Tutaj prezentujemy protokół do analizy wzrostu Aspergillus flavus i produkcji aflatoksyn w ziarnach kukurydzy wyrażających białko przeciwgrzybicze. Używając szczepu A. flavus wykazującego ekspresję GFP, monitorowaliśmy infekcję i rozprzestrzenianie się grzyba w dojrzałych ziarnikach w czasie rzeczywistym. Test jest szybki, wiarygodny i powtarzalny
.Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Hamowanie wzrostu Aspergillus flavus i produkcji aflatoksyn w transgenicznej kukurydzy z ekspresją inhibitora α-amylazy z Lablab purpureus L.
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Zanieczyszczenie aflatoksynami w uprawach spożywczych i paszowych jest głównym wyzwaniem na całym świecie. Aflatoksyny, wytwarzane przez grzyby Aspergillus flavus (A. flavus), są silnymi czynnikami rakotwórczymi, które znacznie obniżają wartość upraw kukurydzy i innych roślin bogatych w olej, takich jak orzeszki ziemne, a także stanowią poważne zagrożenie dla zdrowia ludzi i zwierząt. Różne podejścia, w tym tradycyjna hodowla, transgeniczna ekspresja białek związanych z opornością oraz wywołane przez gospodarza wyciszanie genów krytycznych celów genu A. flavus w oparciu o interferencję RNA (RNAi), są oceniane w celu zwiększenia odporności na aflatoksyny u podatnych upraw. Wcześniejsze badania wykazały ważną rolę α-amylazy w patogenezie A. flavus i produkcji aflatoksyny, co sugeruje, że ten gen/enzym jest potencjalnym celem w zmniejszaniu zarówno wzrostu A. flavus, jak i produkcji aflatoksyny. W związku z tym niniejsze badanie zostało podjęte w celu oceny heterologicznej ekspresji (pod kontrolą konstytutywnego promotora CaMV 35S) białka podobnego do inhibitora α-amylazy Lablab purpureus L. (AILP) w kukurydzy przeciwko A. flavus. AILP jest białkiem o masie 36 kDa, które jest kompetycyjnym inhibitorem enzymu A. flavus α-amylazy i należy do rodziny białek inhibitorów lektyny-arceliny-α-amylazy w fasoli zwyczajnej. Badania in vitro poprzedzające obecne prace wykazały rolę AILP w hamowaniu aktywności A. flavus α-amylazy i rozwoju grzybów. Wzrost grzybów i produkcja aflatoksyn w dojrzałych ziarnikach były monitorowane w czasie rzeczywistym przy użyciu szczepu A. flavus wykazującego ekspresję GFP. Ten test przesiewowy jądra (KSA) jest bardzo prosty do skonfigurowania i zapewnia wiarygodne i powtarzalne dane na temat infekcji i zakresu rozprzestrzeniania się, które można określić ilościowo w celu oceny plazmy zarodkowej i linii transgenicznych. Fluorescencja szczepu GFP jest ściśle skorelowana ze wzrostem grzybów, a co za tym idzie, jest dobrze skorelowana z wartościami aflatoksyn. Celem obecnych prac było zastosowanie tej wcześniejszej wiedzy w uprawach o znaczeniu komercyjnym, takich jak kukurydza, w celu zwiększenia odporności na aflatoksyny. Nasze wyniki wskazują na 35%-72% zmniejszenie wzrostu A. flavus w transgenicznych ziarnach kukurydzy z ekspresją AILP, co z kolei przełożyło się na 62%-88% zmniejszenie poziomu aflatoksyny.
Wprowadzenie
Zanieczyszczenie mikotoksynami przez rodzaje grzybów, Aspergillus, Fusarium, Penicillium i Alternaria jest głównym problemem roślin spożywczych i paszowych uprawianych na całym świecie1,2,3. Spośród tych grzybów fitopatogenicznych Aspergillus ma największy niekorzystny wpływ na wartość upraw oraz zdrowie ludzi i zwierząt. Aspergillus flavus (A. flavus) jest oportunistycznym patogenem roślin, który infekuje uprawy bogate w olej, takie jak kukurydza, nasiona bawełny i orzeszki ziemne, i wytwarza silne czynniki rakot....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Konstrukcje plazmidowe i transformacja kukurydzy
- PCR amplifikuje wkładkę Lablab AILP za pomocą starterów 5'-TATCTAGAACTAGTGATTACCATGGCTCC-3' i 5'-ATACTGCAGGATTGCATGCAGAGTAGTACTG-3'. Warunki PCR obejmują początkowy etap denaturacji w temperaturze 98 °C przez 30 s (etap 1), następnie denaturację w temperaturze 98 °C przez 10 s (etap 2), wyżarzanie w temperaturze 55 °C przez 30 s (etap 3), wydłużenie w temperaturze 72 °C przez 20 s (etap 4), 31 cykli etapu 2 do etapu 4, i końcowy etap wydłużania w temperaturze 72 °C przez 5 min. Sklonuj produkt PCR do zmodyfikowanego wektora pCAMBIA 1,300, używając miejsc ograniczeń XbaI i PstI.....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Transformacja kukurydzy i screening molekularny roślin transgenicznych
Niedojrzałe zarodki kukurydzy linii Hi-II poddano transformacji przy użyciu Agrobacterium tumefaciens szczep EHA101 zawierający końcowy wektor docelowy dla roślin wykazujący ekspresję *Lablab purpureus* AILP gen pod kontrolą CaMV 35S promotor. Pięć niezależnie transformowanych linii kukurydzy przeprowadzono.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Straty w plonach w uprawach rolnych spowodowane patogenami i szkodnikami stanowią problem globalny20. Obecnie stosowanie syntetycznych fungicydów i pestycydów jest dominującym sposobem zwalczania patogenów i szkodników roślin, ale szczątkowa toksyczność tych biochemikaliów w żywności i paszy może stanowić poważne zagrożenie dla zdrowia ludzi i zwierząt21. Biorąc pod uwagę gospodarcze znaczenie kukurydzy jako rośliny spożywczej i pastewnej, zmniejszenie lub wyeliminowanie za.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.
Podziękowania
Dziękujemy Davidowi Meintsowi, University of Arkansas za pomoc w rozwoju i analizie transgenicznej kukurydzy we wczesnych pokoleniach. Prace te otrzymały wsparcie finansowe projektu USDA-ARS CRIS 6054-42000-025-00D. Wzmianka o nazwach handlowych lub produktach komercyjnych w tym artykule służy wyłącznie dostarczeniu konkretnych informacji i nie oznacza rekomendacji ani poparcia ze strony Departamentu Rolnictwa USA. Polityka równych szans zatrudnienia (EEO) USDA-ARS nakazuje równe szanse dla wszystkich osób i zakazuje dyskryminacji we wszystkich aspektach polityki, praktyk i działań kadrowych Agencji.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Agar | Keson | ||
| Niesamowita morska goop | Eklektyczne produkty | ||
| C1000 Touch CFX96 System czasu rzeczywistego | Bio-Rad | ||
| Corning Szalki do hodowli tkankowych Sokoła, 60 mm | Fisher Scientific | 08-772F | |
| Eppendorf 5424 Kolba do mikrowirówek | Fisher Scientific | ||
| Erlenmeyer z korkiem, 50 ml | szkła Ace | 6999-10 | |
| Etanol | |||
| FluoroQuant Afla | Romer Labs | COKFA1010 | |
| karbowane jakościowe koła z bibuły filtracyjnej, 15 cm | Fisher Scientific | 09-790-14E | |
| Piekarnik powietrzny | Force VWR | ||
| FQ-Reader | Romer Labs | EQFFM3010 | |
| Geno/Grinder 2010 | OPS Diagnostics | SP 2010-115 | |
| Ulepszone rękawice odporne na rozpuszczalniki organiczne z polialkoholu winylowego | Ansell | 012-15-554 | |
| Wytrząsarka do inkubatora Innova 44 | Brunswick Scientific | ||
| iScript Zestaw do syntezy cDNA | Bio-Rad | 1708890 | |
| ciekłym azotem | |||
| o niskiej formie, 100 ml | DKW Life Sciences | 14000-100 | |
| Metanol | |||
| Chlorek | |||
| Nexttec 1-etapowy zestaw do izolacji DNA dla roślin Mikroskop | Nexttec | 47N | |
| Nikon Eclipse E600 z aparatem Nikon DS-Qi1 | Nikon | ||
| Mikroskop stereoskopowy Nikon SMZ25 z oświetlaczem episkopowym C-HGFI i kamerą sCMOS Andor Zyla 4.2 Kwadratowe | |||
| Nunc | ThermoFisher Scientific | 240835 | |
| Phire Plant Fiolki | ThermoFisher | Scientific F130WH | |
| , 15 ml | OPS Diagnostics | PCRV 15-100-23 | |
| Ziemniak Zakrętka do bulionu | |||
| , 22 mm | DKW Nauki Przyrodnicze | 242612 | |
| Fosforan sodu dwuzasadowy siedmiowodny | Sigma-Aldrich | ||
| RNA Spectrum Plant | Sigma-Aldrich Kule szlifierskie ze stali nierdzewnej Sigma-Aldrich | ||
| OPS | Diagnostyka GBSS 375-1000-02 | ||
| Płytka | |||
| Synergia 4 Fluorometr | Biotek | ||
| T100 Termocykler | Bio-Rad | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T-9284 | |
| V8 sok | Campbell's | ||
| Whatman Jakościowa klasa Gładkie arkusze, klasa 3 | Fisher Scientific | 09-820P | |
| Wytrząsarka na nadgarstek | Burrell Scientific |
Bibliografia
- Ismaiel, A., Papenbrock, J. Mycotoxins: Producing fungi and mechanisms of phytotoxicity. Agriculture. 5 (3), 492-537 (2015).
- Mitchell, N., Bowers, E., Hurburgh, C., Wu, F. Potential economic losses to the USA corn industry from aflatoxin contaminati....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
