Wykorzystanie rozpraszania wzmocnionego nanoplazmonem i obrazowania mikroskopowego w małym powiększeniu do ilościowego określenia egzosomów pochodzących z guza

Summary

Kliniczne tłumaczenie biomarkerów pochodzących z egzosomów dla chorych i złośliwych komórek jest utrudnione przez brak szybkich i dokładnych metod kwantyfikacji. W niniejszym raporcie opisano wykorzystanie obrazów mikroskopowych ciemnego pola o małym powiększeniu do ilościowego oznaczania określonych podtypów egzosomów w próbkach surowicy lub osocza o małej objętości.

Abstract

Zakażone lub złośliwe komórki często wydzielają więcej egzosomów, co prowadzi do podwyższonego poziomu egzosomów związanych z chorobą w krążeniu. Te egzosomy mogą potencjalnie służyć jako biomarkery do diagnozowania chorób oraz monitorowania postępu choroby i odpowiedzi na leczenie. Jednak większość procedur analizy egzosomów wymaga etapów izolacji i oczyszczania egzosomów, które są zwykle czasochłonne i pracochłonne, a tym samym mają ograniczoną użyteczność w warunkach klinicznych. W niniejszym raporcie opisano szybką procedurę analizy określonych biomarkerów na zewnętrznej błonie egzosomów bez konieczności oddzielnych etapów izolacji i oczyszczania. W tej metodzie egzosomy są wychwytywane na powierzchni szkiełka przez przeciwciała specyficzne dla egzosomu, a następnie hybrydyzowane z sondami przeciwciał sprzężonymi z nanocząstkami specyficznymi dla choroby. Po hybrydyzacji liczebność docelowej populacji egzosomów określa się poprzez analizę obrazów związanych nanocząstek pod mikroskopem ciemnego pola o małym powiększeniu (LMDFM). Podejście to można łatwo zastosować w badaniach i zastosowaniach klinicznych do analizy biomarkerów egzosomów związanych z błoną związanych z chorobą.

Introduction

Egzosomy są uwalniane z większości typów komórek i odgrywają kluczową rolę w komunikacji między komórkami, w tym w procesach patofizjologicznych związanych z różnymi chorobami, ponieważ mogą być domem dla określonych tkanek lub typów komórek i zawierają różnorodne kwasy nukleinowe, białka i lipidy, które odzwierciedlają ich pochodzenie i mogą wywierać wpływ regulacyjny na komórki odbiorcy^{1, 2,3,4}. Egzosomy są często wydzielane w podwyższonych stężeniach w stanach chorobowych, mogą wchodzić w interakcje zarówno z sąsiednimi, jak i odległymi komórkami i znajdują się w stosunkowo wysokim stężeniu w krążeniu, podobnie jak większość innych płynów ustrojowych, w tym ślina, mocz, sok trzustkowy i żółciowy oraz płyn z płukania oskrzeli i pęcherzyków płucnych^{5,6,7,8,9,10,11}. Ta obfitość i stabilność egzosomów w płynach ustrojowych człowieka, w połączeniu z ich bogatą w informacje naturą, czyni je idealnymi biomarkerami do diagnozowania chorób i monitorowania leczenia.

Obejmuje to egzosomy pochodzące z nowotworu (TDE), które zawierają specyficzne dla nowotworu lub selektywne czynniki, które mogą służyć jako biomarkery choroby, w tym zmutowane allele związane z nowotworem. TDE mogą uczestniczyć w przebudowie mikrośrodowiska guza, aby ułatwić rozwój guza i przerzuty oraz regulować reakcje przeciwnowotworowe¹². Zwiększone wydzielanie TDE jest powszechnym fenotypem większości nowotworów, a kilka cech mikrośrodowiska guza, w tym niedotlenienie, kwaśne pH i stan zapalny, sprzyja wydzielaniu egzosomów. Co zaskakujące, biorąc pod uwagę liczbę komórek wydzielających egzosomy, wzrost całkowitego poziomu egzosomów może sam w sobie funkcjonować jako biomarker raka. Na przykład niedawne badanie wykazało, że całkowite stężenie EV w soku żółciowym rozróżnia złośliwe i niezłośliwe u pacjentów ze wspólnym zwężeniem dróg żółciowych ze 100% dokładnością⁷. Podobne wyniki uzyskano w badaniach z użyciem innych płynów ustrojowych, w tym osocza. Jednak ze względu na możliwość zmienności w zależności od podmiotu i innych czynników zakłócających, większość badań nad egzosomami jako biomarkerami choroby koncentrowała się na wykrywaniu biomarkerów, które są selektywnie związane z TDE, a nie z całkowitą liczbą egzosomów.

Przeniesienie biomarkerów egzosomów do praktyki klinicznej pozostaje jednak wyzwaniem, ponieważ większość zgłoszonych metod testowania egzosomów wymaga czasochłonnych i pracochłonnych procedur izolacji ¹³. Obecnie popularne metody izolacji egzosomów obejmują ultrawirowanie, gradienty gęstości, wykluczanie wielkości, współstrącanie, wychwytywanie powinowactwa i izolację mikroprzepływową. Ultrawirowanie jest "złotym standardem" i jest najczęściej stosowane do izolacji egzosomów, ale ta procedura jest czasochłonna i powoduje uszkodzenie egzosomów i grupowanie błony egzosomów, a także wytwarza próbki egzosomów, które są zanieczyszczone białkami, lipoproteinami i innymi czynnikami, które mogą wpływać na późniejsze analizy¹⁴. Większość metod izolacji egzosomów, w tym ultrawirowanie, nie jest w stanie oddzielić egzosomów (30–150 nm) od mikropęcherzyków (100–1000 nm) i ciał apoptotycznych (100–5000 nm), które powstają w wyniku różnych mechanizmów i pełnią różne funkcje, ze względu na nakładanie się wielkości tych grup i różnorodność populacji egzosomów¹⁵. Potrzebne są nowe podejścia, aby poprawić czułość i odtwarzalność testów egzosomów poprzez poprawę odzyskiwania egzosomów przy jednoczesnym zmniejszeniu uszkodzeń i zanieczyszczeń egzosomów, chociaż wszelkie testy oparte na takich metodach będą również musiały zostać zoptymalizowane, aby nadawały się do translacji do zastosowań w warunkach klinicznych.

Kilka ostatnich badań zaproponowało wykorzystanie zintegrowanych platform do przechwytywania i analizowania egzosomów bezpośrednio z płynów ustrojowych. Metody te wykorzystują mikroprzepływowe, elektrokinetyczne, wychwytywanie powinowactwa i różne inne metody izolacji egzosomów oraz elektrochemii, powierzchniowego rezonansu plazmonowego i inne metody wykrywania wychwyconych egzosomów. Nie jest jasne, na ile wiele z tych podejść będzie wykonalnych w warunkach klinicznych ze względu na ich złożoność, koszty, niską przepustowość lub inne problemy.

Opracowaliśmy szybki i tani test, który może być używany do czułej i specyficznej kwantyfikacji całkowitych egzosomów i określonych podtypów egzosomów, w tym egzosomów związanych z chorobą, takich jak TDE, który wymaga tylko niewielkiej ilości próbki i który wykorzystuje usprawniony przepływ pracy odpowiedni dla środowisk klinicznych. W tym teście szkiełko jest pokryte przeciwciałami, które wiążą marker specyficzny dla egzosomu lub specyficzny dla choroby wyrażony na powierzchni egzosomu w celu bezpośredniego wychwycenia docelowych egzosomów obecnych w próbkach osocza lub surowicy o małej objętości nałożonych na studzienki na szkiełku. Uchwycone egzosomy są następnie hybrydyzowane z nanocząstką sprzężoną z przeciwciałem, która rozpoznaje biomarker zainteresowania na tych egzosomach, który może być ogólnym markerem egzosomu lub czynnikiem specyficznym dla podtypu egzosomu będącego przedmiotem zainteresowania. Obrazy tych studzienek na próbki są następnie rejestrowane za pomocą mikroskopu ciemnego pola (DFM) i analizowane w celu zmierzenia światła rozproszonego od nanocząstek związanych z interesującymi egzosomami uchwyconymi w każdej próbce studzienki^6,16,17. Warto zauważyć, że dobre obrazowanie całej próbki za pomocą DFM o małym powiększeniu (LMDFM) pozwala uniknąć błędu selekcji występującego w przypadku analiz DFM o dużym powiększeniu, gdy użytkownicy muszą bezpośrednio wybrać, które pola przechwycić do późniejszej analizy obrazu. Analiza obrazu LMDFM podlega artefaktom rozpraszania światła wynikającym z nierówności powierzchni, w tym zadrapań i resztek próbki, ale to tło można zredukować za pomocą prostego algorytmu redukcji szumów, który opracowaliśmy do uruchomienia w programie do analizy obrazu NIH, ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/). Algorytm ten najpierw stosuje wejściowy próg konturu, który jest używany do wykrywania granic studni próbki w celu zdefiniowania obszaru obrazu do późniejszej analizy. Obszar zdefiniowany przez ten obszar konturu jest następnie dzielony w celu oddzielenia sygnału obecnego w kanałach czerwonym, niebieskim i zielonym obrazu, a kanał niebieski jest odejmowany od kanału czerwonego, aby usunąć sygnał wynikający z artefaktów powierzchniowych i nierównomiernego oświetlenia z sygnału nanoprętowego.

Ten artykuł opisuje, jak używać tego testu do szybkiego ilościowego oznaczania całkowitych lub specyficznych poziomów egzosomów w próbkach osocza lub surowicy.

Protocol

1. Przygotowanie sond nanocząstek

UWAGA: Ten test wykorzystuje funkcjonalizowane nanopręty złota (AuNRs; średnica 25 nm x długość 71 nm), które są kowalencyjnie sprzężone z polimerami neutrawidyny (AV) i mają powierzchniowy pik rezonansu plazmonowego, który wytwarza czerwony (pik 641 nm) sygnał rozpraszający po oświetleniu DFM.

1. Przepłukać 40 μl AuNR-AV (2,56 x 10¹¹ cząstek) trzykrotnie 200 μl PBS (pH 7,0) przez odwirowanie i aspirację (8 500 x g w temperaturze 4 °C przez 10 minut), a następnie końcowy etap wirowania i aspiracji, po którym osad AuNR-AV zawiesza się w 40 μl PBS.
2. Zmieszać tę zawiesinę AuNR-AV z 10 μl biotynylowanego przeciwciała (0,5 mg/ml) specyficznego dla antygenu na powierzchni podtypu egzosomu będącego przedmiotem zainteresowania i 150 μl PBS, a następnie mieszać w temperaturze 4 °C przez 2 godziny za pomocą mieszalnika, aby umożliwić zakończenie wiązania neutrawityny-biotyny.
3. Otrzymane sprzężone z przeciwciałami AuNR (AuNR-IgG) przemyć trzykrotnie przez odwirowanie i aspirację (6 500 x g w temperaturze 4 °C przez 10 minut), a następnie zawiesić je w 200 μl PBS i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
   UWAGA: Należy stosować sterylną technikę i krótkie czasy przechowywania, aby uniknąć zanieczyszczenia i degradacji AuNR-IgG. Najlepiej jest stosować AuNR sprzężone z przeciwciałami w ciągu 24 godzin od ich koniugacji.

2. Przygotowanie slajdów do przechwytywania EV

1. Rozcieńczyć wybrane przeciwciała wychwytujące egzosomy do 0,025 mg/ml w PBS i dodać 1 μl/studzienkę tego rozcieńczenia na wielodołkowym szkiełku białkowym A/G, a następnie inkubować to szkiełko w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę w wilgotnej komorze, aby umożliwić wiązanie przeciwciała wychwytującego z białkiem A/G unieruchomionym na szkiełku.
2. Odessać studzienki w celu usunięcia niezwiązanych przeciwciał i przemyć studzienki trzykrotnie przez dodanie i aspirację 1 μl/basenik PBS, następnie załadować każdą studzienkę 1 μl buforu blokującego (patrz tabela materiałów) i inkubować szkiełko przez 2 godziny w temperaturze 37 °C w wilgotnej komorze w celu zablokowania wszelkich pozostałych miejsc wiązania białek.
3. Odessać studzienki w celu usunięcia buforu blokującego, umyć studzienki trzykrotnie przez dodanie i aspirację 1 μl / studzienkę PBS i natychmiast użyć zablokowanych szkiełek do wychwytywania i analizy egzosomów.

3. Przygotowanie krzywej standardowej

1. Aby dokładnie określić ilościowo bezwzględną lub względną obfitość określonego podtypu egzosomu, użytkownik musi wygenerować standardową krzywą z czystą populacją egzosomów, która jednolicie wyraża interesujący nas biomarker powierzchni egzosomu. W tym badaniu przeanalizowano obfitość egzosomów wyrażających białko błonowe związane z przerzutami, receptor Efryny A2, który ma zgłoszony związek ze stopniem zaawansowania raka trzustki i rokowaniem^6,18.
   UWAGA: Ludzka linia komórkowa raka trzustki PANC-1 i jej egzosomy są znane z ekspresji tego białka, a wyizolowane egzosomy z tej linii komórkowej wykorzystano do wygenerowania krzywej standardowej w celu ilościowego określenia liczby egzosomów, które wyrażają to białko w złożonych próbkach egzosomów.
2. Hodować komórki przez 48 godzin w temperaturze 37 °C w pożywkach hodowlanych bez surowicy, aby umożliwić akumulację egzosomów w pożywce, a następnie wyizolować supernatanty do hodowli komórkowych przez odwirowanie kultur zawiesinowych lub bezpośrednią aspirację pożywek hodowlanych z przylegających kultur komórkowych.
3. Odwirować zebrane podłoże o sile 2000 x g przez 30 minut w celu usunięcia zanieczyszczeń i odzyskania supernatantu.
4. Przefiltrować sklarowany supernatant kultury przez jednostkę filtrującą o niskiej zawartości wiązań białkowych o odpowiedniej pojemności 0,45 μm (np. jednostkę filtracji próżniowej z polieterosulfonu o pojemności 250 ml).
5. Zagęścić otrzymany filtrat przez odwirowanie przy 3200 x g przy użyciu systemu filtrów granicznych o nominalnej masie cząsteczkowej 100 000 do końcowej objętości 250 μl. Zbierz zatrzymaną objętość z tego filtra, a następnie umyj filtr 200 μl PBS i połącz tę objętość płukania z objętością zebranej próbki egzosomu.
6. Odwirować tę próbkę przy masie 21 000 x g przez 45 minut i ostrożnie odzyskać supernatant, uważając, aby nie zebrać żadnego wytrąconego materiału.
7. Odwirować odzyskany supernatant o stężeniu 100 000 x g przez 3 godziny, aby wytrącić egzosomy. Odessać supernatant i zebrać osad egzosomu w 100 μl PBS.
8. Powstałe zawiesiny egzosomów należy przechowywać w temperaturze 4 °C, jeśli zostaną użyte w ciągu 24 godzin, lub w temperaturze -80 °C do długotrwałego przechowywania.
   UWAGA: Nie poddawaj próbek egzosomów powtarzaniu cykli zamrażania i rozmrażania.
9. Określić ilościowo podwielokrotność zawiesiny egzosomu po zmieszaniu przez bezpośredni pomiar liczby egzosomów (np. przez analizę śledzenia nanocząstek lub przestrajalne wykrywanie impulsów rezystancyjnych lub przez pomiar stężenia białka w lizatach egzosomów za pomocą testu kwasu mikro-bicynkowego lub równoważnej metody, jako sposób na przybliżenie ilości egzosomu)^16,19.
10. Wygeneruj zestaw seryjnych rozcieńczeń zawiesiny egzosomu, aby umożliwić porównanie sygnału nanocząstek z liczbą wejściową egzosomu lub zawartością białka.
11. Przenieść 1 μl każdego wzorca egzosomu do każdej z jego kontrprób na płytce testowej.
    UWAGA: Krzywe standardowe można wykorzystać do obliczenia nachylenia linii korelacji między sygnałem nanocząstek a stężeniem egzosomów w celu (1) oceny wydajności testu i (2) określenia względnego stężenia docelowych egzosomów w próbkach eksperymentalnych.

4. Przetwarzanie próbek ludzkiego osocza lub surowicy

1. Pobrać próbki osocza lub surowicy standardowymi metodami i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu, gdy będą potrzebne do analizy egzosomów. Szybko rozmrozić próbki w łaźni wodnej o temperaturze pokojowej. Rozmrożone próbki należy kilkakrotnie mieszać metodą inwersji, aby uzyskać jednorodną zawiesinę.
   UWAGA: Wyniki próbek surowicy i osocza mogą nie być równoważne, ponieważ podczas reakcji krzepnięcia dochodzi do znacznego uwalniania egzosomów.
2. Odwirować próbki osocza lub surowicy o masie 500 x g przez 15 minut w celu wytrącenia agregatów białkowych i innych zanieczyszczeń. Przenieść podwielokrotność próbki osocza lub surowicy do świeżej probówki i dodać PBS w celu uzyskania rozcieńczenia 1:1. Wymieszać rozcieńczoną próbkę przez delikatne wirowanie lub odwrócenie, w zależności od przypadku. Przenieść 1 μl każdej zawiesiny osocza lub surowicy do każdej z kontrprób na płytce testowej.

5. Wychwytywanie i wykrywanie egzosomów

1. Załadować studzienki zablokowanego szkiełka wychwytującego EV 1 μl/studzienkę próbki egzosomu, stosując 8 powtórzeń na próbkę, i inkubować szkiełko przez noc w temperaturze 4 °C w wilgotnej komorze. Odessać wszystkie dołki na próbki, a następnie dodać 1 μl / studzienkę PBS, aby przemyć dołki i usunąć niezwiązane egzosomy i inne zanieczyszczenia z załadowanej próbki egzosomu.
2. Do studzienek na próbki należy załadować 1 μl/basenik uprzednio przygotowanej zawiesiny AuNR-IgG (patrz sekcja 1 powyżej) i inkubować szkiełko przez 2 godziny w temperaturze 37 °C w wilgotnej komorze. Zassać roztwór nanocząstek i przemyć szkiełko w PBS uzupełnionym 0,01% Tween-20 (PBST) przez 10 minut za pomocą mieszalnika, następnie odessać i przemyć wszystkie dołki próbki wodą dejonizowaną przez 10 minut za pomocą mieszalnika obrotowego i wysuszyć na powietrzu w celu późniejszego obrazowania LMDFM.
   UWAGA: Współczynniki zmienności między testami (CV) ocenia się na podstawie ośmiu powtórzeń tej samej próbki. Próbki, które wykazują CV >20%, są uważane za nieinformacyjne i należy je powtórzyć, jeśli jest wystarczająca próba.

6. Przechwytywanie obrazu DFM

1. Rejestruj obrazy w celu ilościowego oznaczania egzosomów przy stałym oświetleniu za pomocą kamery cyfrowej podłączonej do mikroskopu wyposażonego w kondensor ciemnego pola (1,2 < NA < 1,4) i obiektyw 4x o czasie naświetlania 1/220 s.
2. Otwórz oprogramowanie do przechwytywania obrazu.
   UWAGA: Używamy oprogramowania do obrazowania mikroskopowego NIS-Elements (patrz Tabela materiałów) dla protokołu opisanego poniżej, ale możliwe jest użycie innego oprogramowania, które może dopasować jego parametry przechwytywania obrazu. Oprogramowanie do obrazowania NIS-Elements Viewer to bezpłatny, samodzielny program do przeglądania plików obrazów i zestawów danych, który zawiera narzędzia do analizy, wizualizacji i archiwizacji. Poniższe parametry dotyczą również mikroskopu z autofokusem i zautomatyzowanym stolikiem, który umożliwia automatyczne przechwytywanie wielu obrazów i łączenie ich w jeden obraz.
3. Umieść szkiełko do góry nogami na stoliku mikroskopu, wyreguluj pozycję szkiełka i nałóż niewielką kroplę olejku immersyjnego na tył szkiełka, w miejscu, w którym soczewka skraplacza styka się ze szkiełkiem.
4. Kliknij przycisk na żywo w interfejsie oprogramowania i dobrze dostosuj czas ekspozycji do standardu wysokiego stężenia, aby upewnić się, że obraz nie jest nasycony.
5. Otwórz okno Skanuj duży obraz z zakładki Acquire (Pobieranie) i ustaw parametry interfejsu oprogramowania w następujący sposób: Macro Image Optical conf = current; Obiektyw: 2:10x, Skanowanie Konfiguracja optyczna = prąd, Obiektyw: 2:10x; Zakładka szwów = 20%; Zszywanie za pomocą = optymalna ścieżka.
6. Wybierz Utwórz duży obraz, Zamknij aktywną migawkę podczas ruchu sceny, Poczekaj przed każdym zrobieniem zdjęcia: 20 ms, Ustaw ostrość ręcznie na początku i Użyj ostrości krok po kroku co 20 pól. Te ustawienia zostaną zapisane wraz z zeskanowanymi obrazami.
7. Przesuń stolik mikroskopu, aby zdefiniować lewy, górny, prawy, dolny limit pola skanowania docelowego. Dostosuj ostrość, aby uzyskać wyraźny obraz na monitorze, a w razie potrzeby dostosuj ustawienia kondensora i oświetlenie otoczenia, aby zminimalizować wszelkie nieprawidłowości oświetlenia w ostrym obrazie.
8. Nazwij plik wyjściowy obrazu w oprogramowaniu. Kliknij przycisk Skanuj i pozwól mikroskopowi na skanowanie oraz utworzenie i zapisanie zszytego obrazu całego preparatu.
9. Otwórz zapisany obraz za pomocą używanego oprogramowania do przechwytywania obrazu i zapisz go w skali 1/8 do późniejszej analizy we wtyczce DSM w ImageJ.

7. Analiza obrazu DFM

1. Pobierz program ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/). Zainstaluj wtyczkę algorytmu DSM w ImageJ, postępując zgodnie z instrukcjami podanymi na stronie https://imagej.net/Plugins#Installing_plugins_manually.
2. Otwórz oprogramowanie ImageJ, a następnie ustaw następujące parametry wejściowe w algorytmie DSM: Próg konturu (Ct) = 253,020, Typ = Czerwony, Skala środkowa (S) = 0,8, Dolna (Lt)/Wysoka (Ht) granica kwantyfikacji = 0/62.
3. Otwórz zapisany obraz z sekcji 6.8 za pomocą ImageJ. Wybierz przycisk Skanowanie DSM na karcie Wtyczki, a następnie zdefiniuj liczbę kolumn i wierszy zgodnie z otwartym obrazem. Program może automatycznie rozpoznawać obszary wykrywania i analizować intensywność rozpraszania nanocząstek w odpowiednich obszarach. Ustaw następujące parametry wejściowe w oknie DSM Scan: Procent zmiany rozmiaru = 25, Średnica plamki (w pikselach) = 190 – 200, Zakres średnic = 32, Przyrost średnicy (w pikselach) = 8, Konfiguracja DSM — dolny limit = 0, Górny limit = 62, Sąsiednia odległość = 100, Odejmij odchylenie = 0,
   UWAGA: Wyniki intensywności rozpraszania nanocząstek odzwierciedlają ilość związanych egzosomów na szkiełku.

Results

Preparaty pokryte białkiem wielodołkowym A/G (Figura 1A) zostały funkcjonalizowane przeciwciałem anty-EphA2, a następnie użyte do specyficznego wychwytywania egzosomów EphA2-dodatnich z próbek surowicy pacjentów z rakiem trzustki i bez niego (1 μL/dołek) i inkubowane z nanoprętami złota sprzężonymi z przeciwciałem anty-CD9 (Rysunek 1B). Obrazy DFM światła rozproszonego od tych nanocząstek analizowano za pomocą wtyczki DSM w oprogramowaniu ImageJ w celu ilościowego określenia związanych egzosomów EphA-2 dodatnich w każdym dołku. Algorytm DSM automatycznie definiuje granicę studzienki próbki, filtruje szum z artefaktów, oblicza rozproszony sygnał z każdej studzienki i wyprowadza tę informację (Rysunek 2). Algorytm DSM silnie tłumi artefakty rozpraszania światła spowodowane zadrapaniami lub zanieczyszczeniami obecnymi w próbce oraz poprawia czułość i odtwarzalność wykrywania nanocząstek oraz może automatycznie przetwarzać partię obrazów slajdów w celu wykorzystania ich z wysoką przepustowością. Algorytm ten wykorzystuje polecenia ImageJ i parametry wprowadzone przez użytkownika do odejmowania tła obrazu, obliczania sygnału rozpraszania z każdego dołka i wyprowadzania pliku danych i obrazu (Rysunek 3). Obszary zainteresowania są definiowane przez granice studzienek o wysokiej intensywności na przechwytywanym obrazie przy użyciu funkcji progu konturu programu makr ImageJ. Analizy obrazu wykorzystują predefiniowany próg konturu i parametry obrazu do obliczenia intensywności rozpraszania nanocząstek dla każdego dołka.

Jak podano w naszej poprzedniej pracy (dodatkowe informacje Liang et al.⁶), egzosomy wyizolowane z hodowli komórkowych PANC-1 charakteryzujące się transmisyjną mikroskopią elektronową i Western blot wykazywały zakres wielkości, morfologię i ekspresję markerów białkowych zgodną z próbką egzosomu o wysokiej czystości. Egzosomy PANC-1, przygotowane przy użyciu tej samej procedury, co nasze poprzednie prace, zostały tutaj wykorzystane do walidacji naszego testu nPES do kwantyfikacji egzosomów. W teście tym wykorzystano przeciwciało anty-EphA2 w celu wychwycenia dużej populacji egzosomów z całej populacji egzosomów oraz przeciwciało przeciwko ogólnemu białku egzosomu CD9 w celu wykrycia wychwyconych egzosomów. Wyniki uzyskane przy użyciu seryjnie rozcieńczonych próbek egzosomów PANC-1, o stężeniach białka w zakresie od 0,24 do 1,2 μg/μL, wykazały dobrą odtwarzalność w dołkach replikowanych (Rysunek 4A) i silną liniową korelację między odpowiedzią rozproszenia a stężeniem białka egzosomu (Figura 4B).

Aby zademonstrować potencjalne zastosowanie tej metody, próbki surowicy od pacjentów z rakiem trzustki i bez niego zostały przeanalizowane w celu wykrycia obfitości egzosomów w surowicy wyrażających związany z rakiem biomarker EphA2, używając przeciwciała anty-EphA2 do bezpośredniego wychwytywania docelowych egzosomów z surowicy i nanocząstek sprzężonych z przeciwciałem anty-CD9 w celu wykrycia związanych egzosomów. Analiza ta wykazała, że próbki surowicy od pacjentów z rakiem trzustki miały znacznie wyższy poziom egzosomów EphA2 + (Ryc. 5) niż ich kontrole.

Rysunek 1: Schemat kwantyfikacji egzosomów. (A) Schemat wielodołkowych szkiełek białkowych A/G (192 dołki) użytych w tym teście. (B) Docelowe egzosomy są bezpośrednio wychwytywane z próbek, w tym surowicy i osocza, poprzez unieruchomienie powierzchni przeciwciała wychwytującego (np. przeciwciała anty-EphA2) związanego ze szkiełkiem, a następnie inkubowane z nanoprętami złota sprzężonymi z przeciwciałem wykrywającym (np. przeciwciałem anty-CD9) przed analizą za pomocą analizy obrazu DFM. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Kwantyfikacja egzosomów poprzez zastosowanie algorytmu DSM do obrazów LMDFM. Obrazy o małym powiększeniu są przetwarzane za pomocą algorytmu DSM w celu wyeliminowania sygnału tła i artefaktów sygnału, które mogą powstać w wyniku zadrapań, mieszania pustek, zanieczyszczeń i nierównomiernego oświetlenia próbki, aby umożliwić niezawodne wykrywanie sygnału złotego nanopręta, który koreluje ze stężeniem egzosomu. Rysunek ten został zaadaptowany za zgodą Sun, D. et al. Noise Reduction Method for Quantifying Nanoparticle Light Scattering in Low Magnification Dark-Field Microscope Far-Field Images. Chemia analityczna. 88 (24), 12001-12005 (2016). Prawa autorskie (2016) Amerykańskie Towarzystwo Chemiczne. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Schemat poleceń i wyjść algorytmu DSM. Wskazane kroki wykorzystują natywne polecenia z ImageJ, a wszystkie parametry wejściowe są wybierane zgodnie z wymaganiami eksperymentów za pomocą graficznego interfejsu użytkownika. Rysunek ten został zaadaptowany za zgodą Sun, D. et al. Noise Reduction Method for Quantifying Nanoparticle Light Scattering in Low Magnification Dark-Field Microscope Far-Field Images. Chemia analityczna. 88 (24), 12001-12005 (2016). Prawa autorskie (2016) Amerykańskie Towarzystwo Chemiczne. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Reprezentatywne obrazy LMDFM nPES i dane wyjściowe DSM. (A) obraz LMDFM testu nPES analizującego gradient stężeń egzosomów PANC-1 oraz (B) liniowa korelacja sygnału optycznego i stężenia egzosomów z tego slajdu (od lewej do prawej: odpowiednio 0,24, 0,356, 0,53, 0,80, 1,20 μg/μL dla każdej kolumny). Dane przedstawiono jako Mean±SE, n=6, ze współczynnikiem korelacji Pearsona R² = 0,99 i współczynnikiem zmienności dla kontrprób każdego stężenia < 0,2. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 5: Sygnał LMDFM egzosomów EphA2 ⁺ różni się w surowicy od pacjentów z rakiem trzustki i bez niego. Próbki surowicy analizowane przez nPES przy użyciu przeciwciała wychwytującego anty-EphA2 (związanego z rakiem) i przeciwciała wykrywającego anty-CD9 (ogólny marker egzosomu) wykazały istotną różnicę w stężeniu egzosomów EphA2 + w próbkach surowicy pacjentów z rakiem trzustki i bez niego (N = 7 / grupa). Wyniki przedstawiono jako Mean±SE. **p = 0,002 w teście U-Manna-Whitneya (dwustronnym). Ten rysunek został zmodyfikowany na podstawie [Sun, D. et al. Noise Reduction Method for Quantifying Nanoparticle Light Scattering in Low Magnification Dark-Field Microscope Far-Field Images. Chemia analityczna. 88 (24), 12001-12005 (2016)]. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

Egzosomy powstają w wyniku regulowanych wgłębień zewnętrznej błony endosomu, które wytwarzają ciała wielopęcherzykowe, wyspecjalizowany podzbiór endosomów, które zawierają dużą liczbę pęcherzyków śródświetlnych, które ulegają fuzji z błoną plazmatyczną, aby uwolnić dojrzałe egzosomy do przestrzeni zewnątrzkomórkowej. Ze względu na ten szlak biogenezy egzosomy mogą przenosić czynniki związane z błoną związaną z frakcjami błonowymi, które zawierają lub łączą się z błoną endosomu, a także wiele różnych typów składników cytozolowych, a tym samym zawierać ładunki białek, DNA i różnych podtypów RNA (mRNA, mikroRNA, długie niekodujące RNA), które mogą odzwierciedlać fenotyp ich komórki pochodzenia²⁰. Ponieważ egzosomy są wydzielane przez większość, jeśli nie wszystkie typy komórek, mogą wykazywać zwiększone wydzielanie z komórek chorych lub złośliwych i gromadzić się w większości płynów ustrojowych, egzosomy są przedmiotem kompleksowych i systematycznych badań jako obiecujący minimalnie inwazyjny sposób wykrywania określonych stanów chorobowych i monitorowania ich odpowiedzi na leczenie²¹.

Izolacja egzosomów, która jest wymagana w większości obecnych analiz egzosomów, jest długotrwałą i pracochłonną procedurą, ograniczającą kliniczną translację biomarkerów związanych z egzosomami o potencjalnym znaczeniu medycznym. Wiele powszechnych metod izolacji (ultrawirowanie, wykluczanie wielkości, wytrącanie itp.) często nie odróżnia wystarczająco egzosomów (30–100 nm) od mikropęcherzyków (100–1000 nm) i ciał apoptotycznych (100–5000 nm) ze względu na nakładanie się ich zakresów wielkości lub właściwości fizycznych lub może uszkodzić integralność egzosomów¹⁵. Opracowywane są nowe podejścia, które mogą pozwolić na szybsze analizy egzosomów, ale nie jest jasne, na ile wykonalne może być wdrożenie wielu z tych platform w warunkach klinicznych ze względu na to.

W tym raporcie przedstawiamy nowatorskie podejście, które umożliwia wysokoprzepustową kwantyfikację egzosomów w oparciu o nanocząstki przy użyciu obrazów mikroskopowych ciemnego pola o małym powiększeniu. Metoda ta nie wymaga oczyszczania egzosomów, drogiego dedykowanego sprzętu ani nowatorskiej wiedzy technicznej, a zatem powinna być podatna na szybkie tłumaczenie w większości warunków badawczych i klinicznych. Nasz test można zastosować do precyzyjnego ilościowego określenia stężenia docelowej populacji egzosomów zawierających określony biomarker, gdy wyniki testu są porównywane z krzywą standardową, ponieważ nasze wyniki pokazują, że istnieje silna korelacja liniowa (R² = 0,99) między odpowiedzią optyczną a stężeniem egzosomu. Aby zademonstrować rzeczywisty potencjał tego podejścia, dostarczyliśmy dane, w których zastosowaliśmy tę metodę do ilościowego określenia stężenia biomarkera egzosomu związanego z rakiem trzustki w próbkach surowicy uzyskanych od pacjentów z rakiem trzustki i bez niego.

W LMDFM cała studzienka próbki jest obrazowana, aby uniknąć błędu selekcji występującego w analizach DFM o dużym powiększeniu, w których użytkownicy muszą bezpośrednio wybrać pola próbki do przechwycenia do późniejszej analizy obrazu, ale podlega artefaktom rozpraszania światła z nierówności powierzchni, w tym zadrapań i resztek próbki. To tło można zredukować, aby wykryć sygnał pochodzący z docelowego egzosomu za pomocą naszego algorytmu redukcji szumów DSM, który działa w programie do analizy obrazu NIH, ImageJ, ale nadal należy zachować ostrożność, aby uniknąć wprowadzania takich artefaktów, które mogą zmniejszyć zakres dynamiczny testu.

Materiały użyte w tym teście:

Wielodołkowe szkiełka SuperProtein A/G zawierające 1 μl/studzienkę zakupiono od Arrayit Corporation (AGMSM192BC). Nanocząstki uzyskano z Nanopartz (C12-25-650-TN-DIH-50-1, 6,4 x 10¹²/mL). Zdjęcia DFM zostały wykonane aparatem cyfrowym Nikon DiR2 podłączonym do mikroskopu Nikon Ti-Eclipse, przy stałym oświetleniu i czasie naświetlania 1/220 s. Linia komórkowa PANC-1 wykorzystana w tym badaniu została zakupiona z American Type Culture Collection.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Eppendorf Repeater stream	Fisher Scientific	05-401-040
Eppendorf Research plus	Eppendorf	3120000011	0.1 – 2.5 µ L, ciemnoszary
Funkcjonalizowane złote nanopręty	Nanopartz	C12-25-650-TN-DIH-50-1	Funkcjonalizacja polimeru neutrawidyny in vitro
Mieszalnik próbek HulaMixer	Thermo Fisher Scientific	15920D
Wytrząsarka 10L	Benchmark Scientific	H1010
Odwrócony mikroskop badawczy	Nikon	Ti-DH	Z kondensatorem ciemnego pola, kamerą DS-Ri2 i uniwersalnym uchwytem Ti-SH-U oraz zmotoryzowanym stolikiem
Oprogramowanie do obrazowania mikroskopem	NIS-Elements	Nikon
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (1X)	GE Healthcare Life Sciences	SH30256.02	Hyclone
Protein A/G Glass Substrate Slides	Arrayit Corp.	AGMSM192BC	Wysokiej jakości podłoże mikromacierzy
Q500 Sonicator	Qsonica, LLC	Q500-110	Ze standardową sondą (#4220)
Bufor blokujący superblok	Thermo Scientific
TWEEN 20	Sigma Life Sciences	9005-64-5