Dośluzówkowa inokulacja komórek raka płaskonabłonkowego u myszy w celu profilowania immunologicznego guza i oceny odpowiedzi na leczenie

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy powtarzalną metodę tworzenia ortotopowego mysiego modelu raka płaskonabłonkowego głowy i szyi. Guzy wykazują klinicznie istotne cechy histopatologiczne choroby, w tym martwicę, słabe różnicowanie, przerzuty węzłowe i naciek immunologiczny. U myszy z guzem rozwijają klinicznie istotne objawy, w tym dysfagię, przemieszczenie szczęki i utratę wagi.

Streszczenie

Rak płaskonabłonkowy głowy i szyi (HNSCC) jest wyniszczającą i śmiertelną chorobą z dużą częstością nawrotów i niepowodzeniem leczenia. Aby opracować lepsze strategie terapeutyczne, ważne jest zrozumienie czynników mikrośrodowiskowych guza, które przyczyniają się do oporności na leczenie. Główną przeszkodą w zrozumieniu mechanizmów choroby i ulepszeniu terapii jest brak mysich linii komórkowych, które przypominają agresywną i przerzutową naturę ludzkich HNSCC. Ponadto większość modeli mysich wykorzystuje podskórne implantacje guzów, które nie mają ważnych cech fizjologicznych okolicy głowy i szyi, w tym dużej gęstości naczyń, rozległego unaczynienia limfatycznego i rezydentnej flory śluzówkowej. Celem pracy jest opracowanie i scharakteryzowanie ortotopowego modelu HNSCC. Wykorzystujemy dwie genetycznie odrębne linie komórek mysich i ustalone guzy w błonie śluzowej policzka myszy. Optymalizujemy metody trawienia guzów oparte na kolagenazie w celu optymalnego odzyskiwania pojedynczych komórek z powstałych guzów. Przedstawione tutaj dane pokazują, że u myszy rozwijają się silnie unaczynione guzy, które dają przerzuty do regionalnych węzłów chłonnych. Analiza wieloparametrycznej cytometrii masowej pojedynczej komórki wykazuje obecność różnych populacji immunologicznych, przy czym komórki szpikowe stanowią większość wszystkich komórek odpornościowych. Model zaproponowany w tym badaniu ma zastosowanie w biologii nowotworów, immunologii nowotworów i przedklinicznym rozwoju nowych terapii. Podobieństwo modelu ortotopowego do klinicznych cech choroby u ludzi dostarczy narzędzia do lepszego przekładu i poprawy wyników leczenia pacjentów.

Wprowadzenie

HNSCC jest piątym najczęściej występującym nowotworem złośliwym na świecie, z ponad 600 000 pacjentów diagnozowanych rocznie¹. Pomimo agresywnego leczenia obejmującego chemioterapię i radioterapię (RT), wskaźnik całkowitego przeżycia (OS) dla pacjentów z HNSCC bez zakażenia wirusem brodawczaka ludzkiego (HPV) utrzymuje się poniżej 50% po 5 latach². Jest to w dużej mierze przypisywane bardzo złożonemu mikrośrodowisku guza, ponieważ guzy mogą pochodzić z kilku różnych miejsc anatomicznych w okolicy głowy i szyi, w tym błony śluzowej policzka, języka, dna jamy ustnej, jamy nosowej, jamy ustnej, gardła, części ustnej i gardła dolnego. Ponadto obszar głowy i szyi jest silnie unaczyniony i zawiera prawie połowę wszystkich węzłów chłonnych w ciele³. Większość badań dotyczących biologii nowotworów głowy i szyi opiera się na modelach guzów w okolicy boku. Takie modele mogą zapewnić wgląd w mechanizmy wewnętrzne nowotworu, ale brak natywnego mikrośrodowiska głowy i szyi może znacząco wpłynąć na potencjał translacyjny takich odkryć. Jedną z metod, która została zastosowana do wywołania nowotworów jamy ustnej, jest narażenie na rakotwórczy 9,10-dimetylo-1,2-benzantracen (DMBA)⁴. Jednak metoda ta wiąże się z długotrwałym procesem, indukuje nowotwory u szczurów i chomików, ale nie u myszy, a powstałe guzy nie posiadają wielu cech histologicznych zróżnicowanych SCCs^5,6. Wprowadzenie czynnika rakotwórczego-1-nitrochinoliny (4-NQO), rozpuszczalnej w wodzie pochodnej chinolonu, spowodowało nowotwory jamy ustnej myszy po podaniu doustnym, ale cierpiało również z powodu długich czasów ekspozycji (16 tygodni) i ograniczonego wskaźnika przyjmowania w obrębie i między partiami myszy^7,8,9. W celu opracowania klinicznie istotnych modeli, kilka grup wykorzystało genetycznie zmodyfikowane modele obejmujące manipulację onkogenami napędowymi lub genami supresorowymi nowotworów, w tym TP53, TGFB, KRAS, HRAS i SMAD4¹⁰. Modele te mogą oferować wgląd w nowotwory ze znanymi genami sterującymi, ale nie podsumowują złożonej heterogeniczności ludzkich HNSCC.

W tej pracy pokazujemy możliwość przeprowadzenia dośluzówkowej inokulacji komórek raka płaskonabłonkowego u myszy. Zaszczepione komórki przekształcają się w agresywne guzy w ciągu 1 tygodnia od wstrzyknięcia. Podobnie jak w przypadku ludzkich HNSCC, guzy dają przerzuty do regionalnych węzłów chłonnych. Charakteryzujemy histologiczne i kliniczne cechy choroby oraz zapewniamy wgląd w mikrośrodowisko immunologiczne guza. Proponujemy, aby ten ortotopowy model HNSCC miał zastosowanie w biologii nowotworów, immunologii nowotworów i badaniach przedklinicznych. Mechanizmy unikania odpowiedzi immunologicznej, progresji nowotworu, oporności na leczenie i przerzutów reprezentują obszary o znaczeniu klinicznym, które można rozwiązać za pomocą proponowanego modelu.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem zwierząt zostały przeprowadzone zgodnie z zatwierdzonym protokołem instytucjonalnej komisji ds. opieki i użytkowania zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Kolorado w Denver (protokół nr 00250).

1. Hodowla komórek nowotworowych

UWAGA: Linie komórkowe B4B8 i LY2 zostały wykorzystane do wytworzenia ortotopowych guzów HNSCC: komórki nowotworowe B4B8 pochodziły z keratynocytów błony śluzowej przekształconych kancerogenami (z myszy BALB/C)¹¹. Komórki nowotworowe LY2 pochodziły z przerzutów do węzłów chłonnych spontanicznie przekształconej linii keratynocytów BALB/C (Pam 212)^12,13. Obie linie komórkowe zostały uprzejmie udostępnione przez dr. Nadarajaha Vigneswarana (UTHealth, Houston, TX, USA).

1. Do utrzymania linii komórkowych należy używać zmodyfikowanej pożywki Eagle'a w wersji Dulbecco (DMEM) F/12 uzupełnionej o 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% odczynnika przeciwdrobnoustrojowego. Linie komórkowe należy hodować w sterylnym inkubatorze w temperaturze 37 °C i przy 5% CO₂. Komórki powinny zostać wykorzystane do inokulacji przed przekroczeniem 15 pasaży.
2. Wysiać od 2 x 10⁶ do 4 x 10⁶ komórek do kolb hodowlanych o powierzchni 175 cm².
   UWAGA: Należy upewnić się, że konfluencja komórek nie przekracza 90%, aby uniknąć wywołania odpowiedzi stresowej.
3. Gdy komórki osiągną 70% konfluencji (~48 h), wyjąć kolbę z inkubatora i przemyć komórki 3x zimnym roztworem soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS).
4. Odlepić komórki z kolby, używając 0,25% trypsyny w ilości wystarczającej do pokrycia powierzchni płytki.
   1. W tym celu do kolby o powierzchni 175 cm² zawierającej komórki o 70% konfluencji należy wlać 4 mL trypsyny. Inkubować komórki z trypsyną przez 3–4 min w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C i przy 5% CO₂.
   2. Sprawdzić pod mikroskopem, czy komórki zostały odlepione.
   3. Dodać 12 mL pożywki DMEM F/12 zawierającej FBS, aby zneutralizować aktywność trypsyny.
5. Odssać zawiesinę komórkową i przelać ją do probówki stożkowej o pojemności 50 mL.
6. Wymieszać komórki w probówce, odwracając ją 3x–4x.
7. Opcjonalnie, zmieszać 10 µL alikwot zawiesiny komórkowej z 10 µL błękitu Trypan w probówce do mikrocentryfugi i policzyć komórki za pomocą hemocytometru. Żywotność komórek określić, odejmując liczbę komórek wybarwionych błękitem Trypan od całkowitej liczby komórek, a następnie dzieląc wynik przez całkowitą liczbę komórek.
8. Odwirować zawiesinę komórkową przy 300 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C.
9. Resuspendować komórki w pożywce DMEM bez surowicy i antybiotyków w odpowiedniej objętości, tak aby w 50 µL pożywki znajdowało się 1 x 10⁶ komórek.
   UWAGA: W oparciu o agresywność linii komórkowych in vivo (określoną empirycznie), dawkę 1 x 10⁶ komórek na miejsce wstrzyknięcia na mysz uznano za odpowiednią dla komórek B4B8 i LY2.
10. Umieścić probówkę z zawiesiną komórkową na lodzie.
11. Umieścić uprzednio rozmrożoną macierz błony podstawnej na lodzie.
    UWAGA: Macierz błony podstawnej była rozmrażana przez noc w temperaturze 4 °C.

2. Iniekcja komórek do myszy

1. Przygotować mieszaninę komórek i macierzy błony podstawnej w proporcji 1:1 (po 50 µL każdego składnika).
2. Najpierw dodać komórki, a następnie stopniowo pipetować macierz błony podstawnej. Należy unikać wprowadzania pęcherzyków powietrza. Należy upewnić się, że mieszanina została przygotowana bezpośrednio przed iniekcją u zwierzęcia. Długotrwałe przetrzymywanie komórek w macierzy błony podstawnej może prowadzić do ich osiadania w mieszaninie, co utrudnia jej intensywne wymieszanie. Spowoduje to znaczną zmienność wielkości guza u poszczególnych myszy.
3. Wymieszać delikatnie. Wszystkie etapy z użyciem macierzy należy przeprowadzać w lodzie. Macierz błony podstawnej polimeryzuje w temperaturze pokojowej.
4. Przygotować strzykawki do inokulacji.
5. Napełnić strzykawki insulinowe o objętości 0,5 mL (23 G) ilością 100 µL roztworu komórek w macierzy błony podstawnej.
6. Przechowywać strzykawki w lodzie, aby zapobiec polimeryzacji macierzy błony podstawnej.
7. Zanestetyzować myszy, umieszczając je w komorze z izofluranem i tlenem (2,5%).
8. Przed wykonaniem iniekcji upewnić się, że myszy są w głębokiej narkozie (poprzez sprawdzenie braku reakcji na uciśnięcie palca u stopy).
9. Wprowadzić igłę w prawy lub lewy obszar policzka. Zabieg ten wykonuje się poprzez dostępną wolną przestrzeń po obu stronach pyska.
10. Upewnić się, że język myszy nie blokuje dostępu.
    UWAGA: Łatwo jest przebić język, co doprowadzi do powstania guzów języka. W razie potrzeby przesunąć język na przeciwną stronę.
11. Trzymać strzykawkę równolegle do obszaru policzka podczas jej przebywania w jamie ustnej.
12. W momencie gotowości do iniekcji, odsunąć strzykawkę i powoli wprowadzić ją pod kątem 10°.
13. Wstrzyknąć 100 µL zawiesiny komórek w macierzy błony podstawnej w czasie 5 s.
14. Przytrzymać strzykawkę w miejscu przez kolejne 5 s, aby upewnić się, że cały materiał został wstrzyknięty.
    UWAGA: W przypadku myszy kontrolnych bez guzów, wstrzyknąć mieszaninę pożywki bez surowicy i macierzy (zgodnie z opisem powyżej) bez dodatku komórek nowotworowych.
15. Delikatnie wycofać strzykawkę.
16. Powtórzyć powyższą procedurę u pozostałych myszy.
17. Odczekać 1 tydzień, aż guzy staną się widoczne makroskopowo (50–200 mm³ dla komórek B4B8 i LY2).

3. Monitorowanie myszy

1. Wykonaj pierwszy pomiar za pomocą suwmiarki w 1. tygodniu po wstrzyknięciu komórek nowotworowych. W celu obliczenia objętości guza za pomocą zewnętrznych pomiarów suwmiarką, wyznacz największą średnicę podłużną (długość) oraz największą średnicę poprzeczną (szerokość), a następnie zastosuj zmodyfikowany wzór elipsoidalny^14,15.
   
2. Kontynuuj regularne pomiary objętości guza suwmiarką (1–2 razy w tygodniu w regularnych odstępach czasu).
3. Mierz masę ciała zwierząt, aby ocenić wpływ wzrostu guza na odżywianie.

4. Pobieranie guzów

1. Po osiągnięciu punktu końcowego eksperymentu uśmierć zwierzęta, stosując odpowiednie metody (np. uduszenie CO₂, gilotynowanie lub zwichnięcie stawówśrodkowych kręgów szyjnych).
   UWAGA: W niniejszym badaniu punkt końcowy uznawano za osiągnięty, jeśli myszy znajdowały się w stanie przedagonalnym (utrata masy ciała >15% masy początkowej, brak pielęgnacji ciała, kacheksja) i/lub jeśli wielkość guza osiągnęła 1 000 mm³.
2. Rozpocznij sekcję zwierzęcia, wykonując długie cięcie wzdłuż linii środkowej w obszarze szyi.
   1. Użyj pęsety tępą do uchwycenia skóry i ostrych nożyczek do przecięcia skóry.
3. Ostrożnie wprowadź nożyczki pod skórę pokrywającą guz i stwórz pęcherze powietrzne, przesuwając nożyczki w poprzek i w głąb skóry.
4. Po wystarczającym oddzieleniu skóry od guza zidentyfikuj drenujące węzły chłonne (DLNs) i usuń je, aby uniknąć zanieczyszczenia tkanki guza obecnością węzłów chłonnych.
   UWAGA: Duże guzy mogą osiągać lub pokrywać DLN. W zależności od rodzaju wykonywanego testu, izolacja nienaruszonych węzłów chłonnych jest niezbędna, aby uniknąć przedostania się komórek odpornościowych do guza, co spowodowałoby zniekształcenie wyników analizy.
5. Przecnij brzegi guza, aż cała jego objętość zostanie oddzielona.

5. Obróbka guza do dalszych zastosowań

1. W celu późniejszego badania histologicznego umieścić guzy w 10% formalinie w temperaturze pokojowej. Aby uniknąć nadmiernej fiksacji, należy zastąpić formalinę 70% etanolem. Do analizy cytometrycznej z przepływem przetwarzamy guzy zgodnie z opisem poniżej.
   UWAGA: Tkankę można przechowywać w formalinie przez 72 h, zanim nadmierna fiksacja stanie się problematyczna dla niektórych rodzajów barwień.
2. Pokroić guz na kawałki o wielkości 1–2 mm, używając sterylnego ostrza żyletki lub ostrych nożyczek.
3. Umieścić pokrojone kawałki guza w probówce stożkowej 50 mL z kolagenazą III (4 250 jednostek na próbkę), DNazą I (0,1 mg na próbkę) i inhibitorem trypsyny (1 mg na próbkę).
4. Inkubować w 37 °C przez 30 min, wstrząsając co 10 min.
   UWAGA: Próbki można umieścić w szczelnym woreczku, wysterylizować 90% etanolem i włożyć do inkubatora do hodowli komórkowych.
5. Po 30 min dodać 20 mL zrównoważonego roztworu soli Hanksa (HBSS) i wirować przy 300 x g przez 5 min.
   UWAGA: HBSS składa się z chlorku potasu, chlorku sodu, wodorowęglanu sodu, fosforanu sodu dwzasadowego, fosforanu sodu jednozasadowego i glukozy.
6. Odlać nadsącz i resuspender osad w 2–3 mL buforu do lizy erytrocytów (RBC). Pipetować intensywnie.
   UWAGA: Bufor do lizy RBC składa się z chlorku amonu, wodorowęglanu sodu i dwuwodorowodnorku sodu.
7. Inkubować przez 2 min w temperaturze pokojowej.
   UWAGA: Dłuższa inkubacja może być toksyczna dla innych populacji komórek.
8. Dodać 20 mL HBSS, aby zneutralizować działanie buforu do lizy.
9. Wirować przy 300 x g przez 5 min i odlać nadsącz.
10. Resuspender osad w 10 mL HBSS.
11. Przepuścić roztwór przez nylonowy filtr 70 µm i wirować przy 300 x g przez 5 min. Odlać nadsącz.
12. Powtórzyć kroki 5.8–5.10 i przepuścić zawiesinę komórkową przez nylonowy filtr 40 µm, aby upewnić się, że z zawiesiny usunięto wszelkie dodatkowe zanieczyszczenia.

6. Barwienie komórek i akwizycja danych

1. Resuspenduj osad komórkowy w 1 mL HBSS.
2. Policz komórki za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek, zgodnie z opisem w kroku 1.7
3. Określ całkowitą liczbę komórek i odpowiednie stężenie do barwienia.
   UWAGA: Idealne stężenie komórek do barwienia w cytometrii przepływowej to 1–2 miliony komórek. Na przykład, jeśli barwienie jest przeprowadzane na płytce 96-dołkowej i dostępnych jest 10 milionów komórek, resuspenduj próbkę w 1 mL i nanieś 100 µL, aby uzyskać 1 milion komórek na dołek.
4. Dodaj Fc block (CD16/CD32) w stężeniu 1:100, aby zapobiec nieswoistemu wiązaniu immunoglobulin z receptorami FcγIII i FcγII. Inkubuj przez 5 min w temperaturze pokojowej.
   1. Odwiruj i resuspenduj osad komórkowy w 100 µL buforu do barwienia komórek w cytometrii przepływowej (składającego się z roztworu soli fizjologicznej zawierającego 5% FBS, 2% EDTA i 1% HEPES).
5. Przeprowadź barwienie powierzchniowe komórek zgodnie z instrukcjami dostawcy (dodając każde przeciwciało w odpowiednim rozcieńczeniu). Inkubuj przez 60 min w temperaturze pokojowej.
   1. Odwiruj i resuspenduj osad komórkowy w 100 µL HBSS. Powtórz 2x, aby usunąć nadmiar przeciwciał.
6. Przeanalizuj próbki na odpowiednim cytometrze przepływowym.
   1. W przypadku analizy markerów wewnątrzkomórkowych (np. foxp3), przeprowadź permeabilizację i barwienie komórek zgodnie z instrukcjami dostawcy.

Wyniki

Ocena in vitro proliferacji komórek LY2 i B4B8 wykazała, że obie linie komórkowe mają podobny czas podwojenia (odpowiednio 21 h i 23 h). In vivo obie linie komórkowe utworzyły pojedynczą, widoczną i wyczuwalną masę w ciągu 1 tygodnia od inokulacji (Ryc. 1A). U myszy z guzami LY2 w 3. tygodniu doszło do przemieszczenia żuchwy z powodu obciążenia nowotworowego (Ryc. 1A). Myszy kontrolne, które nie otrzymały komórek nowotworowych, z...

Dyskusja

Rygorystyczna analiza i charakterystyka mikrośrodowiska guza stanowią ważną strategię dla zrozumienia mechanizmów rozwoju, progresji i przerzutów guza oraz dla opracowania skutecznych terapii. Rak głowy i szyi jest złożoną chorobą, która może wywodzić się z wielu miejsc anatomicznych w okolicy głowy i szyi. Główną przeszkodą w zrozumieniu mechanizmów choroby i ulepszeniu terapii jest brak linii komórkowych myszy myszy, które przypominają agresywną i przerzutową naturę ludzkich HNSCC. Ponadto wiele modeli mysich wykorzyst...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kolagenaza III	Worthington Biochemical Corp.
DNase I	Worthington Biochemical Corp.
Blok Fc (CD16/32)	BD Biosciences	553141	Klon 2.4G2
Bufor do barwienia cytometrii przepływowej	eBioscience	00-4222-26
HBSS	ThermoFisher Scientific	14175079	bez wapnia, bez magnezu, bez czerwieni fenoczerwonej
cytometru masowego Helois	Fluidigm	NA
Matrigel membrana	Corning	CB-40234B
Skaner MRI	Bruker	NA	7.4 Tesla
Bufor do lizy RBC	BioLegend	420301
Inhibitor trypsyny	Worthington Biochemical Corp.

LS004183LS006328LS002830