Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Nowy ludzki nabłonkowy enteroidalny model martwiczego zapalenia jelit

7.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59194

⸱

10 kwietnia 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Northwestern University, 2Division of Pediatric Surgery, Ann & Robert H. Lurie Children's Hospital of Chicago

W tym artykule

Podsumowanie

Enteroidy wyłaniają się jako nowy model w badaniach nad chorobami ludzkimi. Protokół opisuje, w jaki sposób symulować enteroidalny model ludzkiego martwiczego zapalenia jelit za pomocą leczenia lipopolisacharydami (LPS) enteroidów generowanych z tkanki noworodka. Pobrane enteroidy wykazują zmiany zapalne podobne do tych obserwowanych w ludzkim martwiczym zapaleniu jelit.

Streszczenie

Martwicze zapalenie jelit (NEC) jest wyniszczającą chorobą noworodków. Charakteryzuje się wieloma zmianami patofizjologicznymi w nabłonku jelit człowieka, co prowadzi do zwiększonej przepuszczalności jelit, upośledzenia restytucji i zwiększonej śmierci komórek. Chociaż istnieje wiele zwierzęcych modeli NEC, reakcja na uraz i interwencje terapeutyczne mogą być bardzo zróżnicowane w zależności od gatunku. Co więcej, z etycznego punktu widzenia trudno jest badać patofizjologię choroby lub nowe środki terapeutyczne bezpośrednio u ludzi, zwłaszcza u dzieci. W związku z tym wysoce pożądane jest opracowanie nowego modelu NEC z wykorzystaniem tkanki ludzkiej. Enteroidy to trójwymiarowe organoidy pochodzące z komórek nabłonka jelitowego. Idealnie nadają się do badania złożonych interakcji fizjologicznych, sygnalizacji komórkowej i obrony gospodarz-patogen. W tym manuskrypcie opisujemy protokół, w którym hoduje się ludzkie enteroidy po wyizolowaniu jelitowych komórek macierzystych od pacjentów poddawanych resekcji jelita. Komórki krypty są hodowane w pożywkach zawierających czynniki wzrostu, które zachęcają do różnicowania się w różne typy komórek natywnych dla ludzkiego nabłonka jelitowego. Komórki te są hodowane w syntetycznej, kolagenowej mieszance białek, które służą jako rusztowanie, naśladując zewnątrzkomórkową błonę podstawną. W rezultacie enteroidy rozwijają polaryzację wierzchołkowo-podstawno-boczną. Jednoczesne podawanie lipopolisacharydu (LPS) w pożywce powoduje reakcję zapalną w enteroidach, prowadząc do zmian histologicznych, genetycznych i ekspresji białek podobnych do tych obserwowanych w ludzkim NEC. Eksperymentalny model NEC wykorzystujący tkankę ludzką może stanowić dokładniejszą platformę do testowania leków i leczenia przed badaniami na ludziach, ponieważ staramy się znaleźć lekarstwo na tę chorobę.

Wprowadzenie

Ludzkie enteroidy to trójwymiarowy system hodowli ex vivo generowany z komórek macierzystych wyizolowanych z krypt jelitowych próbek ludzkiej tkanki jelitowej. Ten przełomowy model został zapoczątkowany przez Hansa Cleversa i in. w 2007 roku po odkryciu komórek macierzystych Lgr5+ w kryptach jelita cienkiego u myszy1. Ich praca położyła podwaliny pod stworzenie ex vivo nabłonka jelitowego wielu typów komórek, które mogły być pasażowane bez znaczących zmian genetycznych lub fizjologicznych2. Od czasu tego odkrycia, enteroidy są wykorzystywane jako nowy model do badania prawidłowej fizjologii trawienia i patofizjologii chorób jelit, takich jak nieswoiste zapalenie jelit, interakcje gospodarz-patogen i medycyna regeneracyjna2.

Wykorzystanie enteroidów jako modelu ex vivo do badania patofizjologii jelit ma kilka zalet w porównaniu z alternatywnymi technikami. Przez ostatnie kilkadziesiąt lat modele zwierzęce i nieśmiertelne linie komórkowe pochodzące z raka jelita były wykorzystywane do badania fizjologii jelit3,4,5. Hodowle jednokomórkowe nie reprezentują różnorodności typów komórek obecnych w normalnym nabłonku jelitowym, a tym samym brakuje im wzajemnych oddziaływań między komórkami i swoistości segmentowej w ekspresji białek, sygnalizacji i chorobie wywołanej przez patogen6. Komórki macierzyste w enteroidach różnicują się w główne typy komórek nabłonkowych, takie jak enterocyty, komórki Panetha, komórki kubkowe, komórki enteroendokrynne i inne3. Wykazują one polaryzację, pełnią funkcje transportu nabłonkowego i pozwalają na specyficzność segmentu jelitowego6. Ponieważ enteroidy mogą rekapitulować wiele typów komórek ludzkiego nabłonka jelitowego, są w stanie przezwyciężyć to uznane ograniczenie systemów opartych na komórkach rakowych. Z biegiem czasu pochodne linii komórkowych są subklonowane i ewoluują, wykazując większą różnorodność w ekspresji i lokalizacji białek3. Wręcz przeciwnie, enteroidy mogą być pasażowane bez znaczących zmian genetycznych lub fizjologicznych2. Chociaż istnieje wiele modeli zwierzęcych NEC, reakcja na uraz i interwencje terapeutyczne mogą być bardzo zróżnicowane w zależności od gatunku. W wyniku tych ograniczeń, terapie pochodzące z modeli zwierzęcych zawodzą w 90% przypadków, gdy są testowane w badaniach na ludziach z powodu różnic w toksyczności lub skuteczności3. Enteroidy służą jako obiecujące modele przedkliniczne, które mogą przezwyciężyć te niedobory, prowadząc do lepszego zrozumienia złożonej patofizjologii jelit, a tym samym do bardziej skutecznych i opłacalnych innowacji terapeutycznych. Istnieją również niedawne dowody na to, że wiek tkanki, z której powstaje enteroid, pozostaje biologicznie ważny7. Jest to szczególnie ważny szczegół dla naszego modelu, ponieważ enteroidy są generowane z tkanki noworodka, zachowując w ten sposób fizjologiczne znaczenie dla pacjentów z NEC.

Użyteczność enteroidów jako modeli ludzkich chorób wciąż rośnie, w nadziei na znalezienie lekarstw na ciężkie i wszechobecne stany. Martwicze zapalenie jelit (NEC) jest wyniszczającą chorobą jelit noworodków, charakteryzującą się martwicą jelit i często prowadzi do perforacji ściany jelita, posocznicy i śmierci8. Ze względu na złożoną i wieloczynnikową patofizjologię NEC, dokładny mechanizm choroby nie został jeszcze w pełni wyjaśniony; Jednak zwiększona przepuszczalność jelit jest wyraźnie związana z procesem chorobowym8. Biorąc pod uwagę, że badanie NEC i potencjalnych środków terapeutycznych jest etycznie trudne u ludzi, zwłaszcza dzieci, wysoce pożądane jest wykorzystanie biologicznie istotnego enteroidalnego modelu NEC przy użyciu ludzkiej tkanki noworodka. Do tej pory enteroidy odgrywają ograniczoną rolę w badaniu NEC. Protokół ten opisuje zastosowanie enteroidów pochodzących z próbek ludzkich tkanek jelitowych jako nowego modelu ex vivo do badania martwiczego zapalenia jelit.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Uzyskano zgodę instytucjonalnej komisji rewizyjnej (IRB #2013-15152) na pobieranie próbek tkanek od pacjentów poddawanych resekcji jelita w Szpitalu Dziecięcym Ann and Robert H. Lurie w Chicago, Chicago, IL. Wszystkie protokoły zostały przeprowadzone zgodnie z instytucjonalnymi i krajowymi wytycznymi i przepisami dotyczącymi dobrostanu człowieka. We wszystkich przypadkach wymagana była pisemna świadoma zgoda rodziców, którą uzyskano przed pobraniem próbki.

1. Przygotowanie odczynnika

  1. Przygotuj roztwór podstawowy pożywki hodowlanej do pobrania całych tkanek: 1 l zmodyfikowanego podłoża Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco, 110 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 11 ml penicyliny-streptomycyny (stężenie końcowe 1%) i 1,1 ml insuliny sterylizowanej filtrem (stężenie końcowe 0,1%). Przechowywać roztwór podstawowy w temperaturze 4 °C.
  2. Przygotuj bufor chelatujący #1: 30 ml pożywki hodowlanej (zgodnie z opisem w 1.1), 600 μl 0,5 M kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) (końcowe stężenie 10 mM), 300 μl gentamycyny (stężenie końcowe 1%) i 60 μl amfoterycyny B (stężenie końcowe 0,2%). Przechowywać roztwór podstawowy w temperaturze 4 °C.
  3. Przygotuj bufor chelatujący #2: 30 ml pożywki hodowlanej (zgodnie z opisem w 1.1), 300 μl 0,5 M EDTA (stężenie końcowe 5 mM), 300 μl gentamycyny (stężenie końcowe 1%) i 60 μl amfoterycyny B (stężenie końcowe 0,2%). Przechowywać roztwór podstawowy w temperaturze 4 °C.
  4. Przygotowanie pożywki dla ludzkich minijelit: 41,4 ml DMEM/F-12, 5 ml FBS (końcowe 10%), 500 μL penicyliny-streptomycyny (końcowe stężenie 1%), 500 μL L-glutaminy (końcowe stężenie 1%), 500 μL gentamycyny (końcowe stężenie 1%), 100 μL amfoterycyny B (końcowe stężenie 0,2%), 500 μL 1 M kwasu N-2-hydroksyetylopiperazyno-N-2-etanosulfonowego (HEPES) (stężenie końcowe 10 mM), 500 μl 100x suplementu N-2 i 1 ml 50x suplementu B-27 minus witamina A, co daje całkowitą objętość 50 ml. Przechowywać roztwór podstawowy w temperaturze -20 °C.
  5. Przygotowanie kompletnego ludzkiego podłoża dla minijelitów: 10 ml ludzkiego podłoża dla minijelita (przygotowanego w 1.4), 10 μl 100 μg/ml Wnt3a (stężenie końcowe 100 ng/mL), 10 μl 100 μg/ml Noggin (stężenie końcowe 100 ng/mL), 10 μL 1 mg/ml R-Spondyny (stężenie końcowe 1 μg/mL), 10 μL 500 μg/ml naskórkowego czynnika wzrostu (EGF) (stężenie końcowe 50 ng/ml), 10 μL 1 M N-acetylocysteiny (stężenie końcowe 1 mM), 10 μL 10 mM Y-27632 (stężenie końcowe 10 μM), 10 μL 500 μM A-83 (stężenie końcowe 500 nM), 10 μL 10 mM SB202190 (stężenie końcowe 10 μM), 100 μl 1 M nikotynamidu (stężenie końcowe 10 mM) i 1 μl 100 μM [leu] 15-gastryna 1 (stężenie końcowe 10 nM). Całkowita objętość 10 ml. Przechowywać roztwór podstawowy w temperaturze 4 °C.
    nuta: Roztwory należy zużyć w ciągu 48 godzin.

2. Izolacja krypty i poszycie z całej tkanki

  1. W momencie pobierania na salę operacyjną należy umieścić próbkę ludzkiej tkanki jelita cienkiego w zimnym roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco. Umyj próbkę w zimnym DPBS, aż będzie wolna od stolca i krwi. Przechowywać próbkę w temperaturze 4 °C w pożywce RPMI 1640 do czasu, aż będzie gotowa do izolacji krypty.
    nuta: Tkanka nie może być przechowywana dłużej niż 24 godziny.
    1. Upewnij się, że próbka jest wolna od stolca i krwi. Za pomocą delikatnych nożyczek preparacyjnych usuń nadmiar tłuszczu lub klipsy chirurgiczne/zszywki itp. Zważyć próbkę.
      nuta: Celuj w kawałek o wadze około 0,75-2,5 g.
  2. Pokrój próbkę na kawałki o długości 0,5 cm i umieść w 30 ml buforu chelatującego #1 (przygotowanego w kroku 1.2).
    1. Wstrząsać na niskich obrotach przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
    2. Przefiltruj tkankę przez sitko komórkowe 100 μm i przeprowadź przez nie przepływ odrzutów.
  3. Dodaj tkankę do 30 ml buforu chelatującego #2 (przygotowanego w kroku 1.3).
    1. Wstrząsać na niskich obrotach przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
    2. Przefiltruj tkankę przez sitko o średnicy 100 μm i przepuść przez nie odrzut
      3. .
  4. Rozmrozić 500 ml matrycy błony podstawnej na lodzie do użycia w kroku 2.8.
  5. Dodaj chusteczkę do 10 ml zimnego DMEM w stożkowej probówce o pojemności 50 ml i energicznie wstrząsaj ręcznie przez 10 s.
    1. Przefiltruj przez sitko o wielkości 100 μm i zbierz przez nie przepływ (etykieta #1). Trzymaj rurkę #1 na lodzie.
    2. Dodaj tkankę do kolejnych 10 ml zimnego DMEM w osobnej stożkowej probówce o pojemności 50 ml i energicznie wstrząsaj ręcznie przez 10 s.
    3. Przefiltruj przez sitko o wielkości 100 μm i zbierz przez nie (etykieta #2).
    4. Powtórz jeszcze dwa razy, aż pojawią się cztery stożkowe rurki z przepływem (oznaczone rurki #1-4).
  6. Przefiltruj roztwór probówki #1 przez sitko o pojemności 100 μm i przenieś przepływ do stożkowej probówki o pojemności 15 ml (etykieta #1). Powtórz dla #2-4.
    1. Odwirować 15 ml probówki #1-4 przy 200 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
  7. W okapie z przepływem laminarnym usuń supernatant z probówek #1-4 i wyrzuć. Należy unikać rozerwania chmury tkanki znajdującej się bezpośrednio nad osadem, nawet jeśli oznacza to pozostawienie części supernatantu.
    1. Pipetując powoli, wymieszać granulki z pozostałościami supernatantu w probówkach #1-4.
    2. Przenieś mieszaninę z probówek #1-4 do jednej stożkowej probówki o pojemności 2 ml.
    3. Odwirować stożkową probówkę o masie 200 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
  8. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 500 μl matrycy membrany podstawnej.
    UWAGA:     Utrzymuj matrycę błony podstawnej na lodzie przez cały czas i szybko pracuj, aby przejść do kolejnych kroków. Produkt ten bardzo szybko polimeryzuje w temperaturze pokojowej.
    1. Nanieść 50 μl zawiesiny matrycy próbki/błony podstawnej na środek studzienki w płytce 24-dołkowej. Powinno to wyglądać w kształcie kopuły.
      nuta: Zastosowanie schłodzonych końcówek pipet pomaga w płynniejszym przenoszeniu zawiesiny, minimalizując polimeryzację.
    2. Powtórz 9 razy, aby napełnić łącznie 10 dołków.
  9. Umieścić 24-dołkową płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 na 30 minut, aby umożliwić polimeryzację.
  10. Dodać 500 μl Human Minigut Media Complete (przygotowanego w kroku 1.5) do każdej studzienki. Wymieniaj co 2 dni.
  11. Zbierz enteroidy po 5-10 dniach, gdy uwidoczni się pączkowanie. Zobacz kroki 4 i 5, aby uzyskać instrukcje dotyczące zbierania.

3. Indukcja eksperymentalnego NEC

  1. Dodać 10 μl 5 mg/ml lipopolisacharydu (LPS) do 500 μl Human Minigut Media Complete (przygotowanego w kroku 1.5) do każdej studzienki w dniu 0. Wymieniaj co 2 dni aż do odbioru.

4. Przygotowanie do zatapiania parafiny

  1. Delikatnie wyjmij nośnik.
    1. Dodać 1 ml PBS i delikatnie pipetować w górę iw dół, aby rozpuścić macierz błony podstawnej, uważając, aby nie doszło do lizy enteroidów.
    2. Odwirować mieszaninę PBS/enteroid przy <300 x g przez 5 minut w celu osadzenia i usunięcia PBS.
  2. Dodaj 4% paraformaldehydu, aby utrwalić w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
  3. Wirować przy <300 x g przez 5 minut do osadzania, a następnie usunąć PBS.
    1. Delikatnie przemyć 1 ml PBS i odwirować przy <300 x g przez 5 minut do osadzania, a następnie usunąć PBS.
    2. Powtórz krok 4.3.1.
  4. Stopić odpowiednią objętość żelu do przetwarzania tkanek (około 300 μl), umieszczając żądaną ilość w stożkowej probówce i ogrzewając ją w inkubatorze do suchej kąpieli w temperaturze 65 °C przez 3-10 minut do uzyskania płynu.
    1. Dodaj żel do przetwarzania tkanek do granulki i delikatnie wymieszaj.
    2. Na szkiełku nakrywkowym umieść mały pierścień do klonowania.
    3. Odpipetować mieszaninę żelu do przetwarzania tkanek i enteroidów do pierścienia klonującego zamontowanego na szkiełku nakrywkowym.
  5. Pozostawić mieszaninę żelu do przetwarzania tkanek i enteroidów do zestalenia się w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę.
    1. Zanurz pierścień klonujący ze zestaloną mieszaniną w 70% etanolu w celu przygotowania do zatapiania parafiny.

5. Pobieranie enteroidów do ekstrakcji RNA i białek

  1. Delikatnie wyjmij Human Minigut Media Complete z każdej studzienki.
  2. Dodać 1 ml PBS i delikatnie pipetować w górę i w dół, aby rozpuścić matrycę błony podstawnej. Uważaj, aby nie rozdzielić enteroidów.
    1. Umieść mieszaninę PBS/enteroidów w sterylnej stożkowej probówce o pojemności 2 ml.
    2. Wirować przy <300 x g przez 5 minut do osadzania.
    3. Delikatnie usuń PBS, uważając, aby nie usunąć enteroidów.
  3. Powtórz krok serii 5.2 jeszcze dwa razy.
  4. Zamrażać w temperaturze -80 °C do momentu przygotowania do ekstrakcji białka i/lub RNA.
  5. Przeprowadzić ekspresję genów i izolację białek enteroidów przy użyciu dobrze znanych technik qRT-PCR i Western Blotting.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Bezpośrednio po wysianiu, świeżo wyizolowane krypty jelitowe mają kształt wydłużonych prętów. W ciągu kilku godzin enteroidy przyjmą okrągły wygląd (Rycina 1a). W ciągu kolejnych kilku dni enteroidy zaczną formować sfery, co widoczne jest na Rycynie 1b. Pączkowanie powinno nastąpić między 5. a 10. dniem (Rycina 1c) i to właśnie w tym czasie należy pr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Ten nowatorski model enteroidów jelitowych ludzkich ex vivo służy jako użyteczna metoda do badania dysfunkcji bariery jelitowej w martwiczym zapaleniu jelit (NEC). Przedstawione tutaj metody przetwarzania enteroidów zostały zaadaptowane z poprzednich prac dr Misty Good, Michaela Helmratha i Jasona Wertheima 10,11,12.

Szczegóły dotyczące całego pobierania tkanek i czasu izolacji krypty są krytycznymi k...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez National Institute of Health Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Disease Grant (K08DK106450) oraz nagrodę Jay Grosfeld Award od American Pediatric Surgical Association dla C.J.H.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
4% ParaformaldehydThermoFisherAAJ19943K2
A-83R& D Tocris2939/10
Amfoterycyna BSuplement ThermoFisher15290026
B-27 bez witaminy AThermoFisher17504-044
Matryca membrany podstawnej (Matrigel)CorningCB-40230C
DMEM/F-12ThermoFisherMT-16-405-CV
Dulbecco' s Zmodyfikowane podłoże Eagle (DMEM)ThermoFisher11-965-118
Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (DPBS)ThermoFisher14190-144
Naskórkowy czynnik wzrostu (EGF)SigmaE9644-.2MG
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)SigmaEDS-500G
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Gemini Bio-Pro100-125
GentamycynaSigmaG5013-1G
GlutaMAX ( L-glutamina)ThermoFisher35050-061
InsulinaSigmaI9278-5mL
[leu] 15-gastryna 1SigmaG9145-.1MG
Lipopolisacharyd (LPS)SigmaL2630-25MG
Suplement N-2ThermoFisher17502-048
Kwas N-2-hydroksyetylopiperazyno-N-2-etanosulfonowy (HEPES)ThermoFisher15630-080
N-acetylocysteinaSigmaA9165-5G
NikotynamidSigmaN0636-100G
NogginR& D Systems INC6057-NG/CF
Penicylina-StreptomycynaThermoFisher15140-148
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)SigmaP5368-5X10PAK
RPMI 1640 MediumInvitrogen11875093
R-SpondinPEPROTECH INC120-38
SB202190SigmaS7067-5MG
Żel do przetwarzania tkanek (Histogel)ThermoFisher22-110-678
Wnt3aR& Systemy D INC5036-WN-010
Y-27632SigmaY0503-1MG

Bibliografia

  1. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  2. Zachos, N. C., et al. Human Enteroids/Colonoids and Intestinal Organoids Functionally Recapitulate Normal Intestinal Physiology and Pathophysiology. The Journal of Biological Chemistry. 291 (8), 3759-3766 (2016).
  3. Foulke-Abel, J., et al. Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract. Experimental Biology and Medicine (Maywood). 239 (9), 1124-1134 (2014).
  4. Hidalgo, I. J., Raub, T. J., Borchardt, R. T. Characterization of the human colon carcinoma cell line (Caco-2) as a model system for intestinal epithelial permeability. Gastroenterology. 96 (3), 736-749 (1989).
  5. Hilgers, A. R., Conradi, R. A., Burton, P. S. Caco-2 cell monolayers as a model for drug transport across the intestinal mucosa. Pharmaceutical Research. 7 (9), 902-910 (1990).
  6. In, J. G., et al. Human mini-guts: new insights into intestinal physiology and host-pathogen interactions. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 13 (11), 633-642 (2016).
  7. Senger, S., et al. Human Fetal-Derived Enterospheres Provide Insights on Intestinal Development and a Novel Model to Study Necrotizing Enterocolitis (NEC). Cell and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 549-568 (2018).
  8. Moore, S. A., et al. Intestinal barrier dysfunction in human necrotizing enterocolitis. Journal of Pediatric Surgery. 51 (12), 1907-1913 (2016).
  9. Neal, M. D., et al. A critical role for TLR4 induction of autophagy in the regulation of enterocyte migration and the pathogenesis of necrotizing enterocolitis. The Journal of Immunology. 190 (7), 3541-3551 (2013).
  10. Lanik, W. E., et al. Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation. Journal of Visualized Experiments. (132), 56921(2018).
  11. Mahe, M. M., Sundaram, N., Watson, C. L., Shroyer, N. F., Helmrath, M. A. Establishment of human epithelial enteroids and colonoids from whole tissue and biopsy. Journal of Visualized Experiments. (97), 52483(2015).
  12. Uzarski, J. S., Xia, Y., Belmonte, J. C., Wertheim, J. A. New strategies in kidney regeneration and tissue engineering. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 23 (4), 399-405 (2014).
  13. Leaphart, C. L., et al. A critical role for TLR4 in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis by modulating intestinal injury and repair. The Journal of Immunology. 179 (7), 4808-4820 (2007).
  14. Neal, M. D., et al. Enterocyte TLR4 mediates phagocytosis and translocation of bacteria across the intestinal barrier. The Journal of Immunology. 176 (5), 3070-3079 (2006).
  15. Sodhi, C. P., et al. Intestinal epithelial Toll-like receptor 4 regulates goblet cell development and is required for necrotizing enterocolitis in mice. Gastroenterology. 143 (3), 708-718 (2012).
  16. Koo, B. K., et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature Methods. 9 (1), 81-83 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

ludzkie enteroidymodel martwiczo wyprzedzaj cego zapalenia jelitjelitowe kom rki macierzysteizolacja krypttraktowanie LPSmacierz b ony podstawnejpo ywka do ludzkich minijelitreceptor Toll podobny 4analiza qRT PCRwestern blotting
Nowy ludzki nabłonkowy enteroidalny model martwiczego zapalenia jelit
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.