Połączone ekstrakcje nukleotydów i białek w Caenorhabditis elegans

Summary

Tutaj prezentujemy protokół izolacji RNA, DNA i białka z tej samej próbki, w celu zmniejszenia zmienności, poprawy odtwarzalności i ułatwienia interpretacji.

Abstract

Pojedyncza próbka biologiczna zawiera mnóstwo informacji, a obecnie powszechną praktyką jest jednoczesne badanie kilku makromolekuł, aby uzyskać pełny obraz wielu poziomów przetwarzania molekularnego i zmian między różnymi warunkami. Protokół ten przedstawia metodę izolowania DNA, RNA i białka z tej samej próbki nicienia Caenorhabditis elegans w celu usunięcia zmienności wprowadzonej, gdy te biomolekuły są izolowane z powtórzeń podobnie traktowanych, ale ostatecznie różnych próbek. Kwasy nukleinowe i białko ekstrahuje się z nicieni metodą ekstrakcji kwasem tiocyjanian-fenol-chloroform guanidyny, a następnie wytrąca, przemywania i rozpuszczania każdego z nich. Pokazujemy udaną izolację RNA, DNA i białka z pojedynczej próbki z trzech szczepów nicieni i komórek HeLa, z lepszymi wynikami izolacji białek u dorosłych zwierząt. Dodatkowo, białko ekstrahowane tiocyjanianem guanidyny-fenolem-chloroformem z nicieni poprawia rozdzielczość większych białek, z lepszymi wykrywalnymi poziomami, co obserwuje się za pomocą immunoblottingu, w porównaniu z tradycyjną ekstrakcją białka RIPA.

Przedstawiona tutaj metoda jest przydatna podczas badania próbek przy użyciu podejścia multiomicznego, szczególnie do badania proteomu i transkryptomu. Techniki, które jednocześnie oceniają multiomikę, są atrakcyjne, ponieważ uważa się, że sygnalizacja molekularna leżąca u podstaw złożonych zjawisk biologicznych zachodzi na uzupełniających się poziomach; jednak coraz częściej można zaobserwować, że zmiany poziomów mRNA nie zawsze odzwierciedlają tę samą zmianę poziomu białka i że czas pobrania jest istotny w kontekście regulacji okołodobowych. Ta metoda usuwa wszelkie różnice między próbkami podczas oznaczania różnych zawartości w tej samej próbce (śródpróbce).

Introduction

Multiomika, podejście analityczne, które wykorzystuje kombinację omiki, takiej jak genom, proteom, transkryptom, epigenom, mikrobiom lub lipidom, staje się coraz bardziej popularne podczas przetwarzania dużych zbiorów danych w celu charakterystyki choroby^1,2. Coraz więcej dowodów pokazuje, że ograniczenie podejścia do pojedynczego “ome” zapewnia niekompletną analizę molekularną (zrecenzowaną przez Rotroffa i Motsingera-Reif¹). Generowane są duże zbiory danych, szczególnie w przypadku wykonywania badań przesiewowych przy użyciu technik o wysokiej przepustowości, ale w celu nakreślenia pełnego obrazu lub zidentyfikowania najistotniejszych celów preferowane są podejścia multiomiczne. Jednak przy zastosowaniu podejść multiomicznych często obserwuje się rozbieżności między poziomem mRNA a poziomem białka^3,4,5,6. Warto zauważyć, że mRNA i białko używane do równoległych analiz transkryptomicznych i proteomicznych z sekwencjonowaniem RNA (RNAseq) i chromatografią cieczową z tandemową spektrometrią mas (LC-MS/MS) są często uzyskiwane z podobnie traktowanych próbek z różnych powtórzeń, potencjalnie wprowadzając różnice między tymi samymi warunkami^3,4,5,6. Harvald i in. przeprowadzili eleganckie badanie przebiegu głodu C. elegans, w którym porównali transkryptom i proteom robaków typu dzikiego (WT) z transkryptomem i proteomem zmutowanych robaków hlh-30, które nie mają ważnego czynnika transkrypcyjnego w długowieczności⁷. Warto zauważyć, że RNA i białko zostały zebrane z tych samych replik warunków, a więc nie z tej samej próbki. Ich odkrycia wskazują na niską korelację między poziomami mRNA a poziomami białka w każdym punkcie czasowym (r = 0,559 do 0,628). W rzeczywistości ich mapa cieplna utworzyła cztery klastry: Klaster I miał duży spadek poziomu mRNA, ale niewielki lub żaden spadek odpowiadających mu poziomów białka, Klaster II miał niewielki lub żaden wzrost poziomu mRNA, ale wzrost poziomu białka, Klaster III miał wzrost poziomu mRNA, ale spadek poziomu białka, a Klaster IV miał wzrost poziomu mRNA, ale tylko subtelną zmianę poziomu białka⁴. Ponadto taka zmienność między próbkami może być wprowadzona w przypadkach, gdy próbki tego samego stanu nie są pobierane dokładnie w tym samym czasie. Na przykład mRNA i białka regulowane przez cykl okołodobowy zmieniają się w zależności od pory dnia^8,9, a dokładniej ekspozycji C. elegans na światło⁹; Ekspresja tych białek okołodobowych może być opóźniona do 8 godzin po indukcji ekspresji genów¹⁰. Niemniej jednak rozpowszechnienie tej obserwacji niekoniecznie oznacza, że jest ona błędna; W rzeczywistości może się to okazać pouczające. Białko i mRNA są w stałym stanie dynamicznym między powstawaniem a degradacją. Co więcej, białka są często modyfikowane potranslacyjnie w celu zwiększenia stabilności lub wywołania ich degradacji¹¹. Na przykład ich status ubikwitynacji może prowadzić do aktywacji lub kierowania do proteasomu lub lizosomu w celu degradacji¹². Dodatkowo, niekodujące RNA odgrywają ważną rolę w regulacji ekspresji genów na etapie transkrypcji i posttranskrypcji¹³. W związku z tym pojawia się pytanie, jak ograniczyć zmienne, aby potwierdzić, że rozbieżności, które obserwujemy w tych badaniach nad nicieniami, są prawdziwe.

Tutaj proponujemy metodę, która usuwa zmienną międzypróbkową, umożliwiając analizę różnych makrocząsteczek z tej samej próbki. Celem tego protokołu jest zaoferowanie metody konsekwentnego izolowania DNA, RNA i białka z pojedynczej próbki C. elegans (określanej również jako robaki) w celu zmniejszenia zmienności, poprawy odtwarzalności i ułatwienia interpretacji. Dodatkowe korzyści płynące z używania tej samej próbki obejmują oszczędność czasu i zasobów podczas pobierania próbek, ułatwienie analizy przekrojowej cennych i ograniczonych próbek, w tym szczepów, które są trudne do uprawy i utrzymania, oraz uzyskanie wglądu w różnicową regulację makrocząsteczek w oparciu o zmiany mRNA i poziomów białka w obrębie próbki.

Ta metoda jest odpowiednia do oceny ekspresji genów i poziomów białek z pojedynczej próbki robaków, co pozwala na bardziej wszechstronną ocenę wielu poziomów przetwarzania molekularnego. Odczynnik do tiocyjanianu guanidyny-fenolu-chloroformu (GTCp)¹⁴, powszechnie stosowana substancja chemiczna do izolacji RNA, jest używana do ekstrakcji kwasów nukleinowych i białek z robaków, a następnie wytrącania, mycia i rozpuszczania każdego z nich. Ten protokół jest kompilacją różnych protokołów^15,16 z niewielkimi modyfikacjami, zaprojektowanymi z naciskiem na C. elegans, ale udało nam się również wyizolować RNA, białko i DNA z osadu komórek HeLa, wykonując te same kroki. Chociaż nie został tutaj przetestowany, ten protokół prawdopodobnie będzie działał również na tkankach^17,18.

Protocol

UWAGA: Każdy etap wytrącania makromolekuł jest wykonywany sekwencyjnie, po którym następują równoczesne płukanie; jednak zaleca się najpierw dokończenie izolacji RNA, ponieważ jest ona wewnętrznie niestabilna.

1. Pobieranie próbek

1. Wysiewaj 1 000 jaj robaków na 10 cm talerzu w odpowiednich warunkach wzrostu¹⁹. Inkubować w temperaturze 20 °C przez 72 h.
   nuta: Wybielaj dorosłe osoby niosące jaja w celu zebrania jaj, jak opisano wcześniej¹⁹.
2. Umyj płytkę około 5 ml buforu M9 i zbierz 1 000 dorosłych robaków do probówki.
   nuta: Bufor M9 składa się z 35 mM dwuzasadowego fosforanu sodu, 102 mM chlorku sodu, 22 mM jednozasadowego fosforanu potasu i 1 mM siarczanu magnezu w sterylnej wodzie¹⁹.
3. Odwirować robaki przy 1 000 x g przez 1 minutę, wyrzucić supernatant i przenieść granulowane robaki z 1 ml buforu M9 do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
4. Ponownie odwirować przy 845 x g przez 1 minutę i wyrzucić większość supernatantu. Granulowane robaki należy przechowywać w temperaturze -80 °C przez co najmniej 4 godziny
   nuta: Użycie mrożonego granulatu daje wyższy plon niż świeży pellet. W przypadku stosowania świeżego granulatu zaleca się serię cykli zamrażania/rozmrażania przy użyciu ciekłego azotu lub 95% etanolu na suchym lodzie w celu rozbicia naskórka robaka. Pozostawienie niewielkiej ilości M9 na granulce pomoże rozbić naskórek podczas zamrażania.

2. Izolacja nukleotydów i białek

1. Usunąć jakikolwiek supernatant z rozmrożonego osadu i dodać 1 ml zimnego odczynnika GTCp. Dobrze wymieszaj, pipetując w górę i w dół. Umieść próbkę na lodzie na 10 minut i od czasu do czasu mieszaj, odwracając ją do góry nogami.
   ostrożność: Fenol jest, neurotoksyczny i wysoce toksyczny i może powodować oparzenia chemiczne i ślepotę.
   nuta: Użyliśmy do 5 000 dorosłych robaków jako materiału wyjściowego przy zgłoszonych ilościach; każda objętość opiera się na użyciu 1 ml odczynnika GTCp. W przypadku korzystania z większej próbki może być konieczne zwiększenie skali.
2. Do roztworu robaków i GTCp dodać 200 μl zimnego chloroformu. Trzymaj probówkę między palcami i energicznie potrząsaj przez 15 sekund. Pozostaw w temperaturze pokojowej (RT) na 3 min.
   ostrożność: Chloroform jest toksycznym środkiem drażniącym, może powodować owrzodzenia skóry i inne uszkodzenia narządów oraz jest możliwym czynnikiem rakotwórczym.
3. Odwirować probówkę o stężeniu 13 500 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
   nuta: Po tym wirowaniu powstają trzy warstwy: górna, przezroczysta faza wodna, dolna, różowa faza organiczna i mała, mętna interfaza, która zawiera lipidy i DNA.
4. Za pomocą mikropipety przenieś przezroczystą górną warstwę (fazę wodną) do nowej, wolnej od RNaz probówki do mikrowirówki (probówka A) o pojemności 1,5 ml, aby wyizolować RNA poprzez wytrącanie alkoholu (jak opisano w kroku 2.5) i przenieść różową warstwę (fazę organiczną) z pozostałego osadu do nowej probówki (probówki B) i umieścić ją na lodzie.
   nuta: Różową fazę organiczną można zamrozić w temperaturze -80 °C do czasu wyizolowania DNA i białka z tej próbki. Większe próbki stworzą grubą białą warstwę między fazą wodną a organiczną. Ta frakcja zawiera DNA. Jeśli tę warstwę można usunąć bez naruszania innych faz, zrób to i umieść ją w osobnej tubie (probówce B2).
5. Wyizoluj RNA w następujący sposób.
   1. Z klarownej fazy wodnej w probówce A wytrącić RNA za pomocą 500 μl 100% izopropanolu. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie odwirować probówkę A o sile 13 500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
      nuta: Na dnie probówki powinna być widoczna mała biała osadka RNA.
   2. Zdekantować większą część supernatantu. Resztę usunąć za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml z igłą i wyrzucić supernatant.
      nuta: Rozmiar igły nie jest ważny; Jednak większy rozstaw igieł zapewni większą kontrolę, aby nie zakłócać śrutu. Mikropipeta może być użyta, jeśli igły nie są dostępne.
   3. Dodaj 1 ml 75% etanolu do probówki A, aby umyć osad. Wirować probówkę o wymiarach 5 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
   4. Usunąć supernatant z osadu przez dekantację i użyć strzykawki o pojemności 1 ml z igłą, jak opisano w kroku 2.5.2, i wyrzucić go.
   5. Pozostaw granulkę do wyschnięcia na powietrzu przez 5–10 minut, ale nie pozwól jej przeschnąć. Użyj 50 μl wody wolnej od RNaz, aby rozpuścić osad RNA, zanim stanie się całkowicie przezroczysty.
      nuta: Jest to wystarczająca objętość początkowa dla 1,000–3,000 robaków, ale może być konieczne dostosowanie w zależności od ilości użytego materiału wyjściowego.
   6. Inkubować osad w temperaturze 55–60 °C przez 10 minut, aby go rozpuścić.
   7. Zmierzyć stężenie i czystość za pomocą spektrofotometru. Zapisać absorbancję przy 260 nm dla stężenia RNA oraz przy 230 i 280 nm w celu zidentyfikowania wszelkich zanieczyszczeń.
   8. Oczyść RNA w celu usunięcia wszelkich zanieczyszczeń, takich jak pozostałości fenolu lub DNA, albo poprzez oczyszczanie kolumny, albo poprzez późniejsze płukanie etanolem i obróbkę DNazą.
      nuta: W tym momencie RNA jest gotowe do wysłania do analizy RNAseq lub może być użyte do wytworzenia cDNA do wykorzystania w RT-qPCR (szczegółowe informacje znajdują się w sekcji 3.1). RNA może być przechowywane w temperaturze -80 °C do czasu dalszego wykorzystania.
6. Wyizoluj DNA w następujący sposób.
   1. Z różowej fazy organicznej w probówce B i próbki w probówce B2, jeśli występuje, wytrącić DNA, dodając 300 μl 100% etanolu i wymieszać przez inwersję. Pozostaw probówkę (rurki) w pozycji RT na 2–3 minuty.
   2. Odwirować probówki B i B2 o masie 375 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia DNA.
   3. Przenieść supernatant z probówek B i B2, wlewając go do nowej probówki C o pojemności 2 ml i pozostawić na lodzie w celu późniejszej izolacji białka. Przemyć osad DNA w probówce B lub B2 1 ml 0,1 M cytrynianu sodu w 10% etanolu przez 30 minut. Probówki B i B2 o masie 375 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C.
      nuta: Sód wiąże się ze szkieletem DNA, dzięki czemu DNA łatwiej wytrąca się w cytryninie sodu i etanolu, umożliwiając usunięcie zanieczyszczeń przez wirowanie z niską prędkością.
   4. Powtórz etap prania zgodnie z opisem w kroku 2.6.3. Ponownie zawiesić osad w 1,5 ml 75% etanolu i pozostawić go w temperaturze pokojowej na 20 minut, od czasu do czasu mieszając przez wywrócenie do góry nogami.
   5. Probówkę B i B2 przy 375 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
   6. Wyrzuć supernatant i pozostaw do wyschnięcia na 5–10 minut.
   7. Rozpuścić osad w 150 μl 8 mM wodorotlenku sodu. W razie potrzeby dostosuj do żądanego pH za pomocą HEPES. Wirować próbkę w temperaturze 375 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
   8. Za pomocą mikropipety przenieś supernatant (DNA) do nowej probówki. Zmierzyć stężenie i określić czystość za pomocą spektrofotometru. Zapisać absorbancję przy 260 nm dla stężenia DNA oraz przy 230 i 280 nm w celu zidentyfikowania wszelkich zanieczyszczeń.
7. Wyizoluj białko w następujący sposób.
   1. Aby wytrącić białko, dodaj do 1,5 ml 100% izopropanolu do różowego supernatantu w probówce C, wymieszaj przez kilkakrotne odwrócenie i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
   2. Probówka wirówkowa C o masie 13 500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
   3. Odrzucić supernatant i przemyć osad 2 ml 0,3 M chlorowodorku guanidyny w 95% etanolu przez 20 minut w temperaturze pokojowej stężenia. Probówkę C odwirować przy 5 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
   4. Powtórz krok prania zgodnie z opisem w kroku 2.7.3 2x.
   5. Przenieś granulkę białka do nowej probówki o pojemności 1,5 ml (probówka C2) i dodaj do 1,5 ml 95% etanolu. Wiruj i pozostaw w temperaturze RT przez 20 minut.
   6. Probówkę wirówkową C2 o stężeniu 5 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i pozostawić osad do wyschnięcia na 10 minut w temperaturze pokojowej. Rozpuścić osad w 300 μl 5% SDS w temperaturze 50 °C przez 60 min.
      UWAGA: Do całkowitego rozpuszczenia osadu białkowego może być wymagany dłuższy czas inkubacji. W przeszłości granulat był inkubowany do 6 godzin bez utraty jakości.
   7. Probówkę wirówkową C2 o sile 13 500 x g przez 10 minut w temperaturze 17 °C. Przenieść supernatant do nowej probówki.
   8. Zmierzyć stężenie przy użyciu preferowanego testu ilościowego białka, który jest zgodny z detergentem.
      nuta: Białko jest gotowe do użycia w SDS-PAGE i western blotting. Może być przechowywany w temperaturze -20 °C do wykorzystania w przyszłości. W przypadku innych technik, takich jak LC-MS/MS, detergent będzie musiał zostać dializowany.

3. Ocena poziomów mRNA i białka

1. RT-qPCR (Protokół RT-qPCR)
   1. Przygotować cDNA przez odwrotną transkrypcję z 1 ng RNA, stosując następujący protokół termocyklera: torowanie (5 min w 25 °C), odwrotna transkrypcja (20 min w 46 °C) i inaktywacja RT (1 min w 95 °C).
   2. Przygotuj podstawową płytkę cDNA, dodając 100 μl rozcieńczeń 1:100 każdej próbki cDNA do indywidualnych dołków 96-dołkowej płytki. Uwzględnij odpowiednie kontrole, takie jak studzienki bez matrycy/tylko z wodą oraz seryjnie rozcieńczane próbki od 1:25 do 1:400 (pochodzące z połączonego cDNA ze wszystkich analizowanych próbek), aby umożliwić krzywą standardową ustalenie wydajności startera dla każdego analizowanego genu.
      nuta: Format ten może być używany z 96-dołkowym mikrodozownikiem, który umożliwia przeniesienie wszystkich próbek z płytki na płytkę RT-qPCR i złagodzenie zmian w pipetowaniu między studzienkami. Odpowiednią mieszankę wzorcową (np. SYBR + startery) można następnie dodać do każdej studzienki za pomocą pipety wielokanałowej. Ogólnie rzecz biorąc, takie podejście zmniejsza liczbę błędów wprowadzanych podczas ręcznego pipetowania każdej próbki, co jeszcze bardziej zmniejsza zmienność.
   3. Dodać 3 μl cDNA z płytki podstawowej do dołków płytki RT-qPCR.
   4. Przygotuj mieszankę wzorcową dla każdego zestawu starterów, który zawiera 1x supermix zawierający barwnik cyjaninowy interkalujący DNA, po 5 μM starterów do przodu i do tyłu oraz wodę do 7 μl na próbkę. Dodać 7 μl do odpowiednich dołków płytki RT-qPCR i lekko zamieszać, aby wymieszać.
      nuta: Dołącz próbki do pomiaru genów porządkowania, aby użyć ich jako odniesienia do normalizacji wyników²⁰.
   5. Uruchomić płytkę przy użyciu protokołu RT-qPCR, który jest odpowiedni dla używanych starterów.
2. Western blot
   nuta: Szczegółowe informacje na temat zachodnich plam można znaleźć w Mahmood and Yang²¹.
   1. Przygotować próbki do SDS-PAGE, łącząc 20 μg białka z równą objętością 2x bufor do próbek Laemmli i gotować w temperaturze 95 °C przez 10 minut.
   2. Załaduj próbki do żelu tris-glicynowego o stężeniu 4%–15% i uruchom je pod napięciem 150 V przez 1 godzinę lub do momentu, gdy czoło barwnika dotrze do dna żelu.
   3. Przenieść białka z żelu do membrany nitrocelulozowej pod napięciem 25 V przez 30 minut w półsuchym aparacie transferowym.
   4. Potwierdź prawidłowy transfer, barwiąc membranę barwnikiem Ponceau S.
   5. Dokładnie zmyć plamę z membrany solą fizjologiczną buforowaną tris (TBS) z 0,01% polisorbatem 20 (TBS-T).
   6. Zatkać membranę 5% mlekiem beztłuszczowym w TBS-T przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
   7. Inkubować błonę w przeciwciałie pierwszorzędowym w odpowiednim rozcieńczeniu zgodnie z zaleceniami dostawcy. Pozostaw na noc na bujaku w temperaturze 4 °C.
   8. Umyj membranę 3x, po 5 minut, za pomocą TBS-T.
   9. Inkubować błonę w odpowiednim przeciwciałie drugorzędowym w odpowiednim rozcieńczeniu zgodnie z zaleceniami dostawcy. Pozostaw go na bujaku na 1 godzinę w RT.
   10. Umyj membranę 3x, po 5 minut, za pomocą TBS-T.
   11. Zobrazuj i określ ilościowo western blot przy użyciu preferowanych metod.

Representative Results

Discussion

Methods for biomolecule isolations, such as DNA, RNA, and proteins, are often optimized without technical overlap or combinations. This is particularly disadvantageous when samples are difficult to obtain, which could lead to harvesting samples under the same conditions at different times. Depending on the cellular pathways, replicates collected at different times may generate variation. This manuscript offers a procedure to circumvent this hurdle by enabling the concurrent isolation and purification of each biomolecule from the same sample of worms, reducing variations introduced by different isolation techniques, the timing of sample harvest, or unequal harvesting. Controlling these variables not only saves time and resources, but also facilitates reproducibility. Here, we demonstrate a combinatorial approach that avoids compromising RNA and protein quality, albeit with variable results with DNA. Preparations can be further optimized using DNA cleaning procedures. We demonstrated the approach using material from the nematode C. elegans and HeLa cells.

Previous work exploring the transcriptome and proteome of N2 WT animals and eat-2 and rsks-1 mutants have offered insight into various pathways, including mechanisms that extend lifespan^4,34,35,36. In an effort to investigate the mechanism of caloric restriction in extending lifespan, a Stable Isotope Labeling by/with Amino acids in Cell culture (SILAC) analysis found that eat-2 worms have an overall downregulation of global protein synthesis ³⁶. The data presented here is consistent with this finding, even as the mRNA levels of the same targets are greatly increased. Another group aimed to identify effectors of S6K-mediated longevity and, thus, performed a proteomic screen of rsks-1 worms³⁴. From the RNAseq data found with the current study, we identified at least three genes that corroborate with proteins identified from this screen; MRP-1 and homologs of CPA and neuroligin (F07C4.12) were discovered as being differentially expressed in rsks-1 worms as compared to WT N2³⁴.

The data generated using this method is consistent with previous multiomic investigations. The mRNA levels of nine targets were used to predict the protein levels in each sample. Of these targets, many had predictable protein levels based on the mRNA levels. Nevertheless, there were notable discrepancies between the mRNA and protein levels. Importantly, the protocol presented here allows scientists to confidently evaluate and interpret these differences by removing intersample variability by collecting mRNA and protein from the same sample. Furthermore, we compared the mRNA levels to the protein levels collected from the same sample or collected from a similar but different sample harvested with RIPA. We showed that for a number of the targets, there were much lower levels of protein in the RIPA-extracted sample. Without controlling for the intersample variation, it would be impossible to know if this difference was due to the differential regulation of mRNA and protein.

It is important to keep in mind that there are protocols optimized specifically for these different macromolecules, so if a cross-sectional analysis is not the final goal of the experiment, then it would be pertinent to employ those methods instead. Using GTCp to isolate DNA and protein causes them to become less soluble, requiring the reconstitution of DNA in a weak base, such as NaOH, and solubilizing the protein in a buffer with a high concentration of detergent with heating, at the risk of incomplete solubilization. Additionally, GTCp contains guanidinium thiocyanate and acidic phenol, which inactivates enzymes such as proteases, but will slowly degrade protein over time unless frozen. It will be to the discretion of the researcher to decide if the circumvention of these limitations will be worthwhile.

Importantly, when working with RNA, a sterile technique, keeping the sample on ice unless otherwise noted, and the use of commercially available decontaminating reagent is recommended to keep the RNA intact. Notably, larger samples will need more GTCp to start with, in which each extraction solvent will also need to be scaled up. This protocol does not require any manual homogenization of the worm or cell samples when the correct amount of GTCp is used. In the context of DNA isolation, the yield is highly dependent on the proficiency to recover the organic (pink) layer. Finally, to improve the solubilization of proteins during isolation, increasing the volume of resolubilization buffer or adding other detergents besides SDS may be necessary. Indeed, proteins from an adult-only population of worms instead of a mixture of adults, larvae, and eggs are much easier to resolubilize.

Overall, using this protocol provides an integrated approach to biomolecule isolations and facilitates the interpretation of correlations, or lack thereof, between mRNA and protein levels that can arise from separately harvesting biomolecules from different samples. Using this method can help scientists to identify correctly cases where the translation of mRNA to protein is not correlative and can lead to the deeper investigation of posttranscriptional and posttranslational regulatory mechanisms under various conditions.

Materials

4–15% Mini-PROTEAN® TGX Stain-Free™ Protein Gels	BIORAD	4568084
<strong>Antibodies:</strong>
CePAS7-s	DHSB- U of Iowa
CeTAC1-s	DHSB- U of Iowa
DLG1-s	DHSB- U of Iowa
GRP78	Novus Bio.	NBp1-06274
HRP Goat Anti-Mouse	Li-Cor	926-80010
HRP Goat Anti-Rabbit	Li-Cor	92680011
HSP60-s	DHSB- U of Iowa
LMP1-s	DHSB- U of Iowa
MRP-1	Abcam	ab24102
Neuroligin 3	Abcam	ab172798
&beta;-actin	Millipore	MAB1501R
ChemiDoc MP Imaging System	BIORAD
Chloroform	Fisher	C298-500	Health hazard, Irritant, Toxic
Coomassie Brilliant Blue	ThermoSci	20279
DC Protein assay	BIORAD	500-0116
Epoch 2 microplate reader	BioTek
Ethanol (200 proof)	Fisher	04-355-223	Flammable, health hazard
HeLa cells	ATCC	CCL-2	BSL2
iScript Reverse Transcription Supermix	BIORAD	1708840
Hydra microdispenser: Matrix Hydra	Robbins/ThermoFisher
Isopropanol	Fisher	A516-4	Flammable, health hazard
<strong>M9 buffer</strong>:<br/> 3 g KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub><br/> 6 g Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub><br/> 5 g NaCl<br/> Add H<sub>2</sub>O to 1 liter. Sterilize by autoclaving.<br/> After solution cools down, add 1 mL sterile 1 M MgSO<sub>4</sub>
Laemmli Sample Buffer (2x)	BIORAD	161-0737
NanoDrop One	ThermoSci
PAGE apparatus	BIORAD
Ponceau S	Alfa Aesar	J60744
<strong>Primers</strong>	IDT		25 nmole DNA Oligo with Standard Desalting
dlg-1: F (5'-GGTCCTACCA<br/>GGCAGTTGAG-3')<br/> R (5'-CACGTCCGTT<br/>AACCTCTCCC-3')
hsp-4: F (5'-AGAGGGCTTT<br/>GTCAACCCAG-3')<br/> R (5'-TCGTCAGGGT<br/>TGATTCCACG-3')
hsp-70: F (5'-CGGCATGTGA<br/>ACGTGCTAAG-3')<br/> R (5'-GAGCAGTTGA<br/>GGTCCTTCCC-3')
hsp-60: F (5'-ATTGAGCAAT<br/>CGACGAGCGA-3')<br/> R (5'-CAACACCTCC<br/>TCCTGGAACG-3')
lmp-1: F (5'-ACAACAACAC<br/>CGGACTCACG-3')<br/> R (5'-ATCGAGCTCC<br/>CACTCTTTGG-3')
tac-1: F (5'-AGTGGCAGGC<br/>AAAGTTCCTC-3')<br/> R (5'-TGAGCACCTT<br/>GATCTCGTCG-3')
pas-7: F (5'-GTACGCTCAA<br/>AAGGCTGTCG-3')<br/> R (5'-CTGAATCGGC<br/>ATTGGCTCAC-3')
mrp-1: F (5'-TTTGCCTTGC<br/>GCTTGTTCTG-3')<br/> R (5'-AGTTCCAGTG<br/>CGGAGCATAC-3')
F07C4.12: F (5'-TGCTGAGCAT<br/>GAAGGACTGT-3')<br/> R (5'-TGGCAATAGC<br/>TCCTCCGTTG-3')
<strong>HK</strong> Actin: F (5'-CTACGAACTT<br/>CCTGACGGACAAG-3')<br/> R (5'-CCGGCGGACT<br/>CCATACC-3')
<strong>HK</strong> cyn-1: F (5'-GTGTCACCAT<br/>GGAGTTGTTC-3')<br/> R (5'-TCCGTAGATT<br/>GATTCACCAC-3')
<strong>HK</strong> nhr-23: F (5'-CAGAAACACT<br/>GAAGAACGCG-3')<br/> R (5'-CGATCTGCAG<br/>TGAATAGCTC-3')
<strong>HK</strong> ama-1: F (5'-TGGAACTCTG<br/>GAGTCACACC-3')<br/> R (5'-CATCCTCCTT<br/>CATTGAACGG-3')
<strong>HK</strong> cdc-42: F (5'-CTGCTGGACA<br/>GGAAGATTACG-3')<br/> R (5'-CTCGGACATT<br/>CTCGAATGAAG-3')
<strong>HK</strong> pmp-3: F (5'-GTTCCCGTGT<br/>TCATCACTCAT-3')<br/> R (5'-ACACCGTCGA<br/>GAAGCTGTAGA-3')
LightCycler 96 qPCR machine	Roche
<strong>RIPA buffer</strong>: 10 mM Tris-Cl (pH 8.0)<br/> 1 mM EDTA<br/> 1% Triton X-100<br/> 0.2% SDS<br/> 140 mM NaCl<br/> 1 tablet of Roche protease inhibitor per 20 mL
SsoAdvanced Universal SYBR Supermix	BIORAD	1725274
SuperSignal West Femto Max Sens Substrate	ThermoSci	34095
Trans-Blot Transfer apparatus	BIORAD
Trans-Blot Turbo Transfer Pack	BIORAD	170-4159
TRIzol reagent	Invitrogen	15596026	Health hazard (skin, eyes)
<strong>Worm strains:</strong>	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
N2 (wild type)	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
<em>eat-2 (MAH95)</em>	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
<em>rsks-1 (VB633)</em>	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)