Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Przygotowanie granulatu Gushukang (GSK) do eksperymentów in vivo i in vitro

7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59171

⸱

9 maja 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Spine Institute, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 3Key Laboratory of Theory and Therapy of Muscles and Bones, Ministry of Education, 4School of Rehabilitation Science, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł zawiera szczegółowy protokół przygotowania roztworu roboczego granulatu Gushukang do badań na zwierzętach oraz granulatu GSK zawierającego surowicę do eksperymentów in vitro. Protokół ten może być stosowany do badań farmakologicznych leków ziołowych, a także do recept zarówno na eksperymenty in vivo, jak i in vitro.

Streszczenie

Tradycyjna chińska medycyna ziołowa odgrywa rolę alternatywnej metody leczenia wielu chorób, takich jak osteoporoza pomenopauzalna (POP). Granulat Gushukang (GSK), sprzedawany na receptę w Chinach, ma działanie ochronne na kości w leczeniu POP. Przed podaniem do organizmu zwykle wymagana jest jedna standardowa procedura przygotowawcza, która ma na celu promowanie uwalniania aktywnych składników z surowych ziół i wzmocnienie efektów farmakologicznych, a także wyników terapeutycznych. W niniejszym badaniu zaproponowano szczegółowy protokół stosowania granulatu GSK w testach eksperymentalnych in vivo i in vitro. Autorzy najpierw przedstawiają szczegółowy protokół do obliczania odpowiednich dla zwierząt dawek granulek do badań in vivo: ważenia, rozpuszczania, przechowywania i podawania. Po drugie, w artykule opisano protokoły skanowania mikro-tomografią komputerową i pomiarem parametrów kości. Oceniono przygotowanie próbki, protokoły działania mikrotomografii komputerowej oraz ilościowe określenie parametrów kości. Po trzecie, przygotowuje się granulki GSK zawierające surowicę, a surowicę zawierającą lek ekstrahuje się do osteoklastogenezy in vitro i osteoblastogenezy. Granulat GSK podawano dożołądkowo dwa razy dziennie szczurom przez trzy kolejne dni. Następnie pobrano krew, odwirowano, dezaktywowano i przefiltrowano. Na koniec surowicę rozcieńczono i wykorzystano do przeprowadzenia osteoklastogenezy i osteoblastogenezy. Opisany tutaj protokół można uznać za odniesienie do badań farmakologicznych ziołowych leków na receptę, takich jak granulki.

Wprowadzenie

Tradycyjna medycyna chińska (TCM) jest jednym z ważnych uzupełniających i alternatywnych podejść do leczenia osteoporozy1,2. Odwar wodny jest podstawową i najczęściej używaną formą formuły3. Istnieją jednak również wady: zły gust, niedogodności podczas transportu, krótki okres trwałości i niespójne protokoły, ograniczające zarówno zastosowania, jak i efekty lecznicze. Aby uniknąć powyższych wad, a także uzyskać lepsze efekty, opracowano granulki, które są szeroko stosowane4. Chociaż w wielu badaniach analizowano mechanizmy farmakologiczne jednego lub więcej skutecznych składników z granulek5,6,7, dokładne mechanizmy i podstawowe procesy farmakologiczne są nadal trudne do zidentyfikowania. Dzieje się tak dlatego, że zbyt wiele skutecznych składników z jednej granulki może jednocześnie wywierać podobne lub przeciwstawne efekty4. W związku z tym opracowanie jednego standardowego protokołu przygotowania granulek przed podaniem do organizmu nie tylko miałoby ogromny wpływ na wyniki terapeutyczne, ale jest również wymagane zarówno w testach in vivo, jak i in vitro.

Ponadto, lecznicze działanie granulek w klinice jest trudne do potwierdzenia i dokładnego zidentyfikowania za pomocą badań in vitro lub ex vivo, co stanowi wyzwanie, ponieważ mechanizmy farmakologiczne są zbyt złożone. Aby rozwiązać ten problem, przygotowanie surowicy zawierającej lek zostało po raz pierwszy zaproponowane przez Tashino w latach 80. XX wieku8. Od tego czasu wielu badaczy stosowało surowicę zawierającą leki do ziołolecznictwa, w tym granulek9,10,11. Obecnie wybór surowicy zawierającej lek do badań in vitro jest uważany za jedną ze strategii, która ściśle naśladuje warunki fizjologiczne.

Gushukang (GSK) granulki zostały opracowane do leczenia osteoporozy pomenopauzalnej (POP) w oparciu o praktykę kliniczną w świetle teorii TCM. Granulki GSK zapobiegają utracie masy kostnej u myszy po owariektomii (OVX) in vivo, hamują osteoklastyczną resorpcję kości i stymulują tworzenie kości osteoblastycznej4. W związku z tym Li i wsp.12 stwierdzili, że granulki GSK mają działanie ochronne na kości u myszy OVX poprzez zwiększenie aktywności receptora wapniowego w celu stymulowania tworzenia kości. Aby potwierdzić działanie ochronne kości, a także działanie farmakologiczne granulatu GSK, autorzy przedstawili szczegółową procedurę przygotowania roztworów roboczych i surowicy zawierającej lek (granulat GSK). Ponadto w artykule opisano zastosowanie granulatu GSK w mysim modelu osteoporotycznym indukowanym przez OVX oraz surowicy zawierającej granulki GSK do osteoklastogenezy/osteoblastogenezy in vitro.

Granulki GSK składają się z kilku ziół13,14 i mogą być łatwo całkowicie rozpuszczone w soli fizjologicznej. Dlatego sól fizjologiczna służy jako nośnik. Myszom operowanym pozorowanym (Sham) i myszom OVX podawano taką samą objętość soli fizjologicznej, jak myszom podawanym granulacyjnie. Równoważne dawki granulatu GSK dla myszy obliczono na podstawie równania Meeh-Rubnera15. To równanie ma nie tylko tę zaletę, że pozwala uzyskać bezpieczne dawki, ale także gwarantuje efekty farmakologiczne15. Trzy dawki granulatu GSK zostały wygenerowane w następujący sposób: (1) GSKL: OVX + granulat GSK o niskiej dawce, 2 g/kg/dzień. (2) GSKM: OVX + granulat GSK w średniej dawce, 4 g/kg/dzień. (3) GSKH: OVX + granulat GSK w wysokiej dawce, 8 g/kg/dzień. Myszom w grupach GSKL, GSKM i GSKH podawano dożołądkowo granulki GSK. Węglan wapnia (600 mg/tabletkę) z witaminą D3 (125 jednostek międzynarodowych/tabletkę), na przykład w dojrzałym i sprzedawanym produkcie (np. Caltrate [CAL]) do leczenia i zapobiegania osteoporozie, stosowano jako kontrolę pozytywną.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury eksperymentalne zostały przeprowadzone za zgodą Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu TCM w Szanghaju (SZY201604005).

1. Przygotowanie i administracja działającego rozwiązania GSK

  1. Obliczyć równoważne dawki granulatu GSK dla myszy.
    1. Oblicz powierzchnię ciała na podstawie równania Meeh-Rubnera15: powierzchnia ciała = K x (masa ciała2/3)/1000, gdzie wartości K wynoszą 10,6 dla człowieka i 9,1 dla myszy. Zakładając masę ciała ludzkiego wynoszącą 70 kg, to powierzchnia ciała ludzkiego (m2) = 10,6 x (702/3)/1000 = 1,8 m2. Zakładając, że masa ciała myszy wynosi 20 g (0,02 kg; np. 1 miesiąc, samica, C57/BL6), to powierzchnia ciała myszy (m2) = 9,1 x (0,022/3)/1000 = 0,0067 m2.
    2. Na podstawie obliczonej powierzchni ciała oblicz współczynnik transformacji ciała dla człowieka i myszy. Człowiek: 70 kg/1,8m2 = 39. Mysz: 0,02 kg/0,0067m2 = 3. GSK granulat = 20 g/70 kg x 39/3 = 3,72 g/kg ≈ 4 g/kg.
    3. Na podstawie masy ciała 20 g na mysz oblicz równoważną dawkę dla myszy: 4 g/kg x 0,02 kg = 0,08 g.
    4. Obliczyć trzy równoważne dawki granulatu GSK w oparciu o 20 myszy na grupę i interwencję trwającą 3 miesiące (90 dni): (1) GSKL (OVX + granulat GSK o niskiej dawce [2 g/kg/dzień]): 0,04 g myszy/dzień x 20 myszy x 90 dni = 72 g. (2) GSKM (OVX + granulat GSK średniej dawki [4 g/kg/dzień]): 0,08 g myszy/dzień x 20 myszy x 90 dni = 144 g. (3) GSKH (OVX + granulat GSK w wysokiej dawce [8 g/kg/ dzień]): 0,12 g myszy/dzień x 20 myszy x 90 dni = 216 g.
      UWAGA: W praktyce należy przygotować dodatkowe 20% granulatu GSK, aby zniwelować ubytek.
  2. Obliczyć objętość granulatu GSK na mysz na podstawie masy ciała15: np. objętość (V) = 0,24 ml/mysz/dzień.
    UWAGA: Objętość do podania dożołądkowego dla myszy wynosi 0,12 ml/10 g.
  3. Odważyć trzy dawki granulatu GSK na 10 dni. Zważyć 8 g, 16 g i 24 g granulatu GSK i służyć odpowiednio jako GSKL, GSKM i GSKH.
  4. Obliczyć równoważną dawkę węglanu wapnia z witaminą D3 (CAL) dla myszy na podstawie równania Meeh-Rubnera15, jak w krokach 1.1.1 i 1.1.2: Dawka CAL = 2 tabletki/70 kg x 39/3 = 0,372 tabletki/kg ≈ 0,4 tabletki/kg.
  5. Na podstawie masy ciała wynoszącej 20 g na mysz (np. 1-miesięczna samica, C57/BL6) należy obliczyć równoważną dawkę CAL dla myszy: 0,4 tabletki/kg x 0,02 kg = 0,008 tabletki. Następnie obliczyć równoważną dawkę CAL na podstawie 20 myszy w grupie i interwencji trwającej 3 miesiące (90 dni): 0,008 tabletki x 20 x 90 = 14,4 tabletki. Zważ 10-dniową subskrypcję CAL (1,6 tabletki).
  6. rozpad
    1. Umieścić 8 g granulatu GSK w probówce o pojemności 50 ml. Dodaj 48 ml soli fizjologicznej i wstrząśnij probówką, aby całkowicie się rozpuścić.
      UWAGA: Standardem całkowitego rozpuszczenia jest brak osadu. Całkowite rozpuszczenie można dodatkowo potwierdzić, jeśli igła do zgłębnika może pobrać roztwór roboczy, a następnie płynnie go wydalić.
    2. Powtórzyć krok 1.5.1 z 16 g i 24 g granulatu GSK.
    3. Umieścić 1,6 tabletki (na 10 dni) CAL w probówce o pojemności 50 ml. Dodaj 48 ml soli fizjologicznej i wstrząśnij probówką, aby całkowicie się rozpuścić.
      UWAGA: Roztwory robocze można przechowywać w temperaturze -4 °C i przygotowywać co 10 dni.
  7. Podawanie dożołądkowe
    1. Chwyć tył myszy (1 miesiąc, kobieta, C57/BL6) tak, aby mysz była skierowana do przodu i upewnij się, że pozostaje mocno w tej pozycji. Utrzymuj mysz w spokoju przez 2-3 minuty przed podaniem.
      UWAGA: Upewnij się, że badacz wyraźnie widzi przód myszy. Noś rękawiczki, aby zapobiec ugryzieniu myszy, szczególnie w przypadku nowych badaczy.
    2. Umieścić igłębkę (rozmiar: #12, 40 mm) w roztworze roboczym granulatu GSK i pobrać 0,24 ml roztworu roboczego.
    3. Włóż igłębkę do myszy przez jedną stronę jej pyska, aż igła do zgłębnika dotrze do żołądka.
      UWAGA: Aby potwierdzić, że igła do zgłębnika dotarła do żołądka: (1) Igła do zgłębnika napotyka uczucie oporu. Tymczasem mysz pokazuje czynność połykania, zanim igła zgłębnika przejdzie przez fizyczne zwężenie przełyku. (2) Wstrzyknąć około 0,5 ml roztworu roboczego do myszy i odczekać 1 minutę. Jeśli z myszy nie wydostaje się żaden roztwór, oznacza to, że igła do zgłębnika dotarła do żołądka.
    4. Wstrzyknąć roztwór roboczy granulatu GSK (0,24 ml/mysz) do żołądka, a następnie wyciągnąć igłębkę. Włóż mysz z powrotem do klatki.
    5. Powtórzyć krok 1.6.4 z roztworem CAL i wstrzyknąć 0,24 ml roztworu CAL na mysz.
      UWAGA: Objętość roztworu CAL oblicza się jak w kroku 1.2.

2. Mikrotomografia komputerowa

  1. Zbiór i przygotowanie roślin
    1. Znieczulenie dootrzewnowe myszy 300 ml/100 g 80 mg/kg ketaminy następnego dnia po 90-dniowej interwencji. Użyj szczypania igły u stóp, aby sprawdzić, czy mysz jest całkowicie znieczulona. Brak odpowiedzi wskazuje na udane znieczulenie. Następnie zabij mysz ze zwichnięciem szyjki macicy.
    2. Zamocuj mysz zarówno rękami, jak i nogami na piance za pomocą pinezek.
    3. Odetnij skórę nożyczkami (rozmiar: 8,5 cm) i pęsetą (rozmiar: 10 cm) nóg od bliższego do dalszego końca, a następnie zbierz piszczele.
    4. Natychmiast włóż piszczele do 70% alkoholu etylowego i myj przez 3 razy.
  2. Owiń lewą piszczel myszy pianką gąbczastą i włóż ją do probówki na próbkę (średnica 35 mm, długość 140 mm).
    UWAGA: Długa oś próbki powinna znajdować się równo z osią probówki z próbką. Upewnij się, że bliższy koniec kości piszczelowej jest skierowany do góry.
  3. Uruchamianie skanera micro-CT 80
    1. Uruchom skaner micro-CT 80 w temperaturze pokojowej.
    2. Ustaw probówkę z próbką w micro-CT 80 i rozpocznij skanowanie przekroju poprzecznego z następującymi parametrami skanowania: rozmiar piksela 15,6 μm, napięcie lampy 55 kV, prąd lampy 72 μA, czas integracji 200 ms, rozdzielczość przestrzenna 15,6 μm, rozdzielczość pikseli 15,6 μm i matryca obrazu 2048 x 2048,
      UWAGA: Kość gąbczastą odróżnia się od kości korowej na podstawie wstępnego skanowania. Obszar skanowania kości piszczelowej definiuje się jako obszar kości gąbczastej od 5 mm poniżej płaskowyżu piszczelowego do dystalnego końca.
  4. Kwantyfikacja parametrów kostnych
    1. Po zakończeniu skanowania przekroju poprzecznego uzyskaj obrazy lewej kości piszczelowej.
    2. Ustaw próg gęstości na 245−1000. Za pomocą programu do oceny mikrotomografii komputerowej V6.6 można zmierzyć następujące parametry kości: gęstość mineralna kości (BMD), objętość kości w stosunku do objętości całkowitej (BV/TV), liczba kości beleczkowej (Tb.N), grubość kości beleczkowej (Tb.Th), a także separacja kości beleczkowej (Tb.Sp).

3. Przygotowanie surowicy krwi do eksperymentów in vitro

  1. kalkulacja
    1. Na podstawie masy ciała szczura wynoszącej 0,2 kg (1 miesiąc, samica, Sprague-Dawley) oblicz dawkę granulatu GSK: dawka dla ludzi/dzień x masa ciała człowieka x K/masa ciała szczura = 20 g/70 kg/dzień x 70 kg x K (K = 0,018) /0,2 kg = 2 g/kg/dzień.
      UWAGA: K jest współczynnikiem przemiany farmakologicznej między człowiekiem a myszą15 (K = 0,018).
    2. Powtórz krok 3.1.1 i oblicz następujące dawki.
      1. Obliczyć dawkę GSKL: 10 g/70 kg/dzień x 70 kg x K/0,2 kg = 1 g/kg/dzień.
      2. Oblicz dawkę GSKM: 20 g/70 kg/dzień x 70 kg x K/0,2 kg = 2 g/kg/dzień.
      3. Oblicz dawkę GSKL: 40 g/70 kg/dzień x 70 kg x K/0,2 kg = 4 g/kg/dzień.
      4. Obliczać dawkę CAL: 2 tabletki / 70 kg / dzień x 70 kg x K / 0,2 kg = 0,2 tabletki / kg / dzień.
    3. Oblicz całkowitą dawkę granulatu GSK i CAL.
      1. Oblicz całkowitą dawkę dla GSKL: 1 g/kg/dzień x 0,2 kg x 6 szczurów x 3 dni = 3,6 g.
      2. Obliczyć całkowitą dawkę dla GSKM: 2 g/kg/dzień x 0,2 kg x 6 szczurów x 3 dni = 7,2 g.
      3. Oblicz całkowitą dawkę dla GSKH: 4 g/kg/dzień x 0,2 kg x 6 szczurów x 3 dni = 14,4 g.
      4. Obliczyć dawkę CAL = 0,2 tabletki/kg/dzień x 0,2 kg x 6 szczurów x 3 dni = 0,72 tabletki.
        UWAGA: Do przygotowania 100 ml pożywki hodowlanej (20% surowicy zawierającej granulki GSK) potrzeba łącznie 10 ml surowicy hodowlanej (20% surowicy zawierającej granulki GSK). Oczekuje się, że każdy szczur (6 szczurów / grupa) dostarczy 1,5-2 ml surowicy zawierającej granulki GSK po odwirowaniu.
    4. Obliczyć objętość granulatu GSK zastosowanego na szczura w oparciu o masę ciała15: np. objętość (V) = 2 ml/szczur/dzień.
      UWAGA: Objętość do podania dożołądkowego dla szczurów wynosi 0,1 ml/10 g.
  2. Zważ trzy dawki granulatu GSK na 3 dni. Ważą 3,6 g, 7,2 g i 14,4 g granulatu GSK i służą odpowiednio jako GSKL, GSKM i GSKH. Należy odważyć 0,72 tabletki w grupie CAL.
  3. Umieścić 7,2 g granulatu GSK w probówce o pojemności 50 ml. Dodaj 36 ml soli fizjologicznej i wstrząśnij probówką, aby całkowicie się rozpuściły. Powtórzyć tę czynność z 3,6 g i 14,4 g granulatu GSK.
  4. Powtórzyć sekcję 1.6 dla podawania dożołądkowego z 2 ml roztworu roboczego GSK.
    UWAGA: Podawać tę samą objętość soli fizjologicznej (2 ml na szczura) w celu przygotowania surowicy i służyć jako ślepa próba kontrolna do testów in vitro.
  5. Przygotowanie surowicy zawierającej GSK
    1. Znieczulenie dootrzewnowe szczurów 300 ml/100 g 80 mg/kg ketaminy 1 godzinę po ostatnim podaniu granulatu GSK. Użyj szczypania igły u stóp, aby potwierdzić, czy szczur jest całkowicie znieczulony. Brak odpowiedzi wskazuje na udane znieczulenie.
    2. Wystaw brzuch na dno klatki piersiowej szczurów za pomocą prostych nożyczek operacyjnych po nacięciu skóry i otrzewnej.
      UWAGA: Przed użyciem narzędzie chirurgiczne należy wysterylizować w wysokich temperaturach i pod wysokim ciśnieniem. Obszar operacyjny musi być wysterylizowany 70% etanolem podczas pobierania krwi.
    3. Usuń tkankę łączną aorty brzusznej za pomocą bibuły, aby wyraźnie odsłonić naczynie.
    4. Pobrać krew z aorty brzusznej za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml i 22 g. Następnie wyjąć igłę i przenieść krew do sterylnej probówki o pojemności 15 ml. Zwykle od jednego szczura można uzyskać 6-8 ml krwi.
      UWAGA: Każdy szczur musi pozostać przy życiu podczas pobierania krwi. Jednym ze wskaźników jest to, że aorta brzuszna pulsuje, gdy szczur żyje. Szczur jest martwy po pobraniu krwi.
    5. Trzymaj probówkę pionowo w temperaturze pokojowej przez 30-60 minut, aż krew zakrzepnie w probówce. Następnie odwirować probówkę o stężeniu 500−600 x g przez 20 minut. Przenieść cały supernatant (surowicę) z jednej grupy (6 szczurów) do jednej sterylnej probówki o pojemności 50 ml i wstrząsnąć w celu wymieszania.
    6. Inaktywować surowicę przez inkubację w łaźni wodnej o temperaturze 56 °C przez 30 minut. Przefiltrować surowicę za pomocą hydrofilowego filtra strzykawkowego z polieterosulfonu o wielkości 0,22 μm. Przechowywać w temperaturze -80 °C do długotrwałego użytkowania (mniej niż 1 rok).
      UWAGA: Przefiltrowana surowica może być stosowana do osteoklastogenezy in vitro i osteoblastogenezy.
  6. aplikacja
    1. Osteoklastogeneza in vitro
      1. Rozcieńczyć trzy dawki surowicy zawierającej GSK (GSKL, GSKM, GSKH) w stosunku 1:4 z minimalną pożywką Eagle'a (α-MEM) zawierającą L-glutaminę, rybonukleozydy i dezoksyrybonukleozydy.
        UWAGA: Upewnij się, że końcowe stężenie surowicy zawierającej GSK do osteoklastogenezy in vitro i osteoblastogenezy wynosi 20%.
      2. Dodać rozcieńczoną surowicę zawierającą GSK (200 μl / basenik) z kroku 3.6.1.1 do makrofagów szpiku kostnego (BMM) od 4-6 tygodniowych myszy C57BL / 6 w celu osteoklastogenezy i stymulować BMM czynnikiem stymulującym tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF, 10 ng / ml) i aktywatorem receptora dla liganda czynnika jądrowego κB (RANKL, 100 ng / ml), jak opisano wcześniej2.
    2. Osteoblastogeneza in vitro
      1. Powtórz krok 3.6.1.1.
      2. Dodaj rozcieńczoną surowicę zawierającą GSK (2 ml / dołek) do mezenchymalnych komórek macierzystych kości (BMSC) od 4-6 tygodniowych myszy C57BL / 6, aby wytworzyć osteoblast, jak opisano wcześniej16.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wyniki skanowania mikro-CT wykazały, że u myszy OVX wystąpiła istotna utrata masy kostnej w porównaniu z myszami z grupy kontrolnej otrzymującymi sól fizjologiczną (Ryc. 1A). Interwencja z zastosowaniem granulek GSK (90 dni) znacznie zwiększyła BMD, szczególnie w grupie GSKM (Ryc. 1B). Ilościowo określono parametry struktury kości, takie jak BMD, BV/TV, Tb.N oraz Tb.Th. Leczenie granulkami GSK doprowadziło do zwiększenia BMD, BV/...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Granulki środków TCM stały się jednym z powszechnych wyborów w przypadku preparatów lub recept. Granulki GSK składają się z kilku leków ziołowych opartych na doświadczeniach klinicznych lub teorii TCM i wywierają lepsze efekty lecznicze przy mniejszej liczbie skutków ubocznych4. W porównaniu z wywarem wodnym granulki mają następujące zalety: dobry smak, wygodę dostawy, długotrwałe przechowywanie, standardowy protokół i spójne efekty lecznicze, a także wyższą wydajność. Obecnie granulat jest jedną ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez granty z Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (81804116, 81673991, 81770107, 81603643 i 81330085), programu dla Zespołu Innowacyjnego, Ministerstwa Nauki i Technologii Chin (2015RA4002 do WYJ), programu dla Zespołu Innowacyjnego, Ministerstwa Edukacji Chin (IRT1270 do WYJ), Shanghai TCM Medical Center of Chronic Disease (2017ZZ01010 do WYJ), Trzyletnie działania na rzecz przyspieszenia rozwoju Planu Tradycyjnej Medycyny Chińskiej (ZY(2018-2020)-CCCX-3003 do WYJ) oraz krajowych kluczowych projektów badawczo-rozwojowych (2018YFC1704302).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
α-MEMHyclone
laboratoria		SH30265.018Do hodowli komórkowych
β-GlicerofosforanSigmaG5422Kaltrate osteoblastogenezy
(CAL)WyethL96625Interwencja na zwierzętach
C57BL/6 myszySLAC Laboratory
Animal Co., Ltd.		Losowypreparat Ainimal
DexamethsomeSigmaD4902
DimetylosulfotlenekSigmaD2438Zamrożony
komórkowo kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)Sangon Biotech60-00-4Próbki treatmnet
Surowica bydlęcapłodu GibcoFL-24562Do hodowli komórkowej
Gushukang granulkikangcheng Firma w ChinachZ20003255Ziołowa recepta
Mikroskop świetlnyOlympus BX50Olympus BX50Obrazy osteoklastogenezy
Kwas L-askorbinowy 2-fosforan sequinagneium sequinagneium slab hyclrateSigmaA8960-5GMikroskop osteoblastogenezy
LeicaDMI300BOsteocast i osteoblast imagine
M-CSFPeprotechAF-300-25-10Osteoklastogeneza
i mu; icro-CTScanco
Medical AG		μ Mikrotomograf rentgenowski CT80Analsyza strukturalna kości
RANKLPeprotech11682-HNCHFOsteoklastogeneza
Sprague DawleySLAC Laboratory
Animal Co., Ltd.		Losowepobieranie surowicy krwi
Zestaw do barwienia kwasowo-fosforanowego odpornego na winian (TRAP)Sigma-Aldrich387A-1KTTRAP

Bibliografia

  1. Shu, B., Shi, Q., Wang, Y. J. Shen (Kidney)-tonifying principle for primary osteoporosis: to treat both the disease and the Chinese medicine syndrome. Chinese Journal of Integrative Medicine. 21 (9), 656-661 (2015).
  2. Zhao, D., et al. The naturally derived small compound Osthole inhibits osteoclastogenesis to prevent ovariectomy-induced bone loss in mice. Menopause. 25 (12), 1459-1469 (2018).
  3. Liu, S. F., Sun, Y. L., Li, J., Dong, J. C., Bian, Q. Preparation of Herbal Medicine: Er-Xian Decoction and Er-Xian-containing Serum for In vivo and In vitro Experiments. Journal of Visualized Experiments. (123), e55654(2017).
  4. Wang, Q., et al. The systemic bone protective effects of Gushukang granules in ovariectomized mice by inhibiting osteoclastogenesis and stimulating osteoblastogenesis. Journal of Pharmacological Sciences. 136 (3), 155-164 (2018).
  5. Bian, Q., et al. Oleanolic acid exerts an osteoprotective effect in ovariectomy-induced osteoporotic rats and stimulates the osteoblastic differentiation of bone mesenchymal stem cells in vitro. Menopause. 19 (2), 225-233 (2012).
  6. Zhao, D., et al. Oleanolic acid exerts bone protective effects in ovariectomized mice by inhibiting osteoclastogenesis. Journal of Pharmacological Sciences. 137 (1), 76-85 (2018).
  7. Tang, D. Z., et al. Osthole Stimulates Osteoblast Differentiation and Bone Formation by Activation of β-Catenin-BMP Signaling. Journal of Bone and Mineral Research. 25 (6), 1234-1245 (2010).
  8. Tashino, S. "Serum pharmacology" and "serum pharmaceutical chemistry": from pharmacology of Chinese traditional medicines to start a new measurement of drug concentration in blood. Therapeutic Drug Monitoring Research. 5, 54-64 (1988).
  9. Fu, L., et al. Ex vivo Stromal Cell-Derived Factor 1-Mediated Differentiation of Mouse Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells into Hepatocytes Is Enhanced by Chinese Medicine Yiguanjian Drug-Containing Serum. Evidence Based Complement Alternative Medicine. , 7380439(2016).
  10. Cao, Y., Liu, F., Huang, Z., Zhang, Y. Protective effects of Guanxin Shutong capsule drug-containing serum on tumor necrosis factor-alpha induced endothelial dysfunction through nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase and the nitric oxide pathway. Experimental and Therapeutic. 8 (3), 998-1004 (2014).
  11. Chen, X., et al. Application of serum pharmacology in evaluating the antitumor effect of Fuzheng Yiliu Decoction from Chinese Medicine. Chinese Journal of Integrative Medicine. 20 (6), 450-455 (2014).
  12. Li, X. L., Wang, L., Bi, X. L., Chen, B. B., Zhang, Y. Gushukang exerts osteopreserve effects by regulating Vitamin D and Calcium metabolism in ovariectomized mice. Journal of Bone Mineral Metabolism. , 1-11 (2018).
  13. Cui, S. Q., et al. Mechanistic study of Shen (Kidney)tonifying prescription Gushukang in Preventing and Treating Primary Osteoporosis. Journal of Chinese Medical University. 30 (16), 351-354 (2001).
  14. Wang, Y., Shang, K., Li, Y. K., Tao, X. L. Effect of gushukang on osteoclast cultured from type I diabetic rat in vitro-a preliminary study. Chinese Journal of Bone Tumor and Bone Disease. 3 (12), 22-24 (2004).
  15. Zhang, Y. P. Pharmacology Experiment. , 2nd edition, People’s medical publishing house. Beijing, China. (1996).
  16. Zhao, D. F., et al. Cyclophosphamide causes osteoporosis in C57BL/6 male mice: suppressive effects of cyclophosphamide on osteoblastogenesis and osteoclastogenesis. Oncotarget. 8 (58), 98163-98183 (2017).
  17. Zhong, L. L., et al. A randomized, double-blind, controlled trial of a Chinese herbal formula (Er-Xian decoction) for menopausal symptoms in Hong Kong perimenopausal women. Menopause. 20 (7), 767-776 (2013).
  18. Zhang, D. Issues and strategies for study of serum pharmcology in oncology. Zhong Yi Yan Jiu. 17 (5), 13-14 (2004).
  19. Nair, A. B., Jacob, S. A simple practice guide for dose conversion between animals and human). Journal of Basic and Clinical Pharmacy. 7 (2), 27-31 (2016).
  20. Xu, X., et al. Protective effect of the traditional Chinese medicine xuesaitong on intestinal ischemia-reperfusion injury in rats. International Journal of Clinical and Experiments Medicine. 8 (2), 1768-1779 (2015).
  21. Jiang, Y. R., et al. Effect of Chinese herbal drug-containing serum for activating-blood and dispelling-toxin on ox-LDL-induced inflammatory factors' expression in endothelial cells. Chinese Journal of Integrative Medicine. 18 (1), 30-33 (2012).
  22. Li, Y., Xia, J. Y., Chen, W., Deng, C. L. Effects of Ling Qi Juan Gan capsule drug-containing serum on PDGF-induced proliferation and JAK/STAT signaling of HSC-T6 cells. Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi. 21 (9), 663-667 (2013).
  23. Guo, C. Y., Ma, X. J., Liu, Q., Yin, H. J., Shi, D. Z. Effect of Chinese herbal drug-containing serum for activating blood, activating blood and dispelling toxin on TNF-alpha-induced adherence between endothelial cells and neutrophils and the expression of MAPK pathway. Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi. 35 (2), 204-209 (2015).
  24. Li, Y. K. Some issues in methology of Chinese herbs serum pharmcology. Zhong Yao Xin Yao Yu Lin Chuang Yao Li. 10 (5), 263(1999).
  25. Zhang, L., et al. A review of Chinese herbs serum pharmcology methodological study. Nan Jing Zhong Yi Yao Da Xue Xue Bao. 18 (4), 254(2002).
  26. Pacifici, R. Estrogen, cytokines, and pathogenesis of postmenopausal osteoporosis. Journal. Bone Mineral Research. 11, 1043-1051 (1996).
  27. Ammann, P., et al. Transgenic mice expressing soluble tumor necrosis factor-receptor are protected against bone loss caused by estrogen deficiency. Journal Clinical Investigation. 99, 1699-1703 (1997).
  28. Kimble, R. B., et al. Simultaneous block of interleukin-1 and tumor necrosis factor is required to completely prevent bone loss in the early postovariectomy period. Endocrinology. 136, 3054-3061 (1995).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Granulaty Gushukangeksperymenty in vivoskanowanie mikro-CTpomiar parametrów kostnychprzygotowanie surowicytest osteoklastogenezytest osteoblastogenezypodawanie przez zgłębnik żołądkowypobieranie krwi
Przygotowanie granulatu Gushukang (GSK) do eksperymentów in vivo i in vitro
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.