, jak uzyskane z obniżenia ekspresji α-amylazy. Pierwsze doniesienie na temat roli inhibitora α-amylazy w oporności na grzyby pochodziło z izolacji i scharakteryzowania inhibitora 14-kDa trypsyny-α-amylazy z linii kukurydzy odpornych na A. flavus12. Dalsze badania przesiewowe kilkuset gatunków roślin przeprowadzone przez Fakhoury'ego i Woloshuka doprowadziły do zidentyfikowania białka podobnego do inhibitora α-amylazy o masie 36 kDa (AILP) z nasion fasoli hiacyntowej, Lablab purpureus L.13. Sekwencja peptydowa AILP przypominała lektyny należące do rodziny inhibitorów lektyny-arceliny-α-amylazy opisanej w Common bean14,15. Oczyszczony AILP nie wykazuje żadnej aktywności hamującej w stosunku do trypsyny ssaków, a dalsza charakterystyka in vitro wykazała znaczące zahamowanie wzrostu A. flavus i kiełkowania konidiów13. Przedstawione tutaj doniesienia wyraźnie pokazują α-amylaza może służyć jako cel w podejściach kontrolnych w celu ograniczenia patogenów lub szkodników, które zależą od mobilizacji skrobi (poprzez aktywność α-amylazy) i pozyskiwania rozpuszczalnych cukrów jako źródła energii podczas ich patogennej interakcji z roślinami żywicielskimi.
Alfa-amylaza jest znana jako krytyczna w patogeniczności A. flavus9,10,11, i biorąc pod uwagę znaczenie AILP jako silnego środka anty-A. flavus (hamowanie α-amylazy/przeciwwzrost)13, wygenerowaliśmy transgeniczne rośliny kukurydzy wykazujące ekspresję Lablab AILP pod konstytutywnym promotorem CaMV 35S. Celem było zbadanie, czy heterologiczna ekspresja tego inhibitora α-amylazy w kukurydzy jest skuteczna przeciwko patogenezie A. flavus i produkcji aflatoksyny podczas infekcji ziarna kukurydzy. Nasze wyniki pokazują, że transgeniczne ziarna kukurydzy wykazujące ekspresję AILP znacznie zmniejszyły wzrost A. flavus i produkcję aflatoksyny podczas infekcji ziarna.