Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Hamowanie wzrostu Aspergillus flavus i produkcji aflatoksyn w transgenicznej kukurydzy z ekspresją inhibitora α-amylazy z Lablab purpureus L.

9.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59169

⸱

15 lutego 2019

 ,  ,  ,  , 
1Southern Regional Research Center, USDA-ARS, Food and Feed Safety Research Unit, 2Department of Plant Pathology, University of Arkansas

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół do analizy wzrostu Aspergillus flavus i produkcji aflatoksyn w ziarnach kukurydzy wyrażających białko przeciwgrzybicze. Używając szczepu A. flavus wykazującego ekspresję GFP, monitorowaliśmy infekcję i rozprzestrzenianie się grzyba w dojrzałych ziarnikach w czasie rzeczywistym. Test jest szybki, wiarygodny i powtarzalny

.

Streszczenie

Zanieczyszczenie aflatoksynami w uprawach spożywczych i paszowych jest głównym wyzwaniem na całym świecie. Aflatoksyny, wytwarzane przez grzyby Aspergillus flavus (A. flavus), są silnymi czynnikami rakotwórczymi, które znacznie obniżają wartość upraw kukurydzy i innych roślin bogatych w olej, takich jak orzeszki ziemne, a także stanowią poważne zagrożenie dla zdrowia ludzi i zwierząt. Różne podejścia, w tym tradycyjna hodowla, transgeniczna ekspresja białek związanych z opornością oraz wywołane przez gospodarza wyciszanie genów krytycznych celów genu A. flavus w oparciu o interferencję RNA (RNAi), są oceniane w celu zwiększenia odporności na aflatoksyny u podatnych upraw. Wcześniejsze badania wykazały ważną rolę α-amylazy w patogenezie A. flavus i produkcji aflatoksyny, co sugeruje, że ten gen/enzym jest potencjalnym celem w zmniejszaniu zarówno wzrostu A. flavus, jak i produkcji aflatoksyny. W związku z tym niniejsze badanie zostało podjęte w celu oceny heterologicznej ekspresji (pod kontrolą konstytutywnego promotora CaMV 35S) białka podobnego do inhibitora α-amylazy Lablab purpureus L. (AILP) w kukurydzy przeciwko A. flavus. AILP jest białkiem o masie 36 kDa, które jest kompetycyjnym inhibitorem enzymu A. flavus α-amylazy i należy do rodziny białek inhibitorów lektyny-arceliny-α-amylazy w fasoli zwyczajnej. Badania in vitro poprzedzające obecne prace wykazały rolę AILP w hamowaniu aktywności A. flavus α-amylazy i rozwoju grzybów. Wzrost grzybów i produkcja aflatoksyn w dojrzałych ziarnikach były monitorowane w czasie rzeczywistym przy użyciu szczepu A. flavus wykazującego ekspresję GFP. Ten test przesiewowy jądra (KSA) jest bardzo prosty do skonfigurowania i zapewnia wiarygodne i powtarzalne dane na temat infekcji i zakresu rozprzestrzeniania się, które można określić ilościowo w celu oceny plazmy zarodkowej i linii transgenicznych. Fluorescencja szczepu GFP jest ściśle skorelowana ze wzrostem grzybów, a co za tym idzie, jest dobrze skorelowana z wartościami aflatoksyn. Celem obecnych prac było zastosowanie tej wcześniejszej wiedzy w uprawach o znaczeniu komercyjnym, takich jak kukurydza, w celu zwiększenia odporności na aflatoksyny. Nasze wyniki wskazują na 35%-72% zmniejszenie wzrostu A. flavus w transgenicznych ziarnach kukurydzy z ekspresją AILP, co z kolei przełożyło się na 62%-88% zmniejszenie poziomu aflatoksyny.

Wprowadzenie

Zanieczyszczenie mikotoksynami przez rodzaje grzybów, Aspergillus, Fusarium, Penicillium i Alternaria jest głównym problemem roślin spożywczych i paszowych uprawianych na całym świecie1,2,3. Spośród tych grzybów fitopatogenicznych Aspergillus ma największy niekorzystny wpływ na wartość upraw oraz zdrowie ludzi i zwierząt. Aspergillus flavus (A. flavus) jest oportunistycznym patogenem roślin, który infekuje uprawy bogate w olej, takie jak kukurydza, nasiona bawełny i orzeszki ziemne, i wytwarza silne czynniki rakotwórcze, aflatoksyny, a także liczne toksyczne metabolity wtórne (SM). Kukurydza jest ważną rośliną spożywczą i pastewną uprawianą na całym świecie i jest bardzo podatna na zanieczyszczenie przez A. flavus. Ekonomiczny wpływ zanieczyszczenia aflatoksynami na straty i zmniejszenie wartości kukurydzy może wynosić nawet 686,6 miliona dolarów/rok w USA.2 Biorąc pod uwagę przewidywane zmiany klimatu na świecie, wpływ aflatoksyn może spowodować większe straty ekonomiczne w kukurydzy z szacunkami sięgającymi nawet 1,68 miliarda dolarów rocznie w najbliższej przyszłości2. Biorąc pod uwagę niekorzystne skutki ekonomiczne i zdrowotne aflatoksyn dla ludzi i zwierząt gospodarskich, zwalczanie aflatoksyn w kukurydzy przed zbiorami może być najskuteczniejszym sposobem zapobiegania zanieczyszczeniu aflatoksynami w produktach spożywczych i paszowych.

Głównym podejściem do kontroli odporności kukurydzy na aflatoksyny, które było szeroko stosowane w ciągu ostatnich kilku dekad, jest przede wszystkim hodowla, która wymaga znacznej ilości czasu4. Ostatnio biokontrola odniosła pewne sukcesy w redukcji aflatoksyn w zastosowaniach polowych na dużą skalę5,6. Oprócz kontroli biologicznej, zastosowanie najnowocześniejszych narzędzi molekularnych, takich jak "wyciszanie genów indukowane przez gospodarza" (HIGS) za pomocą RNAi i transgeniczna ekspresja białek związanych z opornością, odniosło pewne sukcesy w ograniczaniu wzrostu A. flavus i produkcji aflatoksyn w badaniach laboratoryjnych i terenowych na małą skalę. Podejścia te są obecnie optymalizowane, a także identyfikowane są nowe potencjalne cele genów A. flavus do przyszłej manipulacji.

Oprócz genów, które są bezpośrednio zaangażowane w produkcję mykotoksyn jako potencjalne cele transgenicznych strategii kontroli, wykazano, że amylazy grzybowe odgrywają kluczową rolę w utrzymaniu skutecznej patogenezy i produkcji mykotoksyn we wczesnych stadiach infekcji roślin żywicielskich. Kilka przykładów to Pythium pleroticum (czynnik wywołujący zgniliznę kłącza imbiru), Fusarium solani (czynnik wywołujący więdnięcie kalafiora), gdzie zaobserwowano pozytywne korelacje między patogennością a ekspresją i aktywnością α-amylazy7,8. Hamowanie aktywności α-amylazy poprzez nokaut genów lub metody knockdown negatywnie wpływa na wzrost grzybów i produkcję toksyn. Mutant A. flavus z nokautem α-amylazy nie był w stanie wytworzyć aflatoksyn, gdy był uprawiany na podłożu skrobiowym lub rozkiełkowanych ziarnach kukurydzy9. Podobnie w Fusarium verticillioides szczep nokautujący α-amylazy nie był w stanie wytworzyć fumonizyny B1 (mikotoksyny) podczas infekcji ziaren kukurydzy10. W nowszym badaniu Gilbert i in. (2018) wykazali, że oparte na RNAi powalenie ekspresji A. flavus α-amylazy przez HIGS znacznie zmniejszyło wzrost A. flavus i produkcję aflatoksyny podczas infekcji ziarna kukurydzy11.

Specyficzne inhibitory aktywności α-amylazy również dały podobne wyniki, jak uzyskane z obniżenia ekspresji α-amylazy. Pierwsze doniesienie na temat roli inhibitora α-amylazy w oporności na grzyby pochodziło z izolacji i scharakteryzowania inhibitora 14-kDa trypsyny-α-amylazy z linii kukurydzy odpornych na A. flavus12. Dalsze badania przesiewowe kilkuset gatunków roślin przeprowadzone przez Fakhoury'ego i Woloshuka doprowadziły do zidentyfikowania białka podobnego do inhibitora α-amylazy o masie 36 kDa (AILP) z nasion fasoli hiacyntowej, Lablab purpureus L.13. Sekwencja peptydowa AILP przypominała lektyny należące do rodziny inhibitorów lektyny-arceliny-α-amylazy opisanej w Common bean14,15. Oczyszczony AILP nie wykazuje żadnej aktywności hamującej w stosunku do trypsyny ssaków, a dalsza charakterystyka in vitro wykazała znaczące zahamowanie wzrostu A. flavus i kiełkowania konidiów13. Przedstawione tutaj doniesienia wyraźnie pokazują α-amylaza może służyć jako cel w podejściach kontrolnych w celu ograniczenia patogenów lub szkodników, które zależą od mobilizacji skrobi (poprzez aktywność α-amylazy) i pozyskiwania rozpuszczalnych cukrów jako źródła energii podczas ich patogennej interakcji z roślinami żywicielskimi.

Alfa-amylaza jest znana jako krytyczna w patogeniczności A. flavus9,10,11, i biorąc pod uwagę znaczenie AILP jako silnego środka anty-A. flavus (hamowanie α-amylazy/przeciwwzrost)13, wygenerowaliśmy transgeniczne rośliny kukurydzy wykazujące ekspresję Lablab AILP pod konstytutywnym promotorem CaMV 35S. Celem było zbadanie, czy heterologiczna ekspresja tego inhibitora α-amylazy w kukurydzy jest skuteczna przeciwko patogenezie A. flavus i produkcji aflatoksyny podczas infekcji ziarna kukurydzy. Nasze wyniki pokazują, że transgeniczne ziarna kukurydzy wykazujące ekspresję AILP znacznie zmniejszyły wzrost A. flavus i produkcję aflatoksyny podczas infekcji ziarna.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Konstrukcje plazmidowe i transformacja kukurydzy

  1. PCR amplifikuje wkładkę Lablab AILP za pomocą starterów 5'-TATCTAGAACTAGTGATTACCATGGCTCC-3' i 5'-ATACTGCAGGATTGCATGCAGAGTAGTACTG-3'. Warunki PCR obejmują początkowy etap denaturacji w temperaturze 98 °C przez 30 s (etap 1), następnie denaturację w temperaturze 98 °C przez 10 s (etap 2), wyżarzanie w temperaturze 55 °C przez 30 s (etap 3), wydłużenie w temperaturze 72 °C przez 20 s (etap 4), 31 cykli etapu 2 do etapu 4, i końcowy etap wydłużania w temperaturze 72 °C przez 5 min. Sklonuj produkt PCR do zmodyfikowanego wektora pCAMBIA 1,300, używając miejsc ograniczeń XbaI i PstI. Zsekwencjonuj końcowy wektor docelowy rośliny, aby potwierdzić orientację i sekwencję sklonowanego genu AILP w wektorze.
  2. Przekształć szczep Agrobacterium EHA101 za pomocą końcowego konstruktu wektorowego (Rysunek 1), jak opisano wcześniej 16.
  3. Użyj przekształconego Agrobacterium zawierającego końcowy wektor docelowy rośliny, aby przekształcić niedojrzałe zarodki kukurydzy (Zea mays L. Hi-II) (wykonane w Zakładzie Transformacji Roślin Uniwersytetu Stanowego Iowa) 16.
  4. Uprawiaj rośliny T0 w szklarni (26–29 °C; 16/8 h fotoperiod uzupełniony wysokociśnieniowymi lampami Na) i wielokrotnie samozapylaj, aby uzyskać pokolenie T6, aby osiągnąć homozygotyczność dla cechy transgenicznej.

2. Test kiełkowania zarodników

  1. Pobrać próbki liści i przechowywać w temperaturze -80 °C. Próbki liści zmielić moździerzem i tłuczkiem przy użyciu ciekłego azotu. Odważyć 0,5 g w probówkach do mikrowirówek o pojemności 2 ml, dodać 17 μl inhibitora proteazy i umieścić probówki na lodzie.
  2. Probówki wirować przez 10 minut przy 16 000 x g. Przenieś 225 μl ekstraktu roślinnego do probówek mikrowirówek o pojemności 0,5 ml i umieść na lodzie.
  3. W probówce wirówkowej o pojemności 15 ml przygotuj 5 ml zawiesiny zarodników Aspergillus flavus 70 – GFP w 1% bulionie z dekstrozy ziemniaczanej (w/v). Odwiruj i dostosuj stężenie zarodników do 105 zarodników/ml za pomocą hemocytometru.
    UWAGA: A. flavus wytwarza aflatoksyny, wszystkie prace z tym grzybem powinny być wykonywane w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
  4. Inkubować w PDB w temperaturze 28 °C do momentu, gdy kultura osiągnie 50% inicjację kiełkowania zarodników, na co wskazuje wybrzuszenie zarodników.
  5. Wirować i podwielokrotność 25 μl roztworu przetrwalników do 225 μl ekstraktu roślinnego. Inkubować próbki przez 20 godzin w temperaturze 28 °C z przerywanym wstrząsaniem.
  6. Pobrać 25 μl roztworu zarodników na szkiełko mikroskopowe i zmierzyć długość zarodników probówek zarodkowych za pomocą oprogramowania aparatu cyfrowego. Należy użyć co najmniej 20 powtórzonych pomiarów dla każdej linii.
    UWAGA: Na tym etapie umieść wszystkie kultury w temperaturze 4 °C, aby zatrzymać wzrost kolonii do momentu, gdy będą gotowe do liczenia.

3. Test przesiewowy jądra (KSA)

  1. Zbuduj nakrętki KSA, przyklejając 4 zaślepki (22 mm) na szalce Petriego o wymiarach 60 x 15 mm. Pozostaw klej do wyschnięcia na 48 godzin przed użyciem nakrętek. Każda czapka KSA to jedno powtórzenie. (Rysunek 2).
  2. W sterylnej komorze bezpieczeństwa biologicznego spryskaj kwadratową tackę do testów biologicznych (24 cm x 24 cm) 70% etanolem:H2O(v/v) i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu. Dodaj sterylną bibułę chromatograficzną do tacy. Spryskaj 9 nakrętek KSA 70% etanolem, pozostaw do wyschnięcia na powietrzu i umieść na tacy do testów biologicznych.
  3. Dla każdej badanej linii kukurydzy transgenicznej wybierz 20 nieuszkodzonych ziaren i umieść je w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml. Dodaj 70% etanolu i odstaw na 4 minuty. Delikatnie potrząśnij probówkami podczas sterylizacji. Odlej etanol i opłucz ziarna trzy razy w sterylnym dejonizowanymH2O.
  4. Przygotuj zawiesinę zarodników Aspergillus flavus 70 – GFP17 z 6-dniowej kultury wyhodowanej na pożywce V8 (sok 5% V8, 2% agar, pH 5,2).
    1. Dodać 20 ml sterylnego 0,02% Triton X-100/dejonizowanegoH2O(v/v) i zeskrobać zarodniki za pomocą sterylnej pętli. Odpipetować inokulum i umieścić w sterylnej zlewce o pojemności 300 ml.
    2. Przygotować 5-krotne rozcieńczenie z 0,02% Triton X-100, a następnie przeprowadzić liczenie zarodników za pomocą hemocytometru. W razie potrzeby ponownie rozcieńczyć, aby uzyskać 100 ml o stężeniu 4 x 106 zarodników/ml.
  5. Umieść ziarna w sterylnej zlewce o pojemności 300 ml z mieszadłem. Dodaj inokulum do zlewki.
    UWAGA: Dodanie ziaren do inokulum spowoduje rozpryskiwanie się roztworu. Umieść zlewkę na talerzu mieszającym na 3 minuty. Po 3 minutach odlać inokulum do pustej zlewki.
  6. Za pomocą kleszczy umieść ziarna w naczyniu do testów biologicznych (1 ziarno/nakrętka). Dodać 30 ml wody dejonizowanej na dno każdej tacki do testów biologicznych i inkubować w temperaturze 31 °C w ciemności przez 7 dni.
  7. Przygotuj ziarna do fotografii.
    1. Odłóż na bok 4 ziarna z każdej linii do analizy mikroskopowej i fotografii.
      UWAGA: Jądra można przechowywać w temperaturze 4 °C nie dłużej niż 5 dni przed zakończeniem fotografowania.
    2. Zrób zdjęcia ziaren po siedmiu dniach od inokulacji A. flavus (Ryc. 3).
    3. Oczyść zewnętrzną powierzchnię ziaren miękką chusteczką i wodą dejonizowaną. Wykonaj przekroje podłużne ziaren i natychmiast zrób zdjęcia pod mikroskopem fluorescencyjnym.
  8. Przygotuj jądra do analizy.
    1. Oczyść z zewnątrz pozostałe ziarna miękką chusteczką i wodą dejonizowaną.
    2. Umieść 4 jądra, stanowiące 1 powtórzenie, w 15 ml zakręcanej fiolce z poliwęglanu zawierającej 2 kulki ze stali nierdzewnej. Natychmiast zamrozić fiolki w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszego przetwarzania i analizy.
    3. Wyjąć fiolki z zamrażarki o temperaturze -80 °C i zmielić ziarna w homogenizatorze z prędkością 1 500 obr./min przez 3 minuty.
      UWAGA: Trzymaj ziarna zamrożone ciekłym azotem.

4. Badania przesiewowe PCR transgenicznych ziaren kukurydzy

  1. Użyj zestawu do izolacji DNA, aby wyizolować genomowe DNA (gDNA) ze sproszkowanych ziaren kukurydzy zakażonych A. flavus zgodnie z instrukcjami producenta. Krótko dodać 280 μl buforu F, 20 μl proteazy i 3 μl ditiotreitolu (DTT) do 10-15 mg sproszkowanych ziaren kukurydzy. Inkubować i wstrząsać w termomikserze (56 °C, 1 200 obr./min, 30 min). Wirować przy 10 000 x g przez 1 minutę i przenieść klarowny supernatant do zrównoważonej kolumny. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 3 minuty i wirować przy 700 x g przez 1 minutę w celu elucji gDNA.
  2. Weź 0,8 μl wyekstrahowanego gDNA, aby ustawić reakcję PCR 20 μl dla każdej próbki za pomocą zestawu do PCR. Postępuj zgodnie z warunkami termocyklingu zgodnie z zaleceniami w protokole producenta. Warunki PCR obejmują początkowy etap denaturacji w temperaturze 98 °C przez 5 minut (etap 1), następnie denaturację w temperaturze 98 °C przez 5 s (etap 2), wyżarzanie w temperaturze 55 °C przez 5 s (etap 3), wydłużenie w temperaturze 72 °C przez 20 s (etap 4), 40 cykli etapu 2 do etapu 4, i końcowy etap wydłużania w temperaturze 72 °C przez 1 minutę (etap 5).
  3. Użyj startera do przodu 5'-TATACCACCCCCATCCGTGT-3' i startera wstecznego 5'-AGCTCGGAAGCAAAAGACCA-3', aby potwierdzić obecność genu Lablab AILP w transgenicznych ziarniach kukurydzy.

5. Izolacja RNA, synteza cDNA i półilościowy RT-PCR

  1. Weź homogenizowane ziarna kukurydzy zakażone A. flavus uprzednio przechowywane w temperaturze -80°C w celu ekstrakcji RNA. Ekstrakcja RNA za pomocą zestawu do całkowitej izolacji RNA zgodnie z protokołem producenta, ale z niewielką modyfikacją18. Po dodaniu 50 mg homogenizowanego proszku z ziaren kukurydzy do buforu ekstrakcyjnego, należy go dobrze wymieszać (bez wirowania) za pomocą końcówki do pipety o pojemności 1 ml i pozostawić na lodzie na 5-6 minut przed przejściem do kolejnych kroków zgodnie z opisem w protokole producenta.
  2. Przygotuj cDNA za pomocą zestawu do syntezy cDNA zgodnie z protokołem producenta 18.
  3. Użyj 0,5 μl nierozcieńczonego cDNA na reakcję PCR dla półilościowego RT-PCR, jak opisano wcześniej18. Do wykrywania ekspresji genu Lablab AILP należy użyć starterów do przodu i do tyłu qAILP-F 5'-TCCCAACAAGGCAACTACTG-3' i qAILP-R 5'- CGGTGTCGAAGAGACCTAGATA-3' oraz starterów do przodu i do tyłu qRib-F 5ʹ-GGCTTGGCTTAAAGGAAGGT-3ʹ i qRib-R 5ʹ-TCAGTCCAACTTCCAGAATGG-3ʹ do ekspresji genu strukturalnego rybosomalnej kukurydzy (Rib), GRMZM2G02483819 jako genu utrzymania domu.

6. Kwant GFP

  1. Przygotować po 50 ml 0,2 M jednozasadowego fosforanu sodu (NaH2PO4) i 0,2 M dwuzasadowego fosforanu sodu (Na2HPO4·7H2O) w dejonizowanymH2O.
  2. Uzupełnić 100 ml buforu fosforanowego Sorensona o pH 7,0. Aby uzyskać pH 7,0, dodaj 19,5 ml bulionu NaH2PO4, 30,5 ml NaHPO4·7H2O i 50 ml dejonizowanegoH2O.
  3. Odważyć 25 mg zmielonego materiału jądrowego (świeża masa, FW) i umieścić w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,0 ml. Dodać 500 μl buforu fosforanowego do probówki wirówkowej i wirować przez 30 s.
  4. Odwirowywać próbki przez 15 minut przy 16 000 x g. Odmierzyć pipetę 100 μl supernatantu do czarnej płytki 96-dołkowej. Odczytać próbki za pomocą fluorometru (wzbudzenie 485 nm, emisja 528 nm).

7. Analiza całkowitej aflatoksyny

  1. Przetwarzanie próbek i ekstrakcja aflatoksyn
    1. Suszyć próbki ziaren w suszarce z wymuszonym obiegiem powietrza przez 2 dni w temperaturze 60 °C. Zważyć próbki i umieścić je w kolbie Erlenmeyera o pojemności 50 ml ze szklanym korkiem.
    2. W dygestorium dodać 25 ml chlorku metylenu do każdej kolby.
      UWAGA: Chlorek metylenu jest wysoce lotny i jest uważany za niebezpieczny (drażniący, rakotwórczy). Ani rękawice lateksowe, ani nitrylowe nie są bezpieczne do pracy z chlorkiem metylenu. Używaj ULEPSZONYCH, odpornych na rozpuszczalniki organiczne rękawic PolyVinylAlcohol.
    3. Wstrząsaj próbkami przez 30 minut na wytrząsarce nadgarstkowej. Po 30 minutach powoli przelać ekstrakt przez karbowane kółko z bibuły filtracyjnej do zlewki o pojemności 80 ml. Pozostaw zlewki do wyschnięcia na noc w dygestorium.
    4. Następnego dnia spryskaj chlorek metylenu (około 5 ml) wokół wewnętrznej krawędzi suchych zlewek, zamieszaj i wlej do 2 szklanych fiolek dram. Pozostawić fiolki otwarte do wyschnięcia w dygestorii na noc.
  2. Analiza aflatoksyn
    1. Dodać 4,0 ml 80% metanolu: dejonizowanego H2O (v / v) do fiolek.
    2. Użyj zestawu do ekstrakcji aflatoksyn do filtrowania, oczyszczania roztworu metanolu za pomocą dostarczonej kolumny. Przeanalizuj całkowity poziom aflatoksyny za pomocą fluorometru, zgodnie z instrukcjami producenta.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Transformacja kukurydzy i screening molekularny roślin transgenicznych

Niedojrzałe zarodki kukurydzy linii Hi-II poddano transformacji przy użyciu Agrobacterium tumefaciens szczep EHA101 zawierający końcowy wektor docelowy dla roślin wykazujący ekspresję *Lablab purpureus* AILP gen pod kontrolą CaMV 35S promotor. Pięć niezależnie transformowanych linii kukurydzy przeprowadzono...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Straty w plonach w uprawach rolnych spowodowane patogenami i szkodnikami stanowią problem globalny20. Obecnie stosowanie syntetycznych fungicydów i pestycydów jest dominującym sposobem zwalczania patogenów i szkodników roślin, ale szczątkowa toksyczność tych biochemikaliów w żywności i paszy może stanowić poważne zagrożenie dla zdrowia ludzi i zwierząt21. Biorąc pod uwagę gospodarcze znaczenie kukurydzy jako rośliny spożywczej i pastewnej, zmniejszenie lub wyeliminowanie za...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Podziękowania

Dziękujemy Davidowi Meintsowi, University of Arkansas za pomoc w rozwoju i analizie transgenicznej kukurydzy we wczesnych pokoleniach. Prace te otrzymały wsparcie finansowe projektu USDA-ARS CRIS 6054-42000-025-00D. Wzmianka o nazwach handlowych lub produktach komercyjnych w tym artykule służy wyłącznie dostarczeniu konkretnych informacji i nie oznacza rekomendacji ani poparcia ze strony Departamentu Rolnictwa USA. Polityka równych szans zatrudnienia (EEO) USDA-ARS nakazuje równe szanse dla wszystkich osób i zakazuje dyskryminacji we wszystkich aspektach polityki, praktyk i działań kadrowych Agencji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AgarKeson
Niesamowita morska goopEklektyczne produkty
C1000 Touch CFX96 System czasu rzeczywistegoBio-Rad
Corning  Szalki do hodowli tkankowych Sokoła, 60 mmFisher Scientific08-772F
Eppendorf  5424 Kolba do mikrowirówekFisher Scientific
Erlenmeyer z korkiem, 50 mlszkła Ace6999-10
Etanol
FluoroQuant AflaRomer LabsCOKFA1010
karbowane jakościowe koła z bibuły filtracyjnej, 15 cmFisher Scientific09-790-14E
Piekarnik powietrznyForce VWR
FQ-ReaderRomer LabsEQFFM3010
Geno/Grinder 2010OPS DiagnosticsSP 2010-115
Ulepszone rękawice odporne na rozpuszczalniki organiczne z polialkoholu winylowegoAnsell012-15-554
Wytrząsarka do inkubatora Innova 44Brunswick Scientific
iScript Zestaw do syntezy cDNABio-Rad1708890
ciekłym azotem
o niskiej formie, 100 mlDKW Life Sciences14000-100
Metanol
Chlorek
Nexttec 1-etapowy zestaw do izolacji DNA dla roślin MikroskopNexttec47N
Nikon Eclipse E600 z aparatem Nikon DS-Qi1Nikon
Mikroskop stereoskopowy Nikon SMZ25 z oświetlaczem episkopowym C-HGFI i kamerą sCMOS Andor Zyla 4.2 Kwadratowe
NuncThermoFisher Scientific240835
Phire Plant FiolkiThermoFisherScientific F130WH
, 15 mlOPS DiagnosticsPCRV 15-100-23
Ziemniak Zakrętka do bulionu
, 22 mmDKW Nauki Przyrodnicze242612
Fosforan sodu dwuzasadowy siedmiowodnySigma-Aldrich
RNA Spectrum PlantSigma-Aldrich Kule szlifierskie ze stali nierdzewnej Sigma-Aldrich
OPSDiagnostyka GBSS 375-1000-02
Płytka
Synergia 4 FluorometrBiotek
T100 TermocyklerBio-Rad
Triton X-100Sigma-AldrichT-9284
V8 sokCampbell's
Whatman Jakościowa klasa Gładkie arkusze, klasa 3Fisher Scientific09-820P
Wytrząsarka na nadgarstekBurrell Scientific
Zlewki Griffin z metylenu naczynia do testów biologicznych Nikon Zestaw do bezpośredniego PCR z poliwęglanu dekstrozowego Jednozasadowy zestaw Total STRN50, 3/8''mieszająca

Bibliografia

  1. Ismaiel, A., Papenbrock, J. Mycotoxins: Producing fungi and mechanisms of phytotoxicity. Agriculture. 5 (3), 492-537 (2015).
  2. Mitchell, N., Bowers, E., Hurburgh, C., Wu, F. Potential economic losses to the USA corn industry from aflatoxin contamination. Food Additives & Contaminants: Part A. 33 (3), 540-550 (2016).
  3. Umesha, S., Manukumar, H. M., Chandrasekhar, B., Shivakumara, P., Shiva Kumar, J., Raghava, S., Avinash, P., Shirin, M., Bharathi, T. R., Rajini, S. B., Nandhini, M., Vinaya Rani, G., Shobha, M., Prakash, H. S. Aflatoxins and food pathogens: Impact of biologically active aflatoxins and their control strategies. Journal of the Science of Food and Agriculture. , (2016).
  4. Brown, R. L., Menkir, A., Chen, Z. Y., Bhatnagar, D., Yu, J., Yao, H., Cleveland, T. E. Breeding aflatoxin-resistant maize lines using recent advances in technologies - a review. Food Additives & Contaminants - Part A Chemistry, Analysis, Control, Exposure & Risk Assessment. 30 (8), 1382-1391 (2013).
  5. Abbas, H., Accinelli, C., Shier, W. T. Biological control of aflatoxin contamination in U.S. crops and the use of bioplastic formulations of Aspergillus flavus biocontrol strains to optimize application strategies. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65, 7081-7087 (2017).
  6. Udomkun, P., Wiredu, A. N., Nagle, M., Müller, J., Vanlauwe, B., Bandyopadhyay, R. Innovative technologies to manage aflatoxins in foods and feeds and the profitability of application – A review. Food Control. 76, 127-138 (2017).
  7. Dohroo, N. P., Bhardwaj, S. S., Shyram, K. R. Amylase and invertase activity as influenced by Pythium pleroticum causing rhizome rot of ginger. Plant Disease Research. 2, 106-107 (1987).
  8. Singh, R., Saxena, V. S., Singh, R. Pectinolytic, cellulolytic, amylase and protease production by three isolates of Fusarium solani variable in their virulence. Indian Journal of Mycology and Plant Pathology. 19, 22-29 (1989).
  9. Fakhoury, A. M., Woloshuk, C. P. Amy1, the α-amylase gene of Aspergillus flavus: Involvement in aflatoxin biosynthesis in maize kernels. Phytopathology. 89 (10), 908-914 (1999).
  10. Bluhm, B. H., Woloshuk, C. P. Amylopectin induces Fumonisin B1 production by Fusarium verticillioides during colonization of maize kernels. Molecular Plant-Microbe Interactions. 18 (12), 1333-1339 (2005).
  11. Gilbert, M. K., Majumdar, R., Rajasekaran, K., Chen, Z. Y., Wei, Q., Sickler, C. M., Lebar, M. D., Cary, J. W., Frame, B. R., Wang, K. RNA interference-based silencing of the a-amylase (amy1) gene in Aspergillus flavus decreases fungal growth and aflatoxin production in maize kernels. Planta. 247 (6), 1465-1473 (2018).
  12. Chen, Z. Y., Brown, R. L., Russin, J. S., Lax, A. R., Cleveland, T. E. A corn trypsin inhibitor with antifungal activity inhibits Aspergillus flavus α-amylase. Phytopathology. 89 (18944733), 902-907 (1999).
  13. Fakhoury, A. M., Woloshuk, C. P. Inhibition of growth of Aspergillus flavus and fungal α-amylases by a lectin-like protein from Lablab purpureus. Molecular Plant-Microbe Interactions. 14 (8), 955-961 (2001).
  14. Mirkov, T. E., Wahlstrom, J. M., Hagiwara, K., Finardi-Filho, F., Kjemtrup, S., Chrispeels, M. J. Evolutionary relationships among proteins in the phytohemagglutinin-arcelin-a-amylase inhibitor family of the common bean and its relatives. Plant Molecular Biology. 26 (4), 1103-1113 (1994).
  15. Kim, Y. H., Woloshuk, C. P., Cho, E. H., Bae, J. M., Song, Y. S., Huh, G. H. Cloning and functional expression of the gene encoding an inhibitor against Aspergillus flavus a-amylase, a novel seed lectin from Lablab purpureus (Dolichos lablab). Plant Cell Reports. 26 (4), 395-405 (2007).
  16. Frame, B., Main, M., Schick, R., Wang, K. Ch. 22. Plant Embryo Culture. Thorpe, T. A., Yeung, E. C. 710, Humana Press. Methods in Molecular Biology 327-341 (2011).
  17. Rajasekaran, K., Sickler, C. M., Brown, R. L., Cary, J. W., Bhatnagar, D. Evaluation of resistance to aflatoxin contamination in kernels of maize genotypes using a GFP-expressing Aspergillus flavus strain. World Mycotoxin Journal. 6 (2), 151-158 (2013).
  18. Rajasekaran, K., Sayler, R. J., Sickler, C. M., Majumdar, R., Jaynes, J. M., Cary, J. W. Control of Aspergillus flavus growth and aflatoxin production in transgenic maize kernels expressing a tachyplesin-derived synthetic peptide, AGM182. Plant Science. , 150-156 (2018).
  19. Shu, X., Livingston, D. P., Franks, R. G., Boston, R. S., Woloshuk, C. P., Payne, G. A. Tissue-specific gene expression in maize seeds during colonization by Aspergillus flavus and Fusarium verticillioides. Molecular Plant Pathology. 16 (4), 662-674 (2015).
  20. Savary, S., Ficke, A., Aubertot, J. -N., Hollier, C. Crop losses due to diseases and their implications for global food production losses and food security. Food Security. 4, 519-537 (2012).
  21. Damalas, C. A., Eleftherohorinos, I. G. Pesticide exposure, safety issues, and risk assessment indicators. International Journal of Environmental Research and Public Health. 8 (5), 1402-1419 (2011).
  22. Kowalska, A., Walkiewicz, K., Kozieł, P., Muc-Wierzgoń, M. Aflatoxins: Characterisitcs and impact on human health. Postępy Higieny i Medycyny Doświadczalnej (Online). 71, 315-327 (2017).
  23. Rajasekaran, K., Cary, J. W., Cotty, P. J., Cleveland, T. E. Development of a GFP-expressing Aspergillus flavus strain to study fungal invasion, colonization, and resistance in cottonseed. Mycopathologia. 165 (2), 89-97 (2008).
  24. Punt, P., Dingemanse, M. A., Kuyvenhoven, A., Soede, R. D., Pouwels, P. H., van den Hondel, C. A. Functional elements in the promoter region of the Aspergillus nidulans gpdA gene encoding glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Gene. 93 (1), 101-109 (1990).
  25. Lee, L. W., Chiou, C. H., Klomparens, K. L., Cary, J. W., Linz, J. E. Subcellular localization of aflatoxin biosynthetic enzymes Nor-1, Ver-1, and OmtA in time-dependent fractionated colonies of Aspergillus parasiticus. Archives of Microbiology. 181 (3), 204-214 (2004).
  26. Bhatnagar, D., Cary, J. W., Ehrlich, K., Yu, J., Cleveland, T. E. Understanding the genetics of regulation of aflatoxin production and Aspergillus flavus development. Mycopathologia. 162, 155-166 (2006).
  27. Williams, W. P., Krakowsky, M. D., Scully, B. T., Brown, R. L., Menkir, A., Warburton, M. L., Windham, G. L. Identifying and developing maize germplasm with resistance to accumulation of aflatoxins. World Mycotoxin Journal. 8 (2), 193-209 (2015).
  28. Broekaert, W. F., van Parijs, J., Leyns, F., Joos, H., Peumans, W. J. A chitin-binding lectin from stinging nettle rhizomes with antifungal properties. Science. 245 (4922), 1100-1102 (1989).
  29. Vanparijs, J., Broekaert, W. F., Goldstein, I. J., Peumans, W. J. Hevein-an antifungal protein from rubber-tree (Hevea brasiliensis) latex. Planta. 183, 258-264 (1991).
  30. Gozia, O., Ciopraga, J., Bentia, T., Lungu, M., Zamfirescu, I., Tudor, R., Roseanu, A., Nitu, F. Antifungal properties of lectin and new chitinases from potato tubers. Comptes Rendus de l'Academie des Sciences - Series III. 316 (8), 788-792 (1993).
  31. Wisessing, A., Choowongkomon, K. Amylase inhibitors in plants: Structures, Functions and Applications. Functional Plant Science and Biotechnology. 6 (1), 31-41 (2012).
  32. Tyagi, B., Trivedi, N., Dubey, A. a-amylase inhibitor: A compelling plant defense mechanism against insect/pests. Environment & Ecology. 32 (3), 995-999 (2014).
  33. Powers, J. R., Culbertson, J. D. In vitro effect of bean amylase inhibitor on insect amylases. Journal of Food Protection. 45, 655-657 (1982).
  34. Gatehouse, A. M. R., Fenton, K. A., Jepson, I., Pavey, D. J. The effects of a-amylase inhibitors on insect storage pests: Inhibition of a-amylase in vitro and effects on development in vivo. Journal of the Science of Food and Agriculture. 37, 727-734 (1986).
  35. Blanco-Labra, A., Chagolla-Lopez, A., Martinez-Gallardo, N., Valdes-Rodriguez, S. Further characterization of the 12-kDa protease a-amylase inhibitor present in maize seeds. Journal of Food Biochemistry. 19, 27-41 (1995).
  36. Abdollahi, A., Buchanan, R. L. Regulation of aflatoxin biosynthesis: Induction of aflatoxin production by various carbohydrates. Journal of Food Science. 46, 633-635 (1981).
  37. Liu, J., Sun, L., Zhang, N., Zhang, J., Guo, J., Li, C., Rajput, S. A., Qi, D. Effects of nutrients in substrates of different grains on aflatoxin B1 production by Aspergillus flavus. BioMed Research International. 2016, (2016).
  38. Uppala, S. S., Bowen, K. L., Woods, F. M. Pre-harvest aflatoxin contamination and soluble sugars of peanut. Peanut Science. 40 (1), 40-51 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Test przesiewowy na ziarnachszczep wykazujący ekspresję GFPHamowanie wzrostu grzybówEkspresja AILPTransformacja AgrobacteriumLiczenie zarodnikówAnaliza fluorometryczna
Hamowanie wzrostu Aspergillus flavus i produkcji aflatoksyn w transgenicznej kukurydzy z ekspresją inhibitora α-amylazy z Lablab purpureus L.
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.