Izolowanie złośliwych i niezłośliwych komórek B od lekko: eGFP danio pręgowanego

Podsumowanie

Transgeniczne lck:eGFP danio pręgowane silnie wyrażają GFP w limfocytach T i były używane do badania rozwoju limfocytów T i ostrej białaczki limfoblastycznej. Linia ta może być wykorzystana do badania limfocytów B, które wyrażają lck na niższych poziomach. Protokół ten opisuje oczyszczanie złośliwych i niezłośliwych komórek B z danio pręgowanego lck:eGFP.

Streszczenie

Danio pręgowany (Danio rerio) to potężny model do badania rozwoju limfocytów. Podobnie jak ssaki, D. rerio posiada adaptacyjny układ odpornościowy, który obejmuje limfocyty B i T. Badania limfopoezy danio pręgowanego są trudne, ponieważ przeciwciała rozpoznające markery powierzchniowe komórek D. rerio są na ogół niedostępne, co komplikuje izolację i charakterystykę różnych populacji limfocytów, w tym komórek linii B. Linie transgeniczne z ekspresją fluoroforu specyficzną dla linii są często używane do obejścia tego wyzwania. Transgeniczna linia lck:eGFP została wykorzystana do badania rozwoju limfocytów T D. rerio, a także do modelowania rozwoju limfocytów T i ostrej białaczki limfoblastycznej (T-ALL). Chociaż ryby lck:eGFP były szeroko stosowane do analizy linii T, nie były używane do badania limfocytów B. Niedawno odkryliśmy, że wiele limfocytów B danio pręgowanego również ulega ekspresji lck, choć na niższych poziomach. W związku z tym limfocyty B lck: eGFP również wyrażają niski poziom GFP. Na podstawie tego odkrycia opracowaliśmy protokół oczyszczania komórek linii B z danio pręgowanego lck:eGFP, o którym informujemy tutaj. Nasza metoda opisuje, jak wykorzystać aktywowany fluorescencyjnie sorter komórek (FACS) do oczyszczania komórek B z ryb lck: eGFP lub pokrewnych linii, takich jak podwójnie transgeniczny rag2: hMYC; lck:ryba eGFP. W tych liniach limfocyty B, szczególnie niedojrzałe limfocyty B, wyrażają GFP na niskich, ale wykrywalnych poziomach, co pozwala odróżnić je od limfocytów T, które wykazują wysoką ekspresję GFP. Limfocyty B można wyizolować ze szpiku, grasicy, śledziony, krwi lub innych tkanek. Protokół ten zapewnia nową metodę oczyszczania limfocytów B D. rerio, umożliwiając badania koncentrujące się na takich tematach, jak rozwój komórek B i nowotwory złośliwe limfocytów B.

Wprowadzenie

Danio pręgowany oferuje potężne atrybuty, takie jak manipulacja genetyczna, wysoka płodność, przezroczystość optyczna i szybki rozwój, które ułatwiają badanie rozwoju kręgowców za pomocą metod genetycznych. Te zalety, wraz ze wspólnymi cechami teleopoezy i hematopoezy ssaków, sprawiają, że D. rerio idealnie nadaje się do analiz in vivo limfopoezy i funkcji limfocytów, od ich najwcześniejszego pojawienia się u larw przez całą dorosłość. Rozwój krwi u danio pręgowanego opiera się na dobrze zachowanych procesach genetycznych, które są wspólne dla ssaków, a te rozciągają się na adaptacyjny układ odpornościowy. Dodatkowo, mechanizmy molekularne rządzące rozwojem limfoidalnym są niezwykle zachowane między danio pręgowanym a ssakami¹.

W ciągu ostatnich 2 dekad powstały transgeniczne linie D. rerio, które oznaczają określone linie krwi i linie mutantów, których brakuje w tych liniach^2,3,4,5. Jedna z nich, transgeniczna linia lck:eGFP, wykorzystuje promotor kinazy tyrozynowej białka limfocytów danio pręgowanego (lck) do napędzania ekspresji GFP⁶. Gen ten, który jest wysoce eksprymowany zarówno przez prekursory linii T, jak i dojrzałe limfocyty T, umożliwia śledzenie in vivo rozwoju limfocytów T grasicy i oczyszczanie ex vivo komórek linii T przez FACS⁷. Wcześniej używaliśmy tej linii w przesiewowym przesiewowym badaniu mutagenezy ENU do identyfikacji mutantów linii zarodkowej podatnych na T-ALL i do badania somatycznie nabytych zdarzeń genetycznych związanych z onkogenezą limfocytów T^8,9.

Ostatnio nasze laboratorium jeszcze bardziej rozszerzyło użyteczność danio pręgowanego lck:eGFP. W podwójnie transgenicznych rag2:hMYC (ludzki MYC), lck:eGFP D. rerio, o których wiadomo, że rozwijają T-ALL ¹⁰, odkryliśmy, że występuje również linia B ALL¹¹. W przeciwieństwie do T-ALL w tym modelu, które fluoryzują jasno ze względu na wysoką ekspresję GFP, B-ALL są słabo fluorescencyjne ze względu na niski poziom GFP, co pozwala na wyraźne odróżnienie ryb z B-ALL od tych z T-ALL za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Ta różnicowa ekspresja GFP umożliwia również oddzielenie komórek GFP^lo B-ALL od komórek GFP^hi T-ALL za pomocą FACS¹¹. Co więcej, niska ekspresja lck nie jest unikalna dla zebry B-ALL, ponieważ ludzki B-ALL również wyraża niskie poziomy LCK^11,12. Podobnie, normalne komórki linii B D. rerio, myszy i ludzi również wyrażają niskie poziomy lck/Lck/LCK, przy czym niedojrzałe komórki B mają najwyższą ekspresję^11,13. W przeliczeniu na komórkę, komórki linii B w danio pręgowanym lckeGFP lub liniach pochodnych wyrażają 1-10% więcej GFP niż limfocyty T. Te komórki^lo GFP wyrażają charakterystyczne mRNA komórek B, takie jak pax5, cd79b, blnk, btk, ighm, ighz i inne, i mogą być oczyszczane ze szpiku, grasicy, śledziony lub krwi obwodowej¹¹. W związku z tym zarówno komórki linii B, jak i T mogą być izolowane z zebry lckeGFP, a w przypadku zwierząt rag2hMYC, lckeGFP, komórek B i T-ALL również¹¹.

Tutaj prezentujemy nasz protokół skutecznego oczyszczania metodą FACS niezłośliwych komórek B z danio pręgowanego lck:eGFP oraz niezłośliwych lub złośliwych komórek B rag2hMYC; lck: eGFP ryb, przy użyciu różnych tkanek źródłowych. Takie komórki można również określić ilościowo za pomocą cytometrii przepływowej bez izolacji FACS, jeśli jest to pożądane. Odkrycie niskiej ekspresji lck - a co za tym idzie niskiej ekspresji GFP - przez limfocyty B otwiera nowe drzwi możliwości eksperymentalnych dla danio pręgowanego lckeGFP, takich jak badania rozwoju komórek B in vivo. Tak więc ta transgeniczna linia, po raz pierwszy opisana w 2004 roku, zyskuje nowe życie, ponieważ staramy się ją wykorzystać do zebrania nowych informacji na temat odporności adaptacyjnej danio pręgowanego.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące danio pręgowanego zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) przy Centrum Nauk o Zdrowiu Uniwersytetu w Oklahomie.

1. Izolowanie niezłośliwych limfocytów B i T od transgenicznych ryb lck:eGFP

1. Znieczulij ryby za pomocą 0,02% trikainy (MS-222) w wodzie z systemem rybnym.
2. Zbadaj ryby w wieku 2–6 miesięcy pod kątem fluorescencyjnej grasicy, która znajduje się w grzbietowo-przyśrodkowej części jamy skrzelowej danio pręgowanego i innych teleostów¹⁴. Użyj mikroskopu epifluorescencyjnego (długość fali wzbudzenia 470/40 i filtr emisyjny 525/50), aby wykryć GFP.
3. Przygotuj wcześniej 50 ml wysterylizowanego przez filtr 1x Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) zawierającego 1% płodowej surowicy bydlęcej i 1% penicyliny-streptomycyny (pożywka sortująca). Niewykorzystane media sortujące można przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 2 miesięcy.
4. Poddaj rybę eutanazji, umieszczając ją w zlewce zawierającej 0,2% trikainy na około 5 minut, a następnie zanurz w kąpieli lodowej. Potwierdź śmierć przez ustanie ruchu operkularnego (skrzela).
5. Umieść uśpioną rybę na szalce Petriego i przeprowadź sekcję interesujących nas narządów limfatycznych, używając mikroskopu fluorescencyjnego do wypreparowania GFP⁺ thymi¹⁴ i ustawień mikroskopii jasnego pola, aby wypreparować szpik nerkowy i śledzionę¹⁵. Przedstawione wyniki uzyskano na 3-miesięcznych rybach. Proporcje limfocytów i liczby bezwzględne różnią się w zależności od wieku i genotypu (więcej szczegółów w dyskusji).
6. Umieść każdy wypreparowany narząd w probówce o pojemności 1,5 ml zawierającej 500 μl zimnego podłoża sortującego.
7. Homogenizuj tkankę na lodzie za pomocą homogenizatora z mikrorurką tłuczkową.
8. Przepuść homogenizowaną tkankę przez filtr siatkowy o wielkości 35 μm, aby wytworzyć zawiesinę pojedynczej komórki. Trzymaj komórki na lodzie do czasu analizy.

2. Izolowanie złośliwych limfocytów z podwójnie transgenicznego rag2:hMYC; lck:eGFP Danio pręgowany

1. Począwszy od 2-4 miesięcy, przesiewowo mikroskopowo rag2:hMYC; lck:ryba eGFP pod kątem nieprawidłowych wzorców GFP.
   UWAGA: Limfocyty B są GFP^lo w tle lck:eGFP, więc B-ALL wymaga praktyki, aby rozpoznać; T-ALL jest oczywisty, ponieważ limfocyty T są^{GFP hi}. W związku z tym podwójna linia transgeniczna rag2:hMYC, lck:eGFP ma dwa fenotypy: jasno fluorescencyjny T-ALL, który zwykle powstaje z grasicy i rozciąga się do organizmu, oraz słabo fluorescencyjny B-ALL.
   1. Używając mikroskopu fluorescencyjnego, prześwietl ryby, używając ustawień "niskiej ekspozycji" (200 ms, wzmocnienie 2,4x), aby zidentyfikować jasny T-ALL (Rysunek 1A) i "wysoką ekspozycję" (1,5 s, 3,4x wzmocnienie), aby zidentyfikować przyciemnione B-ALL (Rysunek 1A). Kontrole WT i ryby przedbiałaczkowe mają GFP zlokalizowane tylko w grasicy (Rysunek 1B).
2. Znieczulić i zbadać rybę zgodnie z opisem w krokach 1.1–1.2.
3. Kategoryzuj ryby na podstawie stopnia fluorescencji GFP, korzystając z prostego systemu trzech kategorii:
   nuta: Poziom 1: Fluorescencja objawia się jako guz grasicy z ograniczonym rozprzestrzenianiem się miejscowym.
   Poziom 2: Fluorescencja pojawia się poza grasicą, obejmując <50% ciała.
   Poziom 3: Fluorescencja rozciąga się poza 50% ciała.
4. Oddziel ryby z ALL od tych bez raka. Monitoruj ryby w stanie przedbiałaczkowym (tj. Ryby bez guzów GFP⁺) raz w miesiącu pod kątem rozwoju nowej ALL. Do ~9 miesięcy wszystkie ryby rag2:hMYC, lck:eGFP rozwijają T-ALL, B-ALL lub oba.
5. Do izolacji komórek T- lub B-ALL wybierz ryby poziomu 3 (ALL obejmujące >50% ciała), które dają więcej niż 2 x 10⁶ komórek ALL i zazwyczaj znacznie więcej.
6. Poddaj rybę eutanazji zgodnie z krokiem 1.4.
   nuta: Istnieją dwie metody uzyskania WSZYSTKICH komórek: homogenizacja całego ciała i technika płukania otrzewnej¹⁶. Metody różnią się bezwzględną liczbą komórek pobranych do sortowania, a co za tym idzie, ilością wymaganego czasu FACS i kosztem (więcej szczegółów można znaleźć w dyskusji).
7. W przypadku każdej z tych metod najpierw umieść uśpioną rybę na szalce Petriego i za pomocą żyletki usuń głowę, w tym obszar grasicy. W razie potrzeby można to przetworzyć osobno lub wykorzystać do barwienia histologicznego.
8. Metoda mycia otrzewnej
   1. Za pomocą pipety P1000 przemyć jamę otrzewnową ryby 500 μl zimnego podłoża sortującego, zbierając komórki i pożywkę w probówce o pojemności 5 ml.
   2. Za pomocą świeżej końcówki pipety wstrzyknąć dodatkowe 200–300 μl zimnego podłoża sortującego do jamy ciała. Następnie, za pomocą końcówki pipety, delikatnie dociśnij ciało ryby, aby wyciągnąć komórki z jamy ciała. Zebrać tę pożywkę i dodać do probówki o pojemności 5 ml.
   3. Powtórz krok 2.8.2 2–3 razy. Zebrane komórki należy przechowywać na lodzie w pożywce do sortowania.
   4. Przefiltruj zawiesinę komórek przez filtr siatkowy 35 μm przed cytometrią przepływową/FACS i utrzymuj komórki na lodzie do czasu analizy.
9. Homogenizacja całego ciała
   1. Po wyjęciu głowy ryby umieść ciało w probówce o pojemności 1,5 ml zawierającej 200 μl pożywki sortującej.
   2. Homogenizuj ciało za pomocą homogenizatora z mikrorurką tłuczkową.
   3. Dodać dodatkowe 300 μl podłoża do sortowania na zimno. Przefiltruj zawiesinę komórek przez filtr siatkowy 35 μm. W razie potrzeby dodaj pożywkę sortującą, aby przepłukać wszystkie komórki przez filtr, aż na filtrze pozostaną tylko resztki tkanek. Trzymaj komórki na lodzie do czasu analizy.

3. Analiza cytometryczna prawidłowych lub złośliwych limfocytów B

1. Ustaw parametry analizy cytometrii przepływowej i/lub FACS zgodnie z przewodnikiem producenta.
2. Uzyskaj żądaną liczbę zdarzeń, aby wstępnie scharakteryzować próbkę. Analizuj zdarzenia 1 x 10⁴ do 5 x 10⁴ przed sortowaniem do określenia konkretnych bramek dla kolejnych kroków sortowania.
   1. Określ bramki: Zdefiniuj bramki limfocytów i komórek progenitorowych za pomocą parametrów rozpraszania do przodu (FSC) i rozpraszania bocznego (SSC), z wyłączeniem resztek komórkowych (Rysunek 2A-C)¹⁷. FSC i SSC odpowiadają odpowiednio wielkości/średnicy i ziarnistości komórki.
      nuta: Komórki GFP^-, GFP^lo i^{GFP hi} różnią się od 10 do 100 razy pod względem intensywności fluorescencji GFP, co ułatwia rozdzielenie tych populacji (ryc. 2-5). Dyskryminacja żywych żywych zwierząt może być oceniona na tym etapie za pomocą barwienia żywotności jodem propidyny (PI) lub 7-aminoaktynomycyną D (7-AAAD). Poprzednie eksperymenty z PI zazwyczaj wykazują >95% żywotność komórek GFP⁺ po FACS.
   2. Wyklucz dublety komórek, zgodnie z parametrami używanej maszyny FACS.
   3. W obrębie bramek limfoidalnych i/lub prekursorowych określ liczbę i procent komórek GFP⁺.
3. Użyj intensywności fikoerytryny (PE) i GFP, zdefiniuj bramkę dla komórek GFP^- vs. GFP^lo vs. GFP^hi.
   nuta: Limfocyty B wykazują słabą fluorescencję GFP, a limfocyty T wykazują jasną GFP w liniach lck: eGFP. Wiele narządów limfatycznych lub próbek guza zawiera obie populacje GFP⁺. Komórki linii B/B-ALL to GFP^lo, a komórki linii T/T-ALL to GFP^hi. Zdefiniuj bramki, aby rozróżnić komórki GFP^-,^{GFP lo} i^{GFP hi}, a następnie zbierz te populacje osobno ( Rysunek 2A-C, Rysunek 3A-C, Rysunek 4A i Rysunek 5A).
4. Posortuj każdą populację komórek do różnych probówek polipropylenowych o pojemności 15 ml zawierających 2 ml pożywki sortującej lub bezpośrednio do różnych probówek o pojemności 1,5 ml zawierających odpowiedni bufor do dalszych analiz (np. ekstrakcji RNA, DNA lub białka, allotransplantacji itp.).
5. Oczyszczone komórki należy przechowywać na lodzie przed dalszymi analizami.

Wyniki

Do analizy wykorzystaliśmy cytometrię przepływową, a do izolacji GFP system FACS.^lo oraz GFP^cześć komórki z grasicy, szpiku nerkowego i śledziony lck:eGFP transgeniczne rybki danio prążkowane. Analiza ryb w wieku 3 miesięcy wykazała, że grasica składała się głównie z GFP⁺ limfocyty. GFP⁺ komórki znajdowały się głównie w bramce limfocytów opisanej wcześniej przez Traver i współpracowników.¹⁷Dwa odrębne GFP⁺

Dyskusja

Opracowaliśmy i udostępniliśmy protokół izolacji komórek B z transgenicznego danio pręgowanego lck:eGFP, dodając go do innych modeli D. rerio z etykietami linii B ^3,4. Nieco zaskakujące jest to, że identyfikacja komórek GFP^lo B w tej linii pozostała niezauważona od czasu jej opisu w 2004 roku. Ogólnie rzecz biorąc, lck jest uważany za specyficzny dla limfocytów T⁶, ale ostatnie badania wykazały nieocze...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
35 &mikro; m siatka	Sefar Technologia filtrów	7050-1220-000-13
5 ml Polistyrenowa rurka z okrągłym dnem z nasadką sitową	Falcon Corning Brand	352235
Rurka stożkowa 50 ml	VWR international	525-0448
AZ APO 100 Mikroskop fluorescencyjny	Nikon
Cytoflex	Beckman Coulter
DS-Qi1MC camara	Nikon
Metanosulfonian 3-aminobenzoesanu etylu; MS-222	Sigma	E-10521
FACSJazz	BD Biosciences
Surowica bydlęca	płodu Thermo Fisher	10437028
FlowJo v10.2	FlowJo, LLC
em>lck:eGFP			See Langeneu et al., 2004
NIS Elements software	Nikon	Version 4.13
Penicilin-Streptomycin	Sigma	P4333
Homogenizatory mikrorurkowe Tłuczek	Mikroskopia elektronowa Sciences	64788-20
Pipety
rag2:hMYC-ER			Patrz Gutierrez et al., 2011
RPMI Media 1640 1x	Life Technologies	11835-030

< do transferu tworzyw sztucznych