Połączone ekstrakcje nukleotydów i białek w Caenorhabditis elegans

Summary

Tutaj prezentujemy protokół izolacji RNA, DNA i białka z tej samej próbki, w celu zmniejszenia zmienności, poprawy odtwarzalności i ułatwienia interpretacji.

Abstract

Pojedyncza próbka biologiczna zawiera mnóstwo informacji, a obecnie powszechną praktyką jest jednoczesne badanie kilku makromolekuł, aby uzyskać pełny obraz wielu poziomów przetwarzania molekularnego i zmian między różnymi warunkami. Protokół ten przedstawia metodę izolowania DNA, RNA i białka z tej samej próbki nicienia Caenorhabditis elegans w celu usunięcia zmienności wprowadzonej, gdy te biomolekuły są izolowane z powtórzeń podobnie traktowanych, ale ostatecznie różnych próbek. Kwasy nukleinowe i białko ekstrahuje się z nicieni metodą ekstrakcji kwasem tiocyjanian-fenol-chloroform guanidyny, a następnie wytrąca, przemywania i rozpuszczania każdego z nich. Pokazujemy udaną izolację RNA, DNA i białka z pojedynczej próbki z trzech szczepów nicieni i komórek HeLa, z lepszymi wynikami izolacji białek u dorosłych zwierząt. Dodatkowo, białko ekstrahowane tiocyjanianem guanidyny-fenolem-chloroformem z nicieni poprawia rozdzielczość większych białek, z lepszymi wykrywalnymi poziomami, co obserwuje się za pomocą immunoblottingu, w porównaniu z tradycyjną ekstrakcją białka RIPA.

Przedstawiona tutaj metoda jest przydatna podczas badania próbek przy użyciu podejścia multiomicznego, szczególnie do badania proteomu i transkryptomu. Techniki, które jednocześnie oceniają multiomikę, są atrakcyjne, ponieważ uważa się, że sygnalizacja molekularna leżąca u podstaw złożonych zjawisk biologicznych zachodzi na uzupełniających się poziomach; jednak coraz częściej można zaobserwować, że zmiany poziomów mRNA nie zawsze odzwierciedlają tę samą zmianę poziomu białka i że czas pobrania jest istotny w kontekście regulacji okołodobowych. Ta metoda usuwa wszelkie różnice między próbkami podczas oznaczania różnych zawartości w tej samej próbce (śródpróbce).

Introduction

Multiomika, podejście analityczne, które wykorzystuje kombinację omiki, takiej jak genom, proteom, transkryptom, epigenom, mikrobiom lub lipidom, staje się coraz bardziej popularne podczas przetwarzania dużych zbiorów danych w celu charakterystyki choroby^1,2. Coraz więcej dowodów pokazuje, że ograniczenie podejścia do pojedynczego "ome" zapewnia niekompletną analizę molekularną (zrecenzowaną przez Rotroffa i Motsingera-Reif¹). Generowane są duże zbiory danych, szczególnie w przypadku wykonywania badań przesiewowych przy użyciu technik o wysokiej przepustowości, ale w celu nakreślenia pełnego obrazu lub zidentyfikowania najistotniejszych celów preferowane są podejścia multiomiczne. Jednak przy zastosowaniu podejść multiomicznych często obserwuje się rozbieżności między poziomem mRNA a poziomem białka^3,4,5,6. Warto zauważyć, że mRNA i białko używane do równoległych analiz transkryptomicznych i proteomicznych z sekwencjonowaniem RNA (RNAseq) i chromatografią cieczową z tandemową spektrometrią mas (LC-MS/MS) są często uzyskiwane z podobnie traktowanych próbek z różnych powtórzeń, potencjalnie wprowadzając różnice między tymi samymi warunkami^3,4,5,6. Harvald i in. przeprowadzili eleganckie badanie przebiegu głodu C. elegans, w którym porównali transkryptom i proteom robaków typu dzikiego (WT) z transkryptomem i proteomem zmutowanych robaków hlh-30, które nie mają ważnego czynnika transkrypcyjnego w długowieczności⁷. Warto zauważyć, że RNA i białko zostały zebrane z tych samych replik warunków, a więc nie z tej samej próbki. Ich odkrycia wskazują na niską korelację między poziomami mRNA a poziomami białka w każdym punkcie czasowym (r = 0,559 do 0,628). W rzeczywistości ich mapa cieplna utworzyła cztery klastry: Klaster I miał duży spadek poziomu mRNA, ale niewielki lub żaden spadek odpowiadających mu poziomów białka, Klaster II miał niewielki lub żaden wzrost poziomu mRNA, ale wzrost poziomu białka, Klaster III miał wzrost poziomu mRNA, ale spadek poziomu białka, a Klaster IV miał wzrost poziomu mRNA, ale tylko subtelną zmianę poziomu białka⁴. Ponadto taka zmienność między próbkami może być wprowadzona w przypadkach, gdy próbki tego samego stanu nie są pobierane dokładnie w tym samym czasie. Na przykład mRNA i białka regulowane przez cykl okołodobowy zmieniają się w zależności od pory dnia^8,9, a dokładniej ekspozycji C. elegans na światło⁹; Ekspresja tych białek okołodobowych może być opóźniona do 8 godzin po indukcji ekspresji genów¹⁰. Niemniej jednak rozpowszechnienie tej obserwacji niekoniecznie oznacza, że jest ona błędna; W rzeczywistości może się to okazać pouczające. Białko i mRNA są w stałym stanie dynamicznym między powstawaniem a degradacją. Co więcej, białka są często modyfikowane potranslacyjnie w celu zwiększenia stabilności lub wywołania ich degradacji¹¹. Na przykład ich status ubikwitynacji może prowadzić do aktywacji lub kierowania do proteasomu lub lizosomu w celu degradacji¹². Dodatkowo, niekodujące RNA odgrywają ważną rolę w regulacji ekspresji genów na etapie transkrypcji i posttranskrypcji¹³. W związku z tym pojawia się pytanie, jak ograniczyć zmienne, aby potwierdzić, że rozbieżności, które obserwujemy w tych badaniach nad nicieniami, są prawdziwe.

Tutaj proponujemy metodę, która usuwa zmienną międzypróbkową, umożliwiając analizę różnych makrocząsteczek z tej samej próbki. Celem tego protokołu jest zaoferowanie metody konsekwentnego izolowania DNA, RNA i białka z pojedynczej próbki C. elegans (określanej również jako robaki) w celu zmniejszenia zmienności, poprawy odtwarzalności i ułatwienia interpretacji. Dodatkowe korzyści płynące z używania tej samej próbki obejmują oszczędność czasu i zasobów podczas pobierania próbek, ułatwienie analizy przekrojowej cennych i ograniczonych próbek, w tym szczepów, które są trudne do uprawy i utrzymania, oraz uzyskanie wglądu w różnicową regulację makrocząsteczek w oparciu o zmiany mRNA i poziomów białka w obrębie próbki.

Ta metoda jest odpowiednia do oceny ekspresji genów i poziomów białek z pojedynczej próbki robaków, co pozwala na bardziej wszechstronną ocenę wielu poziomów przetwarzania molekularnego. Odczynnik do tiocyjanianu guanidyny-fenolu-chloroformu (GTCp)¹⁴, powszechnie stosowana substancja chemiczna do izolacji RNA, jest używana do ekstrakcji kwasów nukleinowych i białek z robaków, a następnie wytrącania, mycia i rozpuszczania każdego z nich. Ten protokół jest kompilacją różnych protokołów^15,16 z niewielkimi modyfikacjami, zaprojektowanymi z naciskiem na C. elegans, ale udało nam się również wyizolować RNA, białko i DNA z osadu komórek HeLa, wykonując te same kroki. Chociaż nie został tutaj przetestowany, ten protokół prawdopodobnie będzie działał również na tkankach^17,18.

Protocol

UWAGA: Każdy etap wytrącania makromolekuł jest wykonywany sekwencyjnie, po którym następują równoczesne płukanie; jednak zaleca się najpierw dokończenie izolacji RNA, ponieważ jest ona wewnętrznie niestabilna.

1. Pobieranie próbek

1. Wysiewaj 1 000 jaj robaków na 10 cm talerzu w odpowiednich warunkach wzrostu¹⁹. Inkubować w temperaturze 20 °C przez 72 h.
   nuta: Wybielaj dorosłe osoby niosące jaja w celu zebrania jaj, jak opisano wcześniej¹⁹.
2. Umyj płytkę około 5 ml buforu M9 i zbierz 1 000 dorosłych robaków do probówki.
   nuta: Bufor M9 składa się z 35 mM dwuzasadowego fosforanu sodu, 102 mM chlorku sodu, 22 mM jednozasadowego fosforanu potasu i 1 mM siarczanu magnezu w sterylnej wodzie¹⁹.
3. Odwirować robaki przy 1 000 x g przez 1 minutę, wyrzucić supernatant i przenieść granulowane robaki z 1 ml buforu M9 do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
4. Ponownie odwirować przy 845 x g przez 1 minutę i wyrzucić większość supernatantu. Granulowane robaki należy przechowywać w temperaturze -80 °C przez co najmniej 4 godziny < br /> nuta: Użycie mrożonego granulatu daje wyższy plon niż świeży pellet. W przypadku stosowania świeżego granulatu zaleca się serię cykli zamrażania/rozmrażania przy użyciu ciekłego azotu lub 95% etanolu na suchym lodzie w celu rozbicia naskórka robaka. Pozostawienie niewielkiej ilości M9 na granulce pomoże rozbić naskórek podczas zamrażania.

2. Izolacja nukleotydów i białek

1. Usunąć jakikolwiek supernatant z rozmrożonego osadu i dodać 1 ml zimnego odczynnika GTCp. Dobrze wymieszaj, pipetując w górę i w dół. Umieść próbkę na lodzie na 10 minut i od czasu do czasu mieszaj, odwracając ją do góry nogami.
   ostrożność: Fenol jest, neurotoksyczny i wysoce toksyczny i może powodować oparzenia chemiczne i ślepotę.
   nuta: Użyliśmy do 5 000 dorosłych robaków jako materiału wyjściowego przy zgłoszonych ilościach; każda objętość opiera się na użyciu 1 ml odczynnika GTCp. W przypadku korzystania z większej próbki może być konieczne zwiększenie skali.
2. Do roztworu robaków i GTCp dodać 200 μl zimnego chloroformu. Trzymaj probówkę między palcami i energicznie potrząsaj przez 15 sekund. Pozostaw w temperaturze pokojowej (RT) na 3 min.
   ostrożność: Chloroform jest toksycznym środkiem drażniącym, może powodować owrzodzenia skóry i inne uszkodzenia narządów oraz jest możliwym czynnikiem rakotwórczym.
3. Odwirować probówkę o stężeniu 13 500 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
   nuta: Po tym wirowaniu powstają trzy warstwy: górna, przezroczysta faza wodna, dolna, różowa faza organiczna i mała, mętna interfaza, która zawiera lipidy i DNA.
4. Za pomocą mikropipety przenieś przezroczystą górną warstwę (fazę wodną) do nowej, wolnej od RNaz probówki do mikrowirówki (probówka A) o pojemności 1,5 ml, aby wyizolować RNA poprzez wytrącanie alkoholu (jak opisano w kroku 2.5) i przenieść różową warstwę (fazę organiczną) z pozostałego osadu do nowej probówki (probówki B) i umieścić ją na lodzie.
   nuta: Różową fazę organiczną można zamrozić w temperaturze -80 °C do czasu wyizolowania DNA i białka z tej próbki. Większe próbki stworzą grubą białą warstwę między fazą wodną a organiczną. Ta frakcja zawiera DNA. Jeśli tę warstwę można usunąć bez naruszania innych faz, zrób to i umieść ją w osobnej tubie (probówce B2).
5. Wyizoluj RNA w następujący sposób.
   1. Z klarownej fazy wodnej w probówce A wytrącić RNA za pomocą 500 μl 100% izopropanolu. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie odwirować probówkę A o sile 13 500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
      nuta: Na dnie probówki powinna być widoczna mała biała osadka RNA.
   2. Zdekantować większą część supernatantu. Resztę usunąć za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml z igłą i wyrzucić supernatant.
      nuta: Rozmiar igły nie jest ważny; Jednak większy rozstaw igieł zapewni większą kontrolę, aby nie zakłócać śrutu. Mikropipeta może być użyta, jeśli igły nie są dostępne.
   3. Dodaj 1 ml 75% etanolu do probówki A, aby umyć osad. Wirować probówkę o wymiarach 5 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
   4. Usunąć supernatant z osadu przez dekantację i użyć strzykawki o pojemności 1 ml z igłą, jak opisano w kroku 2.5.2, i wyrzucić go.
   5. Pozostaw granulkę do wyschnięcia na powietrzu przez 5–10 minut, ale nie pozwól jej przeschnąć. Użyj 50 μl wody wolnej od RNaz, aby rozpuścić osad RNA, zanim stanie się całkowicie przezroczysty.
      nuta: Jest to wystarczająca objętość początkowa dla 1,000–3,000 robaków, ale może być konieczne dostosowanie w zależności od ilości użytego materiału wyjściowego.
   6. Inkubować osad w temperaturze 55–60 °C przez 10 minut, aby go rozpuścić.
   7. Zmierzyć stężenie i czystość za pomocą spektrofotometru. Zapisać absorbancję przy 260 nm dla stężenia RNA oraz przy 230 i 280 nm w celu zidentyfikowania wszelkich zanieczyszczeń.
   8. Oczyść RNA w celu usunięcia wszelkich zanieczyszczeń, takich jak pozostałości fenolu lub DNA, albo poprzez oczyszczanie kolumny, albo poprzez późniejsze płukanie etanolem i obróbkę DNazą.
      nuta: W tym momencie RNA jest gotowe do wysłania do analizy RNAseq lub może być użyte do wytworzenia cDNA do wykorzystania w RT-qPCR (szczegółowe informacje znajdują się w sekcji 3.1). RNA może być przechowywane w temperaturze -80 °C do czasu dalszego wykorzystania.
6. Wyizoluj DNA w następujący sposób.
   1. Z różowej fazy organicznej w probówce B i próbki w probówce B2, jeśli występuje, wytrącić DNA, dodając 300 μl 100% etanolu i wymieszać przez inwersję. Pozostaw probówkę (rurki) w pozycji RT na 2–3 minuty.
   2. Odwirować probówki B i B2 o masie 375 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia DNA.
   3. Przenieść supernatant z probówek B i B2, wlewając go do nowej probówki C o pojemności 2 ml i pozostawić na lodzie w celu późniejszej izolacji białka. Przemyć osad DNA w probówce B lub B2 1 ml 0,1 M cytrynianu sodu w 10% etanolu przez 30 minut. Probówki B i B2 o masie 375 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C.
      nuta: Sód wiąże się ze szkieletem DNA, dzięki czemu DNA łatwiej wytrąca się w cytryninie sodu i etanolu, umożliwiając usunięcie zanieczyszczeń przez wirowanie z niską prędkością.
   4. Powtórz etap prania zgodnie z opisem w kroku 2.6.3. Ponownie zawiesić osad w 1,5 ml 75% etanolu i pozostawić go w temperaturze pokojowej na 20 minut, od czasu do czasu mieszając przez wywrócenie do góry nogami.
   5. Probówkę B i B2 przy 375 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
   6. Wyrzuć supernatant i pozostaw do wyschnięcia na 5–10 minut.
   7. Rozpuścić osad w 150 μl 8 mM wodorotlenku sodu. W razie potrzeby dostosuj do żądanego pH za pomocą HEPES. Wirować próbkę w temperaturze 375 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
   8. Za pomocą mikropipety przenieś supernatant (DNA) do nowej probówki. Zmierzyć stężenie i określić czystość za pomocą spektrofotometru. Zapisać absorbancję przy 260 nm dla stężenia DNA oraz przy 230 i 280 nm w celu zidentyfikowania wszelkich zanieczyszczeń.
7. Wyizoluj białko w następujący sposób.
   1. Aby wytrącić białko, dodaj do 1,5 ml 100% izopropanolu do różowego supernatantu w probówce C, wymieszaj przez kilkakrotne odwrócenie i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
   2. Probówka wirówkowa C o masie 13 500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
   3. Odrzucić supernatant i przemyć osad 2 ml 0,3 M chlorowodorku guanidyny w 95% etanolu przez 20 minut w temperaturze pokojowej stężenia. Probówkę C odwirować przy 5 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
   4. Powtórz krok prania zgodnie z opisem w kroku 2.7.3 2x.
   5. Przenieś granulkę białka do nowej probówki o pojemności 1,5 ml (probówka C2) i dodaj do 1,5 ml 95% etanolu. Wiruj i pozostaw w temperaturze RT przez 20 minut.
   6. Probówkę wirówkową C2 o stężeniu 5 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i pozostawić osad do wyschnięcia na 10 minut w temperaturze pokojowej. Rozpuścić osad w 300 μl 5% SDS w temperaturze 50 °C przez 60 min.
      UWAGA: Do całkowitego rozpuszczenia osadu białkowego może być wymagany dłuższy czas inkubacji. W przeszłości granulat był inkubowany do 6 godzin bez utraty jakości.
   7. Probówkę wirówkową C2 o sile 13 500 x g przez 10 minut w temperaturze 17 °C. Przenieść supernatant do nowej probówki.
   8. Zmierzyć stężenie przy użyciu preferowanego testu ilościowego białka, który jest zgodny z detergentem.
      nuta: Białko jest gotowe do użycia w SDS-PAGE i western blotting. Może być przechowywany w temperaturze -20 °C do wykorzystania w przyszłości. W przypadku innych technik, takich jak LC-MS/MS, detergent będzie musiał zostać dializowany.

3. Ocena poziomów mRNA i białka

1. RT-qPCR (Protokół RT-qPCR)
   1. Przygotować cDNA przez odwrotną transkrypcję z 1 ng RNA, stosując następujący protokół termocyklera: torowanie (5 min w 25 °C), odwrotna transkrypcja (20 min w 46 °C) i inaktywacja RT (1 min w 95 °C).
   2. Przygotuj podstawową płytkę cDNA, dodając 100 μl rozcieńczeń 1:100 każdej próbki cDNA do indywidualnych dołków 96-dołkowej płytki. Uwzględnij odpowiednie kontrole, takie jak studzienki bez matrycy/tylko z wodą oraz seryjnie rozcieńczane próbki od 1:25 do 1:400 (pochodzące z połączonego cDNA ze wszystkich analizowanych próbek), aby umożliwić krzywą standardową ustalenie wydajności startera dla każdego analizowanego genu.
      nuta: Format ten może być używany z 96-dołkowym mikrodozownikiem, który umożliwia przeniesienie wszystkich próbek z płytki na płytkę RT-qPCR i złagodzenie zmian w pipetowaniu między studzienkami. Odpowiednią mieszankę wzorcową (np. SYBR + startery) można następnie dodać do każdej studzienki za pomocą pipety wielokanałowej. Ogólnie rzecz biorąc, takie podejście zmniejsza liczbę błędów wprowadzanych podczas ręcznego pipetowania każdej próbki, co jeszcze bardziej zmniejsza zmienność.
   3. Dodać 3 μl cDNA z płytki podstawowej do dołków płytki RT-qPCR.
   4. Przygotuj mieszankę wzorcową dla każdego zestawu starterów, który zawiera 1x supermix zawierający barwnik cyjaninowy interkalujący DNA, po 5 μM starterów do przodu i do tyłu oraz wodę do 7 μl na próbkę. Dodać 7 μl do odpowiednich dołków płytki RT-qPCR i lekko zamieszać, aby wymieszać.
      nuta: Dołącz próbki do pomiaru genów porządkowania, aby użyć ich jako odniesienia do normalizacji wyników²⁰.
   5. Uruchomić płytkę przy użyciu protokołu RT-qPCR, który jest odpowiedni dla używanych starterów.
2. Western blot
   nuta: Szczegółowe informacje na temat zachodnich plam można znaleźć w Mahmood and Yang²¹.
   1. Przygotować próbki do SDS-PAGE, łącząc 20 μg białka z równą objętością 2x bufor do próbek Laemmli i gotować w temperaturze 95 °C przez 10 minut.
   2. Załaduj próbki do żelu tris-glicynowego o stężeniu 4%–15% i uruchom je pod napięciem 150 V przez 1 godzinę lub do momentu, gdy czoło barwnika dotrze do dna żelu.
   3. Przenieść białka z żelu do membrany nitrocelulozowej pod napięciem 25 V przez 30 minut w półsuchym aparacie transferowym.
   4. Potwierdź prawidłowy transfer, barwiąc membranę barwnikiem Ponceau S.
   5. Dokładnie zmyć plamę z membrany solą fizjologiczną buforowaną tris (TBS) z 0,01% polisorbatem 20 (TBS-T).
   6. Zatkać membranę 5% mlekiem beztłuszczowym w TBS-T przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
   7. Inkubować błonę w przeciwciałie pierwszorzędowym w odpowiednim rozcieńczeniu zgodnie z zaleceniami dostawcy. Pozostaw na noc na bujaku w temperaturze 4 °C.
   8. Umyj membranę 3x, po 5 minut, za pomocą TBS-T.
   9. Inkubować błonę w odpowiednim przeciwciałie drugorzędowym w odpowiednim rozcieńczeniu zgodnie z zaleceniami dostawcy. Pozostaw go na bujaku na 1 godzinę w RT.
   10. Umyj membranę 3x, po 5 minut, za pomocą TBS-T.
   11. Zobrazuj i określ ilościowo western blot przy użyciu preferowanych metod.

Results

Próbki RNA, DNA i białek zostały przeanalizowane, a reprezentatywne wyniki z wykorzystaniem RNA i izolatów białek przedstawiono tutaj. Dodatkowo porównujemy próbkę białka pobraną metodą GTCp z powszechną metodą lizy RIPA²². W naszym eksperymencie użyliśmy czterech niezależnych replik każdego robaka WT (N2) i dwóch długowiecznych zmutowanych robaków, eat-2 i rsks-1^23,24.

ilość i jakość RNA i DNA

Stężenie RNA po ponownym zawieszeniu w 50 μL wody wahało się od 0,2 do 2 μg/μL, przy użyciu około 3 000 dorosłych robaków jako materiału wyjściowego. Współczynniki absorbancji, które wskazują na czystość, wahały się od 2,0 do 2,2 dla A260/A280 i od 1,9 do 2,5 dla A260/A230 (tabela 1), wskazując na udaną ekstrakcję RNA bez zanieczyszczenia składnikami GTCp, takimi jak fenol lub chlorowodorek guanidyny.

Ekstrakcja DNA zakończyła się sukcesem, ale jakość była zmienna. Stężenie DNA po ponownym zawieszeniu w 150 μl NaOH wahało się od 0,04 do 1,1 μg/μL. Współczynniki absorbancji wahały się od 1,8 do 2,1 dla A260/A280 i od 0,9 do 1,6 dla A260/A230 (Tabela 1), co wskazuje na udaną ekstrakcję DNA; jednak niektóre próbki były zanieczyszczone składnikami GTCp, takimi jak fenol lub chlorowodorek guanidyny. Jeśli izolacja DNA jest konieczna, należy zachować ostrożność podczas oddzielania środkowej warstwy od separacji faz GTCp, przy czym może być konieczne więcej płukania.

RT-qPCR wybranych celów

Izolacja RNA z czterech niezależnych próbek każdego szczepu robaka zakończyła się sukcesem i została wysłana do analizy RNAseq, a następnie RT-qPCR została przeprowadzona przy użyciu supermiksu zawierającego barwnik cyjaninowy. Cele analizowane za pomocą RT-qPCR zostały wybrane z dużego zestawu danych RNAseq w oparciu o najbardziej zróżnicowane regulowane geny wspólne dla obu mutantów w porównaniu z robakami WT. F07C4.12²⁵, homolog ludzkiej neuroliginy 3, izoforma b, została wybrana wspólna regulacja w górę. Dołączyliśmy również gen, który był regulowany różnicowo między oboma mutantami, mrp-1²⁶, do dodatkowej analizy, który był regulowany w górę u robaków eat-2, ale regulowany w dół u robaków rsks-1. Zmiany ekspresji mrp-1 potwierdzono za pomocą RT-qPCR; jednak regulacja w górę F07C4.12 u robaków rsks-1 przewidziana w analizie RNAseq nie została zaobserwowana przez RT-qPCR (Rysunek 1).

Zbadano również dodatkowe cele z potwierdzonymi przeciwciałami na obecność robaków. Obejmowały one kilka markerów organelli scharakteryzowanych w Hadwiger et al.²⁷. Wiele z tych markerów ulegało zróżnicowanej ekspresji na poziomie mRNA u zmutowanych robaków. Jak widać w Rysunek 1, lmp-1²⁸ i dlg-1²⁹ były regulowane w górę w robakach eat-2; HSP-4³⁰, HSP-70³⁰ i LMP-1 zostały poddane wzrostowi w robakach RSKS-1; HSP-60³¹ i pas-7³² zostały obniżone w robakach eat-2; HSP-60 i TAC-1³³ zostały obniżone w robakach RSKS-1.

Jednoczesny preparat białkowy vs. RIPA

Aby potwierdzić skuteczność i jakość białka metodą GTCp, jak opisano powyżej, porównaliśmy je z białkiem zebranym przy użyciu bardziej tradycyjnej metody lizy RIPA²². Stosując tę samą ilość materiału wyjściowego, a mianowicie albo tylko dorosłe osobniki (około 10 000 robaków), albo mieszaną populację dorosłych osobników, larw i jaj (około 130 000 robaków), całkowita ilość zebrana za pomocą GTCp była mniejsza po ponownym zawieszeniu w równych objętościach końcowych (tabela 1); Jednak ekstrakcja z populacji tylko dla dorosłych była bardziej udana niż z populacji mieszanej. Dodatkowo, jakość białek była podobna, chociaż białko ekstrahowane GTCp wykazywało lepszą rozdzielczość większych białek przy równym obciążeniu całkowitego białka, jak pokazano za pomocą barwienia Coomassie w Rysunek 2. Rzeczywiście, cele oceniane za pomocą western blot w Rysunek 3 wykazywały podobne poziomy w większości przypadków; jednak białka większe niż 75 kDa wykazywały niższe poziomy w białku ekstrahowanym RIPA w porównaniu z białkiem ekstrahowanym GTCp (Rysunek 3A, prawy pas; Rysunek 3B, żółty pasek).

Przedstawiona tutaj metoda ekstrakcji została również oceniona w linii komórkowej HeLa ssaków. Dla porównania, ilość białka wyekstrahowanego za pomocą RIPA z kompaktowej pastylki składającej się z sześciu milionów komórek HeLa (~25 μL pastylki) była porównywalna z tą wyekstrahowaną ze 130 000 mieszanej populacji robaków (~ 75 μL kompaktowej pastylki) lub około połowy tego, co jest ekstrahowane z 10 000 dorosłych robaków (~100 μL osadzonej grawitacyjnie pastylki). jak pokazano w tabeli 1. Pokazujemy, że wydajność ekstrakcji białek (Tabela 1) i rozdzielczość większych białek (Rysunek 2) była zmniejszona w GTCp w porównaniu z białkiem ekstrahowanym RIPA w komórkach HeLa, co sugeruje, że ta technika działa lepiej w dorosłej populacji robaków. Niepełna rozpuszczalność osadu białkowego z białka HeLa ekstrahowanego GTCp może być ograniczeniem tej metody w komórkach ssaków.

Cele immunoblottingu analizowane przez RT-qPCR

Następnie zbadaliśmy poziomy białek w produktach genowych testowanych za pomocą RT-qPCR, aby ustalić, czy poziomy mRNA korelują z poziomami białka. Jak widać na Rysunek 3, średnie zmiany ekspresji białka skorelowane ze średnimi ekspresjami mRNA zmieniły się dla wielu celów; jednak niektóre poziomy białka nie odzwierciedlały zmian w poziomach mRNA. Często poziomy mRNA w robakach eat-2 były wyższe niż w innych szczepach, ale poziomy białka były takie same lub niższe niż w innych szczepach o tym samym celu. Najbardziej wyróżniającą się obserwacją był bardzo wysoki poziom mRNA dlg-1 u robaków eat-2, co nie przekładało się na większą ilość białka; w rzeczywistości poziomy białka DLG-1 były niższe w porównaniu z innymi szczepami (Ryc. 3).

Na koniec, poziomy białka ekstrahowanego GTCp i białka ekstrahowanego RIPA wykazały uderzającą różnicę. RNA zostało wyekstrahowane w ten sam sposób dla obu; jednak podobna, ale oddzielna próbka pobrana przez lizę RIPA wykazała znacznie obniżone poziomy białka, szczególnie dla tych większych niż 75 kDa (Rysunek 3A, prawy pas; Rysunek 3B, żółty pasek).

Wewnątrzpróbkowe porównanie poziomów mRNA i białek

Jednym z celów tego protokołu było ustalenie, czy zróżnicowanie, które zaobserwowaliśmy na poziomie mRNA i białka, było prawdziwe, czy też może to być artefakt zmienności międzypróbkowej. W Rysunek 4, podzbiór celów został porównany w pojedynczych próbkach. Każda pojedyncza próbka jest pokazana jako ten sam odcień i kolor kropki, przy czym próbka 1 jest najciemniejszym odcieniem, a próbka 4 jest najjaśniejszym odcieniem szarości (WT), niebieskiego (eat-2) lub czerwieni (rsks-1). W większości próbek występowała niska zmienność poziomów mRNA, z większą zmiennością na poziomie białka, co stanowi potencjalną wadę półilościowej analizy zachodnich plam. Patrząc na położenie każdej z kolorowych kropek między parami mRNA i białek, kolejność od najwyższej do najniższej często się nie zgadzała; na przykład w WT kolejność mRNA hsp-60 wynosiła próbkę 4, 3, 2, 1, ale poziomy białka wynosiły 1, 2, 3, 4. Tak więc różnice między poziomami mRNA i białek w próbce z pewnością istnieją, ale przedstawiona metoda pozwala użytkownikom usunąć czas pobrania jako możliwe źródło obserwowanej różnicy.

Tabela 1: Stężenia i współczynniki absorpcji. Stężenia RNA i DNA oraz współczynniki czystości mierzono na spektrofotometrze. Stężenia białek oznaczono za pomocą kolorymetrycznego testu kwantyfikacji białek. Kolor szary, niebieski i czerwony oznaczają próbki używane do RT-qPCR i western blot. Kolorem żółtym oznaczone są próbki używane do porównania ekstrakcji białka GTCp z białkiem RIPA lub białka robaka z białkiem HeLa. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek 1: Ekspresja genów przez RT-qPCR. Analiza RT-qPCR dla mRNA uzyskanego tą metodą, potwierdzająca cele zidentyfikowane na podstawie danych RNAseq oraz genów markerów organelli. Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe; n = 4. Stężenie mRNA określono w odniesieniu do krzywej standardowej dla każdego zestawu starterów. Wszystkie poziomy mRNA zostały znormalizowane do średniej z zestawu sześciu genów porządkowych używanych jako geny referencyjne, które obejmują ACT-1, CDC-42, AMA-1, NHR-23, PMP-3 i CYN-1. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 2: Porównanie białka ekstrahowanego GTCp i RIPA w robakach i komórkach HeLa. Białko całkowite z robaków typu dzikiego (WT) lub komórek HeLa zebranych metodą lizy GTCp lub RIPA, oddzielonych za pomocą SDS-PAGE i wybarwionych błękitem Coomassie. Każdy tor zawiera 25 μg białka ogółem. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 3: Poziomy białka u robaków. (A) Western blot tarcz badanych za pomocą RT-qPCR oraz (B) analiza densytometryczna intensywności sygnału. Każdy pas zawiera 20 μg całkowitego białka wyekstrahowanego GTCp z zmutowanych robaków typu dzikiego (WT), eat-2 lub rsks-1. Pokazany obraz jest reprezentacją czterech niezależnych powtórzeń dla każdego szczepu robaka. β-aktyna (na dole) została użyta do kontroli równego obciążenia dla każdego celu; Pokazany jest tylko jeden reprezentatywny zestaw. Prawy pas zawiera 20 μg całkowitego białka wyekstrahowanego RIPA ze zmutowanych robaków rsks-1. (B) Odpowiednie intensywności sygnału określono ilościowo za pomocą ImageJ. Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe; n = 4. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Porównanie poziomu mRNA i białka w obrębie próbki. Poziomy mRNA i białka z poszczególnych próbek z podzbioru celów dla każdego szczepu są wyrównane. Kolor jest reprezentatywny dla tabeli 1. Szary/to WT, niebieski to eat-2, a czerwony to rsks-1. mRNA i białko tego samego celu są sparowane obok siebie i oddzielone szczepem nicienia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

Metody izolacji biomolekuł, takich jak DNA, RNA i białka, są często optymalizowane bez technicznego nakładania się lub kombinacji. Jest to szczególnie niekorzystne, gdy próbki są trudne do uzyskania, co może prowadzić do pobierania próbek w tych samych warunkach w różnym czasie. W zależności od szlaków komórkowych, kontrpróby zebrane w różnym czasie mogą generować zmienność. Niniejszy manuskrypt oferuje procedurę pozwalającą obejść tę przeszkodę, umożliwiając jednoczesną izolację i oczyszczanie każdej biomolekuły z tej samej próbki robaków, zmniejszając różnice wprowadzone przez różne techniki izolacji, czas pobierania próbek lub nierówne zbiory. Kontrolowanie tych zmiennych nie tylko oszczędza czas i zasoby, ale także ułatwia odtwarzalność. W tym miejscu demonstrujemy podejście kombinatoryczne, które pozwala uniknąć pogorszenia jakości RNA i białka, aczkolwiek ze zmiennymi wynikami w przypadku DNA. Preparaty można dodatkowo zoptymalizować za pomocą procedur czyszczenia DNA. Zademonstrowaliśmy to podejście, wykorzystując materiał z nicieni C. elegans i komórek HeLa.

Wcześniejsze prace badające transkryptom i proteom zwierząt N2 WT oraz mutantów eat-2 i rsks-1 dały wgląd w różne szlaki, w tym mechanizmy wydłużające życie 4,34,35,36. W celu zbadania mechanizmu ograniczenia kalorii w przedłużaniu życia, analiza znakowania stabilnych izotopów przez/z aminokwasami w hodowli komórkowej (SILAC) wykazała, że robaki eat-2 mają ogólną regulację w dół globalnej syntezy białek ³⁶. Przedstawione tutaj dane są zgodne z tym odkryciem, nawet jeśli poziomy mRNA tych samych celów są znacznie podwyższone. Inna grupa miała na celu zidentyfikowanie efektorów długowieczności, w których pośredniczy S6K, a tym samym przeprowadziła proteomiczne badanie przesiewowe robaków rsks-1 ³⁴. Na podstawie danych RNAseq znalezionych w obecnym badaniu zidentyfikowaliśmy co najmniej trzy geny, które potwierdzają białka zidentyfikowane na podstawie tego badania; Odkryto, że MRP-1 i homologi CPA i neuroliginy (F07C4.12) ulegają zróżnicowanej ekspresji w robakach rsks-1 w porównaniu z WT N2³⁴.

Dane wygenerowane przy użyciu tej metody są zgodne z wcześniejszymi badaniami multiomicznymi. Poziomy mRNA dziewięciu celów wykorzystano do przewidywania poziomów białka w każdej próbce. Spośród tych celów wiele miało przewidywalne poziomy białka na podstawie poziomów mRNA. Niemniej jednak wystąpiły znaczące rozbieżności między poziomami mRNA i białka. Co ważne, przedstawiony tutaj protokół pozwala naukowcom na pewną ocenę i interpretację tych różnic poprzez usunięcie zmienności między próbkami poprzez zebranie mRNA i białka z tej samej próbki. Ponadto porównaliśmy poziomy mRNA z poziomami białka pobranymi z tej samej próbki lub pobranymi z podobnej, ale innej próbki zebranej za pomocą RIPA. Wykazaliśmy, że w przypadku wielu celów w próbce ekstrahowanej za pomocą RIPA występowały znacznie niższe poziomy białka. Bez kontroli zmienności między próbkami niemożliwe byłoby ustalenie, czy różnica ta wynikała ze zróżnicowanej regulacji mRNA i białka.

Ważne jest, aby pamiętać, że istnieją protokoły zoptymalizowane specjalnie dla tych różnych makrocząsteczek, więc jeśli analiza przekrojowa nie jest ostatecznym celem eksperymentu, wówczas należy zastosować te metody. Stosowanie GTCp do izolowania DNA i białka powoduje, że stają się one mniej rozpuszczalne, co wymaga odtworzenia DNA w słabej zasadzie, takiej jak NaOH, i rozpuszczania białka w buforze z detergentem o wysokim stężeniu z ogrzewaniem, co wiąże się z ryzykiem niepełnej rozpuszczalności. Dodatkowo GTCp zawiera tiocyjanian guanidyny i kwaśny fenol, który inaktywuje enzymy, takie jak proteazy, ale z czasem powoli rozkłada białko, chyba że zostanie zamrożony. To od badacza będzie zależało, czy obejście tych ograniczeń będzie warte zachodu.

Co ważne, podczas pracy z RNA, techniką sterylną, zaleca się trzymanie próbki na lodzie, chyba że zaznaczono inaczej, oraz stosowanie dostępnego na rynku odczynnika odkażającego w celu utrzymania RNA w stanie nienaruszonym. Warto zauważyć, że większe próbki będą wymagały na początek więcej GTCp, przy czym każdy rozpuszczalnik ekstrakcyjny będzie również musiał zostać zwiększony. Protokół ten nie wymaga żadnej ręcznej homogenizacji próbek robaka lub komórek, gdy używana jest odpowiednia ilość GTCp. W kontekście izolacji DNA, wydajność jest w dużym stopniu zależna od biegłości w odzyskiwaniu warstwy organicznej (różowej). Wreszcie, aby poprawić rozpuszczalność białek podczas izolacji, może być konieczne zwiększenie objętości buforu do rozpuszczania lub dodanie innych detergentów oprócz SDS. Rzeczywiście, białka z dorosłej populacji robaków zamiast mieszanki dorosłych osobników, larw i jaj są znacznie łatwiejsze do rozpuszczenia.

Ogólnie rzecz biorąc, zastosowanie tego protokołu zapewnia zintegrowane podejście do izolacji biomolekuł i ułatwia interpretację korelacji lub jej braku między poziomami mRNA i białek, które mogą powstać w wyniku oddzielnego zbierania biomolekuł z różnych próbek. Zastosowanie tej metody może pomóc naukowcom w prawidłowym zidentyfikowaniu przypadków, w których translacja mRNA na białko nie jest skorelowana i może prowadzić do głębszego zbadania potranskrypcyjnych i potranslacyjnych mechanizmów regulacyjnych w różnych warunkach.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
4– 15% Mini-PROTEAN® TGX bez plam i handlu; Żele białkowe	BIORAD	4568084
Przeciwciała:
CePAS7-s	DHSB- U z Iowa
CeTAC1-s	, DHSB- U z Iowa
DLG1-s,	DHSB- U z Iowa
GRP78	Novus Bio.	NBp1-06274
HRP Goat Anti-Mouse	Li-Cor	926-80010
HRP Goat Anti-Rabbit	Li-Cor	92680011
HSP60-s	DHSB-U stanu Iowa
LMP1-s	DHSB- U stanu Iowa
MRP-1	Abcam	ab24102
Neuroligina 3	Abcam	ab172798
β-aktyna	Millipore	MAB1501R
ChemiDoc MP System obrazowania	BIORAD
Chloroform	Fisher	C298-500	Zagrożenie dla zdrowia, Drażniące, Toksyczne
Coomassie Brilliant Blue	ThermoSci	20279
DC Test białka	BIORAD	500-0116
Czytnik mikropłytek Epoch 2	BioTek
Etanol (200 proof)	Fisher	04-355-223	Łatwopalne, zagrażające zdrowiu
komórki HeLa	ATCC	CCL-2	BSL2
iScript Odwrotna transkrypcja Supermix	BIORAD	1708840
Mikrodozownik Hydra: Matrix Hydra	Robbins/ThermoFisher
Isopropanol	Fisher	A516-4	Łatwopalny, Zagrożenie dla zdrowia
< silny> bufor M9: 3 g KH2PO4 6 g Na2HPO4 5 g NaCl Dodać H2O do 1 litra. Sterylizuj w autoklawie. Po ostygnięciu roztworu dodać 1 ml sterylnego 1 M MgSO4
Laemmli Sample Buffer (2x)	BIORAD	161-0737
Aparat NanoDrop One	ThermoSci
PAGE	BIORAD
Ponceau S	Alfa Aesar	J60744
Primers	IDT		25 nmole DNA Oligo ze standardowym odsalaniem
dlg-1: F (5'-GGTCCTACCA GGCAGTTGAG-3') R (5'-CACGTCCGTT AACCTCTCCC-3')
hsp-4: F (5'-AGAGGGCTTT GTCAACCCAG-3') R (5'-TCGTCAGGGT TGATTCCACG-3')
hsp-70: F (5'-CGGCATGTGA ACGTGCTAAG-3') R (5'-GAGCAGTTGA GGTCCTTCCC-3')
hsp-60: F (5'-ATTGAGCAAT CGACGAGCGA-3') R (5'-CAACACCTCC TCCTGGAACG-3')
lmp-1: F (5'-ACAACAAC CGGACTCACG-3') R (5'-ATCGAGCTCC CACTCTTTGG-3')
tac-1: F (5'-AGTGGCAGGC AAAGTTCCTC-3') R (5'-TGAGCACCTT GATCTCGTCG-3')
pas-7: F (5'-GTACGCTCAA AAGGCTGTCG-3') R (5'-CTGAATCGGC ATTGGCTCAC-3')
mrp-1: F (5'-TTTGCCTTGC GCTTGTTCTG-3') R (5'- AGTTCCAGTG CGGAGCATAC-3')
F07C4.12: F (5'-TGCTGAGCAT GAAGGACTGT-3') R (5'-TGGCAATAGC TCCTCCGTTG-3')
HK Aktyna: F (5'-CTACGAACTT CCTGACGGACAAG-3') R (5'-CCGGCGGACT CCATACC-3')
HK cyn-1: F (5'-GTGTCACCAT GGAGTTGTTC-3') R (5'-TCCGTAGATT GATTCACCAC-3')
HK nhr-23: F (5'-CAGAAACACT GAAGAACGCG-3') R (5'-CGATCTGCAG TGAATAGCTC-3')
HK ama-1: F (5'-TGGAACTCTG GAGTCACACC-3') R (5'-CATCCTCCTT CATTGAACGG-3')
HK cdc-42: F (5'-CTGCTGGACA GGAAGATTACG-3') R (5'-CTCGGACATT CTCGAATGAAG-3')
HK pmp-3: F (5'-GTTCCCGTGT TCATCACTCAT-3') R (5'-ACACCGTCGA GAAGCTGTAGA-3')LightCycler
96 qPCR Maszyna	Roche
RIPA buffer: 10 mM Tris-Cl (pH 8,0) 1 mM EDTA 1% Triton X-100 0,2% SDS 140 mM NaCl 1 tabletka inhibitora proteazy Roche na 20 ml
SsoAdvanced Universal SYBR Supermix	BIORAD	1725274
SuperSignal West Femto Max Sens Substrate	ThermoSci	34095
Aparat do transferu Trans-Blot	BIORAD
Trans-Blot Turbo Transfer Pack	BIORAD	170-4159
TRIzol	Invitrogen	15596026	Zagrożenie dla zdrowia (skóra, oczy)
< silne>Szczepy robaków:	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
N2 (typ dziki	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
eat-2 (MAH95)	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
rsks-1 (VB633)	Centrum Genetyki Caenorhabditis (CGC)